CN114410599B - 羰基还原酶突变体及其制备瑞舒伐他汀手性中间体的应用 - Google Patents

羰基还原酶突变体及其制备瑞舒伐他汀手性中间体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体、编码基因及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第233位甘氨酸突变为天冬酰胺获得的。本发明突变体相较于野生型酶在转化上述反应时催化活力明显提高，催化制备(3R,5S)‑CDHH效率高，反应时间短，且重组工程菌的酶表达量高，易于发酵制备，湿菌体单位酶活高，可直接用于瑞舒伐他汀中间体的酶法催化制备，具有生产成本低、效率高的突出优势，具有良好的开发与应用价值；本发明提供的技术所得产品立体选择性高，简化了繁琐的化学催化步骤，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。

Description

羰基还原酶突变体及其制备瑞舒伐他汀手性中间体的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种立体选择性羰基还原酶突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备瑞舒伐他汀手性中间体（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
背景技术
立体选择性羰基还原酶（Carbonyl reductase, E.C.1.1.1.148）是一类能够催化醇与醛/酮之间的双向可逆反应，需要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD（H））和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP（H））作为氢传递体。羰基还原酶广泛存在于细菌、真菌与动植物体内，种类和数量繁多。近年来，立体选择性羰基还原酶被广泛应用于手性醇的不对称合成中。
瑞舒伐他汀钙是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，可通过抑制肝脏内胆固醇合成降低低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C） 浓度，是治疗高胆固醇血症的首要药物，被称为“超级他汀”。（3R,5S）-CDHH是该药物的手性侧链中间体，可通过化学法和生物酶法催化合成。目前，化学法合成（3R,5S）-CDHH仍占据主导地位，主要通过低温、硼烷催化合成，但是化学催化过程对反应条件和设备的要求苛刻，手性醇的立体选择性不高，总产物收率较低。生物酶法催化合成（3R,5S）-CDHH具有高立体选择性、高转化率、副反应少以及反应条件温和，避免了剧毒物质的引入，对环境友好，弥补了化学法的不足。
近年来，利用羰基还原酶不对称催化合成他汀侧链中间体（3R,5S）-CDHH被广泛应用于工业生产。有学者利用从短乳杆菌（Lactobacillus brevis）中筛选到LbADH催化合成（3R,5S）-CDHH，产物产率可达到72%且e.e.>99.5%（ Wolberg M, Hummel W, Wandrey C,et al. Angewandte Chemie International Edition,2000, 112 （23）: 4476-4478）。此外，利用来源于高加索乳杆菌（Lactobacillus kefir）中的羰基还原酶LkADH1和LkADH2，通过两步还原反应生成产物（3R,5S）-CDHH，最终产率为47.5%， e.e.>99.5%（ Pfruender H,Amidjojo M, Hang F, et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67（5）: 619-622）。随后，日本学者将从木兰假丝酵母（Canadian magnoliae IFO 0705）和葡萄糖脱氢酶进行共表达，催化200g/L （S）-CHOH不对称还原，产率可达97.2%，d.e.>98.6 %（US 6645746 B1、US 6472544 B1）。国内学者利用10g/L重组羰基还原酶干细胞，外加辅因子NAD+0.1mM，能够催化100g/L的（S）-CHOH，产物产率达96%，d.e.>97.2%（CN 104630125A）。有公司采用双酶一锅法不对称合成（3R,5S）-CDHH，底物浓度120g/L，产率高达98.3%，e.e.>99%（CN 104372039 A）。此外，有公司利用羰基还原酶（KRED）和葡萄糖脱氢酶共表达的菌作催化剂，180g/L全细胞催化250g/L （S）-CHOH，同时添加 NADPH 0.12g/L，反应24 h，转化率>95%，d.e.>99.9%（CN 104328148 A）。近来，有学者利用50g/L重组羰基还原酶，以异丙醇作为辅底物，不对称催化500g/L的（S）-CHOH，转化8h，产率>99%，e.e.>99 %（CN108486075 B）。
目前可用于工业生产的羰基还原酶酶源较少，且羰基还原酶催化的具体机制尚未得到准确的阐述，利用蛋白质工程改造是提高酶活力和立体选择性的有利工具。半理性设计的方法已经成为蛋白质分子的主流方法之一，并广泛应用于改造酶的催化活力和立体选择性等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高的底物耐受性和催化活力的立体选择性羰基还原酶突变体及其编码基因，以及其在生物催化制备瑞舒伐他汀手性中间体（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种羰基还原酶突变体，由SEQ ID NO.2所示氨基酸经下列之一的突变而得：（1）第153位缬氨酸突变为半胱氨酸；（2）第233位甘氨酸突变为天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺中的一种。所述羰基还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第153位或第233位进行单突变获得的。
本发明提供的重组羰基还原酶突变体，经检测具有较高的底物耐受性和催化活力，反应条件温和，催化效率高，生产成本降低且对环境友好。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还涉及编码所述羰基还原酶突变体的基因。
具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还涉及含有所述编码基因的载体和基因工程菌。所述重组载体包含适合在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选的表达载体为pET28b。基因工程菌构建方法具体为：将羰基还原酶突变体编码基因同表达载体pET28b连接，构建了含有羰基还原酶突变体编码基因的异源表达重组质粒，将表达重组质粒转化至宿主菌中，获得含有重组质粒的重组基因工程菌。
构建含有所述羰基还原酶突变体编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌（优选大肠杆菌E. coli BL21（DE3））中，对获得的重组基因工程菌进行诱培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶突变体的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，即可获得突变体羰基还原酶纯酶。
本发明还涉及所述羰基还原酶突变体在生物催化制备瑞舒伐他汀手性中间体（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯（tert-butyl （3R,5S）-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate，（3R,5S）-CDHH ）中的应用。
具体的，所述应用为：以含所述羰基还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以（S）-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯（tert-butyl （S）-6-chloro-5–hydroxy-3-oxohexanoate，（S）-CHOH）为底物，以有机溶剂为辅助底物，于pH值为6-8的缓冲溶液中构成反应体系，在25-35℃、150-600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得所述（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
所述催化剂用量以湿菌体重量计为3~50g/L缓冲溶液，所述底物的初始浓度为2~300g/L缓冲溶液，所述辅助底物体积用量为缓冲液体积的5~70%。
所述湿菌体按如下方法制备：将含有所述羰基还原酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h获得种子液，再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集获得湿菌体。
本发明所述羰基还原酶纯酶的制备可按如下方法进行：将重组羰基还原酶基因工程菌湿菌体用生理盐水清洗三遍，按照1g湿菌体加20mL 100mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液重悬湿菌体，冰浴条件下进行超声破碎（200W，持续1s，间歇3s，连续破碎15min），获得细胞破碎液。将超声破碎后获得的细胞破碎液于8000rpm、4℃离心25min，所得到的上清即为所需的粗酶液。DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析：将 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱（1.6cm×20cm）首先用 20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡流速为 2mL/min，待基线走平后，将粗酶液上柱，上样流速为 1.0mL/min。上完样后首先用 20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱流速为2mL/min，待基线走平后用含0-1M NaCl的20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集活性部分，浓缩得纯酶。整个纯化过程均在 4 ℃下进行操作。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供一种具有还原（S）-CHOH活性的重组羰基还原酶突变体，该突变体相较于野生型酶在转化上述反应时催化活力明显提高，催化制备（3R,5S）-CDHH效率高，反应时间短，且重组工程菌的酶表达量高，易于发酵制备，湿菌体单位酶活高，可直接用于瑞舒伐他汀中间体的酶法催化制备，具有生产成本低、效率高的突出优势，具有良好的开发与应用价值；相比于化学法制备（3R,5S）-CDHH，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，简化了繁琐的化学催化步骤，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。
附图说明
图1为（3R,5S）-CDHH不对称合成示意图。
图2为羰基还原酶纯化后的SDS-PAGE 图：泳道M为蛋白质分子量 Marker，泳道1为重组羰基还原酶原始菌株SCR破碎上清，泳道3为mut-Val153Cys破碎上清，泳道5为mut-Gly233Asn破碎上清，泳道2为重组羰基还原酶原始菌株SCR纯化样，泳道4为mut-Val153Cys纯化样，泳道6为mut-Gly233Asn纯化样。
图3为底物（S）-CHOH检测示意图。
图4为产物（3R,5S）-CDHHHPLC检测示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：
实施例1：重组羰基还原酶突变文库的建立
将羰基还原酶编码基因SEQ ID NO.1同表达载体pET28b连接，构建了含有羰基还原酶编码基因的异源表达重组质粒，将表达重组质粒转化至宿主菌E. coli BL21（DE3）中，获得含有重组质粒的重组基因工程菌。以含有表达载体pET28b-SCR的重组菌（E. coli BL21（DE3）/pET28b-SCR）为出发菌株，通过半理性设计的方法构建突变文库，通过定点饱和突变技术，进一步提高羰基还原酶对底物（S）-CHOH的催化活力。
定点饱和突变：
Val（V）153：
上游引物1：5’-GGCGATCCGACTNNKGGCGCTTATAAC-3’
下游引物3：5’-GTTATAAGCGCCMNNAGTCGGATCGCC-3’
Gly（G）233:
上游引物3：5’-TATCTGGCTAGCNNKGAATCTAAGTTC-3’
下游引物4：5’-GAACTTAGATTCMNNGCTAGCCAGATA-3’
饱和突变引物如上所述，下划线标出了突变位点。以含有SCR基因的质粒DNA为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：98℃ 3min；98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 6 min30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理2h，灭活后转化至E. coli BL21（DE3）受体菌中，涂布于含终浓度50μg/ml 卡那抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后，得到了克隆的突变文库。
实施例2：重组羰基还原酶突变体的筛选
从获得的突变文库随机挑取单菌落进行测序分析，得到不同突变点的不同突变氨基酸，再进行酶活测定分析，确立最优的突变点。
阳性克隆子的筛选：
通过对Val（V）153、Gly（G）233位点的饱和突变分析，获得一系列不同的氨基酸突变体。通过比较不同突变体在催化底物时的转化率高低来确定最优突变体。转化反应在10mL的转化瓶中进行，底物（（S）-CHOH浓度为100g/L，异丙醇4mL，突变体湿菌体15g/L，30℃，600rpm磁力搅拌反应20min，反应液通过HPLC分析来确定反应的转化率从而确定最优的突变体。突变体不对成合成催化合成示意图如图1。
结果表明，通过定点饱和突变方法，在两个不同突变位点获得的最优突变体为mut-Val153Cys和mut-Gly233Asn，相较于野生型，酶活分别提高了10%和40%。
实施例3：重组羰基还原酶突变体湿菌体的制备
将实施例2获得的含有表达重组羰基还原酶突变体基因的重组大肠杆菌（重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28b-mut-Val153Cys、重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28b-mut-Gly233Asn）接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h，再以2%接种量（v/v）接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000 rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组羰基还原酶突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体。该湿菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。相同方法制备含有表达重组羰基还原酶基因的重组大肠杆菌（BL21（DE3）/pET28b-SCR）湿菌体。
实施例4：重组羰基还原酶突变体的分离纯化
将实施例3中获得的湿菌体用生理盐水清洗三遍，按照1g湿菌体加20mL 100mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液重悬湿菌体，冰浴条件下进行超声破碎（200W，持续1s，间歇3s，连续破碎15min），获得细胞破碎液。将超声破碎后获得的细胞破碎液于8000rpm、4℃离心25min，所得到的上清即为所需的粗酶液。
DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析：将 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱（1.6cm×20cm）首先用 20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡流速为2mL/min，待基线走平后，将粗酶液上柱，上样流速为 1.0mL/min。上完样后首先用 20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，洗脱流速为2mL/min，待基线走平后用含0-1M NaCl的20mM、pH7.0的Tris-HCl缓冲液梯度洗脱。收集活性部分，浓缩得纯酶。整个纯化过程均在 4 ℃下进行操作。收集活性部分，浓缩得纯酶。整个纯化过程均在 4℃下进行操作。取截留液采用BCA试剂盒法测定蛋白含量，并冻存于-80℃冰箱中（羰基还原酶突变体蛋白电泳图见图2），获得羰基还原酶SCR及其突变体mut-Val153Cys和mut-Gly233Asn纯酶。
实施例5：羰基还原酶活力测定
将实施例4中分离纯化得到的羰基还原酶SCR及其突变体mut-Val153Cys和mut-Gly233Asn纯酶用于催化底物（S）-CHOH。
羰基还原酶SCR及其突变体酶活的测定在100 mM，pH 7.0的磷酸钾缓冲体系中进行。5 mL催化体系：（S）-CHOH浓度为10 mM，辅酶NADPH浓度为1 mM，30˚C，600rpm条件下预热3min，反应3min。加入5mL 体积浓度30%乙腈水溶液终止反应，混合均匀后取样检测酶活。
表1： SCR及突变体酶活力测定结果
Enzyme Specific activity（U/mg） e.e.（%）
Wild-type 90.30±2.40 >99
mut-Val153Cys 100.11±1.25 >99
mut-Gly233Asn 126.69±2.56 >99
酶活单位（U）定义为：在30℃、pH7.0条件下，1min内产生1µmol 产物（3R,5S）-CDHH所需的酶量定义为1U。产物的生成量通过HPLC检测确定。
实施例6：重组羰基还原酶SCR在制备（3R,5S）-CDHH中的应用
（1）以实施例2中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28b-SCR湿菌体作为生物催化剂，以（S）-CHOH为底物，进行生物转化反应制备（3R,5S）-CDHH。
催化体系组成及催化条件如下：10mL反应体系中，加入磷酸钾缓冲溶液（pH7.0）6mL，加入重组羰基还原酶SCR湿菌体（用量为15g/L缓冲液），异丙醇4mL，初始底物终浓度为100g/L，30℃水浴，磁力搅拌装置600rpm，反应定时取样，取样体积100μL，用体积浓度30%乙腈水溶液稀释50倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化5h产率达80%以上，e.e.>99%。
（2）（S）-CHOH与（3R,5S）-CDHH的液相检测方法
检测转化率时采用色谱柱：Agilent Zorbax SB-C8 柱 （150×4.6mm, 5μm），流动相：乙腈：水=30：70，流速1mL/min，检测波长210nm。（S）-CHOH与（3R,5S））-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为9.307min（图3）和6.067min（图4）。
检测e.e.时采用手性色谱柱OD-H 柱 （250×4.6mm, 5μm） ，流动相：正己烷：异丙醇=85：15，流速1mL/min，检测波长215nm。（S）-CHOH与（3R,5S）-CDHH和（3S,5S）-6-氯二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为5.99min，5.09min和4.93min。
实施例7：重组羰基还原酶突变体mut-Val153Cys在制备（3R,5S）-CDHH中的应用
以实施例2中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28b-mut-Val153Cys湿菌体作为生物催化剂，以（S）-CHOH为底物，进行生物转化反应制备（3R,5S）-CDHH。
催化体系组成及催化条件如下：10mL反应体系中，加入磷酸钾缓冲溶液（pH7.0）6mL，加入重组羰基还原酶突变体湿菌体（用量为15g/L缓冲液），异丙醇4mL，初始底物终浓度为100g/L，30℃水浴，磁力搅拌装置600rpm，反应定时取样，取样体积100μL，用体积浓度30%乙腈水溶液稀释50倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化6h产率达到85%以上，e.e.>99%。
实施例8：重组羰基还原酶突变体mut-Gly233Asn在制备（3R,5S）-CDHH中的应用
以实施例2中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28b- mut-Gly233Asn湿菌体作为生物催化剂，以（S）-CHOH为底物，进行生物转化反应制备（3R,5S）-CDHH。
催化体系组成及催化条件如下：10mL反应体系中，加入磷酸钾缓冲溶液（pH7.0）6mL，加入重组羰基还原酶突变体湿菌体（用量为15g/L缓冲液），异丙醇4mL，初始底物终浓度为100g/L，30℃水浴，磁力搅拌装置600rpm，反应定时取样，取样体积100μL，用体积浓度30%乙腈水溶液稀释50倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化6h产率>99%，e.e.>99%。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 羰基还原酶突变体及其制备瑞舒伐他汀手性中间体的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 759
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgactgatc gtctgaaagg caaggtagct attgttactg gtggtaccct gggtatcggt 60
ctggctatcg ctgacaaatt cgtggaagaa ggcgcgaagg tcgttatcac cggtcgtcgt 120
gccgacgttg gcgagcgtgc tgccaaaagc atcggtggta ctgatgttat ccgtttcgta 180
cagcacgatg caagcgatga agcaggctgg accaaactgt tcgataccac ggaagaggca 240
ttcggtccgg taaccaccgt cgtgaacaac gccggtatcg gtgtggtcaa atctgttgaa 300
gacactacca ccgaagagtg gcacaaactg ctgtctgtga acctggacgg cgttttcttc 360
ggtacccgcc tgggtatcca gcgtatgaaa aacaaaggcc tgggcgcaag catcatcaac 420
atgtcctcta ttttcggcat ggtaggcgat ccgactgtag gcgcttataa cgcgtccaaa 480
ggcgcggtgc gtattatgtc caagagcgcg gctctggact gtgcactgaa agactacgac 540
gtgcgcgtaa acacggtaca tccgggtccg attaaaaccc ctatgctgga cgacgttgag 600
ggcgcggaag aaatgtggtc ccagcgtact aaaaccccga tgggccacat cggtgagccg 660
aacgacatcg catgggtatg tgtctatctg gctagcggtg aatctaagtt cgcaaccggt 720
gctgaattcg taatcgatgg tggctggacc gcacagtaa 759
<210> 3
<211> 252
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg Arg Ala Asp Val Gly Glu Arg Ala Ala
35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Val
85 90 95
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp His Lys Leu Leu Ser
100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Phe Gly Met Val Gly Asp Pro Thr Val Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Met Leu Asp Asp Val Glu Gly Ala Glu Glu Met Trp Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
210 215 220
Trp Val Cys Val Tyr Leu Ala Ser Gly Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Ile Asp Gly Gly Trp Thr Ala Gln
245 250

Claims (8)

1.一种羰基还原酶突变体，由SEQ ID NO.2所示氨基酸经下列突变而得：第233位甘氨酸突变为天冬酰胺。
2.编码权利要求1所述羰基还原酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的载体。
4.含有权利要求2所述编码基因的基因工程菌。
5.权利要求1所述羰基还原酶突变体在生物催化制备瑞舒伐他汀手性中间体（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：以含所述羰基还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以（S）-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，以有机溶剂为辅助底物，于pH值为6-8的缓冲溶液中构成反应体系，在25-35℃、150-600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得所述（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为3~50g/L缓冲溶液，所述底物的初始浓度为2~300g/L缓冲溶液，所述辅助底物体积用量为缓冲液体积的5~70%。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有所述羰基还原酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养8h获得种子液，再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm下培养至菌体OD600达0.6~0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集获得湿菌体。
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