CN113528606B

CN113528606B - 一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法

Info

Publication number: CN113528606B
Application number: CN202110829847.0A
Authority: CN
Inventors: 原犇犇; 陶荣盛; 潘震华; 沈青; 胡海亮; 沈正权; 孙梁栋; 朱傅赟; 郑云; 刘萍
Original assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-22
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-07-22
Also published as: CN113528606A

Abstract

本发明提供了一种利用羰基还原酶制备17β‑羟基类固醇的方法，包括如下步骤：以17–酮基类固醇为底物，使用羰基还原酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化还原反应，得到17β‑羟基类固醇。

Description

一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及一种利用羰基还原酶催化制备17β-羟基类固醇的方法。

背景技术

甾体药物中最主要的是甾体激素药物，临床上广泛应用于治疗心血管疾病、肿瘤、支气管哮喘、风湿性关节炎以及湿疹等皮肤病，还用在避孕安胎以及减肥等领域。我国已把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期发展的方向和重点之一。17β-羟基类固醇是甾体化合物17位C原子连接β羟基的一类化合物，其中有许多物质是一些重要的甾体激素类药物及潜在药物，比如睾酮(17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮)、宝丹酮(17β-羟基-1,4-雄甾二烯-3-酮)等，它们在医药市场上的需求量逐年上升。

目前，17β-羟基类固醇主要通过化学法合成，通常以醇羟基甾体化合物为起始物，经过基团保护、还原、水解等多步化学反应得到。期间用到大量的保护剂、硼氢化物和酸，废水量大，副反应多，杂质含量高，产品收率低，环保和成本压力越来越大，急需开发出更高效环保的制备方法。

近年来，生物催化法制备17β-羟基类固醇的研究取得了较大进展。例如，专利文献CN109486738A公开了采用表达17β-羟基类固醇脱氢酶的大肠杆菌转化ADD为宝丹酮，以甲基化-β-环糊精为助溶剂，产量为872.9mg/L。CN109971817A公开了采用简单节杆菌和表达17β羰基还原酶的酵母工程菌转化4-AD制备宝丹酮，以羟丙基-β-环糊精作为底物助溶剂，产量达到7.7g/L，转化率为77％。CN105483199A公开了采用自制的两种羰基还原酶转化雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮制备17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮，以聚乙二醇辛基苯基醚为助溶剂，底物浓度在30g/L左右，转化率最高可以达到93.7％。CN106011158A公开了采用表达17β-羟基类固醇脱氢酶和羰基还原酶的解脂耶氏酵母全细胞转化4-AD生产睾酮，以甲基化-β-环糊精为助溶剂，睾酮浓度可以达到14.3g/L。CN109306342A公开了采用表达17β-羟基甾体脱氢酶的静息细胞转化4-AD制备睾酮，以吐温80为助溶剂，底物浓度为5g/L，产率为95％。CN112852767A公开了一系列羰基还原酶突变体，这些突变体和葡萄糖脱氢酶共表达的菌体可用于制备一些17β-甾体化合物，多以甲醇、乙醇、异丙醇为助溶剂，转化率均可达到96％，但底物浓度均不高于25g/L。CN111454919A公开了采用表达人来源的17β羟基类固醇羟化酶3突变体的工程菌，以甲基化-β-环糊精为助溶剂，转化4-AD可以得到3.95g/L的睾酮。可以看出，虽然生物催化法天然的具有产物光学纯度高，副反应少，操作简单，环保等优点，但现有技术普遍存在投料浓度低的问题，转化率也较低，不能满足工业化生产的要求，无法替代化学法。

发明内容

为了探索生物催化法制备17β-羟基类固醇的工业化可行性，发明人选择羰基还原酶作为研究对象，从众多微生物来源的羰基还原酶中筛选出能够用于两种以上17β-羟基类固醇制备的通用型品种并进行改良。具体而言，本发明包括如下技术方案。

一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法，包括如下步骤：

以17–酮基类固醇为底物，使用羰基还原酶SEQ ID NO:1或者其突变体SEQ ID NO:3催化还原反应，得到17β-羟基类固醇。

上述17–酮基类固醇选自下组：雄甾-4-烯-3,17-二酮，5α-雄甾烷-3，17-二酮，雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮，1,4-雄甾二烯-3,17-二酮，19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-1-烯-3,17-二酮，雌酮，去氢表雄酮，表雄酮，9α-羟基-4-烯-3,17-雄甾二酮，雄甾-4-烯-3,11,17-三酮，雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮，19-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮。

其中，野生型羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MTDRLKGKVAIVTGGTLGIGLAIADKFVEEGAKVVITGRHADVGEKAAKSIGGTDVIRFVQHDASDEAGWTKLFDTTEEAFGPVTTVVNNAGIAVSKSVEDTTTEEWRKLLSVNLDGVFFGTRLGIQRMKNKGLGASIINMSSIEGFVGDPTLGAYNASKGAVRIMSKSAALDCALKDYDVRVNTVHPGYIKTPLVDDLEGAEEMMSQRTKTPMGHIGEPNDIAWICVYLASDESKFATGAEFVVDGGYTAQ(SEQ ID NO:1)；

所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MTNRLKSKVAIVTGGTQGIGLAIADKFVEEGAKVVITGRRADVGEKAAKSIGGTDVIRFVQHDVSDEAGWTKLFDTTEEAFGPVTTVVNNAGISLPKSLEDTTTEEWHKLLSVNLDGVFFGTRLGIRRMKNKGLGASIINMSSISGIVGDPMLGAYNASKGAVRIMSKSAALDCAVKDYDVRVNTVHPGAIKTPLTDKWPAGGEMRSQRTKTPMGHIGEPNDVAWVCVYLASDESKFATGSEFVVDGGYTAQ(SEQ ID NO:3)。

优选地，上述17–酮基类固醇选自下组：4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮。相应地，反应产物17β-羟基类固醇选自下组：睾酮、宝丹酮、17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮、17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮。

在一种优选的实施方式中，反应体系中添加有异丙醇和辅酶NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，辅酶II)，以便促进还原反应。例如，NADP+的作用是，作为氧化剂掠夺电子，羰基还原酶利用异丙醇将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH作为生物合成的还原剂，从而促进还原反应。

反应体系中添加异丙醇的优点在于：异丙醇既作为反应物，又可兼做助溶剂来促进底物溶解。众所周知，甾体类底物水溶性差，添加助溶剂可以促进该底物溶解，从而加快反应速度。添加有机溶剂异丙醇作为助溶剂，其助溶效果好，且便于回收利用，从而使得底物投料浓度和转化率均大幅提升。本发明发现，羰基还原酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ IDNO:3具备耐溶剂的特点，这一独特优势在很大程度上方便了生物催化反应过程上下游的操作。

在另一种实施方式中，反应可以在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+的存在下进行。

上述反应温度可以为25-45℃。

优选地，上述羰基还原酶SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3呈其表达微生物菌体形式。

本发明的第二个方面提供了一种羰基还原酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。该羰基还原酶是SEQ ID NO:1的突变体，可将多种17-位是酮基的甾体化合物还原为17β-羟基类固醇。

本发明的第三个方面提供了一种微生物，其表达上述的羰基还原酶SEQ ID NO:1或其突变体SEQ ID NO:3。

上述微生物可以选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

在一种优选的实施方式中，上述微生物还可以同时表达葡萄糖脱氢酶。该微生物用于包含葡萄糖的反应体系，其中葡萄糖作为葡萄糖脱氢酶的底物。反应时，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化，同时将NADP⁺还原为NADPH，从而促进羰基还原酶催化的还原反应。

本发明的第四个方面提供了上述微生物在生产17β-羟基类固醇中的用途。

本发明提供的羰基还原酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3能够促进至少4种17-酮基甾体化合物(包括4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮)的酮基还原反应，得到相应的17β-羟基类固醇，体现出一定的底物普适性即底物广谱性，有利于生物催化法生产17β-羟基类固醇的工业化开发。

具体实施方式

为了寻找能够将两种以上17-位是酮基的甾体化合物还原为羟基的通用型还原酶，发明人对于具有酮基还原功能的酶类进行了广泛筛选，尤其是羰基还原酶或称酮还原酶(KRED)。

上述“17-位是酮基的甾体化合物”或者“17-酮基甾体化合物”在本文中还可简称为“17–酮基类固醇”。

本领域技术人员容易理解，同一种酶蛋白有可能具有不同的功能，因而可以归类于不同的酶种类。比如，发明人从众多微生物来源的还原酶中筛选出来的开菲尔乳杆菌Lactobacillus kefiri来源的野生型羰基还原酶(NCBI登陆号：WP_054768785.1)还具有葡萄糖1-脱氢酶(glucose 1-dehydrogenase)的功能，同样可归类为葡萄糖脱氢酶(GDH)；同时还具有3-beta-羟基类固醇脱氢酶(3-beta hydroxysteroid dehydrogenase)功能。

发明人意外地发现，Lactobacillus kefiri来源的野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1是个双功能酶，既有羰基还原酶功能，还兼具催化NADPH再生的葡萄糖脱氢酶功能，这一特点使得它呈现出多种用途从而用于多种氧化/还原反应，例如在将反应底物上的酮基还原为羟基的同时，能够催化反应体系中的异丙醇氧化为丙酮，同时将NADP+还原为NADPH。

在本发明中，术语“野生(型)羰基还原酶”、“野生酮基还原酶”表示相同的意义，都是指野生型的羰基还原酶或称酮还原酶(SEQ ID NO:1)。

相对应地，术语“羰基还原酶突变体”、“突变体羰基还原酶”、“突变羰基还原酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指羰基还原酶的突变体。为简要起见，有时为了表述方便起见，在本发明中可以将野生型羰基还原酶与其突变体统称为“羰基还原酶”，只要不与野生酶SEQ ID NO:1混淆即可。

野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1与其突变体SEQ ID NO:3的优点在于具有底物普适性(或称底物广谱性)，它们能够促进多种17-酮基甾体化合物的酮基还原反应，例如分别将4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮还原为睾酮、宝丹酮、17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮、17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮。

为描述简便起见，在本文中有时将“羰基还原酶”简称为“KRED”，它们表示相同的意义，可以互换使用。有时将“葡萄糖脱氢酶”简称为“GDH”，它们表示相同的意义，可以互换使用。

本发明的羰基还原酶突变体的氨基酸数量只有252个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

为了在微生物宿主例如基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达羰基还原酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3，本发明对其表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

经过密码子优化，野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2，而羰基还原酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

当作为生物催化剂用于制备17β-羟基类固醇时，本发明的羰基还原酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

生物催化领域公知，与游离酶法相比，应用固定化酶技术具有生产过程简化、生产效率提高等优点。同时，由于酶可多次使用，且酶的稳定性提高，从而有效提高了单位酶的生产力；其次，固定化酶极易与底物、产物分开，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。

本领域技术人员容易理解，菌体本身就是一种天然的酶固定化形式，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

另一方面，相比分离出的酶的催化，本发明利用微生物的简单发酵就可以源源不断、取之不尽地提供酶或的供应，无需进一步提取、纯化分离酶等操作，经济效益明显，为工业化应用创造条件。

在一种实施方式中，本发明的羰基还原酶(KRED)可以与葡萄糖脱氢酶(GDH)联用，用于催化甾体化合物上17-位的酮基还原为羟基。其中葡萄糖脱氢酶用于催化葡萄糖氧化，同时将NADP⁺还原为NADPH，从而再生NADPH。因此，可以将羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶在同一个微生物细胞中共表达，构建出羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶共表达重组菌体。利用微生物的简单发酵就可以同时地、按比例地提供两种酶，无需根据两种酶的酶活力进行比例调整。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min；

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；

4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮、睾酮、宝丹酮、17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮、17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮的标准品均购自国药集团化学试剂有限公司。

17β-羟基类固醇的HPLC检测条件：

检测仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪

流动相：乙腈：水＝55:45(v/v)

色谱柱：SB-C18(250*4.6*5)

进样量5μl流速：1.0ml/min

检测波长：241nm

柱温：30℃

4-雄烯二酮保留时间：10.4min

睾酮保留时间：8.6min

1,4-雄烯二酮保留时间：10.4min

宝丹酮保留时间：8.2min

雌甾-4,9-二烯-3，17-二酮保留时间：13.2min

17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮保留时间：9.4min

19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮保留时间：8.5min

17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮保留时间：7.2min。

实施例1：构建表达野生型羰基还原酶的重组大肠杆菌

根据开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri，Lentilactobacillus kefiri)来源的羰基还原酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1(NCBI登陆号：WP_054768785.1)，进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID NO:2。全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点NdeI和BamHI，并亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-KRED。将构建好的重组质粒pET24a-KRED用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-KRED。

实施例2：易错PCR和随机突变库的构建

以羰基还原酶基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。设计引物如下：

正向引物KREDerr-F：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC-3’；

反向引物KREDerr-R：5’-GACGGAGCTCGAATTCGGAT-3’。

100μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板，各0.2μM一对引物KREDerr-F和KREDerr-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0.2mM,0.3mM,0.4mM)MnCl₂，1U Taq。

PCR反应条件为：95℃，5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，40个循环；72℃7min。胶回收1kb随机突变片段作为大引物，用KOD FX neo DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃，2min，98℃10s，55℃30s，68℃30s，25个循环；68℃10min。

在PCR产物中加入DpnI，于37℃消化，去除质粒模板，纯化回收后电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，加入1mL LB培养基，37℃复苏1h，涂布Kan平板37℃培养过夜，得到超过2×10³个克隆的随机突变体库。

实施例3：随机突变体库的筛选

在96孔板上每个孔中加入300μl LB培养基(灭菌，含终浓度100mg/L的硫酸卡那霉素和0.3mM的IPTG)，挑取各单菌落接种96孔板，37℃摇床250rpm培养8h，降温到30℃培养过夜。3000rpm离心20分钟，去掉上清，加入200μl反应液(反应液成分：4-雄烯二酮50g，异丙醇200mL，20mM pH 7.0磷酸钾缓冲液定容到900mL，用NaOH溶液调至pH 7.0，加NADP⁺0.04g，用同样的缓冲液定容到1L)。30℃摇床250rpm反应8h，取样1μl反应液点板，TLC板：上邦新材料有限公司，涂层厚度：0.2-0.25mm，展开剂：乙酸乙酯：石油醚＝6：4，在254nm紫外灯下观察。根据点板分析，筛选反应斑点特征明显的突变体，用于进一步考察和进一步突变。

重复实施例2和实施例3进行共4轮实验，不同的是，第4轮突变库筛选的反应液采用点板分析和HPLC检测结合的方式。最终筛选发现其中一株突变菌株编号2-G3催化4-雄烯二酮的转化最为彻底，反应液经液相检测，转化率为99.1％。相比野生型羰基还原酶SEQ IDNO:1表达菌株BL21(DE3)/pET24a-KRED催化反应的转化率20.0％，提示突变株2-G3催化4-雄烯二酮还原反应的能力提高了近4倍。

委托金斯瑞对突变菌株2-G3进行基因组测序比对，该菌株基因组中的羰基还原酶基因序列为SEQ ID NO:4，确认其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

下文中，也可将该突变的羰基还原酶简称为“2-G3”

实施例4：羰基还原酶突变体2-G3的发酵

将羰基还原酶菌种2-G3培养液接种摇瓶(蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，三水磷酸氢二钾16.43g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，1000ml培养基装入到5L摇瓶，121℃灭菌20min)，摇床37℃培养至OD600＝5时，降温至30℃，加入终浓度0.03mM IPTG(已过滤除菌)溶液诱导产生酶，继续培养16小时。发酵液4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻保藏，得到胞内含有羰基还原酶突变体2-G3的菌体，备用。

经发酵培养的2-G3菌体无需破胞进行粗酶提取/纯化，就可以直接作为固定化酶用于生物催化反应。

按照相同的方法，对野生型羰基还原酶表达菌株BL21(DE3)/pET24a-KRED进行发酵，离心收集，冷藏备用。

然后考察野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1表达菌株BL21(DE3)/pET24a-KRED、突变株2-G3催化多种17-酮基甾体化合物(包括4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮)进行酮基还原反应制备相应17β-羟基类固醇的情况。

实施例5：制备睾酮

分别称取4-雄烯二酮15g到250ml三角瓶中，再加入异丙醇20ml和水75g，用10％NaOH溶液调pH7.0左右，水浴升温至30℃，分别加入实施例4得到的野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED和羰基还原酶突变体2-G3菌体2g，再加入NADP+0.004g，搅拌反应8-10小时取样，通过HPLC检测4-雄烯二酮转化率和产物睾酮产率。

反应式如下：

经检测，菌体2-G3催化的转化率为99.6％，野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED催化的转化率为21.2％。

实施例6：制备宝丹酮

分别称取1,4-雄烯二酮15g到250ml三角瓶中，再加入异丙醇20ml和水75g，用10％NaOH溶液调pH7.0左右，水浴升温至30℃，分别加入实施例4得到的野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED和羰基还原酶突变体2-G3菌体1.5g，再加入NADP+0.004g，搅拌反应12-16小时取样，通过HPLC检测1,4-雄烯二酮转化率和宝丹酮产率。

反应式如下：

经检测，菌体2-G3催化的转化率为98.5％，野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED催化的转化率为11.4％。

实施例7：制备17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮

分别称取雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮15g到250ml三角瓶中，再加入异丙醇20ml和水75g，用10％NaOH溶液调pH7.0左右，水浴升温至30℃，分别加入实施例4得到的野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED和羰基还原酶突变体2-G3菌体3g，再加入NADP+0.004g，搅拌反应16-20小时取样，通过HPLC检测转化率雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮和17β-羟基雌甾-4,9-二烯-3-酮产率。

反应式如下：

经检测，菌体2-G3催化的转化率为99.1，野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED催化的转化率为26.0％。

实施例8：制备17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮

分别称取19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮15g到250ml三角瓶中，再加入异丙醇20ml和水75g，用10％NaOH溶液调pH7.0左右，水浴升温至30℃，分别加入实施例4得到的野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED和羰基还原酶突变体2-G3菌体1g，再加入NADP+0.004g，搅拌反应16-20小时取样，通过HPLC检测19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮转化率和17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯-3-酮产率。

反应式如下：

经检测，菌体2-G3催化的转化率为99.5％，野生酶菌体BL21(DE3)/pET24a-KRED催化的转化率为34.6％。

以上实验表明，羰基还原酶SEQ ID NO:1及其突变体SEQ ID NO:3能够催化4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮进行酮基还原反应，得到相应的17β-羟基类固醇，具有底物广谱性，对于工业化生产甾体药物具有开发价值。

序列表

<110> 湖州颐盛生物科技有限公司

<120> 一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法

<130> SHPI2110203

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 252

<212> PRT

<213> Lactobacillus kefiri

<400> 1

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 2

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaccgatc gtctgaaagg caaagtcgca atcgttacgg gcggcacgct gggcatcggt 60

ctggcaatcg ctgataaatt cgttgaagaa ggtgcgaaag tggttattac gggtcgtcat 120

gccgatgttg gcgaaaaagc ggccaaaagt attggcggta ccgacgtcat ccgttttgtg 180

cagcatgatg catccgacga agccggctgg acgaaactgt ttgataccac ggaagaagca 240

ttcggtccgg tgaccacggt cgtgaacaat gctggcattg ctgttagcaa atcggtggaa 300

gataccacga ccgaagaatg gcgtaaactg ctgagtgtca acctggacgg cgtgtttttc 360

ggtacccgcc tgggcatcca gcgcatgaaa aacaaaggcc tgggtgcgag cattatcaat 420

atgagctcta ttgaaggctt cgttggtgat ccgaccctgg gtgcgtataa cgcctctaaa 480

ggcgcagtgc gtattatgag taaatccgca gctctggact gcgctctgaa agattacgac 540

gttcgcgtca ataccgtcca tccgggttat atcaaaacgc cgctggtcga tgatctggaa 600

ggcgccgaag aaatgatgtc acaacgtacg aaaaccccga tgggccacat cggtgaaccg 660

aatgatatcg catggatctg tgtttatctg gcttcggacg aatctaaatt tgccacgggc 720

gccgaatttg tcgttgacgg cggttacacg gctcagtga 759

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Thr Asn Arg Leu Lys Ser Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Gln Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Val

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ser Leu Pro

85 90 95

Lys Ser Leu Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Arg Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Ser Gly Ile Val Gly Asp Pro Met Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Val

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Ala Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Thr Asp Lys Trp Pro Ala Gly Gly Glu Met Arg Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Val Ala

210 215 220

Trp Val Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaccaatc gtctgaaaag caaagtcgca atcgttacgg gcggcacgca gggcatcggt 60

ctggcaatcg ctgataaatt cgttgaagaa ggtgcgaaag tggttattac gggtcgtcgc 120

gccgatgttg gcgaaaaagc ggccaaaagt attggcggta ccgacgtcat ccgttttgtg 180

cagcatgatg tttccgacga agccggctgg acgaaactgt ttgataccac ggaagaagca 240

ttcggtccgg tgaccacggt cgtgaacaat gctggcattt cactgccgaa atcgctggaa 300

gataccacga ccgaagaatg gcacaaactg ctgagtgtca acctggacgg cgtgtttttc 360

ggtacccgcc tgggcatccg tcgcatgaaa aacaaaggcc tgggtgcgag cattatcaat 420

atgagctcta tttctggcat cgttggtgat ccgatgctgg gtgcgtataa cgcctctaaa 480

ggcgcagtgc gtattatgag taaatccgca gctctggact gcgctgttaa agattacgac 540

gttcgcgtca ataccgtcca tccgggtgcg atcaaaacgc cgctgaccga taaatggccg 600

gccggcggtg aaatgcgttc acaacgtacg aaaaccccga tgggccacat cggtgaaccg 660

aatgatgtgg catgggtgtg tgtttatctg gcttcggacg aatctaaatt tgccacgggc 720

tccgaatttg tcgttgacgg cggttacacg gctcagtga 759

Claims

1.一种酶催化制备17β-羟基类固醇的方法，包括如下步骤：

以17 –酮基类固醇为底物，使用羰基还原酶催化还原反应，得到17β-羟基类固醇，其中所述羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1或者SEQ ID NO: 3，

所述17 –酮基类固醇选自下组：4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中添加有异丙醇和辅酶NADP⁺。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和辅酶NADP+的存在下进行。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶呈其表达微生物菌体形式。

5.一种羰基还原酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。

6.一种微生物，其表达如权利要求5中所述的羰基还原酶。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，还同时表达葡萄糖脱氢酶。

8.如权利要求6或7所述的微生物在以17–酮基类固醇为底物制备17β-羟基类固醇中的用途，所述17 –酮基类固醇选自下组：4-雄烯二酮、1,4-雄烯-二酮、雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮、19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮。