CN111484961A - 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及直接从廉价底物植物甾醇(PS)为原料到5α‑雄烷二酮(5α‑AD)一步转化的基因工程菌构建及其应用。本发明将来自梅毒螺旋体中的5α‑还原酶基因异源表达到主产雄烯二酮(AD)的分枝杆菌中，实现从植物甾醇到5α‑AD的一步生物转化，从而实现5α‑AD的绿色高效生产。

Description

一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用

技术领域：

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种能够直接从廉价底物植物甾醇(PS)到5α-雄烷二酮(5α-AD)一步转化的基因工程菌及其应用。

背景技术：

甾体药物作为一类在医药上占有重要地位的激素类药物，目前已被鉴定的已经超过250多种，其市场需求仅次于抗生素，全球年产量超过100万吨，具有非常广阔的市场前景。甾体激素类药物在抗肿瘤、抗炎症、抗过敏等方面被广泛应用，同时在治疗风湿性关节炎、支气管炎以及艾迪森等内分泌疾病也是必不可少的药物。

5α-AD作为一种重要的甾体药物中间体，被广泛应用于合成美睾酮、雄诺龙、美替诺龙等甾体激素类药物，具有广泛的应用前景。目前5α-AD的现有合成途径为化学合成法，但该方法存在合成起始底物价格高、反应步骤多、环境污染大、专一性差、过程不易控制等问题。随着可持续发展理念的提出，开发一条绿色生物法生产重要甾体激素类药物的新方法已经成为近期技术发展的重要方向。

近年来，随着生物转化与生物催化技术的发展，利用微生物转化法发酵获得重要甾体激素类药物已经屡见不鲜。如利用分枝杆菌对PS进行侧链降解来生产雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)；AD可以在简单节杆菌的3-甾酮-△1-脱氢酶(ksdD)催化作用下生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)；AD又可以在赭曲霉的11α-羟化酶作用下生成11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(11α-OH-AD)。这些酶对底物的专一性作用是化学生产法所无法比拟的。

发明内容：

本发明针对现有化学法生产5α-AD的诸多问题，探索出一种绿色生物法生产5α-AD的新途径。通过对5α-AD的合成路线进行重新设计，首先利用廉价的PS为原料经分枝杆菌侧链降解作用生成AD，再经甾体5α-还原酶作用，将AD催化为5α-AD。因此本发明采用利用基因工程的手段，在主产AD的分枝杆菌中异源表达5α-还原酶，来实现从PS到5α-AD的一步生物转化。

本发明实现上述目的的技术方案如下：一种产5α-AD的基因工程菌，是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达5α-还原酶基因，从而获得由PS到5α-AD的一步快速转化的基因工程菌。

所述5α-还原酶基因是以齿垢密螺旋体中的5α-还原酶基因为原始基因，根据5α-还原酶基因在所述分枝杆菌内的表达密码子偏好性，进行优化，获得优化的5α-还原酶基因序列。

所述5α-还原酶基因原始核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

所述5α-还原酶基因优化后核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。

更优选地，所述宿主细胞为新金分枝杆菌。

更优选地，所述新金分枝杆菌具体为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD。

所述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD由实验室成员谢日丽所构建。所述新金分枝杆菌由原始菌株TCCC11028(MNR)(保藏编号为CICC 21097)经自发突变后得到的突变菌株TCCC11028M3(MNR M3)为出发菌株，通过敲除3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，从而获得基因缺陷型菌株MNR M3△ksdD。新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的构建方法来源于文章：Xie R,Shen Y,Qin N,et al.Genetic differences in ksdD influence on the ADD/AD ratio ofMycobacterium neoaurum[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2015,42(4):507-513.)

优选地，所述产5α-AD的基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)将5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；

(2)将重组质粒pMV261-5α导入至分枝杆菌的感受态细胞中，构建获得产5α-AD的基因工程菌。

更优选地，所述产5α-AD的基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)将5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；

(2)将重组质粒pMV261-5α导入至新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的感受态细胞中，获得基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α。

本发明的另一目的是提供上述产5α-AD的基因工程菌用于发酵制备5α-AD的用途。

优选地，利用所述基因工程菌发酵制备5α-AD具体如下：

将所述产5α-AD的基因工程菌经种子培养后，按5-10％(v/v)的接种量接种入发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d；

所述发酵培养基组成如下：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，余量为水，pH6.5-7.8。

有益效果：

现有技术中公开的不同来源的5α-还原酶基因有很多类型，例如哺乳动物细胞(人、猴、小鼠、蟾蜍等)，植物细胞(棉花、油菜、水稻、拟南芥等)，微生物细胞(链霉菌属、红球菌属、结核分枝杆菌、新生隐球菌等)，但本发明发现，现有技术中不同来源的5α-还原酶基因并不能在分枝杆菌中成功表达，如：根据文献调研，发现来自小鼠中的5α-还原酶基因成功表达于酿酒酵母细胞，并表现出相应的活性；因此考虑将小鼠来源的5α-还原酶进行密码子优化后表达于分枝杆菌，并没有在分枝杆菌中展示出5α-还原的能力。分析原因可能是由于表达宿主分枝杆菌属于细菌，而来自于动物细胞的5α-还原酶可能在表达过程中需要有分子伴侣帮助折叠成正确的构象才会有活性；而且原核细胞中缺乏高尔基体等细胞器，无法将多肽变成具有一定空间结构的蛋白质。

本发明通过质粒pMV261，实现了齿垢密螺旋体的5α-还原酶在分枝杆菌中的成功表达，酶活达到了4.16U/mL，全细胞转化PS生成5α-AD的摩尔转化率达到67.8％(发酵7d)。齿垢密螺旋体的5α-还原酶在分枝杆菌中表达及全细胞转化PS均为首次报道，且重组子表达的酶活及PS的摩尔转化率均较高。分枝杆菌作为安全稳定的生产菌株，具有较厚的分枝菌酸，能够耐受一定浓度的甾体底物和产物，成为微生物甾醇发酵工业潜在的生产菌株。

本发明通过异源表达5α-还原酶于分枝杆菌，赋予分枝杆菌5α-还原能力，实现了从PS到5α-AD的一步生物转化。该方法可替代现有技术中通过化学法将AD转化为5α-AD的生产方式，不仅原料价格低廉，而且制备方法清洁环保、生产效率较高。

附图说明：

图1：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α菌液PCR验证图，其中，M：DL5000DNAMarker；1-4：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α菌液PCR扩增条带。

图2：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α双酶切验证图，其中，M：DL5000DNAMarker；1-4：基因工程菌MNRM3△ksdD/261-5α的质粒双酶切条带。

图3：基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α与对照菌即宿主菌MNRM3△ksdD/261转化PS和AD的薄层层析色谱图，其中，1：标品PS/5α-AD/AD；2：MNR M3△ksdD/261转化PS；3：标品AD；4：MNR M3△ksdD/261-5α转化PS。

图4：纯化产物的高分辨率液相质谱图，其中(a)为5α-AD标准品，(b)为本发明基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α所产5α-AD。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

以下实施例中主要试剂：PS购自中粮集团科技生物工程有限公司，标准品5α-AD购自湖北万得化工有限公司。

实施例1目的基因5α-还原酶基因的获得

根据文献调研，来自小鼠中的5α-还原酶已成功表达于酿酒酵母细胞，并展现出相应的活性；结合NCBI序列查找及比对分析，发现来自齿垢密螺旋体的5α-还原酶与小鼠中的5α-还原酶同源性较高，并且其属于细菌来源。因此选择齿垢密螺旋体中的原始5α-还原酶基因(即SEQ ID NO.1)作为本次发明的原始基因。

将来自齿垢密螺旋体的5α-还原酶原始基因序列送至金唯智公司，合成符合分枝杆菌密码子偏好性的5α-还原酶基因。

以合成好的含有5α-还原酶基因序列的质粒PUC57-5α(该质粒为基因合成所通用的常规质粒)为模板，以及pMV261质粒上的酶切位点设计5α-还原酶基因引物，通过PCR扩增并纯化获得密码子优化后的5α-还原酶基因序列(即SEQ ID NO.2)；

PCR反应体系：5×Trans pfu Buffer 10μL，2.5mMdNTPS 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，Trans FastpfuDNAploy 1μL，ddH₂O补齐至总体积50μL。

PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，63℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min，10℃保持。

实施例2基因工程菌的构建

1、构建pMV261-5α质粒，其过程包括：

将由实施例1获得的目的片段5α-还原酶基因按一定的比例与穿梭质粒pMV261分别用BamH I和HindIII双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行PCR、双酶切验证，即重组质粒经BamHI和Hind III双酶切后，释放出大小约为4.5kb和0.8kb的基因片段，将双酶切验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-5α。

2、构建基因工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α：

(1)新金分枝杆菌MNRM3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNRM3△ksdD作为宿主细胞，将该菌的一级种子培养至OD₆₀₀为1.0左右,按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，其余为水，pH7.2；

(2)电转化：10μL步骤1所得重组质粒pMV261-5α加入100μL分枝MNR M3△ksdD感受态菌体中放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；

(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液PCR(图1)以及质粒双酶切(图2)验证，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α。

实施例3基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化PS生产5α-AD的方法与产物鉴定

将菌株分为两组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：

实验组：本发明实施例2制备的基因工程菌：MNR M3△ksdD/261-5α

对照组：新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261

所述对照菌MNR M3△ksdD/261的构建方法：是将质粒pMV261质粒直接导入宿主菌MNRM3△ksdD中，具体导入方法同实施例2步骤2，唯一区别是质粒不同(即(1)感受态细胞制备(2)电转化：(3)重组子筛选与验证)，以下新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261均为该菌株。

1、菌种活化培养:

将基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α和新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液；

斜面培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，其余为水，pH7.2。

2、植物甾醇微生物转化：

将步骤1中活化的种子培养液按8％的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养5-8d；

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。

3、5α-雄烷二酮的检测、分离及鉴定：

每隔24h取样，并用等体积乙酸乙酯萃取，经超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行TLC。标准品5α-AD用乙酸乙酯溶解后作为标样对照。

TLC的展开剂为乙酸乙酯：石油醚(2:3)，展开至距离上边缘1cm左右，TLC显色：显色剂为10％的硫酸溶液，均匀喷洒10％的稀硫酸，放置于160℃烘干至显色，对其产物进行定性分析(图3)；

产物分离纯化步骤如下：将发酵8d左右的发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，旋蒸得到浓缩后的发酵产物；加入少量硅胶研磨，得到粉末状浓缩产物；导入装有硅胶的硅胶柱中，用石油醚：乙酸乙酯(3:1)去分离得到液体的纯化产物；继续旋蒸至一定体积后室温干燥，得到固体纯化产物约1.5g，摩尔转化率约65％。

产物结构鉴定步骤如下：对基因工程菌得到的固体纯化产物以及标准品分别进行高分辨率气相质谱(GC-MS)(图4)分析。其中图4(a)(b)中的最高峰即为5α-AD。

需要说明书的是，由以下实施例4-11构建的基因工程菌在定性分析以及产物结构鉴定结果均与实施例3的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α产物的鉴定结构相同。

实施例4基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

1、基因工程菌的构建：

(1)构建pMV261-5α质粒：方法同实施例2步骤1；

(2)构建基因工程菌株：选择将分枝杆菌NRRLB-3683作为宿主细胞，在感受态细胞制备、电转化以及重组子筛选与验证方法同实施例2的步骤2，以此获得基因工程菌。

2、基因工程菌转化PS生产5α-AD的方法：

将构建的基因工程菌按照实施例3的菌种活化培养以及植物甾醇微生物转化方法发酵生产5α-AD。

实施例5基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为分枝杆菌NRRLB-3805。

实施例6基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为耻垢分枝杆菌。

实施例7基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为偶发分枝杆菌。

实施例8基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为微黄分枝杆菌。

实施例9基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为新金分枝杆菌。

实施例10基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为草分枝杆菌。

实施例11基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法

基因工程菌的构建以及转化PS生产5α-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为鸟分枝杆菌。

实施例12基因工程菌株与原始菌株酶活比较

将菌株分为两组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：

实验组：本发明实施例2制备的基因工程菌：MNR M3△ksdD/261-5α

对照组：新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261

(1)菌种培养：将基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α及宿主菌MNRM3△ksdD/261分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液，当菌株生长到对数生长期时，按8％的接种量转接至装有50mL不含3g/L植物甾醇的发酵培养基中，每隔12h取样测定吸光度600nm处的吸光值，绘制生长曲线。

斜面培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；

种子培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO₃ 10g/L，其余为水，pH7.2。

发酵培养基组成:K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇3g/L，其余为水，pH 7.2。

收集发酵液菌体细胞进行超声破碎，4℃，12000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液。

(2)5α-还原酶酶活测定方法：

酶促反应体系：50mMTris-HCL缓冲液(pH 7.2)，0.6Mm AD溶于甲醇中，适量的粗酶液，加入0.2mM NADPH去启动反应。

酶活单位定义：在37℃，pH7.2条件下，一分钟转化1μmolAD生成5α-AD所需的酶量。

(3)结果比较

如表1所示，基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α与对照菌株MNR M3△ksdD/261相比具有了5α-还原的能力。

表1株菌5α-还原酶酶活测定

需要说明书的是，由以上实施例4-11构建的基因工程菌在酶活力上同样可以获得同实施例12的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α的相近的技术效果。

实施例13基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化PS生产5α-AD性能验证

将菌株分组进行由PS生产5α-AD转化性能的比较，具体分组为：

对照组：新金分枝杆菌对照菌株MNR M3△ksdD/261；

实验组：实施例2构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α；

(1)菌种培养：将两组菌株分别按照实施例3步骤1：菌种活化培养以及步骤2：植物甾醇微生物转化方法进行发酵生产，得到发酵液。

(2)5α-AD摩尔生成率的检测：

用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(3：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。

(3)结果比较：

如表2所示，生物转化4d时，工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α的5α-AD生成量为0.52g/L；5d时，工程菌株的5α-AD的生成量为0.73g/L；6d时，工程菌株的5α-AD生成量为0.96g/L；7d后，工程菌株的5α-AD的生成量高达1.45g/L。

所述新金分枝杆菌宿主菌MNR M3△ksdD为敲除了3-甾酮-Δ1-脱氢酶(ksdD)的新金分枝杆菌，ksdD催化AD生成ADD，其敲除可以阻断AD的降解，达到积累AD的目的。

采用ksdD(C1,2位脱氢酶)基因敲除的新金分枝杆菌作为宿主，在植物甾醇侧链降解时不会将生成的AD转化成ADD等C1,2位脱氢产物，提高AD的积累量，最终可协同异源表达的5α-还原酶共同提高目标产物5α-AD的产量。

表2基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化过程中5α-AD产量(g/L)

需要说明书的是，由以上实施例4-11构建的基因工程菌在转化PS生产5α-AD的性能验证上同样可以获得同实施例13的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α相近的技术效果。

实施例14基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化不同浓度PS生产5α-AD性能比较

将菌株进行不同PS浓度的转化实验，以比较其对5α-AD摩尔转化率的影响，具体实验安排为：

(1)菌种培养：将基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α按照实施例3步骤1：菌种活化培养。

(2)转化实验：将活化好的种子液转接至分枝发酵培养基中，每天在固定的取样。

发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1g/L，其余为水，pH 7.2。

(3)5α-AD的检测分析：

用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(3：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。

(4)结果比较：

对工程菌株MNR M3△ksdD/261-5α转化PS结果分析发现，当PS浓度为1g/L时，5α-AD的摩尔转化率达到90％。

实施例15基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化不同浓度PS生产5α-AD性能比较

基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α转化PS生产5α-AD的方法同实施例14，唯一不同是植物甾醇为30g/L，对转化结果分析发现，当底物浓度为30g/L时，5α-AD的摩尔转化率约41％。

需要说明书的是，由实施例4-11构建的基因工程菌在进行实施例14、15转化PS生产5α-AD的5α-AD产量以及摩尔转化率中，均能获得与实施例14、15的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α-G6PDH相近的技术效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种产5α-雄烷二酮的基因工程菌及其应用

<130> 2019

<141> 2019-01-29

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 齿垢密螺旋体()

<400> 1

atggaaagac tgatatttat atttaatatt acgcagattg tcttattcgg cgtaggctta 60

atttgttttg tagtattgtt ttttgttccg gccggatacg gtaagatgat aaataaaaaa 120

tggggatttt cttttaacaa taaaattgcg tggtttttaa tggaagttcc tacacttatc 180

actatgattg tcctaatgtg tgtatgggct aaacctgaaa attttgtgag aattataata 240

ggcctttttt ttgtgctgca ttatgctcaa agagttttta tatttccttt tttacttaag 300

ggaaaaagta agatgcccat cctcatcgtt ttgatgggaa tcacatttaa tacgataaat 360

gcctttttaa taggtgcatg gcttttttac ctttccccca agaccatgta ccccatctcg 420

tggctttatg acccccgatt tataatcgga gctcttgttt ttttgctcgg aatggccata 480

aacatagact cggacaagta tatacgttcc ttacgaaagc cgggagacac ggcacactat 540

tttccgcata aacggatgta caaatatgta tccagcgcca attatttcgg tgaaatattg 600

gaatggttcg gctttgccct cctatcatgg agctttgtag gccttttgtt tgcattttgg 660

acctgtgcca accttgttcc gagggcctat actataaata aaagatacag ggaagaattt 720

cctgaagaat ttgcagcctt aaaacctaag agggtatttc cttttatatt ttaa 774

<210> 2

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggagcggc tcatcttcat cttcaacatc acccagatcg tcctcttcgg cgtcggtctg 60

atctgctttg tggtgctgtt cttcgtcccg gcgggctacg gcaagatgat caacaagaag 120

tggggcttct cgttcaacaa caagatcgct tggtttttaa tggaggtgcc gactttaatc 180

accatgatcg ttttaatgtg cgtgtgggcc aagcccgaga acttcgtgcg gatcatcatc 240

ggtttattct tcgtgctgca ttacgcccag cgggtgttca tcttcccctt tttactgaag 300

ggcaagtcca agatgccgat tttaatcgtg ctgatgggca tcaccttcaa caccatcaac 360

gcctttttaa tcggtgcttg gctcttttat ttatcgccca agaccatgta cccgatctct 420

tggctgtacg acccgcgctt catcatcggt gccctcgtgt ttttactggg catggccatc 480

aacatcgact cggacaagta catccgctcg ctgcgcaagc cgggtgacac cgcccactac 540

ttcccccaca agcggatgta caagtacgtc tcctcggcca actacttcgg tgagatttta 600

gagtggttcg gcttcgcttt actgtcgtgg tcgttcgtcg gtctgctgtt tgccttctgg 660

acttgtgcca atttagtccc ccgggcctac acgatcaaca agcgctaccg cgaggagttc 720

ccggaggagt tcgccgcgct gaagccgaag cgcgtcttcc cgttcatttt ctga 774

Claims (8)

1.一株产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达5α-还原酶基因所得。

2.如权利要求1所述一株产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述5α-还原酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述一株产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌NRRLB-3683、分枝杆菌NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌、草分枝杆菌、鸟分枝杆菌。

4.如权利要求1或2所述一株产5α-AD的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD。

5.权利要求3所述一株产5α-AD的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将所述5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；

(2)将所述重组质粒pMV261-5α导入至所述分枝杆菌的感受态细胞中，构建获得产5α-AD的基因工程菌。

6.权利要求4所述一株产5α-AD的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将所述5α-还原酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-5α重组质粒；

(2)将所述重组质粒pMV261-5α导入至所述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态细胞中，构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/261-5α。

7.权利要求1-4任一所述产5α-AD的基因工程菌用于发酵制备5α-AD的用途。

8.如权利要求7所述用途，其特征在于：，所述基因工程菌发酵制备5α-AD具体如下：

将所述产5α-AD的基因工程菌经种子培养后，按5-10％的接种量接种至发酵培养基中，28-32℃，130-200r/min，pH6.5-7.8条件下，发酵4-8d；

所述发酵培养基组成如下：K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1-30g/L，余量为水，pH6.5-7.8。

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