CN107058251A

CN107058251A - 重组羰基还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN107058251A
Application number: CN201710257065.8A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 郑裕国; 吴林; 张晓建; 薛亚平; 王亚军
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: CN107058251B

Abstract

本发明公开了一种重组羰基还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位、第144位或第156位进行单点突变获得的。本发明提供一种具有还原(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑氧代己酸叔丁酯的重组羰基还原酶突变体，该突变体相比于野生型酶在转化上述反应时催化活力和底物耐受性大大提高，反应进程耗时明显缩短。相比于化学法制备(3R,5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，简化了繁琐的化学催化步骤，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。

Description

重组羰基还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及羰基还原酶突变体、突变体基因、含有该突变体基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌以及其在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

(二)背景技术

立体选择性羰基还原酶(Specific Carbonyl Reducatase,SCR；Ketoreductase,KRED,E.C 1.1.1.x)属于氧化还原酶系，是一类能够催化醇和醛/酮之间双向可逆氧化还原反应的酶类，并且需要辅酶NAD(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADP(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)作为氢传递体。NADH和NADPH作为电子供体参与其还原反应，NAD⁺和NADP⁺则作为电子受体参与其氧化反应。目前，根据文献报道的羰基还原酶一般属于短链脱氢酶超家族(Short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)、中链脱氢酶超家族(Medium-chaindehydrogenase/reductase,MDR)、醛酮还原酶超家族(Aldo-keto reductase,AKR)等。虽然三者具有相似的催化功能，但在进化和结构上差异较大。羰基还原酶广泛分布于各类动物、微生物和植物中。微生物种类繁多、分布广，是羰基还原酶的主要来源，如：Pichiafinlandica、Clostridium ljungdahlii、Vibrio vulnificus、Candida glabrata、Serratia quinivorans、Polygonum minus、Arabidopsis thaliana、Oenococcus oeni、Serratia marcescens、Chryseobacterium sp.、Rhodococcus erythropolis、Candidamagnoliae、Lactobacillus jensenii和Lactobacillus coryniformis等。此外，极端微生物中也存在嗜极端环境的羰基还原酶，如来源于Thermococcus sibiricus、Thermococcusguaymasensis、Haloferax volcanii、Thermus thermophilus、Sulfolobusacidocaldarius、Carboxydothermus hydrogenoformans、Thermococcus kodakarensis、Thermotoga maritime、Koliella Antarctica、Pyrobaculum calidifontis和Halobacterium sp.等极端微生物的羰基还原酶。

(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯是HMG-CoA酶抑制剂阿托伐他汀和瑞舒伐他汀类药物的侧链手性中间体，可以通过化学合成和生物催化合成的方法获得。化学法合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯往往从一个简单的化合物出发，如(S)-环氧氯丙烷，经过一系列化学反应合成我们所需的中间体物质，其中C3位手性中心的引入需使用易燃易爆的硼氢化钠作为还原剂，并且需要在<-65℃低温条件下进行，能耗大，再加上(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯非对映诱导不充分，产物的光学纯度难以达到要求，最终产率不高。近年来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为关注的重点。生物催化不对称还原法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物中的重金属残留，对环境友好，弥补了化学方法的不足，近年生物催化的羰基不对称还原反应在(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯合成中的应用越来越受到重视。短乳杆菌(Lactobacillus brevis)中的羰基还原酶LbADH对(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的前体化合物6-氯-3,5-二氧代己酸叔丁酯具有较好的催化活力，能够不对称还原C5位的羰基，e.e.>99.5％。另外，从高加索乳杆菌(Lactobacillus kefir)中克隆得到的羰基还原酶LkADH1和LkADH2构成了双羰基还原酶催化体系，催化6-氯-3,5-二氧代己酸叔丁酯合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，产率达47.5％，e.e.>99.5％。之后，日本学者从加拿大木兰(Canadian magnoliae IFO 0705)中克隆出羰基还原酶并和葡萄糖脱氢酶共表达于大肠杆菌中，该共表达菌株能够催化200g/L(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，产率达97.2％，d.e.>98.6％(US 6645746 B1、US 6472544 B1)。最近又有学者通过固定化酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2233)100％催化50g/L(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的底物，d.e.>99％。除此之外，目前国内(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生产能力在100-300g/L之间，浙江大学用异丙醇作为辅底物，10g/L的重组羰基还原酶细胞干重，0.1mM的NAD⁺催化100g/L的(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，产率达96％，d.e.>97.2％(CN 104630125 A)。尚科生物医药(上海)有限公司，利用羰基还原酶(KRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达的全细胞作催化剂，底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯浓度为250g/L，全细胞浓度为180g/L，NADPH 0.12g/L，用三乙醇胺作为缓冲液，反应24h，转化率>95％，光学纯度>99.9％(CN 104328148 A)。苏州汉酶生物技术有限公司，改用葡萄糖和葡萄糖脱氢酶用作辅酶循环后，在反应体系中加入(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯浓度在250-300g/L之间，羰基还原酶菌体浓度约75g/L，GDH浓度约25g/L，NADP 0.6g/L，搅拌24h，产率96.7％，d.e.>99.9％，纯度99％(CN 102965403 A、CN104726506 A)。

(三)发明内容

本发明目的是提供重组羰基还原酶突变体、编码基因、含有该突变体基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。本发明提供的重组羰基还原酶突变体具有较高的底物耐受性、较好的稳定性和较高的催化活力，使得反应条件温和，催化效率提高，生产成本降低且对环境友好。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组羰基还原酶突变体，能够以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，在适合的条件下将其还原为(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，所述重组羰基还原酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位、第144位或第156位之一进行单突变获得的，优选所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8之一所示。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明提供一种所述重组羰基还原酶突变体的编码基因，所述编码基因的多核苷酸序列为SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7之一所示。

由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明涉及含所述重组羰基还原酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选该表达载体为pET28a。

本发明涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将羰基还原酶突变体编码基因同表达载体pET28a连接，构建了含有羰基还原酶突变体编码基因的异源表达重组质粒。将表达重组质粒转化至宿主菌中，获得含有重组质粒的重组基因工程菌。

本发明涉及羰基还原酶突变体编码基因在制备重组羰基还原酶突变体中的应用，具体为：构建含有所述羰基还原酶突变体编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3))中，对获得的重组基因工程菌进行诱培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶突变体的菌体细胞，破碎后获得的羰基还原酶粗酶液进行纯化，获得羰基还原酶纯酶。

本发明涉及所述重组羰基还原酶突变体在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，具体所述应用为：以含重组羰基还原酶编码基因突变体的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡萄糖脱氢酶(GDH)为辅酶，以pH值为6-8(优选6.5-7.5)的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在25-35℃(优选30℃)，150-500rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。所述催化剂用量以湿菌体重量计为3-50g/L缓冲溶液(优选30g/L)，所述底物的初始浓度为10-1300mmol/L缓冲溶液(优选800mmol/L)，所述辅助底物用量为10-1820mmol/L缓冲溶液(优选1120mmol/L)，所述葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量为计为3-50g/L缓冲溶液(优选30g/L)。

本发明所述含重组羰基还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有重组羰基还原酶突变体编码基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，150rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。

进一步，本发明所述葡萄糖脱氢酶湿菌体的制备方法具体如下：将含有葡萄糖脱氢酶(GDH)基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示)的重组菌(BL21(DE3)/pET28b-GDH)接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，150rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。湿菌体分离纯化提取纯酶的方法为：将湿菌体以结合缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl)重悬后，于4℃冰浴中进行超声破碎(40W，持续1s，间歇1s，连续破碎3min)，12000×g离心40min，得到的上清为粗酶液；将上清与经上述结合缓冲液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，15mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，400mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，以透析缓冲液(20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液)透析24h，取截留液即获得羰基还原酶突变体的纯酶。

所述反应体系中还添加有机溶剂，所述有机溶剂为水溶性有机溶剂或非水溶性有机溶剂，所述水溶性有机溶剂终体积添加量为5-15％(优选5％)，所述非水溶液有机溶剂体积终浓度添加量为10-30％(优选10％)，所述水溶性有机溶剂为下列之一：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、吐温-20、吐温-60、吐温-80，优选吐温-80；所述非水溶性有机溶剂为下列之一：四氢呋喃、二氯甲烷、叔戊醇、甲苯、二甲苯、正辛醇、正己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯或甲基叔丁基醚，优选正辛醇。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供一种具有还原(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的重组羰基还原酶突变体，该突变体相比于野生型酶在转化上述反应时催化活力和底物耐受性大大提高，反应进程耗时明显缩短。相比于化学法制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，简化了繁琐的化学催化步骤，反应条件更加温和，对设备要求低，降低了反应成本，且对环境友好。

(四)附图说明

图1为羰基还原酶RtSCR9表达载体构建示意图。

图2为羰基还原酶基因易错PCR与大引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1为Marker；泳道2为易错PCR所得羰基还原酶基因片段；泳道3为大引物PCR所得质粒DNA；泳道4为Marker。

图3为随机突变文库阳性克隆子筛选示意图。

图4为定点饱和突变所得突变体相对活力比较图；a为Gln95突变体相对活力比较图；b为Ile144突变体相对活力比较图；c为Phe156突变体相对活力比较图。

图5为羰基还原酶SDS-PAGE图；泳道M为Marker；泳道1为空载宿主菌E.coli BL21(DE3)破碎上清样；泳道2为RtSCR9破碎上清样；泳道3为mut-Gln95Asp破碎上清样；泳道4为mut-Ile144Lys破碎上清样；泳道5为mut-Phe156Gln破碎上清样；泳道6为RtSCR9纯化样；泳道7为mut-Gln95Asp纯化样；泳道8为mut-Ile144Lys纯化样；泳道8为mut-Phe156Gln纯化样。

图6为(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯不对称合成示意图。

图7为辅酶循环体系中葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度优化结果示意图。

图8为辅酶循环体系中葡萄糖浓度优化结果示意图。

图9为有机溶剂对催化反应影响结果示意图。

图10为助溶剂吐温-80在催化反应中优化结果示意图。

图11为两相体系正辛醇在催化反应中优化结果示意图。

图12为产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯产率HPLC检测示意图。

图13为产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯HPLC手性检测示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。

实施例1：重组羰基还原酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9的构建

从圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212(CCTCC NO.M2014613，已在专利申请CN 105039361 A中公开)中挖掘具有催化(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯生成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶RtSCR9。

利用Ambion公司的TRIzol试剂提取圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides)ZJB2014212菌体的总mRNA。以1mg mRNA为模板，利用ReverTra AceqPCR RT试剂盒对其进行反转录合成cDNA。以该cDNA为模板，在引物1(ATGTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)和引物2(CTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)的作用下进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，65℃45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pGEM-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-RtSCR9。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，涂布于含有浓度为50μg/mL氨苄青霉素钠抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆进行测序分析。根据分析结果设计表达引物3(catatgTCTTCGCCTACTCCCAACGTC)、引物4(aagcttCTACCATGGCAAGAACGTCCCGTC)(下划线为Nde I和Hind III限制性酶切位点)，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得759bp的羰基还原酶基因序列(核苷酸序列如SEQ IN NO.1所示)。利用Nde I和Hind III限制性内切酶对扩增片段进行酶切处理，利用T4DNA连接酶将该片段与用相同限制性内切酶处理的pET28a进行连接，构建表达载体pET28a-RtSCR9。将构建的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组羰基还原酶基因工程菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9)(图1)。

实施例2：重组羰基还原酶突变体的获得

以含有表达载体pET28a-RtSCR9的重组菌(E.coli BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9)为出发菌株，通过随机突变和定点饱和突变技术，进一步提高羰基还原酶对底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的催化活力和底物耐受性。

(1)易错PCR和大引物PCR

易错PCR上游引物5：5’-TATGTCTTCGCCTACTCCCAAC-3’

易错PCR下游引物6：5’-TCTACCATGGCAAGAACGTCC-3’

易错PCR通过改变PCR体系中Mn²⁺，Mg²⁺使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体。本发明以RtSCR9基因(核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)所在的质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将扩增后回收的带有突变位点的PCR产物作为引物，用于扩增质粒DNA(大引物PCR)，获得带有突变点的重组载体。大引物PCR程序如下：98℃3min；98℃10s，55℃5s，72℃6min，重复26个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后。随机挑取单菌落进行酶活筛选后获得活力提高突变体。

(2)定点饱和突变

Gln(Q)95：

上游引物7：5’-GCATCTCCNNKTCGACCGAC-3’

下游引物8：5’-GTCGGTCGAMNNGGAGATGC-3’

Ile(I)144：

上游引物9：5’-GTCTCCACCNNKGCCGGCTCGATC-3’

下游引物10：5’-GATCGAGCCGGCMNNGGTGGAGAC-3’

Phe(F)156：

上游引物11：5’-CCAATTCCTGNNKCCCGTGAGCTCG-3’

下游引物12：5’-CGAGCTCACGGGMNNCAGGAATTGG-3’

饱和突变引物如上所述，下划线标出了突变位点。同样地，以含有RtSCR9基因的质粒DNA为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：98℃3min；98℃10s，55℃5s，72℃6min，重复26个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coliBL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L卡那抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后。随机挑取单菌落进行测序分析，得到不同突变点的不同突变氨基酸，再进行酶活测定分析，确立最优的突变点。

(3)阳性克隆子的筛选

随机挑选平板上的阳性克隆子于96孔板中，加入800μL LB培养基(50μg/mL，Kan)，37℃，150rpm下培养过夜。转接50μL种子液于另一块新的96孔板中，37℃，150rpm培养4h后加入IPTG(0.1mM)，转至28℃培养16h。所得的细胞通过96孔板离心机，1500×g离心30min得到，pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液洗涤一次后，保存至-80℃冰箱，反复冻融3次，再加入200μL2g/L的溶菌酶酶液于28℃处理2h，离心除去细胞碎片，得到粗酶液。突变体酶活通过酶标仪测定辅酶NADPH在340nm处吸收峰值的变化来实现，具体地，96孔板200μL酶活测定体系包含：0.5mM NADPH，2mM底物((S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯)，50μL经溶菌酶破胞处理所得酶液。测定反应体系3min钟内OD₃₄₀的变化值。相应地，突变体酶活越高，OD₃₄₀处吸光值的变化越大，从而筛选出活力相对较高的突变体，初筛示意图如图3所示。

通过对Gln95，Ile144和Phe156位点的饱和突变分析，我们获得一系列不同的氨基酸突变体。通过比较不同突变体在催化底物时的转化率高低来确定最优突变体。转化反应在10mL的转化瓶中进行，底物((S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯)浓度为100mM，葡萄糖140mM，突变体湿菌体5g/L，葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L，30℃，150rpm反应45min，反应液通过HPLC分析来确定反应的转化率从而确定最优的突变体。定点饱和突变各突变体活力检测示意图如图4所示。

结果表明，通过随机突变和定点饱和突变方法，在三个不同突变位点获得的最优突变体为RtSCR9-Gln95Asp(即mut-Gln95Asp，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)、RtSCR9-Ile144Lys(即mut-Ile144Lys，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)和RtSCR9-Phe156Gln(即mut-Phe156Gln，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)，转入大肠杆菌(BL21(DE3)，分别获得重组大肠杆菌，即重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Gln95Asp、重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Ile144Lys和重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Phe156Gln。

实施例3：重组羰基还原酶突变体湿菌体的制备

将实施例2获得的含有表达重组羰基还原酶突变体基因的重组大肠杆菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，150rpm下培养8h，再以1％接种量(v/v)接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组羰基还原酶突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体。该湿菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。相同方法制备含有表达重组羰基还原酶基因的重组大肠杆菌(BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9)湿菌体。

实施例4：羰基还原酶突变体的分离纯化

将实施例3中获得的湿菌体以结合缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl)重悬后，于4℃冰浴中进行超声破碎(40W，持续1s，间歇1s，连续破碎3min)，12000×g离心40min，得到的上清为粗酶液。将上清与经上述结合缓冲液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，15mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，400mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液)透析24h，取截留液采用BCA试剂盒法测定蛋白含量，并冻存于-80℃冰箱中(羰基还原酶突变体蛋白电泳图见图5)，获得羰基还原酶突变体mut-Gln95Asp、mut-Ile144Lys、mut-Phe156Gln纯酶。

实施例5：羰基还原酶活力及表观动力学参数测定

将实施例4中分离纯化得到的羰基还原酶突变体mut-Gln95Asp、mut-Ile144Lys、mut-Phe156Gln纯酶用于催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯。

酶活催化体系组成及催化条件如下：5mL，100mM、pH 7.0磷酸盐缓冲液中加入用相同缓冲溶液稀释的羰基还原酶突变体纯酶(终浓度RtSCR9 7.5μg/mL，mut-Gln95Asp 4.54μg/mL、mut-Ile144Lys 3.86μg/mL、mut-Phe156Gln 6.45μg/mL)，NAD(P)H(终浓度0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mmol/L缓冲液)，在不同辅酶浓度下测定(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯浓度(终浓度0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3、5、8和10mmol/L缓冲液)变化时的初速度，于30℃，150rpm条件下预热3min，反应3min。加入1mL体积浓度30％乙腈水溶液终止反应，混合均匀后取样检测酶活。同样条件下，以大肠杆菌BL21(DE3)以及大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a菌体破碎上清经透析得到的截留液作为对照。

表1 RtSCR9表观动力学参数结果

酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，1min内产生1μmol产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1U。产物的生成量通过HPLC检测确定。测定结果见表1。

实施例6：重组羰基还原酶辅酶再生体系建立

以实施例3方法获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9湿菌体作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物。

(1)羰基还原酶RtSCR9的辅酶再生体系的选择在专利CN 105039361A中已经详细给出，表明当选择葡萄糖/葡萄糖脱氢酶(GDH)(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示)作为辅酶再生体系时，转化率最高。葡萄糖脱氢酶(GDH)(来源于Exiguobacterium sibiricum 255-15，GenBank:ACB59697.1)的制备如下：将重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-GDH接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，150rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量(v/v)接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。该菌体可直接用于辅酶再生体系。生物催化不对称合成(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的示意图如图6所示。

(2)辅酶循环再生体系中葡萄糖脱氢酶浓度的优化

实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Ile144Lys具有最优的催化活力，故以该重组菌作为催化反应条件优化过程中的催化剂。以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物。

转化体系组成及催化条件：磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH 7.0)10mL，重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为3g/L缓冲液，底物浓度为100mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度为140mmol/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度分别为0g/L，0.3g/L，0.6g/L，1.2g/L，1.8g/L，2.4g/L，3.0g/L，3.6g/L，4.5g/L，6.0g/L。30℃，150rpm水浴摇床反应1h。反应结束后用加入1mL乙腈终止反应，充分混匀反应液，取适量反应液用HPLC检测转化率。优化结果见图7。

结果表明当重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys菌体量与葡萄糖脱氢酶菌体浓度比为1:1时，辅酶循环已基本能够满足羰基还原酶对NADPH的需求，以上催化反应产物e.e.>99％。

(3)辅酶循环体系中葡萄糖浓度的优化

转化体系组成及催化条件：磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH 7.0)10mL，重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为3g/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为3g/L缓冲液，底物浓度为100mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度分别为0mmol/L，20mmol/L，40mmol/L，60mmol/L，80mmol/L，100mmol/L，120mmol/L，140mmol/L，160mmol/L，200mmol/L。30℃，150rpm水浴摇床反应1h。反应结束后用加入1mL乙腈终止反应，充分混匀反应液，取适量反应液用HPLC检测转化率。优化结果见图8。

结果表明当葡萄糖浓度与底物(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯浓度摩尔比为1.4:1时，辅酶循环已基本能够满足羰基还原酶对NADPH的需求，以上催化反应产物e.e.>99％。

实施例7：有机溶剂对重组羰基还原酶在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯应用中的影响

以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Ile144Lys湿菌体作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物。

(1)有机溶剂对转化反应的影响

转化体系组成及催化条件：磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH 7.0)10mL，重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为3g/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为3g/L缓冲液，底物浓度为100mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度为140mmol/L缓冲液，加入一定量的有机溶剂。30℃，150rpm水浴摇床反应1h。反应结束后用加入1mL乙腈终止反应，充分混匀反应液，取适量反应液用HPLC检测转化率。筛选结果见图9。

所述水溶性有机溶剂为：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、异丙醇(IPA)、丙酮(Acetone)、乙醇(Ethanol)、甲醇(Methanol)、吐温-20(Tween-20)、吐温-60(Tween-60)、吐温-80(Tween-80)，在反应体系中的添加量为5％(v/v)。

所述的非水溶性有机溶剂为：四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、叔戊醇(tAmyl-OH)、甲苯(Toluene)、二甲苯(Xylene)、正辛醇(Octanol)、正己烷(c-Hexane)、乙酸乙酯(EtOAc)、乙酸丁酯(BuOAc)、乙酸异丁酯(iBuOAc)、乙酸异丙酯(iPrOAc)、甲基叔丁基醚(MTBE)，在反应体系中的添加量为10％(v/v)。

结果表明当使用吐温作为助溶剂时(吐温-20、吐温-60和吐温-80)，催化反应的转化率有明显的提升；当使用正辛醇用作两相催化体系的有机相时，催化反应的转化率有明显的提升。

(2)吐温-80用作助溶剂在催化反应中的优化

转化体系组成及催化条件：磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH 7.0)10mL，重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为3g/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为3g/L缓冲液，底物浓度为100mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度为140mmol/L缓冲液，吐温-80的体积加入量分别为：0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％。30℃，150rpm水浴摇床反应1h。反应结束后用加入1mL乙腈终止反应，充分混匀反应液，取适量反应液用HPLC检测转化率。优化结果见图10。

结果表明当助溶剂吐温-80的体积添加量在10％左右时，催化反应转化率最高，e.e.>99％。

(3)两相体系有机相正辛醇在催化反应中的优化

转化体系组成及催化条件：磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH 7.0)10mL，重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为3g/L缓冲液，葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为3g/L缓冲液，(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯浓度为100mmol/L缓冲液，葡萄糖浓度为140mmol/L缓冲液，正辛醇的体积加入量分别为：0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％。30℃，150rpm水浴摇床反应1h。反应结束后用加入1mL乙腈终止反应，充分混匀反应液，取适量反应液用HPLC检测转化率。优化结果见图11。

结果表明当反应中添加的有机溶剂正辛醇量为20％时，催化反应的转化率最高。

实施例8：重组羰基还原酶RtSCR9在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用

(1)以实施例3中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-RtSCR9湿菌体作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。实施例9-12以此为对照。

催化体系组成及催化条件如下：30mL磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中加入重组羰基还原酶RtSCR9湿菌体浓度为30g/L缓冲液和葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为30g/L缓冲液，初始底物浓度为1mol/L缓冲液，葡萄糖1.4mol/L缓冲液，30℃水浴，磁力搅拌装置500rpm，pH采用8M NaOH通过自动流加的方式控制在7.0，反应定时取样，取样体积50μL，用磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)稀释200倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化12h产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率达到78％，e.e.>99％。

(2)(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相检测方法

高效液相色谱仪器：Shimadzu LC-20AD系统-SPD-20A紫外检测器

检测转化率时采用色谱柱：Agilent Zorbax SB-C8柱(150×4.6mm,5μm)，流动相：乙腈：水＝30：70，流速1mL/min，检测波长210nm。(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为9.66min和6.11min，如图12所示。

检测e.e.时采用手性色谱柱OD-H柱(250×4.6mm,5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝85：15，流速1mL/min，检测波长215nm。(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和(3S,5S)-6-氯二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为5.99min，5.09min和4.93min，如图13所示。

实施例9：重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用

以实施例3中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Ile144Lys湿菌体作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

催化体系组成及催化条件如下：30mL磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中加入重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为30g/L缓冲液和葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为30g/L缓冲液，初始底物浓度为1mol/L缓冲液，葡萄糖浓度为1.4mol/L缓冲液，30℃水浴，磁力搅拌装置500rpm，pH采用8M NaOH通过自动流加的方式控制在7.0，反应定时取样，取样体积50μL，用磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)稀释200倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化5h后产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率能达到90％，8h后产物的产率保持在98％以上，e.e.>99％。

实施例10：重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用

催化体系组成及催化条件如下：30mL磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中加入重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为30g/L缓冲液和葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为30g/L缓冲液，初始底物浓度为1mol/L缓冲液，葡萄糖浓度为1.4mol/L缓冲液，加入助溶剂吐温-80量为10％(v/v)，30℃水浴，磁力搅拌装置500rpm，pH采用8M NaOH通过自动流加的方式控制在7.0，反应定时取样，取样体积50μL，用磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)稀释200倍，通过HPLC分析测定转化率。结果表明在催化4h后产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率能达到95％，5h后产物的产率保持在98％以上，e.e.>99％。

实施例11：重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用

催化体系组成及催化条件如下：30mL磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中加入重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys湿菌体浓度为30g/L缓冲液和葡萄糖脱氢酶湿菌体浓度为30g/L缓冲液，初始底物浓度为1mol/L缓冲液，葡萄糖浓度为1.4mol/L缓冲液，加入两相催化体系有机相正辛醇20％(v/v)，30℃水浴，磁力搅拌装置500rpm，pH采用8M NaOH通过自动流加的方式控制在7.0，反应定时取样，取样体积50μL，用磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)稀释200倍，通过HPLC检测分析测定转化率。结果表明在催化5h后产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率能达到90％，8h后产物的产率保持在98％以上，e.e.>99％。

实施例12：重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用

以实施例4中获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-mut-Ile144Lys湿菌体的粗酶液作为生物催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，进行生物转化反应制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

催化体系组成及催化条件如下：30mL磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)中加入重组羰基还原酶突变体mut-Ile144Lys细胞破碎液(浓度相当30g/L缓冲液的湿菌体)和葡萄糖脱氢酶细胞破碎液(浓度相当30g/L缓冲液的湿菌体)，初始底物浓度为1mol/L缓冲液，葡萄糖浓度为1.4mol/L缓冲液，30℃水浴，磁力搅拌装置500rpm，pH采用8M NaOH通过自动流加的方式控制在7.0，反应定时取样，取样体积50μL，稀释200倍，通过HPLC检测分析测定转化率。结果表明在催化2h后产物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的产率就能达到90％，4h反应达到平衡，转化率>98％，e.e.>99％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 重组羰基还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgtcttcgc ctactcccaa cgtctacgtc atttctggcg cctctcgcgg catcggtttc 60

gccatcacct ccatccttgc tcaacgcgac aacgtcctca tctttgccgg cgcacgcgac 120

ctgaagtcga cgcagctgaa cgagctcgcc ctgaagtctg gcggcaaggt cgtcccggtc 180

aagctcgagt cgacgagtgt cgaggatgcc gctgcgcttg caaaggttgt cgaggagaag 240

gctggaaagg tcgactacgt cttggcggtg gccggcatct cccagtcgac cgacccgatc 300

gcccaggttc cgctcgacga cgtcaggcgt cacttcgaag tcaacaccat cggccctctc 360

gtcctgttcc aatccctcct cgccctcctc accaagtcca gcgcgccgca ctttatcgtc 420

gtctccacca tcgccggctc gatcgcctcc atgccccaat tcctgttccc cgtgagctcg 480

tacgcgatct ccaagaccgc cgtcaactcg gccgtggtgc gcatcgcggt cgagcacccc 540

gatctggacg cattcgtctg ccacccgggc gtggtcagta gcgacatgat caaggagtat 600

gtggcgaaga cgggcacagc gctctcggac tttgagtcga tgggtatgat caccccggaa 660

gaatcggctg cgagtctcgt caagctcttc gacggggcca agaaggagac gcactcgggc 720

aagttcttca acgtggacgg gacgttcttg ccatggtag 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Ser Ser Pro Thr Pro Asn Val Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Gly Phe Ala Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln Arg Asp Asn Val

20 25 30

Leu Ile Phe Ala Gly Ala Arg Asp Leu Lys Ser Thr Gln Leu Asn Glu

35 40 45

Leu Ala Leu Lys Ser Gly Gly Lys Val Val Pro Val Lys Leu Glu Ser

50 55 60

Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Glu Glu Lys

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Pro Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe

100 105 110

Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ser Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Leu Thr Lys Ser Ser Ala Pro His Phe Ile Val Val Ser Thr Ile

130 135 140

Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Phe Leu Phe Pro Val Ser Ser

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Val Arg Ile Ala

165 170 175

Val Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Val Val

180 185 190

Ser Ser Asp Met Ile Lys Glu Tyr Val Ala Lys Thr Gly Thr Ala Leu

195 200 205

Ser Asp Phe Glu Ser Met Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala

210 215 220

Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Gly Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly

225 230 235 240

Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr Phe Leu Pro Trp

245 250

<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> unknown

<220>

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ctgaagtcga cgcagctgaa cgagctcgcc ctgaagtctg gcggcaaggt cgtcccggtc 180

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35 40 45

Leu Ala Leu Lys Ser Gly Gly Lys Val Val Pro Val Lys Leu Glu Ser

50 55 60

Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Glu Glu Lys

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Pro Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe

100 105 110

Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ser Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Leu Thr Lys Ser Ser Ala Pro His Phe Ile Val Val Ser Thr Lys

130 135 140

Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Phe Leu Phe Pro Val Ser Ser

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Val Arg Ile Ala

165 170 175

Val Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Val Val

180 185 190

Ser Ser Asp Met Ile Lys Glu Tyr Val Ala Lys Thr Gly Thr Ala Leu

195 200 205

Ser Asp Phe Glu Ser Met Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala

210 215 220

Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Gly Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly

225 230 235 240

Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr Phe Leu Pro Trp

245 250

<210> 7

<211> 759

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

atgtcttcgc ctactcccaa cgtctacgtc atttctggcg cctctcgcgg catcggtttc 60

gccatcacct ccatccttgc tcaacgcgac aacgtcctca tctttgccgg cgcacgcgac 120

ctgaagtcga cgcagctgaa cgagctcgcc ctgaagtctg gcggcaaggt cgtcccggtc 180

aagctcgagt cgacgagtgt cgaggatgcc gctgcgcttg caaaggttgt cgaggagaag 240

gctggaaagg tcgactacgt cttggcggtg gccggcatct cccagtcgac cgacccgatc 300

gcccaggttc cgctcgacga cgtcaggcgt cacttcgaag tcaacaccat cggccctctc 360

gtcctgttcc aatccctcct cgccctcctc accaagtcca gcgcgccgca ctttatcgtc 420

gtctccacca tcgccggctc gatcgcctcc atgccccaat tcctgcaacc cgtgagctcg 480

tacgcgatct ccaagaccgc cgtcaactcg gccgtggtgc gcatcgcggt cgagcacccc 540

gatctggacg cattcgtctg ccacccgggc gtggtcagta gcgacatgat caaggagtat 600

gtggcgaaga cgggcacagc gctctcggac tttgagtcga tgggtatgat caccccggaa 660

gaatcggctg cgagtctcgt caagctcttc gacggggcca agaaggagac gcactcgggc 720

aagttcttca acgtggacgg gacgttcttg ccatggtag 759

<210> 8

<211> 252

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Met Ser Ser Pro Thr Pro Asn Val Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Gly Phe Ala Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln Arg Asp Asn Val

20 25 30

Leu Ile Phe Ala Gly Ala Arg Asp Leu Lys Ser Thr Gln Leu Asn Glu

35 40 45

Leu Ala Leu Lys Ser Gly Gly Lys Val Val Pro Val Lys Leu Glu Ser

50 55 60

Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Glu Glu Lys

65 70 75 80

Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser

85 90 95

Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Pro Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe

100 105 110

Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ser Leu Leu Ala

115 120 125

Leu Leu Thr Lys Ser Ser Ala Pro His Phe Ile Val Val Ser Thr Ile

130 135 140

Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Phe Leu Gln Pro Val Ser Ser

145 150 155 160

Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Val Arg Ile Ala

165 170 175

Val Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Val Val

180 185 190

Ser Ser Asp Met Ile Lys Glu Tyr Val Ala Lys Thr Gly Thr Ala Leu

195 200 205

Ser Asp Phe Glu Ser Met Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala

210 215 220

Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Gly Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly

225 230 235 240

Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr Phe Leu Pro Trp

245 250

<210> 9

<211> 789

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

<210> 10

<211> 262

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Met Gly Tyr Asn Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ile Gly Glu Ala Ile Ile Arg Arg Tyr Ala Glu Glu Gly

20 25 30

Met Arg Val Val Ile Asn Tyr Arg Ser His Pro Glu Glu Ala Lys Lys

35 40 45

Ile Ala Glu Asp Ile Lys Gln Ala Gly Gly Glu Ala Leu Thr Val Gln

50 55 60

Gly Asp Val Ser Lys Glu Glu Asp Met Ile Asn Leu Val Lys Gln Thr

65 70 75 80

Val Asp His Phe Gly Gln Leu Asp Val Phe Val Asn Asn Ala Gly Val

85 90 95

Glu Met Pro Ser Pro Ser His Glu Met Ser Leu Glu Asp Trp Gln Lys

100 105 110

Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ala Arg Glu Ala

115 120 125

Leu Lys Tyr Phe Val Glu His Asn Val Lys Gly Asn Ile Ile Asn Met

130 135 140

Ser Ser Val His Glu Ile Ile Pro Trp Pro Thr Phe Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Ser Lys Gly Gly Val Lys Leu Met Thr Gln Thr Leu Ala Met Glu

165 170 175

Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Ile Asn Ala Ile Gly Pro Gly Ala Ile

180 185 190

Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Glu Asp Pro Lys Gln Arg Ala

195 200 205

Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Asn Ile Gly Lys Pro Glu Glu

210 215 220

Ile Ser Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Val

225 230 235 240

Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser

245 250 255

Phe Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种重组羰基还原酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位、第144位或第156位进行单突变获得的。

2.如权利要求1所述重组羰基还原酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第95位谷氨酰胺突变为天冬氨酸、第144位异亮氨酸突变为赖氨酸或第156位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺获得的。

3.一种权利要求1所述重组羰基还原酶突变体编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7之一所示。

4.一种由权利要求3所述重组羰基还原酶突变体编码基因构建的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体制备的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述重组羰基还原酶突变体在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以含重组羰基还原酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡萄糖脱氢酶为辅酶，于pH值为6-8的缓冲溶液中构成反应体系，在25-35℃、150-500rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为3-50g/L缓冲溶液，所述底物的初始浓度为10-1300mmol/L缓冲溶液，所述辅助底物用量为10-1820mmol/L缓冲溶液，所述葡萄糖脱氢酶用量以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体重量为计为3-50g/L缓冲溶液。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有重组羰基还原酶突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，150rpm下培养8h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000×g离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应体系中还添加有机溶剂，所述有机溶剂为水溶性有机溶剂或非水溶性有机溶剂，所述水溶性有机溶剂终体积添加量为5-15％，所述非水溶液有机溶剂体积终浓度添加量为10-30％，所述水溶性有机溶剂为下列之一：二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、吐温-20、吐温-60或吐温-80；所述非水溶性有机溶剂为下列之一：四氢呋喃、二氯甲烷、叔戊醇、甲苯、二甲苯、正辛醇、正己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯或甲基叔丁基醚。