CN112813041B

CN112813041B - 一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用

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Publication number: CN112813041B
Application number: CN202011620794.3A
Authority: CN
Inventors: 李会; 许正宏; 刘伟; 史劲松; 薛苗苗; 龚劲松; 张晓梅
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112813041A

Abstract

本发明公开了一种分枝杆菌的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将分枝杆菌(Mcobacterium sp.)LY‑1的17β‑羟基类固醇脱氢酶17β‑HSDy的L173位点突变成了缬氨酸，得到突变体17β‑HSDy2，并将此突变体进行外源表达，重组菌B.Subtilis‑pMA5‑17β‑HSDy2的比酶活达到6882.45U·mg^‑1，酶活提高16.4％。本发明还提供了突变体17β‑HSDy2的增强表达菌株，以pMV261为增强表达质粒，实现了突变体17β‑HSDy2在分枝杆菌LY‑1中的增强表达，相较于原始菌株显著的降低了9α‑羟基雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮的积累，提高了睾酮积累。该增强表达菌株还可用于雄甾烯‑4‑烯‑3，17‑二酮转化睾酮的生产，具有潜在工业应用。

Description

一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用

技术领域

本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及一种来源于分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和重组菌及其应用，能将植物甾醇转化为睾酮以及将雄甾烯-4-烯-3，17-二酮转化为睾酮。

背景技术

17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)，是一类氧化还原酶，能够催化甾体中C-17的羟基与酮基之间的相互转化，反应时需要辅因子NAD(P)H/NAD(P)⁺。在生物进化的过程中，始终存在17β-HSD的表达，17β-HSD家族中酶的结构与功能也随着微生物到脊柱动物的进化而不断的分化。Marcus等人于Comamonas testosterone中发现的17β-HSD能特异性地催化从雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)到睾酮(T)的转化。而在某些嗜热酵母中17β-HSD不仅能催化AD到T，还能实现雌酮与雌二醇之间的相互转化。

早期的免疫组织实验证明17β-HSD在各种鸟类、爬行类动物和哺乳类动物中均有分布。到目前为止，高等动物中的17β-HSD酶研究较多，例如在人类的机体中，17β-HSD酶在雌激素的合成中起至关重要的作用，负责T等性激素类甾体化合物转化的17β-HSD主要分布在胎盘、卵巢、睾丸间质细胞等组织中，其中17β-HSD3仅在人类的睾丸间质细胞中得到克隆，作为睾丸间质细胞组织的一种标志酶，它同样具有催化AD到T的能力。

AD是一类较为常见的具有雄激素功能的甾醇代谢产物，一般为白色粉末，水中的溶解度低，易溶于乙酸乙酯、乙醇等有机试剂。其生物活性介于DHEA和T之间，常用作部分雄激素的合成。T是睾丸内间质细胞产生的一类雄性激素，其分子式为C₁₉H₂₆O₂，微黄色粉末，不溶于水，然而易溶于有机试剂。因此常作为雄性激素类药物，具有较强的雄激素特性，在临床方面具有广泛的应用。

因此寻找新的合适的具有高催化活性的17β-羟基类固醇脱氢酶有利于促进在生物医药领域转化甾醇的应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一株17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的工程菌株，提供该突变体的基因及包含该突变体基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，实现了17β-羟基类固醇脱氢酶的增强表达，相应的突变体进行异源表达并且能够有效转化植物甾醇实现产物组成结构的调整。该增强表达工程菌株的发酵结果显示：显著的降低了9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)的积累，提高了雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)和睾酮(T)的积累。

本发明的技术方案是：

该分枝杆菌LY-1是从自然界中土样中经分离筛选获得的一株放线菌，该菌于2016年9月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13031,分类命名为分枝杆菌(Mcobacterium sp.)LY-1。

通过对分枝杆菌LY-1全基因组测序，进行全基因注释。在通过使用美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLAST程序比对进行比对，发现一种17β-羟基类固醇脱氢酶17β-HSDy。以分枝杆菌LY-1基因组为模板，扩增17β-HSDy的目的编码基因，基因序列为SEQ ID NO.1，所述的完整的目的基因推导的17β-HSDy氨基酸序列为SEQID NO:2。

本发明的第一个目的是提供一种17β-羟基类固醇脱氢酶17β-HSDy，其核苷酸序列为以下任意一种：

a)如SEQ ID N0:1所示的碱基序列；

b)编码由如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质；

所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因来源于分枝杆菌Mycobacterium sp LY-1CGMCC No.13031。

本发明的第二个目的是提供一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体17β-HSDy2，所述突变体17β-HSDy2是在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本分枝杆菌LY-1中17β-羟基类固醇脱氢酶的基础上，对第173位的氨基酸进行了突变。

所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将第173位的亮氨酸突变成为缬氨酸。优选的，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第三个目的是提供一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，核苷酸序列为以下任意一种：

a)如SEQ ID N0:3所示的碱基序列；

b)编码由如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列或其无义突变序列组成的蛋白质。

进一步的，所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因来源于分枝杆菌Mycobacterium spLY-1CGMCC No.13031。

进一步的，本发明的第四个目的是提供一种用于编码分枝杆菌(Mcobacteriumsp.)LY-1的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的重组表达质粒，含有上述的核苷酸序列，所述重组表达质粒为pMA5-17βHSDy2或pMV261-17βHSDy2。

本发明的第五个目的是提供一株高效表达17β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌株，所述工程菌株整合有上述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，或含有17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因的重组表达质粒。

进一步的，所述工程菌株的宿主微生物为枯草芽孢杆菌WB600或分枝杆菌LY-1，分别得到17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的异源表达工程菌株、增强表达菌株。

更进一步的，所述工程菌株为枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-17βHSDy2或分枝杆菌LY-1-pMV261-17βHSDy2。

更进一步的，所述异源表达工程菌株为：枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-17βHSDy2。该突变体异源表达菌株酶活相较于对照菌株，酶活提高了16.4％。

更进一步的，所述增强表达菌株为：分枝杆菌LY-1-pMV261-17βHSDy2。所述的增强表达菌株可显著降低植物甾醇发酵生成9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮的产量，提高睾酮的产量。

本发明的第六个目的是提供该工程菌株或/和其分泌表达的粗酶液，在制备睾酮中的应用，所述制备睾酮的方法为将植物甾醇和/或雄甾烯-4-烯-3，17-二酮转化为睾酮。

进一步的，所述制备睾酮的方法为：将所述工程菌株或/和其分泌表达的粗酶液转接至含15g/L植物甾醇和/或1.5g/L雄甾烯-4-烯-3，17-二酮的培养基中，30℃，220r·min^-1转化7d，得到睾酮。

本发明的第六个目的是提供由上述的制备睾酮的方法制备得到的睾酮。

有益效果：本发明通过对分枝杆菌LY-1的基因进行注释，挖掘到一种17β-羟基类固醇脱氢酶。并对该酶进行分子对接模拟确定该酶的活性中心氨基酸并进行突变，所获得的突变体17β-HSDy2在枯草芽孢杆菌中异源表达，酶活提高了16.4％。此外，本发明构建的分枝杆菌LY-1增强表达菌株可显著降低植物甾醇发酵生成9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮的产量，提高睾酮的产量，具有潜在的工业生产应用。

附图说明：

图1为不同17β-羟基类固醇脱氢酶突变体在枯草芽孢杆菌中异源表达的酶活比较。

具体实施方式

本发明将分枝杆菌(Mcobacterium sp.)LY-1的17β-羟基类固醇脱氢酶17β-HSDy的L173位点突变成了缬氨酸，得到突变体17β-HSDy2，并将此突变体进行了外源表达，重组工程菌株B.Subtilis-pMA5-17β-HSDy2的比酶活达到6882.45U·mg^-1，酶活相较于未突变酶提高了16.4％。本发明还提供了突变体17β-HSDy2的增强表达菌株，以pMV261为增强表达质粒，实现了突变体17β-HSDy2在分枝杆菌LY-1中的增强表达，相较于原始菌株，显著的降低了9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)的积累，提高了睾酮(T)的积累。该增强表达菌株还可用于雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)转化睾酮(T)的生产，具有潜在的工业应用。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

(1)培养基：

LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 5.0g/L。

分枝杆菌LY-1植物甾醇转化培养基：植物甾醇(底物)15.0g/L，NaNO₃ 5.4g/L，(NH₄)₂HPO₄ 0.6g/L，玉米浆20.0g/L，葡萄糖40g/L，pH 8.0。

(2)17β-羟基类固醇脱氢酶及其突变体的酶活测定

将含有0.3mmol·L^-1底物AD 2％甲醇溶液与1mL含有1.5mmol·L^-1NADPH的50mmol·L^-1磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)混合，并置于30℃金属浴中保温，随后加入500μL破碎后上清粗酶液，置于对应温度的金属浴中反应5min，记录OD340变化。

酶活：将每分钟催化反应消耗1μmol NADPH所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。其中，εNADPH＝6.22L·(mmol·cm)^-1。

实施例1：分枝杆菌LY-1中17β-HSDy基因的挖掘、克隆

(1)：分枝杆菌LY-1中17β-HSDy基因的挖掘

根据分枝杆菌LY-1的全基因注释结果的最终测序分析报告。得到了一个17β-HSD基因，命名为17β-HSDy。通过Blast比对17β-HSDy序列，确认存在序列高度一致的编码17β-HSD酶的DNA序列，基因序列如SEQ ID NO:1所示，完整的目的基因推导的17β-HSDy2氨基酸序列为SEQID NO:2。

(2)：分枝杆菌LY-1的17β-HSDy基因的克隆

引物F：aaagtgaaatcagggggatccATGGAGATCGAAGGCAAGAAGG

引物R：atttcgacctctagaacgcgtCTACACCACCACCACCACCACCTTGGGGGCGAACCG

以分枝杆菌LY-1基因组为模板，用上述引物pcr扩增17β-HSDy的编码基因。PCR反应在25μL的体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min后开始循环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸l min，共34个循环；72℃终延伸l0 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。

实施例2：不同活性位点的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的异源表达

(1)：未突变的17β-HSDy的异源表达重组表达质粒及工程菌的构建

选用一步克隆试剂盒构建重组枯草芽孢杆菌的质粒pMA5-17β-HSDy。

将构建成功的重组表达质粒通过化学转化法转化入枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含有50mg/L的卡那霉素的LB培养基过夜培养，挑取阳性转化子，获得未突变的异源表达重组枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-17β-HSDy。

(2)：分枝杆菌LY-1来源17β-羟基类固醇脱氢酶晶体结构模拟

以已报道的来自Burkholderia thailandensis E264的3-羟酰基辅酶A脱氢酶(PDB code：4XGN)为模板(两者氨基酸相似度为47.41％)，利用分子模拟对接软件Autodock，模拟底物雄甾烯-4-烯-3，17-二酮与17β-HSDy的对接，选择该酶第173位亮氨酸为本研究的17β-HSDy的活性位点。

(3)：17β-羟基类固醇脱氢酶活性位点突变对酶活表达的影响

利用定点突变试剂盒，设计引物L173-F，L173-R如表1所示，以已经构建的pMA5-17β-HSDy为模板，进行PCR，17β-羟基类固醇脱氢酶的第173位亮氨酸分别替换为异亮氨酸，丙氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸。PCR反应条件为：95℃3min，34个循环(95℃30S、58℃30S、72℃1.5min)，72℃10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各1μL，Prime Star Max(Premix)DNA20μL，ddH₂O 17μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。将其转化到感受态E.coil JM109，涂布氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，再转入枯草芽孢杆菌WB600，得到定点突变的重组菌株。

表1引物序列

L173代表无突变。

L173I代表将位置173的氨基酸由亲本的亮氨酸(LEU，L)替换为异亮氨酸(Ile，I)，

L173A代表将位置173的氨基酸由亲本的亮氨酸(LEU，L)替换为丙氨酸(Ala，A)，

L173V代表将位置173的氨基酸由亲本的亮氨酸(LEU，L)替换为缬氨酸(Val，V)，

L173Q代表将位置173的氨基酸由亲本的亮氨酸(LEU，L)替换为谷氨酰胺(Gln，Q)，

L173G代表将位置173的氨基酸由亲本的亮氨酸(LEU，L)替换为甘氨酸(Gly，G)，

将发酵生长良好的不同突变体重组菌WB600s-pMA5-17β-HSDy进行超声细胞破碎，超声细胞破碎20min，8000rpm离心20min，取上清制得粗酶液。将上清粗酶液用于酶活测定。不同突变体的酶活如图1所示，其中突变体3的酶活最高，即将17β-羟基类固醇脱氢酶的第173位亮氨酸突变为缬氨酸，其酶活达到了6882.45U·mg^-1，酶活相较于原始17β-HSDy提高了16.4％。

实施例3：增强表达重组工程菌株的构建

(1)：增强表达质粒pMV261-17βHSDy2的构建

引物P1：CGGGATCCCGGAGGAATCACTTCGCAATGGAGATCGAAGG

引物P2：GGAATTCCTACTTGGGGGCGAACCGCTGACCGGC

以突变体酶活最高的WB600-pMA5-17β-HSDy2质粒为模板，用上述引物pcr扩增17β-HSDy2突变体的编码基因。PCR反应在25μL的体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min后开始循环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸l min，共34个循环；72℃终延伸l0 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。

(2)分枝杆菌LY-1感受态的制备

挑取活化好的分枝杆菌LY-1单克隆50mL种子培养基(酵母粉15.0g/L，(NH₄)₂HPO₄0.6g/L，NaNO₃ 5.4g/L，甘油2.0g/L)中，30℃振荡36-48h后转接至感受态培养基。将于感受态培养基中培养的种子液于4℃静置30min，4000rpm离心10min后弃上清。在无菌条件下取3mL预冷的10％甘油溶液将沉菌充分悬浮后冰上静置3min，4000rpm离心10min收集菌体沉淀。重复上述步骤三次后，菌体悬浮于3mL 10％甘油溶液中，按100μL/1.5mL EP管分装，于-80℃保存。

(3)分枝杆菌LY-1感受态细胞的电转化

将得到的片段经快切酶BamH I与EcoR I双酶切，目的DNA片段回收纯化后，与同样经限制性内切酶酶切过的质粒pMV261在T4 DNA连接酶的作用下，16℃过夜连接，将连接完的质粒利用化学转化法，转化大肠杆菌E.coil JM109，涂布于带有卡那霉素的LB平板上，挑取阳性转化子，并进行测序验证。提取pMV261-17β-HSDy2质粒转化分枝杆菌LY-1感受态，具体操作如下：

将-80℃冰箱中拿出的分枝杆菌LY-1的感受态置于冰上融化后，加入约2μg增强表达质粒pMV261-17βHSDy2置于4℃冰浴30min。将EP管中的全部液体于超净台中转入电极杯，将电极杯放置在电转仪中，2.5kV电击2次后于冰上静置3min；加入800μL新鲜种子培养基(酵母粉15.0g·L^-1，(NH₄)₂HPO₄ 0.6g·L^-1，NaNO₃ 5.4g·L^-1，甘油2.0g·L^-1)充分悬浮底部细胞后，将全部液体转移至无菌离心管；置于30℃往复式摇床120rpm振荡培养3-4h，以6000rpm离心5min后弃上清。充分悬浮底部细胞后全部涂布在带有卡那霉素的LB平板上，固体平板置于30℃恒温培养箱培养7天，挑取阳性转化子，并进行测序验证。

实施例4：增强表达重组工程菌株的发酵验证

将重组菌LY-1-pMV261-17βHSDy2进行植物甾醇的转化实验，其中野生分枝杆菌LY-1为对照，发酵7d结束。具体的实验方法即制备睾酮的方法为：将相应的工程菌株转接至含15g/L植物甾醇的培养基中，30℃，220r·min^-1转化7d，得到睾酮。同理，此处的工程菌株还可以替换为该工程菌株经破碎等处理后得到的粗酶液进行底物转化。

分枝杆菌转化产物的萃取：取0.5mL发酵液，放入2.0mL烘干至恒重的离心管中，加入1.0mL乙酸乙酯萃取，1500rpm低于30℃震荡20-30min，静置分层后转移上清至5mL EP管，重复上述步骤3～4遍，合并上层乙酸乙酯，氮气将液体挥发干后加入4mL HPLC级乙腈复溶，过0.22μm有机滤膜后注入进样瓶中，用于高效液相检测。

HPLC检测条件为色谱柱：Agilent TC-C18，5μm，4.6×250mmol·L^-1；流动相为V甲醇：VH2O＝7：3(v/v)；紫外吸收波长：254nm；柱温：30℃；流速：0.5mL·min^-1；进样量：10μL。产物相关的计算公式如下：

C1，标样浓度(g·L^-1)；Cd，底物浓度(g·L^-1)；Cc，产物浓度(g·L^-1)；P1，标样HPLC检测图谱峰面积；Pc，产物HPLC检测图谱峰面积；D，样品的稀释倍数；Mc，产物摩尔质量；Md，底物摩尔质量。

菌株发酵产物浓度如表2所示，可以看出，强化表达突变体17β-HSDy2即LY-1-pMV261-17βHSDy2对分枝杆菌LY-1降解植物甾醇的影响，对照于原始菌株分枝杆菌LY-1，显著的降低了9α-羟基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)的积累，提高了雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)和睾酮(T)的积累，尤其是大大提到了T的浓度，相较于原始菌株，T的浓度提高了约30倍。

表2菌株发酵产物浓度

实施例5：增强表达菌株转化AD生成T

通过往培养基中添加底物AD，并且添加助溶剂，使其终浓度达到1.5g/L。在增强表达菌株分枝杆菌LY-1-pMV261-17βHSDy2发酵7天，停止发酵。取0.5mL发酵液，放入2.0mL烘干至恒重的离心管中，加入1.0mL乙酸乙酯萃取，1500rpm低于30℃震荡20-30min，静置分层后转移上清至5mL EP管，重复上述步骤3～4遍，合并上层乙酸乙酯，氮气将液体挥发干后加入4mL HPLC级乙腈复溶，过0.22μm有机滤膜后注入进样瓶中，用于高效液相检测。

通过液相检测结果分析，结果如表3所示，表达菌株LY-1-pMV261-17βHSDy和增强表达菌株分枝杆菌LY-1-pMV261-17βHSDy2都能够利用AD，产生T，说明17βHSDy在分枝杆菌LY-1中实现了增强表达，而经过点位突变后的增强表达菌株分枝杆菌LY-1-pMV261-17βHSDy2的转化率得到了进一步的提升，相较于未突变增强表达菌株的转化率提高了70％。

表3 AD生成T的转化率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种分枝杆菌的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体和工程菌及其应用

<141> 2020-12-31

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 分枝杆菌LY-1()

<400> 1

atggagatcg aaggcaagaa ggcgatcgtc gtcggcggcg cgtccggctt tggccgcgcg 60

accgccgagg cgttggccaa gcggggcgcc agcgtggctg tgctggaccg gccgcaatcc 120

aagggccagg aagtggccga cgcgatcggc ggctcgttct tcgccgtcga cgtcacggac 180

ttcgacggta ccgaaaaggt gctggaagag gccgtcgcgg cgctgggtgg tctgcacatc 240

atcgtgacca ccgcaggtgg cggcatcggc gagcgcacca tcaagaagga cggcccgcac 300

agcctggatt cgttccgttc caccatcgac ctcaacctca tcggcacgtt caacatcagc 360

cggctggcgg cgtggcacat gagcaagaac gagccggtcg acgccgaggc cgaggagcgc 420

ggcgtcatca tcaacaccgc ctcgatcgcc gcgttcgagg gccagatcgg tcaggtcgcc 480

tacaccgcgt ccaaggccgc gatcgccggc atgtgcctga ccatggcgcg cgacctgggc 540

agtctgggaa tccgcgtgct ggccatcgcg ccgagcctgt tcgccaccgg tctgaccgag 600

ggcattcccg acgagttcgc cgcggtgctg accaaggacg ccgcgttccc caagcgtctg 660

ggcaagcccg aggagtacgc caagctcgcc gtggcgatcg ccgagaacgc gatgctcaac 720

ggccagtgtc tgcgtttgga cgccggtcag cggttcgccc ccaagtag 768

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 分枝杆菌LY-1()

<400> 2

Met Glu Ile Glu Gly Lys Lys Ala Ile Val Val Gly Gly Ala Ser Gly

1 5 10 15

Phe Gly Arg Ala Thr Ala Glu Ala Leu Ala Lys Arg Gly Ala Ser Val

20 25 30

Ala Val Leu Asp Arg Pro Gln Ser Lys Gly Gln Glu Val Ala Asp Ala

35 40 45

Ile Gly Gly Ser Phe Phe Ala Val Asp Val Thr Asp Phe Asp Gly Thr

50 55 60

Glu Lys Val Leu Glu Glu Ala Val Ala Ala Leu Gly Gly Leu His Ile

65 70 75 80

Ile Val Thr Thr Ala Gly Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Ile Lys Lys

85 90 95

Asp Gly Pro His Ser Leu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ile Asp Leu Asn

100 105 110

Leu Ile Gly Thr Phe Asn Ile Ser Arg Leu Ala Ala Trp His Met Ser

115 120 125

Lys Asn Glu Pro Val Asp Ala Glu Ala Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile

130 135 140

Asn Thr Ala Ser Ile Ala Ala Phe Glu Gly Gln Ile Gly Gln Val Ala

145 150 155 160

Tyr Thr Ala Ser Lys Ala Ala Ile Ala Gly Met Cys Leu Thr Met Ala

165 170 175

Arg Asp Leu Gly Ser Leu Gly Ile Arg Val Leu Ala Ile Ala Pro Ser

180 185 190

Leu Phe Ala Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ile Pro Asp Glu Phe Ala Ala

195 200 205

Val Leu Thr Lys Asp Ala Ala Phe Pro Lys Arg Leu Gly Lys Pro Glu

210 215 220

Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Val Ala Ile Ala Glu Asn Ala Met Leu Asn

225 230 235 240

Gly Gln Cys Leu Arg Leu Asp Ala Gly Gln Arg Phe Ala Pro Lys

245 250 255

<210> 3

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggagatcg aaggcaagaa ggcgatcgtc gtcggcggcg cgtccggctt tggccgcgcg 60

accgccgagg cgttggccaa gcggggcgcc agcgtggctg tgctggaccg gccgcaatcc 120

aagggccagg aagtggccga cgcgatcggc ggctcgttct tcgccgtcga cgtcacggac 180

ttcgacggta ccgaaaaggt gctggaagag gccgtcgcgg cgctgggtgg tctgcacatc 240

atcgtgacca ccgcaggtgg cggcatcggc gagcgcacca tcaagaagga cggcccgcac 300

agcctggatt cgttccgttc caccatcgac ctcaacctca tcggcacgtt caacatcagc 360

cggctggcgg cgtggcacat gagcaagaac gagccggtcg acgccgaggc cgaggagcgc 420

ggcgtcatca tcaacaccgc ctcgatcgcc gcgttcgagg gccagatcgg tcaggtcgcc 480

tacaccgcgt ccaaggccgc gatcgccggc atgtgcgtga ccatggcgcg cgacctgggc 540

agtctgggaa tccgcgtgct ggccatcgcg ccgagcctgt tcgccaccgg tctgaccgag 600

ggcattcccg acgagttcgc cgcggtgctg accaaggacg ccgcgttccc caagcgtctg 660

ggcaagcccg aggagtacgc caagctcgcc gtggcgatcg ccgagaacgc gatgctcaac 720

ggccagtgtc tgcgtttgga cgccggtcag cggttcgccc ccaagtag 768

<210> 4

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Glu Ile Glu Gly Lys Lys Ala Ile Val Val Gly Gly Ala Ser Gly

1 5 10 15

Phe Gly Arg Ala Thr Ala Glu Ala Leu Ala Lys Arg Gly Ala Ser Val

20 25 30

Ala Val Leu Asp Arg Pro Gln Ser Lys Gly Gln Glu Val Ala Asp Ala

35 40 45

Ile Gly Gly Ser Phe Phe Ala Val Asp Val Thr Asp Phe Asp Gly Thr

50 55 60

Glu Lys Val Leu Glu Glu Ala Val Ala Ala Leu Gly Gly Leu His Ile

65 70 75 80

Ile Val Thr Thr Ala Gly Gly Gly Ile Gly Glu Arg Thr Ile Lys Lys

85 90 95

Asp Gly Pro His Ser Leu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ile Asp Leu Asn

100 105 110

Leu Ile Gly Thr Phe Asn Ile Ser Arg Leu Ala Ala Trp His Met Ser

115 120 125

Lys Asn Glu Pro Val Asp Ala Glu Ala Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile

130 135 140

Asn Thr Ala Ser Ile Ala Ala Phe Glu Gly Gln Ile Gly Gln Val Ala

145 150 155 160

Tyr Thr Ala Ser Lys Ala Ala Ile Ala Gly Met Cys Val Thr Met Ala

165 170 175

Arg Asp Leu Gly Ser Leu Gly Ile Arg Val Leu Ala Ile Ala Pro Ser

180 185 190

Leu Phe Ala Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ile Pro Asp Glu Phe Ala Ala

195 200 205

Val Leu Thr Lys Asp Ala Ala Phe Pro Lys Arg Leu Gly Lys Pro Glu

210 215 220

Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Val Ala Ile Ala Glu Asn Ala Met Leu Asn

225 230 235 240

Gly Gln Cys Leu Arg Leu Asp Ala Gly Gln Arg Phe Ala Pro Lys

245 250 255

Claims

1.一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体为17β-HSDy2，是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本分枝杆菌LY-1的17β-羟基类固醇脱氢酶的第173位亮氨酸突变为缬氨酸得到的。

3.如权利要求2所述的一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因来源于分枝杆菌（Mycobacterium sp.） LY-1 CGMCC No.13031。

4.一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，其特征在于：核苷酸序列为以下任意一种：

如SEQ ID NO.3所示的碱基序列；

编码如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的核苷酸序列。

5.一种携带权利要求4所述基因的重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒为pMA5-17βHSDy2或pMV261-17βHSDy2。

6.一株表达17β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株整合有权利要求4所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，或含有权利要求5所述的重组表达质粒。

7.根据权利要求6所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株为枯草芽孢杆菌WB600或分枝杆菌LY-1。

8.权利要求6所述的工程菌株和/或该工程菌株分泌表达的粗酶液在制备睾酮中的应用，其特征在于，所述制备睾酮为将植物甾醇和/或雄甾烯-4-烯-3，17-二酮转化为睾酮。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述工程菌株和/或该工程菌株的粗酶液转接至含15 g/L植物甾醇和/或1.5 g/L雄甾烯-4-烯-3，17-二酮的培养基中，30°C，220r·min^-1转化7 d，得到睾酮。