CN111349677B - 甾体c1,2位脱氢药物中间体的一种生物催化制备方法 - Google Patents

甾体c1,2位脱氢药物中间体的一种生物催化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行甾体药物中间体C1,2位生物脱氢的方法，将甾体化合物以有机溶剂溶解，投入培养好的甾酮C1,2位脱氢酶重组菌发酵液中，同时加入氢受体进行转化，转化后提取得到脱氢物。本发明所述的方法仅需要一步催化反应即可得到甾体化合物的脱氢产物，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，得到的产品纯度高，大于95％，易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少对环境的污染，具有重要的应用价值。

Description

甾体C1,2位脱氢药物中间体的一种生物催化制备方法
技术领域
本发明涉及甾体药物中间体的制备方法，具体涉及一种甾体C1,2位脱氢药物中间体的制备方法，属于生物制药和生物化工的技术领域。
背景技术
甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物。甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等，可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。
甾体药物母核A环C1,2位引入双键后，能成倍增加抗炎活性，目前，许多临床上常用重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及C1,2位脱氢反应，包括泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(betamethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。甾体化合物的1,2位脱氢的方法一般包括化学法和微生物发酵法。化学法脱氢一般需要使用SeO2，收率比较低，而且SeO2对环境污染很大，目前已逐渐被生物法取代。微生物发酵法脱氢，现在应用较多的菌种是节杆菌(CN101760495，CN200710060202)，虽然避免了化学法的上述缺陷，但存在着底物浓度低、转化时间长、转化率和收率都比较低、分离纯化比较困难等缺点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种利用甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行甾体药物中间体C1,2位生物脱氢的方法，该方法易于制备、底物浓度高、转化率高、产率高、产品纯度高。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：将甾体化合物以溶剂溶解，投入培养好的甾酮C1,2位脱氢酶重组菌发酵液中，同时加入氢受体进行转化，转化后提取得到脱氢物。所述溶解甾体化合物的溶剂选自二甲基亚砜、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、异辛醇、甲苯、乙酸丁酯中的一种或几种，且助溶剂的投料体积为反应体系总体积的10％～60％。所述的氢受体为甲萘醌、亚硫酸氢钠甲萘醌、1,4-萘醌、吩嗪硫酸甲酯中的一种或多种。所述的甾体化合物为以下几种化合物中的一种：
雄甾-4-烯-3,17-二酮；
雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮；
17β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮；
孕甾-4-烯-3,20-二酮；
17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮；
17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮；
17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮；
11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮；
17α-羟基-21-氯-孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮；
17α,21-双羟基孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮-21-醋酸酯；
11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯；
21-羟基-孕甾-4,9(11),16-三烯-3,20-二酮-21-醋酸酯。
作为底物的甾体化合物的优选投料浓度为0.5％～3％，所述氢受体与底物的投料摩尔比为0.01～1:1。
生物脱氢反应结束后，采用有机溶剂萃取发酵液的形式提取脱氢产物，所述萃取用的有机溶剂优选乙酸乙酯。
所述甾酮C1,2位脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
所述甾酮C1,2位脱氢酶重组菌发酵液的制备方法如下：用接种环挑取重组菌单菌落接入含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基中(LB培养基)，37℃，200rpm培养至A600 0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导10～12h，得到发酵液。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1)解决了现有技术中采用化学法脱氢过程中，采用重金属催化剂所带来的环境问题，同时还解决了制备过程中收率低的问题；
2)解决了现有技术中采用微生物发酵法脱氢过程中，转化周期长、转化率和收率都比较低，转化后提纯困难，结果不稳定的问题；
3)本发明利用甾酮C1,2位脱氢酶重组菌作为生物催化剂，仅需要一步催化反应即可得到甾体化合物的脱氢产物，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，得到的产品纯度高，大于95％，易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少对环境的污染，具有重要的应用价值。
附图说明
图1所示的是泼尼松龙标样的HPLC图；
图2所示的是实施例9,10中转化产品泼尼松龙的HPLC图。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：甾酮C1,2位脱氢酶重组菌的构建和诱导表达
将来源于Sphingomonas jatrophae的甾酮C1,2位脱氢酶基因(氨基酸序列如SEQID No.1所示)由通用生物系统(安徽)有限公司合成，连接在pET21a载体上，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆即得到重组菌。
种子培养：用接种环挑取甾酮C1,2位脱氢酶重组菌单菌落接入含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。
发酵诱导培养：将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基中(LB培养基)，37℃，200rpm培养至A600 0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导10～12h，得到发酵液。
实施例2：以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于DMSO(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为3％，再加入吩嗪硫酸甲酯16g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率100％，收率97％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例3：以雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于DMF(100mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为3％，再加入甲萘醌90mg(与底物摩尔比为0.01:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率96％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例4：以17β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于甲醇(50mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为3％，再加入亚硫酸氢钠甲萘醌720mg(与底物摩尔比为0.05:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率100％，收率97％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例5：以孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于乙二醇(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2％，再加入1,4-萘醌503mg(与底物摩尔比为0.1:1)，30℃搅拌反应。反应12h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率96％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例6：以17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于丙二醇(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为1.5％，再加入吩嗪硫酸甲酯3.5g(与底物摩尔比为0.5:1)，30℃搅拌反应。反应16h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率96％，收率92％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度97％。
实施例7：以17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于异辛醇(200mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2％，再加入1,4-萘醌4.6g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率95％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例8：以17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于己醇(200mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2％，再加入1,4-萘醌4.4g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率95％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例9：以11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于异辛醇(250mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2％，再加入甲萘醌475mg(与底物摩尔比为0.1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率95％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例10：以11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于甲苯(250mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2.5％，再加入亚硫酸氢钠甲萘醌9.53g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率99％，收率95％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例11：以17α-羟基-21-氯-孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于丙二醇(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为1.5％，再加入吩嗪硫酸甲酯3.2g(与底物摩尔比为0.5:1)，30℃搅拌反应。反应12h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率96％，收率92％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度97％。
实施例12：以17α,21-双羟基孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于乙酸丁酯(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为1％，再加入吩嗪硫酸甲酯198mg(与底物摩尔比为0.05:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率96％，收率92％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度96％。
实施例13：以11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于乙酸丁酯(150mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为0.5％，再加入甲萘醌1.06g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应24h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率100％，收率96％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
实施例14：以21-羟基-孕甾-4,9(11),16-三烯-3,20-二酮-21-醋酸酯为底物
将甾酮C1,2位脱氢酶重组菌进行种子培养和发酵诱导培养，将溶于庚醇(300mL)的底物投入500mL发酵液中，投料浓度为2.5％，再加入吩嗪硫酸甲酯10.4g(与底物摩尔比为1:1)，30℃搅拌反应。反应16h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，HPLC检测反应的转化率100％，收率96％。使用石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度99％。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 甾体C1,2位脱氢药物中间体的一种生物催化制备方法
<130> Wang, X. J.; Feng, J. H.; Zhang, D. L.; Wu, Q. Q.; Zhu, D. M.;Ma, Y. H. Applied Microbiology and Biotechnology 2017, 101, 6049
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 511
<212> PRT
<213> Sphingomonas jatrophae
<400> 1
Met Pro Val Trp Asp Glu Glu Cys Asp Val Leu Val Val Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Met Thr Gly Ala Tyr Thr Ala Ala Arg Glu Gly Leu Arg
20 25 30
Val Ile Leu Ala Glu Ala Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Met Trp Phe Pro Cys Asn Ala Val Leu Arg Arg Ala
50 55 60
Gly Asp Asp Asp Thr Met Glu Asp Ala Arg Asp Tyr Tyr Arg Ala Val
65 70 75 80
Val Gly Asp Arg Thr Pro Arg Asp Val Gln Asp Ala Tyr Leu Glu Thr
85 90 95
Gly Arg Lys Leu Ile Asp Tyr Leu Glu Gln Asp Pro Gly Phe Glu Phe
100 105 110
Ile Val Tyr Pro Trp Pro Asp Tyr Tyr Gly Arg Val Pro Lys Ala Arg
115 120 125
Glu Ser Gly Arg His Ile Met Pro Met Ser Leu Asp Gly Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Asp Leu Arg Gly Ser Leu Arg Ala Ala Leu Gly Glu Glu Arg Arg
145 150 155 160
Gly Gln Pro Ala Pro Glu Met Leu Asp Ala Gly Gln Ala Leu Ile Gly
165 170 175
Arg Phe Leu Leu Ala Leu Ser Lys Met Pro Asn Ala Ala Leu Arg Leu
180 185 190
Arg His Glu Leu Val Glu Phe Val Arg Glu Gly Asp Arg Val Thr Gly
195 200 205
Ala Val Met Glu Thr Pro Glu Gly Val Arg Arg Ile Arg Ala His Ala
210 215 220
Gly Ile Val Val Ala Ala Gly Gly Phe Glu His Asp Ala Glu Leu Arg
225 230 235 240
Ala Arg Phe Gly Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ala Met Gly Pro Pro
245 250 255
Gly Asn Lys Gly Leu Ala Leu Lys Ala Gly Met Ala Ile Gly Ala Asp
260 265 270
Val Asp Leu Met Asp Gln Ala Trp Trp Ser Pro Gly Leu Met Gln Pro
275 280 285
Asp Gly Thr Ala Ser Phe Thr Leu Gly Phe Asp Gly Gly Ile Phe Val
290 295 300
Asp Gln Asp Gly Arg Arg Phe Ile Asn Glu Ser Leu Pro Tyr Asp Arg
305 310 315 320
Ala Gly Arg Glu Ile Ile Ala Arg Val Lys Glu Gly Arg Leu Thr Leu
325 330 335
Pro Phe Trp Leu Val Tyr Asp Asp Arg Asp Gly Gly Met Pro Pro Ile
340 345 350
Gln Phe Pro Asn Leu Pro Phe Ala Pro Ala Glu Asp Tyr Arg Ala Ala
355 360 365
Gly Leu Trp Arg Ser Ala Pro Thr Leu Ser Gly Leu Ala Asp Ala Ile
370 375 380
Gly Val Pro Ala Asp Ala Leu Ala Ala Thr Val Glu Arg His Asn Cys
385 390 395 400
His Ala Glu Arg Gly Glu Asp Pro Asp Phe Glu Arg Gly Val Glu Ala
405 410 415
Phe Asp Arg Met Phe Thr Gly Gly Ala Val Pro Leu Ala Pro Ile Ala
420 425 430
Arg Pro Pro Phe His Ala Ala Ala Phe Gly Leu Ser Asp Leu Gly Thr
435 440 445
Lys Gly Gly Met Arg Thr Asp Ala Arg Ala Arg Val Leu Asp Gly Glu
450 455 460
Gly Arg Val Ile Pro Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Ser Met Ala Ala
465 470 475 480
Val Ser Gly Glu Ala Tyr Pro Gly Gly Gly Asn Pro Ile Gly Ser Ser
485 490 495
Met Val Phe Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Asp Met Ala Ala Glu Arg
500 505 510

Claims (6)

1.一种甾体药物中间体C1,2位的生物脱氢方法，其特征在于，将甾体化合物以溶剂溶解，投入培养好的甾酮C1,2位脱氢酶大肠杆菌重组菌发酵液中，所述甾酮C1,2位脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 1所示，同时加入氢受体进行转化，转化后得到脱氢物。
2.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征在于，所述溶解甾体化合物的溶剂选自二甲基亚砜、DMF、丙酮、甲醇、乙醇、乙二醇、丙二醇、异丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、异辛醇、甲苯、乙酸丁酯中的一种或几种，且溶剂的投料体积为反应体系总体积的10%～60%。
3.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征在于，所述的氢受体为甲萘醌、亚硫酸氢钠甲萘醌、1,4-萘醌、吩嗪硫酸甲酯中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征在于，所述氢受体与甾体化合物的投料摩尔比为0.01～1:1。
5.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征在于，所述甾体化合物的投料浓度质量体积比为0.5%～3%，反应时间为12～24 h。
6.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征在于，所述甾体化合物为以下几种化合物中的一种：
雄甾-4-烯-3,17-二酮；
雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮；
17β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮;
孕甾-4-烯-3,20-二酮;
17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮;
17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮;
17α,21-双羟基孕甾-4-烯-3,11,20-三酮;
11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮;
17α-羟基-21-氯-孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮；
17α,21-双羟基孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮-21-醋酸酯;
11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯；
21-羟基-孕甾-4,9(11),16-三烯-3,20-二酮-21-醋酸酯。
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