CN115975959A - 一种细菌5α-还原酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种来源于大肠杆菌的新型5α‑还原酶基因及其应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该5α‑还原酶的重组表达菌株，以及该新型细菌5α‑还原酶在转化雄烯二酮(AD)到5α‑雄烷二酮(5α‑AD)的应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明构建的包含该新型5α‑还原酶的重组表达菌株对转化AD生成5α‑AD具有很好的效果，大大缩短了底物转化的时间，提高了转化效率，在工业生产中具有较大的应用潜力。
Description
技术领域：
本发明涉及一种来源于大肠杆菌的新型5α-还原酶基因及其应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该5α-还原酶的重组表达菌株，以及该新型细菌5α-还原酶在转化雄烯二酮(AD)到5α-雄烷二酮(5α-AD)的应用，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
甾体5α-还原酶是一种还原型辅酶Ⅱ(NADPH)依赖型酶，它能够催化一系列类固醇底物在4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成为5α-还原产物。例如，睾酮(TS)在5α-还原酶的作用下被还原成一种活性更强的甾体激素：双氢睾酮(DHT)，其在雄激素的生理调节以及人的两性分化等方面，发挥着极其重要的作用。
甾体类药物即类固醇，是机体中组成甾醇、胆酸、类固醇激素、性激素和维生素D的基本物质，对维持生命体生理功能的正常化运行具有重大意义。肿瘤、炎症等方面具有较好的疗效而被广泛应用，目前在全球市场的需求仅次于抗生素，具有广泛的市场前景。5α-AD作为合成美雄诺龙、美睾酮等数十种甾体激素类药物的关键中间体，具有重要的市场价值和研究前景。
一些化学法和生物法可用于合成重要甾体化合物5α-AD，但化学法往往伴随着反应步骤复杂、环境污染大、过程不易控制等问题。生物法因其条件温和、环境友好、专一性强等优势，已越来越受关注。但目前已发现的5α-还原酶，其对底物表现的活性并不能满足工业化生产的要求，在一定程度上限制了其应用。
大肠杆菌作为5α-AD生产菌株，具有生长迅速、营养需求简单、遗传操作简便等优点，还拥有底物代谢广泛和发酵技术成熟的优势，是最具发展潜力的高产5α-AD的菌种之一。所以本申请考虑通过同源表达策略，将筛选出的新型细菌5α-还原酶基因导入大肠杆菌中，构建一株以AD为底物生产5α-AD的重组表达菌株，通过在大肠杆菌中表达新型5α-还原酶，赋予大肠杆菌5α-还原能力，以实现从AD到5α-AD的一步生物转化。
在本发明中，新型细菌5α-还原酶来源于大肠杆菌，并通过在大肠杆菌中进行同源表达，能够得到5α-AD的高效转化菌株，为工业化生产5α-AD甾体化合物提供优良菌株。
发明内容:
本发明的目的在于克服目前工业上生产5α-AD存在的诸多问题，并提供一种来源于大肠杆菌的新型细菌5α-还原酶和表达该新型细菌5α-还原酶基因的重组表达菌株及其应用。
本发明实现上述目的的技术方案如下：本发明获得一种来源于大肠杆菌的未知功能的蛋白，经鉴定其为具有5α-还原作用的新型细菌5α-还原酶，并将其基因命名为5αE。将筛选的大肠杆菌来源的新型细菌5α-还原酶基因用CE Design进行无缝克隆引物设计(即SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)；通过PCR扩增目标基因，将该新型细菌5α-还原酶基因和质粒pET29b通过酶切，连接，构建pET29b-5αE重组质粒，将重组质粒pET29b-5αE导入至大肠杆菌的BL21(DE3)感受态细胞中，构建获得高产5α-AD的重组表达菌株BL21-pET29b-5αE，并进一步通过转化工艺优化获得高产的5α-AD。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一是：一种新型细菌5α-还原酶，所述新型细菌5α-还原酶来源于大肠杆菌，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；
进一步地，所述新型细菌5α-还原酶的编码基因5αE，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案之二是：含有5αE基因的重组质粒或重组菌株；
进一步地，所述重组质粒采用的表达载体为pET29b；
进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞为大肠杆菌；
更进一步地，所述重组菌株，是将5αE基因与pET29b载体构建重组质粒后导入大肠杆菌BL21(DE3)所得。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案之三是，上述重组质粒或重组表达菌株的应用，特别是在生产5α-还原酶中的应用，或者是在生物转化AD生成5α-AD中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之四是，SEQ ID NO.2所示5α-还原酶的应用，特别是在类固醇底物4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成为5α-还原产物中的应用，更特别地是在催化AD生成5α-AD中的应用。
有益效果：
1、本发明通过高通量菌株筛选，获得能够生产5α-AD的细菌菌株，即大肠杆菌，通过PCR扩增获得该菌株的能够生产5α-AD的基因片段，经测序为一段新的未知功能的碱基序列，鉴定为一种新型细菌5α-还原酶。
2、本发明构建的包含该新型5α-还原酶的重组表达菌株对转化AD生成5α-AD具有很好的效果，大大缩短了底物转化的时间，当底物AD浓度为3g/L时，全细胞催化9h的时候,重组菌株BL21-pET29b-5αE转化AD为5α-AD达到最大转化率89.9％，提高了转化效率。因此该新型5α-还原酶和重组表达菌株在工业生产中具有较大的应用潜力。
附图说明：
图1为本发明新型5α-还原酶的AD转化薄层层析实验结果
其中：S为5α-AD标品，1为AD转化结果。
图2为本发明新型5α-还原酶基因的PCR扩增电泳图
其中：M为DNA Marker，1为新型5α还原酶基因5αE。
图3为本发明重组质粒pET29b-5αE酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pET29b-5αE经Nde I和Sal I双酶切条带。
图4为本发明新型5α-还原酶重组菌株BL21-pET29b-5αE生长细胞转化AD效率。
图5为本发明新型5α-还原酶重组菌株BL21-pET29b-5αE全细胞催化AD效率。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明涉及的5α-还原酶来源于大肠杆菌，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示：
MGQQTFEFLLLAMSALAVIVFVALYYVRAGYGMFHTPKWGLSVNNKLGWVLMEAPVFLVMLYLWWNSSVRFDAAPFLFFLLFELHYFQRSFIFPFLMKGKSRMPLAIMLMGVVFNVLNGLMQGEWLFYLAPEGLYTDAWLSTPSFWLGVILFFIGMGINLHSDSVIRHLRKPGDTRHYLPQKGMYRYVTSGNYFGELVEWIGFAVLTCSPAAWVFVLWTFANLAPRANSIRNRYREEFGKDAVGKKKRMIPFIY
以下实施例中主要试剂：标准品5α-AD购自湖北万得化工有限公司。
实施例1：大肠杆菌来源的未知功能蛋白的鉴定
1、大肠杆菌来源的未知功能蛋白基因的获得
(1)该未知功能蛋白基因来源于一株申请人实验室筛选保存的大肠杆菌，利用试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取其基因组，其提取步骤如下：
a.从甘油管中接种并划线于含有卡那抗性的LB固体平板中，33℃静置培养12h；
b.从培养菌体的平板上挑取一单菌落接种于5mL液体LB培养基中，于200r/min，33℃条件下培养12h；
c.将培养的菌液收集于2mL微量离心管中，置于离心机中13000r/min，1min离心，弃上清液，收集菌体，重复上述步骤，直至将所需菌体收集完成。
d.向所收集的菌体中加入200μL缓冲液GA，用移液枪混匀。
e.向上述处理好的溶液中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
f.向上述管中加入220μL缓冲液GB，振荡15s，30℃放置10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
g.加入220μL无水乙醇，充分振荡15s。
h.将步骤g所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，离心30s，弃去收集柱中的液体。
i.向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，置于离心机中，13000r/min离心1min，弃去收集柱中的液体。
j.向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，置于离心机中，13000r/min离心1min，弃去收集柱中的液体。
k.重复操作步骤j
l.将吸附柱放回收集管中，13000r/min离心1min，弃去收集柱中的液体，将吸附柱置于室温以彻底晾干。
m.将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间加入50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，13000r/min离心1min，将溶液收集到离心管中，完成基因组DNA的提取。
(2)设计扩增引物如下：
上游扩增引物P1：(SEQ ID NO.3):
taagaaggagatatacatatgATGGGTCAGCAGACCTTTGAAT
下游扩增引物P2：(SEQ ID NO.4):
tgcggccgcaagcttgtcgacTTAATAAATAAACGGAATCATGCGT
上、下游引物分别引入限制性酶切位点Nde I和Sal I。
扩增模板为大肠杆菌基因组，其PCR体系如表1所示：
表1 PCR体系
扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，32℃延伸1min反应30个循环，32℃彻底延伸5min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，得到365bp的条带，用小量DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，并进行双酶切和纯化回收，得到大肠杆菌来源的未知功能的蛋白基因。经测序得知，其碱基如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、重组表达菌株的构建
(1)构建重组质粒，其过程包括：
将大肠杆菌质粒pET29b用Nde I和Sal I进行双酶切，并将酶切后的质粒进行切胶回收。将未知功能蛋白基因(SEQ ID NO.1)用CE Design进行无缝克隆引物设计；通过PCR扩增(图2)该目标基因并纯化回收，用Minerva Super Fusion Cloning Kit将酶切后的载体pET29b和SEQ ID NO.1所示基因进行连接，将连接后的产物化学转化至大肠杆菌E.ColiDH5α感受态，采用双酶切(图3)以及PCR进行验证，送基因测序公司测序测序正确的质粒即为重组质粒。
(2)构建重组表达菌株，其过程包括：
①大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备：选择大肠杆菌BL21作为宿主细胞，将该菌按1％的接种量接种至5ml LB培养基中一级培养至OD600为0.6左右,按1％接种量转接到50ml LB培养基中进行二级培养至OD600至0.4-0.6，离心收集菌体后加入0.1mmol氯化钙静置30min。离心收集菌体，加入预冷的0.1mmol的氯化钙和30％的甘油冲洗悬浮菌体，并分装保存；
②大肠杆菌热激转化法：
a.将重组质粒(加入量应少于感受态的1/10)与100μL的感受态细胞轻轻吹打混匀，置于冰上30min；
b.在42℃水浴上热激90s后立刻冰浴3min.；
c.在超净工作台内，用800μL新鲜的LB液体培养基重悬感受态，在33℃，200r/min的摇床内复苏45min-60min；
d.将复苏液于5000rpm，室温离心5min，除去上清后将剩余的100μL菌液重悬，用灭菌玻璃珠涂布到加抗生素的LB平板上，倒置在33℃培养箱中直至有合适大小的单菌落产生。
③重组子筛选与验证：
挑取阳性克隆至含卡那霉素抗性的5mL液体LB培养基中，33℃，200r/min，培养过夜，然后进行菌液PCR以及提质粒进行双酶切验证，验证正确的阳性转化子即为重组菌株。
3、大肠杆菌来源的未知功能蛋白基因的鉴定
(1)菌种活化培养:
将重组表达菌株接种于5mL液体LB培养基中，于200r/min，33℃条件下培养12h。
(2)重组表达菌株生长细胞转化实验：
将上述步骤中活化培养液按2％的接种量取1ml转接于50ml LB培养基中，在33℃，200r/min条件下摇床培养至OD600为0.6，加0.2mmol的IPTG 16℃诱导12h，将AD投入至上述培养液中，使其终浓度为3g/L，继续培养5d，完成生长细胞转化。
(3)大肠杆菌来源的未知功能蛋白基因的鉴定结果分析
上述转化实验过程中，培养5d后取样，取发酵液800μL，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，后将萃取产物超声处理30min左右，13800r/min离心10min，取2.5μL上清于硅胶板上点样进行薄层色谱法分析，点样完成后将硅胶板放入展开剂(乙酸乙酯：石油醚＝2:3)中，展开完成后用10％硫酸乙醇喷显，结果如图1所示，在5α-AD标品所示位置出现一发酵产物，其颜色与Rf值与标品均能保持一致，因此确定该产物为5α-AD。
所以通过生长细胞转化实验与薄层色谱法分析其转化结果，确定该大肠杆菌来源的未知功能蛋白基因具有将AD转化为5α-AD的5α-还原酶活力，因此确定其为一种细菌5α-还原酶，并将其编码基因命名为5αE。
4、新型细菌5α-还原酶酶活的测定
菌种培养：将步骤2-③获得的重组菌株(命名为BL21-pET29b-5αE菌株)转接于5mlLB培养基上，200r/min，33℃培养12h，按1％的接种量转接至装有50mL LB培养基中，在33℃，200r/min条件下摇床培养至OD600为0.6，加0.2mmol的IPTG 16℃诱导12h，待用。
酶活的测定：将上述培养完成的菌液置于冰上，于4℃条件下，以12000r/min，离心5min收集菌体，用50mM PBS缓冲液(pH3.2)洗2次后在重悬菌体，然后进行超声破碎(功率20％，超声3s，间隔5s，共5min)，在4℃条件下，12000r/min，离心10min，取上清液即为粗酶液。将粗酶液600μL、50mM PBS缓冲液200μL、0.6mM溶于甲醇中的AD 100μL、0.2mM NADPH100μL依次添加后快速取200μL于石英96孔板中，放入设定好参数的酶标仪上检测AD的吸光度的变化。
酶活单位定义：在30℃，pH3.2条件下，一分钟转化1μmol AD生成5α-AD所需的酶量。
酶标仪参数的设定
①振板：10s；②检测波长：254nm；③检测温度：30℃；④检测时间：每隔30s检测一次，共测10min，测得该新型细菌5α-还原酶酶活力为9.63±0.23U/mL。酶活的测定为多次平行实验，结果取平均值。
经实验证明，该新型细菌5α-还原酶酶活力高于目前文献报道的5α-还原酶酶活力。
实施例2重组表达菌株BL21-pET29b-5αE转化AD为5α-AD的生长细胞转化实验
1、菌种活化培养:
将重组表达菌株BL21-pET29b-5αE接种于5mL液体LB培养基中，于200r/min，33℃条件下培养12h。
2、重组表达菌株BL21-pET29b-5αE生长细胞转化实验：
将步骤1中活化培养液按2％的接种量取1ml转接于50ml LB培养基中，在33℃，200r/min条件下摇床培养至OD600为0.6，加0.2mmol的IPTG 16℃诱导12h，将AD投入至上述培养液中，使其终浓度为3g/L，继续培养5d，每隔12h取一次样。
所述LB培养基组成如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，其余为水。
反应结束后，用等量的乙酸乙酯超声萃取发酵液，13800r/min离心10min，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中，自然风干后加0.8mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱，流动相为甲醇：水(4：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。
结果：当底物AD浓度为3g/L时，生物转化第4天的时候，重组菌株BL21-pET29b-5αE转化AD为5α-AD达到最大转化率99.3％(图4)。
实施例3重组菌株BL21-pET29b-5αE转化AD为5α-AD的全细胞催化实验
1、菌种活化培养:
将重组菌株BL21-pET29b-5αE接种于5mL液体LB培养基中，于200r/min，33℃条件下培养12h。
2、重组菌株BL21-pET29b-5αE全细胞催化实验：
将步骤1中活化的菌种挑取单菌落至50ml LB培养基中，在33℃，200r/min的条件下培养10h。按2％的接种量转接至200ml LB培养基中，在33℃，200r/min的条件下培养OD600值至0.6。当OD600达到标准后加入0.2mmol的IPTG在16℃低温诱导12h，然后8000r/min，10min，4℃离心收集菌体，用1×PBS洗涤1-2次然后混悬在含有羟丙基β环糊精、AD和葡萄糖的转化液中形成全细胞催化体系，在30℃，200r/min培养12h，每隔3h取一次样。反应结束后，用等量的乙酸乙酯超声萃取发酵液，13800r/min离心10min，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中，自然风干后加0.8mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(4：1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为290nm。
所述全细胞催化体系组成为：羟丙基β环糊精20g/L、雄烯二酮(AD)3g/L、葡萄糖20g/L、静息细胞30g/L。
结果：当底物AD浓度为3g/L时，全细胞催化9h的时候,重组菌株BL21-pET29b-5αE转化AD为5α-AD达到最大转化率89.9％(图5)。
由上述数据可以看出，该基因具有AD的5α-还原酶活力，并且通过转化工艺的优化在很大程度上提高了AD生成5α-AD的转化效率，对于5α-AD的绿色高效的工业化生产具有重要意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种细菌来源的5α-还原酶，其特征在于，所述5α-还原其氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示。
2.权利要求1所述5α-还原酶的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
4.含有权利要求2所述5α-还原酶的编码基因的重组质粒或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，表达载体为pET29b。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。
7.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，是将5α-还原酶的编码基因与pET29b载体构建重组质粒后导入大肠杆菌BL21(DE3)所得。
8.权利要求2所述重组质粒或重组菌株的应用，其特征在于，是在生产5α-还原酶中的应用，或者是在生物转化AD生成5α-AD中的应用。
9.权利要求1所述5α-还原酶的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，是在类固醇底物4,5位双键发生还原作用，并将C-5位上的氢加成为5α-还原产物中的应用，或者是在催化AD生成5α-AD中的应用。
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