CN113061593A - 一种l-苹果酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种l-苹果酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，与野生型L‑苹果酸脱氢酶相比，显著提高了酶活力。该L‑苹果酸脱氢酶突变体能够通过酶促拆分DL‑苹果酸来生产高光学纯度的D‑苹果酸和草酰乙酸。

Description

一种L-苹果酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种L-苹果酸脱氢酶突变体、及其用于生产D-苹果酸和草酰乙酸的用途。
背景技术
苹果酸，又名2-羟基丁二酸，由于分子中有一个不对称碳原子，故存在两种立体异构体L-苹果酸和D-苹果酸。天然存在的苹果酸都是L-型的，几乎存在于一切果实中，以仁果类中最多，也可由延胡索酸经生物发酵制得。它是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为性能优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、化妆品、医疗和保健品等领域。DL-苹果酸可由延胡索酸或马来酸在催化剂作用下于高温高压条件和水蒸气作用制得。因为人体不易代谢D-苹果酸，因而不允许DL-苹果酸作为添加剂。随着医药工业的发展，D-苹果酸在医药工业中有越来越广泛的用途，例如，D-苹果酸作为手性前体可用于手性药物的合成，用作原料合成抗生素、抗病毒药物、抗组胺药物等。
D-苹果酸的制备方法主要有化学合成法、外消旋体的物理和化学拆分法、生物法。化学合成及拆分法制备D-苹果酸成本较高，一直处于研究阶段。生物法制备D-苹果酸主要通过微生物自身诱导表达L-苹果酸脱氢酶的微生物由马来酸制备D-苹果酸；此外，参见CN110747190A，还有大肠杆菌表达L-苹果酸脱氢酶来全细胞催化制备D-苹果酸，产物浓度都可以达到200g/L以上，通过微生物自身诱导表达L-苹果酸脱氢酶的微生物培养条件复杂，微生物生长浓度不高，同时，产物中会含有少量的L-苹果酸、DL-苹果酸，苹果酸二聚体等难以分离的物质，提纯比较困难，造成工业化生产成本较高，无法满足市场需求。
采用一种专一高效的L-苹果酸脱氢酶，以DL-苹果酸为底物，将其中的L-苹果酸脱氢转化成为草酰乙酸，然后分别纯化提起D-苹果酸和草酰乙酸，是一个可供选择的替代方法。
发明内容
为了探索酶促拆分法制备D-苹果酸的工业化可行性，我们将研究方向关注在L-苹果酸脱氢酶(MDH，EC1.1.1.37)的利用上，并对于各种来源的L-苹果酸脱氢酶进行了筛选和比较。
L-苹果酸脱氢酶广泛存在于自然界的各种生物中，需要以NADP+(少数可以NAD+)为辅因子，可逆地催化L-苹果酸到草酰乙酸，是三羧酸循环(TCA cycle)的关键酶。源于冷海水黄杆菌(Flavobacterium frigidimaris KUC-1)的苹果酸脱氢酶(ffMDH)(SEQ ID NO:1)可以特异地催化L-苹果酸的氧化和草酰乙酸的还原，并能同时以NAD+和NADP+作为辅因子，但ffMDH热稳定性较差，因此通过定向诱变获得高酶活性和立体选择性的突变酶是本发明的目标。经过高通量筛选和实验验证，最终获得一些酶活力显著提高的L-苹果酸脱氢酶突变体ffMDHmut，通过大肠杆菌过表达密码子优化的ffMDHmut基因和LreNox基因，再辅以NADH/NADPH氧化酶进行全细胞催化，可高效制备D-苹果酸和草酰乙酸，有望在工业化生产中得到应用。
具体而言，本发明包含如下技术内容。
一种L-苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第65位的Y替换为D、第139位的R替换为L、第231位的A替换为V的突变体，其氨基酸序列为：
MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDDSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNLIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGVSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQ ID NO:3)；或者
SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第65位的Y替换为C、第231位的A替换为R的突变体，其氨基酸序列为：
MKVTIVGAGNVGATCADVISYRGIASEVVLLDIKEGFAEGKALDIMQCATNTGFNTKVSGVTNDCSKTAGSDVVVITSGIPRKPGMTREELIGINAGIVKTVAENVLKHSPNTIIVVVSNPMDTMTYLALKATGVPKNRIIGMGGALDSSRFRTYLSLALDKPANDISAMVIGGHGDTTMIPLTRLASYNGIPVTEFLSEEVLQKVAADTMVGGATLTGLLGTSAWYAPGRSVAYLVDSILNDQKKMIACSVFVEGEYGQNDICIGVPCIIGKNGVEEILDIKLNDQEKALFAKSADAVRGMNDALKSILV(SEQ ID NO:4)。
这两个突变体的共同特征是野生型L-苹果酸脱氢酶SEQ ID NO:1第65位的酪氨酸Y(或Tyr)和第231位的丙氨酸A(或Ala)发生了突变。
优选上述L-苹果酸脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的第二个方面提供了一种编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4的基因。
优选地，编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是核苷酸序列SEQ ID NO:5。
本发明的第三个方面提供了一种质粒，其包含编码上述L-苹果酸脱氢酶突变体的基因。该质粒优选是pET系列载体，比如是pET28a、pET24a或者pET-Duet，但并不受限于此。
在一种实施方式中，上述质粒还可以包含NADH氧化酶基因(Nox基因)，使得该质粒能够共表达L-苹果酸脱氢酶突变体的基因和NADH氧化酶的基因。优选该质粒载体是pET-Duet，由于pET-Duet含有双T7启动子，可同时启动两个基因比如L-苹果酸脱氢酶突变体基因和Nox基因的表达。
优选地，所述Nox基因是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri JCM 1112)来源的Nox基因(GenBank:AP007281.1)，简称为LreNox基因，SEQ ID NO:6：
atgaaggttattattgttggttgtacacatgcgggaacaattactgccactcaaattttacagaatcatccagaaacagaagtcacaatttatgaacggaatgataacgtttcattcctctcatgtgggattgcagtttacttgagcggtgatgttggtaatccagatgcgatgttttattcaagccctgaacaacttgctgccatgggtgcaacagttcatatgcaacataatgtaactgatattgaccctaagactaagacagtcacagtgacagaccttgtgacaggcgaaacaaagaccgaccattatgataagttagttgatactactggttcttggccagtaattccaccaattgaaggtgtagatggccctcatgtttatttgtgcaagaattaccatcatgctaaagaattatttaacgttgctaaagatgcgcaacgaattgttgtgattggtggaggttatattggggttgaattagtagaagcttacactcgtcaaaataaggacgttacattgattgatgggtctccacggatgcttcataaatactttgaccgcgagtatacggatcgaattcaacaggaatttgtagatcacggcgcccactttgcttttgaccaacgcgtaactggatttgaaaaccacgaaaatggtgtaaccgttaagacggataagggcaactacgaggcagatattgctatcctctgtgttggcttccgtcctaatactgatctcttaaaaggtaaagttaagatgcatgataatggggcaatcattacgaacgaatacatgcaatcatctgatccagatatttacgctgccggagattcaacggctgttcactataacccaactggcaaggatgcatacattccattagctactaacgctattcggcaaggaacaattgttggaacaaatctctttggtaatacaatgcgcgatatgggaacccaatctagttctggcttaaacttatatggaacaacgatggtatcatctggcttaactttggagaatgccaaagaagcgggctttgatgcagctgcggtgacagttgaagacaactaccgtccagaatttatgccgacaacaactcctgtattaatgacattggtgtgggataagaagactcggcaaattcttggtggacagtttatgagtaagcatgatgtttctcaatctgctaacattatttccttatgtatccaggataagcacacgattgattatttagcatttgttgatatgcttttccaaccacactttgatcgtccatttaactatgtaaatattcttggccaagcggcggtaaagaaacaagctgaattagaaaaataa(SEQ ID NO:6)。
上述NADH氧化酶(NOX)是NADH脱氢酶的一种，LreNox是能够同时催化NADH/NADPH氧化为NAD+/NADP+的氧化还原酶。由于NAD+/NADP+可以作为L-苹果酸脱氢酶催化L-苹果酸生成草酰乙酸的辅因子，因此NADH氧化酶的存在有助于促进对DL-苹果酸的拆分反应。
本发明的第四个方面提供了一种转化了上述质粒的微生物。作为一种基因工程菌宿主，该微生物可以选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。例如，该微生物可以是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个方面在于提供上述L-苹果酸脱氢酶突变体或者上述微生物在生产D-苹果酸中的用途。
具体地讲，使用上述L-苹果酸脱氢酶突变体或者上述微生物作为生物催化剂，通过手性拆分底物DL-苹果酸，将L-苹果酸转化为草酰乙酸，从而生产D-苹果酸和草酰乙酸。
在反应体系中，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式。
优选地，反应体系中还可以添加有辅因子NAD+或者NADP+以便促进催化反应。
本发明筛选的L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的酶活力相对于野生型L-苹果酸脱氢酶SEQ ID NO:1都有显著提高，其中SEQ ID NO:3的酶活力提高了3倍多，而且立体选择性更高。当采用表达该L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3的全细胞催化底物DL-苹果酸进行拆分反应时，只催化L-苹果酸反应，但D-苹果酸没有消耗，提示该突变体具有工业化开发应用前景。
附图说明
图1是用于表达野生型L-苹果酸脱氢酶ffMDH的质粒pET28a-ffMDH结构示意图。
图2是用于共表达突变体SEQ ID NO:3和NADH氧化酶的质粒pET-Duet-ffMDHmut-Nox的结构示意图。
具体实施方式
冷海水黄杆菌(Flavobacterium frigidimaris KUC-1)来源的野生型L-苹果酸脱氢酶(ffMDH)的基因文库号是Genbank：AB161423，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明在SEQ ID NO:1的基础上进行了随机突变，虽然绝大部分突变体都是负向突变，即酶活力不升反降，或者酶活力大致相当，但也得到了个别酶活力提高的正向突变体，包括(Y65D、R139L、A231V)突变体SEQ ID NO:3和(Y65C、A231R)突变体SEQ ID NO:4。
这两个突变体具有超过99％的同源性，值得注意的是，它们的共同点是Y65和A231发生突变，提示这两个位点与酶活力密切相关。另外研究中还发现，L31也是一个值得关注的位点，也有可能与酶的活性中心有关，这些位点有待于进一步研究。
在本文中L-苹果酸脱氢酶SEQ ID NO:1可以称为“野生(型)酶”、“野生酶”、“野生(型)L-苹果酸脱氢酶”等，标示为WT或ffMDH。
本发明的L-苹果酸脱氢酶突变体的氨基酸数量只有311个，结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在不同微生物中实现突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的最佳表达，可以针对特定的微生物比如大肠杆菌、毕赤酵母、或者枯草芽孢杆菌进行密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。比如，当在大肠杆菌中表达野生L-苹果酸脱氢酶时，可以选择基因SEQ ID NO:2；当在大肠杆菌中表达突变体SEQ ID NO:3时，可以选择基因SEQ ID NO:5。
上述转化体宿主可以使任何适合表达本发明突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产时，本发明的突变体可以呈现分离酶的形式或者菌体的形式。所述分离酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述突变体SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的微生物菌体细胞作为酶催化反应的生物催化剂。菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金唯智生物技术有限公司完成。
实施例中所用的引物列表如下。
表1、PCR实验中所用引物
引物名称 序列(5’-3’)
FfMDH-F agcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagttagaccagaatgcttttcag
FfMDH-R ataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaatgaaagttactatcgttggc
FfMDHmut-F caattcccctctagaatgaaagttactatcgttggc
FfMDHmut-R ttcggatccttagaccagaatgcttttcagcg
FfMDHmut-V-F gaggatcgagatcgatctcg
LreNox-F tcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacatatgaaggttattattgttgg
LreNox-R tcaaatttcgcagcagcggtttctttaccagactcgagttatttttctaattcagcttg
LreNox-V-F1 taatcgtattgtacacggccgc
LreNox-V-F2 gatcacggcgcccactttgc
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
苹果酸和草酰乙酸的HPLC测定条件：
使用安捷伦高效液相色谱仪1260infinity II进行检测，色谱柱为手性色谱柱CHIRALPAK-IC(4.6×250mm，5μm)；流动相为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝80∶20∶0.1，流速为0.5mL/min；进样量为100μL；检测波长为210nm；柱温为35℃。
旋光仪型号：Rudolph Autopol V。
实施例1野生型L-苹果酸脱氢酶定向突变
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
以野生型L-苹果酸脱氢酶ffMDH(Genbank：AB161423)序列为模板，进行大肠杆菌密码子优化，优化后核苷酸序列为SEQ ID NO:2。进行全基因合成。将基因SEQ ID NO:2通过xbaI/XhoI连入到pET28a载体中，构建得到质粒pET28a-ffMDH，参见图1。
以pET28a-ffMDH为模板，进行易错PCR。50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒模板pET28a-ffMDH，50pmol ffMDH-F和ffMDH-R，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mMdCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas公司)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min。
胶回收0.95kb大小PCR片段(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，以上述回收PCR片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃1min，25个循环；68℃10min。
Dpn I限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen公司)，涂含有50μg/mL卡那霉素LB平板，得到表达L-苹果酸脱氢酶突变体的重组大肠杆菌。也可以将其他微生物比如毕赤酵母、枯草芽孢杆菌等作为宿主来表达L-苹果酸脱氢酶突变体。
实施例2高通量筛选高活性突变体库
在实施例1得到的各个LB平板上挑取单克隆转化子，接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至30℃，继续培养16h，4000rpm离心5min，沉淀菌泥用加入终浓度为1mg/ml溶菌酶150ul的50mM Glycine-NaOH(pH7.0)缓冲液悬浮，30℃放置30min。等细胞裂解后，依次加入终浓度为10mM的L-苹果酸，2mM NAD+，通过测定340nm下的吸光值变化判断活力的大小。
酶活测定方法：
酶活力(U/mg)＝ΔOD340×Vt×df/(ε×b×Vs×c)
Vt：反应总体积；Vs：样品体积；ε：摩尔消光系数6.22×103(L/m-1cm-1)；
b：光程(1.0cm)；df：稀释因子；c：酶蛋白浓度。
酶的酶活力和立体选择性也可以通过在评价酶促反应动力学中常用的米氏方程常数比如Km(米氏常数)、Vmax(最大速度)、kcat(转换数)等进行表征。
通过对实施例1中得到的突变体转化子进行酶活力测定，发现绝大部分突变体要么酶活力下降，要么酶活力大致相当，极个别突变体的酶活力有2倍以上的提高，筛选出5个转化子进行验证和突变体鉴定。
实施例3苹果酸脱氢酶突变体及催化性能鉴定
从实施例2中所得的突变体转化子中挑选5株经96孔板检测的高活力菌株，并以野生型L-苹果酸脱氢酶ffMDH表达菌株(转入质粒pET28a-ffMDH的转化子)作为对照菌株，按照实施例2中所述96孔板制备菌体方法进行LB摇瓶培养。收集菌体进行酶催化性能鉴定，酶活力参数测定方法同上，酶活力测定前酶液30℃保温2h；同时抽提质粒(Axygen小量质粒制备试剂盒)，送南京金唯智生物技术有限公司测序验证ffMDH突变靶点。突变体的酶活测试及测序结果列于如下表2中。
表2、
基因型 Km(mM) Vmax(U/mg)
WT 0.3 126
G259P 0.31 238
Y65C、A231R 0.23 417
L31P、D123Q 0.28 315
Y65D、R139L、A231V 0.19 493
L31D、G259P 0.25 372
表2的实验结果显示，Y65D、R139L、A231V突变所形成的突变体(即SEQ ID NO:3)的酶活性相比野生型酶SEQ ID NO:1有明显提高，提高了3倍多，将其命名为ffMDHmut。另外，Y65C、A231R突变所形成的突变体(即SEQ ID NO:4)的酶活性相比野生型酶SEQ ID NO:1也有明显提高，提高了2倍多。
实施例4突变体用于拆分苹果酸制备D-苹果酸
4.1构建NADH氧化酶与ffMDH突变体共表达质粒
针对ffMDH突变体SEQ ID NO:3，设计其编码基因SEQ ID NO:5。按照实施例1中的方法，构建用于表达突变体ffMDHmut的质粒pET28a-ffMDHmut。
以pET28a-ffMDHmut质粒为模板，PCR扩增ffMDHmut基因片段SEQ ID NO:5，PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，68℃30s，30个循环；68℃10min。
胶回收0.95kb大小PCR片段(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，回收片段连入pET-Duet质粒XbaI/BamHI酶切位点，获得pET-Duet-ffMDHmut质粒，FfMDHmut-V-F引物单向测序验证获得阳性质粒；采用引物对LreNox-F/LreNox-R，以合成pUC-Nox(罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri JCM 1112菌株来源的Nox基因SEQ ID NO:6)质粒为模板，PCR扩增LreNox基因，PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，68℃50s，30个循环；68℃10min。胶回收1.35kb大小PCR片段(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)，回收片段连入pET-Duet-ffMDHmut质粒NdeI/XhoI酶切位点，获得pET-Duet-ffMDHmut-Nox质粒，用LreNox-V-F1和LreNox-V-F2引物测序鉴定阳性质粒，阳性质粒图谱如图2所示。
4.2全细胞催化拆分反应
将pET-Duet-ffMDHmut-LreNox质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中，获得BL21(DE3)/pET-Duet-ffMDHmut-LreNox菌株，将此菌株按照实施例3中所述摇瓶培养方案进行培养，IPTG诱导后，直接加入终浓度为0.5M的DL-苹果酸溶液(pH7.0)，30℃振荡培养5h，HPLC检测D-苹果酸和L-苹果酸及草酰乙酸含量，检测结果显示L-苹果酸已经100％转化为草酰乙酸，且D-苹果酸没有任何消耗。
综上所述，本发明筛选的L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的酶活力相对于野生型L-苹果酸脱氢酶SEQ ID NO:1都有显著提高，能够用于催化底物DL-苹果酸进行拆分反应制备D-苹果酸，有工业化开发应用前景。
序列表
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 一种L-苹果酸脱氢酶突变体及其应用
<130> SHPI2110056
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 311
<212> PRT
<213> Flavobacterium frigidimaris KUC-1
<400> 1
Met Lys Val Thr Ile Val Gly Ala Gly Asn Val Gly Ala Thr Cys Ala
1 5 10 15
Asp Val Ile Ser Tyr Arg Gly Ile Ala Ser Glu Val Val Leu Leu Asp
20 25 30
Ile Lys Glu Gly Phe Ala Glu Gly Lys Ala Leu Asp Ile Met Gln Cys
35 40 45
Ala Thr Asn Thr Gly Phe Asn Thr Lys Val Ser Gly Val Thr Asn Asp
50 55 60
Tyr Ser Lys Thr Ala Gly Ser Asp Val Val Val Ile Thr Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Ile Gly Ile Asn Ala
85 90 95
Gly Ile Val Lys Thr Val Ala Glu Asn Val Leu Lys His Ser Pro Asn
100 105 110
Thr Ile Ile Val Val Val Ser Asn Pro Met Asp Thr Met Thr Tyr Leu
115 120 125
Ala Leu Lys Ala Thr Gly Val Pro Lys Asn Arg Ile Ile Gly Met Gly
130 135 140
Gly Ala Leu Asp Ser Ser Arg Phe Arg Thr Tyr Leu Ser Leu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Lys Pro Ala Asn Asp Ile Ser Ala Met Val Ile Gly Gly His Gly
165 170 175
Asp Thr Thr Met Ile Pro Leu Thr Arg Leu Ala Ser Tyr Asn Gly Ile
180 185 190
Pro Val Thr Glu Phe Leu Ser Glu Glu Val Leu Gln Lys Val Ala Ala
195 200 205
Asp Thr Met Val Gly Gly Ala Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Ser
210 215 220
Ala Trp Tyr Ala Pro Gly Ala Ser Val Ala Tyr Leu Val Asp Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asn Asp Gln Lys Lys Met Ile Ala Cys Ser Val Phe Val Glu Gly
245 250 255
Glu Tyr Gly Gln Asn Asp Ile Cys Ile Gly Val Pro Cys Ile Ile Gly
260 265 270
Lys Asn Gly Val Glu Glu Ile Leu Asp Ile Lys Leu Asn Asp Gln Glu
275 280 285
Lys Ala Leu Phe Ala Lys Ser Ala Asp Ala Val Arg Gly Met Asn Asp
290 295 300
Ala Leu Lys Ser Ile Leu Val
305 310
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgaaagtta ctatcgttgg cgcgggcaac gttggtgcaa cctgcgcaga tgtaatcagc 60
taccgtggta tcgcgtctga ggtagttctg ctggatatca aagaaggttt cgctgaaggc 120
aaagctctgg atatcatgca gtgcgcaact aatactggtt tcaacaccaa ggttagcggc 180
gtcactaatg attacagcaa aactgcaggt tccgatgttg tagtaatcac gtctggtatt 240
cctcgtaagc cgggcatgac ccgtgaggaa ctgatcggta ttaacgcggg tatcgttaaa 300
actgttgcgg aaaacgtact gaagcacagc ccgaatacga tcatcgttgt tgtttccaac 360
ccgatggata ccatgaccta cctggccctg aaagctactg gcgtaccaaa aaatcgtatt 420
atcggtatgg gtggcgctct ggactctagc cgcttccgta cttacctgtc cctggccctg 480
gataaaccgg ctaacgacat ctccgcgatg gtaattggtg gccacggtga caccaccatg 540
atcccgctga ctcgtctggc gagctacaac ggcatcccgg taactgaatt cctgtctgaa 600
gaagttctgc agaaggtagc ggctgatacc atggttggtg gcgcgaccct gaccggtctg 660
ctgggcacgt ctgcttggta cgcaccaggt gcgagcgtgg catacctggt ggattctatt 720
ctgaacgatc agaaaaaaat gatcgcgtgc agcgtattcg tggaaggtga atacggtcag 780
aacgacattt gcatcggcgt gccgtgtatt attggcaaaa acggtgttga agaaatcctg 840
gacatcaagc tgaacgacca ggaaaaagcc ctgttcgcga aaagcgctga cgcggttcgt 900
ggtatgaacg atgcgctgaa aagcattctg gtctaa 936
<210> 3
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Lys Val Thr Ile Val Gly Ala Gly Asn Val Gly Ala Thr Cys Ala
1 5 10 15
Asp Val Ile Ser Tyr Arg Gly Ile Ala Ser Glu Val Val Leu Leu Asp
20 25 30
Ile Lys Glu Gly Phe Ala Glu Gly Lys Ala Leu Asp Ile Met Gln Cys
35 40 45
Ala Thr Asn Thr Gly Phe Asn Thr Lys Val Ser Gly Val Thr Asn Asp
50 55 60
Asp Ser Lys Thr Ala Gly Ser Asp Val Val Val Ile Thr Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Ile Gly Ile Asn Ala
85 90 95
Gly Ile Val Lys Thr Val Ala Glu Asn Val Leu Lys His Ser Pro Asn
100 105 110
Thr Ile Ile Val Val Val Ser Asn Pro Met Asp Thr Met Thr Tyr Leu
115 120 125
Ala Leu Lys Ala Thr Gly Val Pro Lys Asn Leu Ile Ile Gly Met Gly
130 135 140
Gly Ala Leu Asp Ser Ser Arg Phe Arg Thr Tyr Leu Ser Leu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Lys Pro Ala Asn Asp Ile Ser Ala Met Val Ile Gly Gly His Gly
165 170 175
Asp Thr Thr Met Ile Pro Leu Thr Arg Leu Ala Ser Tyr Asn Gly Ile
180 185 190
Pro Val Thr Glu Phe Leu Ser Glu Glu Val Leu Gln Lys Val Ala Ala
195 200 205
Asp Thr Met Val Gly Gly Ala Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Ser
210 215 220
Ala Trp Tyr Ala Pro Gly Val Ser Val Ala Tyr Leu Val Asp Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asn Asp Gln Lys Lys Met Ile Ala Cys Ser Val Phe Val Glu Gly
245 250 255
Glu Tyr Gly Gln Asn Asp Ile Cys Ile Gly Val Pro Cys Ile Ile Gly
260 265 270
Lys Asn Gly Val Glu Glu Ile Leu Asp Ile Lys Leu Asn Asp Gln Glu
275 280 285
Lys Ala Leu Phe Ala Lys Ser Ala Asp Ala Val Arg Gly Met Asn Asp
290 295 300
Ala Leu Lys Ser Ile Leu Val
305 310
<210> 4
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Met Lys Val Thr Ile Val Gly Ala Gly Asn Val Gly Ala Thr Cys Ala
1 5 10 15
Asp Val Ile Ser Tyr Arg Gly Ile Ala Ser Glu Val Val Leu Leu Asp
20 25 30
Ile Lys Glu Gly Phe Ala Glu Gly Lys Ala Leu Asp Ile Met Gln Cys
35 40 45
Ala Thr Asn Thr Gly Phe Asn Thr Lys Val Ser Gly Val Thr Asn Asp
50 55 60
Cys Ser Lys Thr Ala Gly Ser Asp Val Val Val Ile Thr Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Ile Gly Ile Asn Ala
85 90 95
Gly Ile Val Lys Thr Val Ala Glu Asn Val Leu Lys His Ser Pro Asn
100 105 110
Thr Ile Ile Val Val Val Ser Asn Pro Met Asp Thr Met Thr Tyr Leu
115 120 125
Ala Leu Lys Ala Thr Gly Val Pro Lys Asn Arg Ile Ile Gly Met Gly
130 135 140
Gly Ala Leu Asp Ser Ser Arg Phe Arg Thr Tyr Leu Ser Leu Ala Leu
145 150 155 160
Asp Lys Pro Ala Asn Asp Ile Ser Ala Met Val Ile Gly Gly His Gly
165 170 175
Asp Thr Thr Met Ile Pro Leu Thr Arg Leu Ala Ser Tyr Asn Gly Ile
180 185 190
Pro Val Thr Glu Phe Leu Ser Glu Glu Val Leu Gln Lys Val Ala Ala
195 200 205
Asp Thr Met Val Gly Gly Ala Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Ser
210 215 220
Ala Trp Tyr Ala Pro Gly Arg Ser Val Ala Tyr Leu Val Asp Ser Ile
225 230 235 240
Leu Asn Asp Gln Lys Lys Met Ile Ala Cys Ser Val Phe Val Glu Gly
245 250 255
Glu Tyr Gly Gln Asn Asp Ile Cys Ile Gly Val Pro Cys Ile Ile Gly
260 265 270
Lys Asn Gly Val Glu Glu Ile Leu Asp Ile Lys Leu Asn Asp Gln Glu
275 280 285
Lys Ala Leu Phe Ala Lys Ser Ala Asp Ala Val Arg Gly Met Asn Asp
290 295 300
Ala Leu Lys Ser Ile Leu Val
305 310
<210> 5
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
atgaaagtta ctatcgttgg cgcgggcaac gttggtgcaa cctgcgcaga tgtaatcagc 60
taccgtggta tcgcgtctga ggtagttctg ctggatatca aagaaggttt cgctgaaggc 120
aaagctctgg atatcatgca gtgcgcaact aatactggtt tcaacaccaa ggttagcggc 180
gtcactaatg atgacagcaa aactgcaggt tccgatgttg tagtaatcac gtctggtatt 240
cctcgtaagc cgggcatgac ccgtgaggaa ctgatcggta ttaacgcggg tatcgttaaa 300
actgttgcgg aaaacgtact gaagcacagc ccgaatacga tcatcgttgt tgtttccaac 360
ccgatggata ccatgaccta cctggccctg aaagctactg gcgtaccaaa aaatcttatt 420
atcggtatgg gtggcgctct ggactctagc cgcttccgta cttacctgtc cctggccctg 480
gataaaccgg ctaacgacat ctccgcgatg gtaattggtg gccacggtga caccaccatg 540
atcccgctga ctcgtctggc gagctacaac ggcatcccgg taactgaatt cctgtctgaa 600
gaagttctgc agaaggtagc ggctgatacc atggttggtg gcgcgaccct gaccggtctg 660
ctgggcacgt ctgcttggta cgcaccaggt gtgagcgtgg catacctggt ggattctatt 720
ctgaacgatc agaaaaaaat gatcgcgtgc agcgtattcg tggaaggtga atacggtcag 780
aacgacattt gcatcggcgt gccgtgtatt attggcaaaa acggtgttga agaaatcctg 840
gacatcaagc tgaacgacca ggaaaaagcc ctgttcgcga aaagcgctga cgcggttcgt 900
ggtatgaacg atgcgctgaa aagcattctg gtctaa 936
<210> 6
<211> 1350
<212> DNA
<213> Lactobacillus reuteri JCM 1112
<400> 6
atgaaggtta ttattgttgg ttgtacacat gcgggaacaa ttactgccac tcaaatttta 60
cagaatcatc cagaaacaga agtcacaatt tatgaacgga atgataacgt ttcattcctc 120
tcatgtggga ttgcagttta cttgagcggt gatgttggta atccagatgc gatgttttat 180
tcaagccctg aacaacttgc tgccatgggt gcaacagttc atatgcaaca taatgtaact 240
gatattgacc ctaagactaa gacagtcaca gtgacagacc ttgtgacagg cgaaacaaag 300
accgaccatt atgataagtt agttgatact actggttctt ggccagtaat tccaccaatt 360
gaaggtgtag atggccctca tgtttatttg tgcaagaatt accatcatgc taaagaatta 420
tttaacgttg ctaaagatgc gcaacgaatt gttgtgattg gtggaggtta tattggggtt 480
gaattagtag aagcttacac tcgtcaaaat aaggacgtta cattgattga tgggtctcca 540
cggatgcttc ataaatactt tgaccgcgag tatacggatc gaattcaaca ggaatttgta 600
gatcacggcg cccactttgc ttttgaccaa cgcgtaactg gatttgaaaa ccacgaaaat 660
ggtgtaaccg ttaagacgga taagggcaac tacgaggcag atattgctat cctctgtgtt 720
ggcttccgtc ctaatactga tctcttaaaa ggtaaagtta agatgcatga taatggggca 780
atcattacga acgaatacat gcaatcatct gatccagata tttacgctgc cggagattca 840
acggctgttc actataaccc aactggcaag gatgcataca ttccattagc tactaacgct 900
attcggcaag gaacaattgt tggaacaaat ctctttggta atacaatgcg cgatatggga 960
acccaatcta gttctggctt aaacttatat ggaacaacga tggtatcatc tggcttaact 1020
ttggagaatg ccaaagaagc gggctttgat gcagctgcgg tgacagttga agacaactac 1080
cgtccagaat ttatgccgac aacaactcct gtattaatga cattggtgtg ggataagaag 1140
actcggcaaa ttcttggtgg acagtttatg agtaagcatg atgtttctca atctgctaac 1200
attatttcct tatgtatcca ggataagcac acgattgatt atttagcatt tgttgatatg 1260
cttttccaac cacactttga tcgtccattt aactatgtaa atattcttgg ccaagcggcg 1320
gtaaagaaac aagctgaatt agaaaaataa 1350

Claims (10)

1.一种L-苹果酸脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:4。
2.编码如权利要求1所述L-苹果酸脱氢酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码L-苹果酸脱氢酶突变体SEQ ID NO:3的基因核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
4.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求3所述的基因。
5.如权利要求5所述的质粒，其特征在于，还包含NADH氧化酶基因即Nox基因。
6.转化了如权利要求4或5所述质粒的微生物。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌。
8.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述L-苹果酸脱氢酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产D-苹果酸中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，用权利要求1所述L-苹果酸脱氢酶突变体或者如权利要求6所述微生物通过手性拆分DL-苹果酸来生产D-苹果酸和草酰乙酸。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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