CN104232673A - 微生物发酵生产去氢表雄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，包括如下步骤：敲除原件5228up-kan-5228down的构建；重组菌株的构建；菌种繁殖及发酵转化。本发明利用分子生物学方法敲除3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因MSMEG_5228，得到重组耻垢分枝杆菌，之后在单水相发酵体系中以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮。本发明降低了生产成本，去氢表雄酮质量收率达90％以上，同时简化了提取工艺，降低了提取成本，污染小、环保压力小、极具工业生产的优势。

Description

微生物发酵生产去氢表雄酮的方法

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，特别是利用重组耻垢分枝杆菌的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法。

背景技术

去氢表雄酮(dehyroepiandrosterone，DHEA)是一种C₁₉类固醇载体化合物，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C₁₉H₂₈O₂，结构式为：

DHEA是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物，具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在动物实验中能促进免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。此外，DHEA还是合成甾体药物的重要中间体，如甾体避孕药屈螺酮等。

现有的去氢表雄酮的制备工艺大多采用传统的化学工艺来合成，比如以孕甾双烯醇酮或醋酸妊娠双烯醇酮为原料，经过肟化、重排与水解后得到产物。这类方法存在以下缺陷：

1、大多以苯或卤代烷为溶媒，有机溶剂毒性大，导致药品存在安全隐患；

2、原料价格昂贵，生产成本高；

3、制备步骤繁琐，且制备过程中使用有机溶剂导致产品纯度低，后期提纯操作繁琐，生产效率低。

为解决上述问题，生产成本低、反应条件温和的微生物发酵技术被广泛应用去氢表雄酮生产领域中。中国专利申请201210038094.2提出了利用4-AD制备去氢表雄酮的方法，即植物甾醇先发酵生产4-AD，然后利用化学方法得到DHEA，虽改善了上述问题，但是仍然存在多步反应造成的生产成本高、总收率小、环保压力大等问题。

以耻垢分枝杆菌作为发酵转化菌种，植物甾醇代谢的底物包括去氢表雄酮、孕烯诺龙、胆固醇及胆固醇代谢过程中的中间体，代谢过程中的第一步反应为：在NAD+存在下，催化3位羟基脱氢生成3位羰基；第二步反应为：在还原性辅酶的作用下，激活类固醇-σ-异构酶，发生双键异构反应。第一羟基脱氢反应及第二步双键异构反应分别由3β-羟基类固醇脱氢酶(EC1.1.1.145)及类固醇-σ-异构酶(EC5.3.3.1)两种酶催化，其中3β-羟基类固醇脱氢酶为双功能酶。

类固醇-σ-异构酶的催化活性受到某些特殊酶类的激活，如3β-羟基类固醇脱氢酶。因此，理论上失活3β-羟基类固醇脱氢酶即可阻止植物甾醇代谢的前两步反应从而为去氢表雄酮的生物合成奠定基础。

发明内容

本发明提出了一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，用于解决背景技术中的上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，包括如下步骤：

第一步，敲除原件5228up-kan-5228down的构建；

第二步，重组菌株的构建；

第三步，菌种繁殖及发酵转化。

优选的，第一步中：

首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc²155带有酶切位点EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段；以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有EcoRI及Acc65I位点的MSMEG_5228上游片段；将其连接于克隆载体pUC18上构建质粒pUC-5228up；

其次，以耻垢分枝杆菌表达载体pMV261作为模板，通过PCR技术获得带有Acc65I及XbaI位点的kan基因片段，将其连接于pUC-5228up构建质粒pUC-5228up-kan；

接着，以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有XbaI及HindIII位点的MSMEG_5228下游片段，将其连接于pUC-5228up-kan构建pUC-5228up-kan-5228down；

最后，通过PCR技术获得大量敲除原件5228up-kan-5228down。

采用PCR技术，以GENBANK网站上公布的耻垢分枝杆菌mc²155染色体基因组DNA为模板，获得带有酶切位点EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段，为方便表述，将起始菌株命名为ZS-3。

优选的，MSMEG_5228上游片段全长540bp，MSMEG_5228下游片段全长575bp。

优选的，第二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的敲除原件5228up-kan-5228down电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。

优选的，耻垢分枝杆菌感受态细胞的制备方法为：

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态；

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mLEP管内-70℃保藏备用。

将敲除原件5228up-kan-5228down电转化于上述方法制备的感受态细胞中，转化条件为：2.5kV、1000Ω、25μF，使用0.2cm电转杯，电转时间为19-21ms，线性片段浓度1μg。以卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，将挑选出的阳性转化子经PCR验证敲除是否成功，为方便表述，将敲除成功的菌株命名为ZS3-△MSMEG_5228。

优选的，第三步中，先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀≈15时，以30-50％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化。

优选的，第三步中发酵转化的条件为：温度29-31℃、罐压0.05MPa、搅拌转速150-200rpm、培养周期4-5day。

优选的，种子培养基的组分为：葡萄糖8-15g/L、K₂HPO₄0.3-0.8g/L、MgSO₄·7H₂O0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，种子培养基的pH为6.0-8.0。

优选的，发酵培养基的组分为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，K₂HPO₄0.5-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，发酵培养基的pH为6.0-8.0。

优选的，植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1-2.5％。

本发明利用分子生物学方法敲除3β-羟基类固醇脱氢酶编码基因MSMEG_5228后与表达载体连接，经过菌株构建、菌种繁殖后得到重组耻垢分枝杆菌，之后在单水相发酵体系中以植物甾醇为原料生产去氢表雄酮，降低了生产成本，提高了产品质量收率。同时，由于最终产物存在于水相中，简化了提取工艺，降低了提取成本，且污染小、环保压力小，极具工业生产的优势。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的以下实施例中，植物甾醇购自西安海斯夫生物科技有限公司，其余各培养基的各组分均可商购获得，以下实施例中的ZS3-△MSMEG_5228的制备方法如下所述：

1、敲除原件5228up-kan-5228down的构建

以出发菌株基因组(GENBANK网站上公布的耻垢分枝杆菌mc²155染色体基因组DNA)为模板，通过PCR技术获得带有酶切位点EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段；以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有EcoRI及Acc65I位点的MSMEG_5228上游片段，全长540bp，将其连接于克隆载体pUC18上构建质粒pUC-5228up；以分枝杆菌表达载体pMV261作为模板，通过PCR技术获得带有Acc65I及XbaI位点的kan基因片段，将其连接于pUC-5228up构建质粒pUC-5228up-kan；以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有XbaI及HindIII位点的MSMEG_5228下游片段，全长575bp，将其连接于pUC-5228up-kan构建pUC-5228up-kan-5228down；最后通过PCR获得大量敲除原件5228up-kan-5228down重组菌株的构建。

2、重组菌株的构建

2.1感受态细胞的制备

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态；

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mLEP管内-70℃保藏备用。

2.2电转入操作

将敲除原件5228up-kan-5228down电转化于上述方法制备的感受态细胞中，转化条件为：2.5kV、1000Ω、25μF，使用0.2cm电转杯，电转时间为19-21ms，线性片段浓度1μg。以卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，将挑选出的阳性转化子经PCR验证敲除是否成功，敲除成功的ZS3-△MSMEG_5228进入如下的应用中。

实施例1

将ZS3-△MSMEG_5228先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀≈15时，以30％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化，植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1％，发酵转化的条件为：温度29-31℃、罐压0.05MPa、搅拌转速150-200rpm、培养周期4-5day；

种子培养基的组分为：葡萄糖15g/L、K₂HPO₄0.3g/L、MgSO₄·7H₂O0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02g/L、CaCO₃5.5g/L和柠檬酸1.0g/L，种子培养基的pH为6.0；

发酵培养基的组分为：葡萄糖15g/L，蛋白胨30g/L，豆饼粉25g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O0.06g/L，CaCO₃4.5g/L，柠檬酸3.0g/L和NH₄NO₃1.5g/L，发酵培养基的pH为6.0。

测试结果为：最终DHEA的收率为86.89％。

上述培养基中组分的浓度处于下述范围比较合适，组分浓度与培养基的PH在下述范围内的改变对实验结果的影响不是很大，种子培养基的组分优选范围：葡萄糖8-15g/L、K₂HPO₄0.3-0.8g/L、MgSO₄·7H₂O0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，种子培养基的pH为6.0-8.0；发酵培养基的组分优选范围：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，K₂HPO₄0.5-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，发酵培养基的pH为6.0-8.0。

实施例2

将实施例1中的接种量更改为40％，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为88.75％。

实施例3

将实施例1中的接种量更改为50％，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为92.51％。

实施例4

将实施例1中的植物甾醇与发酵培养基的重量百分比更为1.5％，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为86.62％。

实施例5

将实施例2中的植物甾醇与发酵培养基的重量百分比更为2％，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为92.15％。

实施例6

将实施例3中的植物甾醇与发酵培养基的重量百分比更为2.5％，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为78.80％。

实施例7

将实施例1中的种子培养基与发酵培养基pH均更改为7，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为89.21％。

实施例8

将实施例1中的种子培养基与发酵培养基的pH均更改为8，其余条件不变。

测试结果为：最终DHEA的收率为83.44％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：利用重组耻垢分枝杆菌单水相发酵转化植物甾醇生产去氢表雄酮，包括如下步骤：

第一步，敲除原件5228up-kan-5228down的构建；

第二步，重组菌株的构建；

第三步，菌种繁殖及发酵转化。

2.根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第一步中：

首先，通过PCR技术获得来源于耻垢分枝杆菌mc²155带有酶切位点EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段；以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有EcoRI及Acc65I位点的MSMEG_5228上游片段；将其连接于克隆载体pUC18上构建质粒pUC-5228up；

其次，以耻垢分枝杆菌表达载体pMV261作为模板，通过PCR技术获得带有Acc65I及XbaI位点的kan基因片段，将其连接于pUC-5228up构建质粒pUC-5228up-kan；

接着，以带有EcoRI及HindIII的MSMEG_5228全基因片段为模板，PCR扩增出带有XbaI及HindIII位点的MSMEG_5228下游片段，将其连接于pUC-5228up-kan构建pUC-5228up-kan-5228down；

最后，通过PCR技术获得大量敲除原件5228up-kan-5228down。

3.根据权利要求2所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述MSMEG_5228上游片段全长540bp，MSMEG_5228下游片段全长575bp。

4.根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第二步中，先制备耻垢分枝杆菌感受态细胞，再将第一步获得的敲除原件5228up-kan-5228down电转入到耻垢分枝杆菌感受态细胞中。

5.根据权利要求4所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：

耻垢分枝杆菌感受态细胞的制备方法为：

将浓度10⁷-10⁹个/ml的耻垢分枝杆菌以10％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基中含有重量百分比0.05％的吐温80，在30℃下培养至OD₆₀₀＝0.4-0.5时，添加终浓度为1％的甘氨酸继续培养，当OD₆₀₀达到0.8-1.0时开始制备感受态；

首先，将菌悬液以11000g、4℃离心20min后，弃去上层清液；接着，以培养基体积1/6量添加含有重量百分比0.05％吐温80的甘油吐温溶液重悬菌体，甘油溶液的质量百分比为10％，4000g、4℃离心10min，离心完毕后弃去上层清液；以上述方法再次洗菌2次，使用的甘油吐温溶液体积分别为培养基体积的1/15及1/30；最后，以2mL、重量百分比10％的甘油重悬菌体，分装于50μl/1.5mLEP管内-70℃保藏备用。

6.根据权利要求1所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第三步中，先在种子培养基中进行菌种繁殖，待种子培养基OD₆₀₀≈15时，以30-50％的接种量将其接入装有发酵培养基和植物甾醇的发酵罐中进行发酵转化。

7.根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：第三步中发酵转化的条件为：温度29-31℃、罐压0.05MPa、搅拌转速150-200rpm、培养周期4-5day。

8.根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述种子培养基的组分为：葡萄糖8-15g/L、K₂HPO₄0.3-0.8g/L、MgSO₄·7H₂O0.3-0.8g/L、(NH₄)₂Fe(SO₄)₂·6H₂O0.02-0.06g/L、CaCO₃4.5-5.5g/L和柠檬酸1.0-3.0g/L，所述种子培养基的pH为6.0-8.0。

9.根据权利要求6所述的微生物发酵生产去氢表雄酮的方法，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：葡萄糖15-30g/L，蛋白胨15-30g/L，豆饼粉10-25g/L，K₂HPO₄0.5-1.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.5-1.0g/L，(NH₄)₂Fe(SO₄)2·6H₂O0.02-0.06g/L，CaCO₃4.5-5.5g/L，柠檬酸1.0-3.0g/L和NH₄NO₃0.5-1.5g/L，所述发酵培养基的pH为6.0-8.0。

10.根据权利要求6所述的微生物发酵生产9α-羟基雄烯二酮的方法，其特征在于：植物甾醇与发酵培养基的重量百分比为1-2.5％。