CN105695551A - 一种制备去氢表雄酮的生物方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的生物制备方法。其包括使用具有序列1的酮还原酶将式(Ⅱ)的双键移位中间体A的3-位酮羰基选择性不对称地还原。

Description

一种制备去氢表雄酮的生物方法
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的生物制备方法。
背景技术
许多甾体化合物具有重要的生物活性及多种生理功能,去氢表雄酮(DHEA)就是这样一个甾体类药物。值得关注的是：此化合物的应用非常广泛，作为性激素前体，具有抗衰老及蛋白同化作用。主要功能有：1.辅助治疗疾病，目前已经应用于治疗系统性红斑狼疮，抗过敏/哮喘等；2.改善性功能,提高性欲；3.调节免疫系统功能,提高肌体免疫力；4.增强体能,改善情绪和睡眠,提高记忆力；5.延缓衰老,保持青春活力。正由于它如此广泛的用途，其在临床上应用是当前研究的一大热点。生产去氢表雄酮的方法主要有：天然产物提取，化学法合成等。由于天然产物提取存在效率低下，成本高等缺点。目前工业化生产的主要是化学法：但是此类方法一般都存在步骤比较长，反应条件比较苛刻，对环境不友好等缺点。比如：
中国专利申请号201110085711.X，公开号102212099A的专利文献报道路线如下：
此方法以醋酸妊娠双烯醇酮为原料经过肟化反应，贝克曼重排反应，水解反应等三步化学反应最终以70％左右的总收率得到目标产物去氢表雄酮。该工艺路线需要使用大量的易制毒试剂醋酐和丙酮，并且会产生大量的废水，对环境非常不友好。另外，此路线的总收率只有70％，原子经济性较差。
中国专利申请号201210038094.2，公开号102603841A的专利文献报道路线如下：
此方法以甾体雄烯二酮为原料经过酯化反应，缩酮反应(保护羰基)，还原反应，水解反应(脱保护)等四步化学反应最终以80％左右的总收率得到目标产物去氢表雄酮。该方法第一步酯化反应对温度以及溶剂的量比较敏感，不易控制。另外此方法，需要对底物进行保护，脱保护两步反应，非常不经济。
中国专利申请号201480029546.8，公开号105339382A的专利文献报道了使用具有特定序列的酮还原酶选择性地将还原为此方法相对于化学合成方法具有更高的选择性和环境友好性，但是作为酶促反应而言，其底物浓度不高(60g/L左右)，反应时间过长(4-24小时)，所需辅酶种类较多，因此，该方法在工业生产方面成本较高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单易行的合成去氢表雄酮的生物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且大幅度降低了生产的成本，适合大规模的工业化生产。
一方面，本申请提供制备式(Ⅰ)的去氢表雄酮(DHEA)的方法，
其包括使用具有序列1的酮还原酶将式(Ⅱ)的3-位酮羰基选择性不对称地还原，
该反应进一步包括添加NAD+作为辅酶，
该反应进一步包括添加葡萄糖脱氢酶作为辅酶来循环使用NAD+。
另一方面，本申请提供制备式(Ⅱ)的方法，
其包括以下步骤：使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(Ⅲ)的甾体雄烯二酮异构化
本发明的反应式如下：
用于上述立体选择性还原的酮还原酶包括但不限于具有与序列1相对应的氨基酸序列的酶。具有序列的酶与序列相对应或与序列1至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明的优点：
1.以廉价易得的起始物甾体雄烯二酮出发通过在碱性条件下双键移位，得到中间体。再利用酮还原酶对中间体的3-位酮羰基选择性不对称还原，最终能以85％的总收率得到目标产物。
2.此反应路线不会产生原料的浪费，未反应的原料和中间体都能回收利用。
3.此反应路线生物转化步骤能在底物浓度50-800克/升浓度下进行，优选120-600克/升，并且反应在2小时之内都能完成，有利于实现产业化。
4.含酮还原酶ADH046和葡萄糖脱氢酶GDH103的重组大肠杆菌透性细胞可以直接用于制备去氢表雄酮，简化了生物酶粉的制备，同时利用重组细胞内生NAD+再生体系免去了外源添加价格昂贵的辅酶NAD+，大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：构建质粒pET30a-ADH046及生产菌株pET30a-ADH046/BL21(DE3)。
根据序列1，基因合成ADH046基因片段，基因两端引入酶切位点NdeI和HindIII，连入pUC57载体(苏州泓迅生物技术有限公司)获得质粒pUC57-ADH046。将基因进行NdeI/HindIII双酶切，回收后的片段与NdeI/HindIII双酶切的质粒pET30a一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a完成重组质粒pET30a-ADH046的构建。将重组质粒pET30a-ADH046转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株pET30a-ADH046/BL21(DE3)。
实施例2：制备ADH046冻干粉
将pET30a-ADH046/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mMIPTG于25℃振荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，30min)，收集上清液冷冻干燥，获得ADH046的冻干粉。
实施例3：构建质粒pET30a-GDH103及生产菌株pET30a-GDH103/BL21(DE3)。
以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)基因组为模板，设计引物GDH103_NdeI_F:AACATATGTATCCGGATTTAAA和GDH103_HindIII_R:TTAAGCTTTTAACCGCGTCCTGCCTGGA，通过PCR从基因组上扩增葡萄糖脱氢酶基因GDH103，NdeI/HindIII双酶切，回收后的片段与NdeI/HindIII双酶切的质粒pET30a一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a完成重组质粒pET30a-GDH103的构建。将重组质粒pET30a-GDH103转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株pET30a-GDH103/BL21(DE3)。
实施例4：制备GDH103冻干粉
将pET30a-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mMIPTG于25℃振荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，30min)，收集上清液冷冻干燥，获得GDH103的冻干粉。
实施例5：构建质粒pET30a-ADH046-GDH103及生产菌株pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)。
以pET30a-GDH103为模板，设计引物GDH103_HimdIII_F:CCCAAGCTTAAGGAGATATACTTATGTATCCGGATTTAAAAGG和GDH103_XhoI_R:CCGCTCGAGTTAACCGCGTCCTGCCTGGAATG，PCR获得GDH103基因，HIndIII/XhoI双酶切，回收后的片段与HIndIII/XhoI双酶切的质粒pET30a-ADH046一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a完成重组质粒pET30a-ADH046-GDH103的构建。将重组质粒pET30a-ADH046-GDH103转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)。
实施例6：制备ADH046、GDH103混合冻干粉
将pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mMIPTG于25℃振荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，30min)，收集上清液冷冻干燥，获得ADH046、GDH103混合冻干粉。
实施例7：制备含ADH046和GDH103的重组大肠杆菌透性细胞
将pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mMIPTG于25℃振荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用10ml100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，添加1％(50uL)的甲苯用于增加大肠杆菌的膜透性，重悬细胞可以直接用于生物转化。
实施例8：制备双键移位中间体A
取叔丁醇225毫升于500毫升三颈瓶中，在氮气保护下加入叔丁醇钾29克，搅拌10-15分钟，使其溶解。氮气保护下将原料甾体雄烯二酮30克加入至三颈瓶中，反应1.5小时。在氮气氛围下将20克冰醋酸溶于600毫升水中，在20-25℃下将三颈瓶中的反应液加入其中，搅拌30分钟，析出固体，抽滤，用水洗涤滤饼，干燥称重。产品重量：27.3克，收率91％，HPLC纯度97％。母液通过乙酸乙酯萃取回收约2克原料与产品的混合物，回收率占投料量的7％。
实施例9：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉72毫克，辅酶GDH10336毫克以及NAD+3毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖6.8克，双键移位中间体A3.6克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约3.25克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.27克，回收率占投料量的7.5％。
实施例10：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉200毫克，辅酶GDH103100毫克以及NAD+8毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖18克，双键移位中间体A10.8克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约9.65克，收率89％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.6克，回收率占投料量的5.5％。
实施例11：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉500毫克，辅酶GDH103250毫克以及NAD+20毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖45克，双键移位中间体A25.2克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约22.67克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收1.9克，回收率占投料量的7.5％。
实施例12：ADH046、GDH103混合冻干粉制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046、GDH103混合冻干粉72毫克和辅酶NAD+3毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖6.8克，双键移位中间体A3.6克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约3.17克，收率88％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.8克，回收率占投料量的7.4％。
实施例13：ADH046、GDH103混合冻干粉制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046、GDH103混合冻干粉500毫克和辅酶NAD+20毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖45克，双键移位中间体A25.2克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约22.7克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收1.8克，回收率占投料量的7.1％。
实施例14：ADH046和GDH103的重组大肠杆菌透性细胞直接用于制备去氢表雄酮
取上述实施例7中的静态细胞重悬液30mL，在搅拌的同时向细胞液加入葡萄糖6.8克，双键移位中间体A3.6克。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/LNaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液-取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约3.35克，收率93％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.18克，回收率占投料量的5％。
序列1：
ATGGGACGACTCGCCGGCAAGGTAGCGATCATCAGTGGCGCGGCACAGGGGATGGGCGC
GGCAACCGCGCGACTCTTCGCTTCGGAAGGCGCGAAAGTGGTGCTGGGCGACGTTCTGG
AGGAGAAGGGTCGCGTGGTCGCCGCGGAGATCGGCGACGCCGCGTCCTTCCAGAAGCTG
GACGTGCGCGAGGAGGCGGATTGGGCTGCGATCGTGGCGCATGCCGGAGAGCGGTTCGG
CAAGCTCGACATCCTCGTCAACAACGCCGCGGTGACCCATTTCGGCGCCGCCGAGGAAT
TGCGCAAGGCGGATGTCGAGCGCGTGCTGGGGATCAACCTGATCGGCACGATGATGGGG
GTGAAGCATGCGGTGCCGGCGCTCAAGGCGAACGGCAAGGGCGTGATCGTCAACATCTC
TTCGGTGGATGGCCTGCGCGGCTGCAACGGGCTCGTCGCCTATACCGCCAGCAAATGGG
CGGTGCGCGGCATCAGCAAATCCTACGCCTATGAATTCGGGCCGTTCGGTATCCGCGTC
GTCTCGATCCATCCCGGCGGGGTGAATACGGAGATGGGCAATCCCGCGGGCGAAGCTGC
CGAGGCGGTCAATGCGCGCCACTTCCGCCGCGTGCCGCTGCAGCGCATCGGCGAGCCCG
AGGAGATCGCGCGGGCGACCCTGTTCGTGTGCAGCGACGAGGCGAGCTACATCAGCGGC
GCCGAGATCGCGGTCGATGGCGGCTGGACGGCCGGCCATTACGAGCCGGCGCTGCCCGG
TTGCGCACCCAGCCTGCTGGCCTAA

Claims (10)

1.制备式(Ⅰ)的去氢表雄酮的方法，
其包括使用具有序列1的酮还原酶将式(Ⅱ)的3-位酮羰基选择性不对称地还原，
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加入NAD+作为辅酶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加入葡萄糖脱氢酶作为辅酶来循环使用NAD+。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶以枯草芽孢杆菌基因组为模板设计而成。
5.如权利要求1-4所述的制备方法，其特征在于，所述酶是以酶粉的形式加入。
6.如权利要求1、3-4所述的制备方法，其特征在于，所述酶是以培养菌株的透性细胞形式加入。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养菌株是重组大肠杆菌。
8.如权利要求1-7所述的制备方法，其特征在于，酶促还原反应的底物浓度为50-800克/升。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，酶促还原反应的底物浓度为120-600克/升。
10.如权利要求1-9所述的制备方法，其特征在于，所述还原反应在2小时内完成。
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