CN113917140B - 一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，涉及蛋白原核表达系统领域。本发明将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS‑PAGE检测和Western blot等验证过程。通过改进诱导方法和筛选方法，采用Dot blot(斑点印记)可以快速实现多个单克隆菌落的鉴定，从而有助于更快速的获得原核蛋白表达的阳性菌。整个过程仅仅需要2‑3天，可以极大程度上缩减工作量以及实验周期，有利于节约科研人员的宝贵时间。

Description

一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法
技术领域
本发明涉及蛋白原核表达系统领域，具体而言，涉及一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法。
背景技术
目前，筛选原核蛋白表达菌的方法是：在得到待转化质粒后，先将待转化质粒转入感受态细胞，培养，挑取单克隆菌斑，进一步活化、诱导目标蛋白的表达，细胞破碎后采用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测和/或Western blot(蛋白质印记法)验证等一系列实验过程。一般需要5-7天，且尚不能保证目的蛋白有表达，需要重新挑斑、检测、验证等实验。若平板上没有目的菌斑，甚至需要重新转化，增加了工作量和时间成本。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述平板上含抗生素的浓度为0.5‰～1‰。
在一种可选的实施方式中，感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布体积为30-100μL。可选地，将部分感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上。
在本发明应用较佳的实施方式中，每100ul带有目标质粒的感受态细胞与终浓度为0.5mM-2mM的诱导剂混合。
在一种可选的实施方式中，感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述诱导剂选自IPTG、TMG或ONPG。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述对菌液进行细胞裂解获得沉淀液的方法包括：采用超声细胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、热休克法或化学裂解液法使得菌液的细胞破碎，然后离心得到沉淀物，经缓冲液溶解沉淀后获得沉淀液。
在一种可选的实施方式中，缓冲液为8-10M的尿素溶液。
在本发明应用较佳的实施方式中，取5-30μL的菌液进行细胞裂解。
在一种可选的实施方式中，裂解是在0-4℃下超声15-20min，然后进行离心收集沉淀物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述对沉淀液进行Dot blot分析包括：将沉淀液直接点在PVDF膜上，干燥后，进行封闭，依次与一抗和二抗孵育，曝光。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括：根据曝光的结果判断菌株是否表达目的蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述一抗为小鼠抗6×His单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述曝光是采用ECL发光试剂盒或DAB显色试剂盒。
本发明具有以下有益效果：
本发明将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS-PAGE检测和Western blot等验证过程。通过改进诱导方法和筛选方法，采用Dotblot(斑点印记)可以快速实现多个单克隆菌落的鉴定，从而有助于更快速的获得原核蛋白表达的阳性菌。整个过程仅仅需要2-3天，可以极大程度上缩减工作量以及实验周期，有利于节约科研人员的宝贵时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
图2为实施例2提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
图3为实施例3提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
图4为对比例1提供的快速筛选原核蛋白表达菌的方法的印迹实验结果图；
图5实施例1筛选出的原核蛋白表达菌细胞裂解后的蛋白沉淀物进行WesternBlot验证结果图；
图6实施例2筛选出的原核蛋白表达菌细胞裂解后的蛋白沉淀物进行WesternBlot验证结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑。
发明人发现，将热激后的感受态细胞直接与诱导剂混合，而后将二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同时节省活化的时间和检测的时间，缩减了活化后再诱导的冗长步骤、SDS-PAGE检测和Western blot等验证过程。通过改进诱导方法和筛选方法，采用Dot blot(斑点印记)可以快速实现多个单克隆菌落的鉴定，从而有助于更快速的获得原核蛋白表达的阳性菌。整个过程仅仅需要2-3天，可以极大程度上缩减工作量以及实验周期，有利于节约科研人员的宝贵时间。本发明筛选的阳性菌落可以用来完成后续的实验。
上述热激后的带有目标质粒的感受态细胞是指：感受态细胞融化后，加入目标质粒，冰上静置20-30min后，40-42℃热激40-90s后置于冰上静置的感受态细胞。需要说明的是，热激步骤可根据感受态细胞的不同选择热激的条件。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述平板上含抗生素的浓度为0.5‰～1‰(m/v)。发明人发现，当抗生素的浓度在上述范围内时，可以保证平板上在正常时间范围内长单克隆菌斑。若抗生素的浓度低于0.5‰，则容易导致假阳性菌斑的出现，而抗生素的浓度高于1‰，又会抑制正常阳性菌落的生长，致使整个培养周期延长，从而不利于阳性菌落的快速筛选。
抗生素的类型可以是大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、β-内酰胺类抗生素和氨基糖苷类抗生素中的任意一种或两种。
大环内酯类抗生素选自红霉素、白霉素、乙酰螺旋霉素、阿齐霉素、克拉霉素、麦迪霉素和交沙霉素中的至少一种。
四环素类抗生素选自四环素、土霉素、金霉素、多西霉素、米诺霉素和美他环素中的至少一种。
此外，上述四环素类抗生素还可以是其他四环素族的化合物中的至少一种，例如选自氯四环素、多西环素、甘氨四环素、胍甲环素、赖甲环素、甲烯土霉素或山环素。
β-内酰胺类抗生素为头孢菌素类抗生素；头孢菌素类抗生素选自头孢唑啉钠、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢孟多酯钠、头孢西丁钠、头孢呋新、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢他啶、头孢唑肟钠、氨苄青霉素和安曲南中的至少一种。
氨基糖苷类抗生素选自链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素和阿斯霉素中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布体积为30-100μL。在其他实施方式中，可以根据需要将混合液部分或全部涂布于含有抗生素的平板上。
在本发明应用较佳的实施方式中，每100ul带有目标质粒的感受态细胞与终浓度为0.5mM-2mM的诱导剂混合。发明人发现，在上述浓度下，可以更好的诱导目的菌株的目的蛋白表达。
在一种可选的实施方式中，感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。例如可以是大肠杆菌BL21(DE3)、DH5α或Top10感受态细胞。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述诱导剂选自IPTG(异丙基巯基半乳糖)、TMG(巯甲基半乳糖苷)、ONPG(O-硝基半乳糖苷)、阿拉伯糖、色氨酸或磷酸盐。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述对菌液进行细胞裂解获得沉淀液的方法包括：采用超声细胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、热休克法或化学裂解液法使得菌液的细胞破碎，然后离心得到沉淀物，经缓冲液溶解沉淀后获得沉淀液。
在一种可选的实施方式中，缓冲液为8-10M的尿素溶液。可选的，缓冲也为包涵体缓冲液。
在本发明应用较佳的实施方式中，取5-30μL的菌液进行细胞裂解。本发明选取较少体积的菌液进行细胞裂解，离心即可获得沉淀物，通过对沉淀物进行Dot blot分析即可确认菌株是否表达目的蛋白，从而筛选出相应的阳性菌株。
需要说明的是，只要目的菌株表达了蛋白，沉淀物中就可以收集到蛋白，利用Dotblot分析实现准确的检测。
在一种可选的实施方式中，裂解是在0-4℃下超声15-20min，然后进行离心收集沉淀物。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述对沉淀液进行Dot blot分析包括：将沉淀液直接点在PVDF膜上，干燥后，进行封闭，依次与一抗和二抗孵育，曝光。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括：根据曝光的结果判断菌株是否表达目的蛋白。曝光显影后，可以看到PVDF膜上的印迹情形。若有印迹，可判断其为阳性菌株。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述一抗为小鼠抗6×His单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG。在其他实施方式中，也可以根据需要设置一抗和二抗的类型。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述曝光是采用ECL发光试剂盒或DAB显色试剂盒。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其包括如下依次进行的质粒转化、筛选阳性菌斑和Dot blot检测。
1.质粒的转化
(1)质粒准备：质粒干粉加入30μL无菌水，震荡，离心(5000rpm×30s)；本实施例中的质粒选自带有组氨酸标签(6×His标签)和目的基因的质粒(质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)。本实施例中，根据目的序列设计引物，保留载体N端标签，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出足够量的PCR产物，将外源基因连接至终载，通过阳性克隆筛选以及测序验证，得到全基因合成的质粒。
(2)从-80℃冰箱中取制备好的1管(100μL/管)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(感受态细胞由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，货号B528414-0005)，在冰盒上慢慢融化，加入1μL准备好的质粒，于冰盒上静置30min，42℃水浴热激90s，冰盒上静置5min(质粒转入菌株)；
(3)待10mL固体培养基冷却至50～60℃时，加入卡那霉素抗生素(质粒抗性+菌株抗性)0.5‰(每1000mL中加入0.5g的卡那霉素)，倒平板；
(4)涂板：取1μL 0.1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)加至步骤(2)中热激后的感受态细胞中，轻微吹打混合均匀后取出30μL菌液，用玻璃涂布珠在平板中涂布均匀，37℃培养箱，倒置，培养24小时。
2.筛选阳性菌斑。
(1)菌种保存。
在超净工作台中取20μL无抗性的无菌LB肉汤培养基于1.5mL无菌离心管中，在上述质粒转化步骤(4)过夜培养的平板中挑取多个单菌落溶于无抗性培养基中，吹打混匀，4℃保存备用。
(2)制备样品。
将步骤(1)中每管菌液各取10μL分别加入新的1.5mL无菌离心管中(剩余菌液作为菌种4℃保存备用)，加入10μL破碎缓冲液(50mM Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)，300mM NaCl(氯化钠)，0.2％曲拉通X-100(Triton X-100)，pH＝8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，超声完毕后，15000rpm，4℃离心10min，将上清和沉淀彻底分离，沉淀用10μL包涵体缓冲液(8M尿素，pH＝8.0)溶解，制成“沉淀液”。
3.Dot Blot检测。
(1)点样：取一张PVDF转印膜，用铅笔画出田字形网格，浸没在甲醇中活化2分钟，将活化后的PVDF转印膜铺在干净的滤纸上，取筛选阳性菌斑步骤(2)中的上清和尿素溶解后的“沉淀液”各取10μL分别点于PVDF转印膜田字网格的中心，放在37℃烘箱中烘干。
(2)封闭：将烘干后的PVDF膜浸没在7.5％的脱脂奶粉中(脱脂奶粉用洗涤缓冲液(TBST)充分溶解)，37℃，震荡孵育2小时封闭。
(3)孵抗体：将封闭好的PVDF膜用TBST室温震荡淋洗3次，每次10min，洗去多余的脱脂奶粉后浸没在小鼠抗6×His单克隆抗体(一抗)中(单克隆抗体由生工生物提供，货号D191001，稀释比例1:2000)，37℃震荡孵育1小时，再用TBST室温震荡淋洗3次，每次10min，洗去多余一抗，将洗好后的PVDF膜浸没在HRP标记的山羊抗小鼠IgG(二抗)中(多克隆抗体由生工生物提供，货号D110087，稀释比例1:8000)，37℃震荡孵育30分钟，再用TBST室温震荡淋洗3次，每次10分钟，洗去多余二抗。
(4)曝光：将ECL发光试剂盒(试剂盒由生工生物提供，货号C510043)中的发光液和稳定液各取500uL 1:1混合均匀后涂在PVDF膜点样的一面，静置1分钟，将PVDF膜用单层保鲜膜包裹后放于X光暗盒中(暗盒由生工生物提供，货号C500045)，在暗房中将X光胶片放在暗盒里的PVDF膜上曝光，初次曝光1分钟(如果样品亮度肉眼可见应减少曝光时间，一般3～5秒)，曝光完毕，经显影，定影后，观察曝光结果，视曝光结果可再次确定曝光时间，曝光结束后用清水冲洗X光胶片放于37℃烘箱中烘干，观察结果确定6个样品中的阳性菌斑序号，对应筛选阳性菌斑步骤(1)中保存的菌种，可进行后续实验。
实验结果参照图1所示，曝光结果显示1号菌落表达较强，3号菌落表达稍弱，2号，4号和5号菌落未检测到目的蛋白，6号为阳性对照(有组氨酸标签的纯化蛋白)。
4.Western Blot验证
取步骤(1)中保存的1号菌种于4mL肉汤培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600＝0.6～0.8时，加入中终浓度为0.5mM的IPTG，诱导6小时后4℃，4000rpm离心收集菌体，加入500μL包涵体缓冲液(8M尿素，pH＝8.0)溶解，冰水浴超声10分钟后4℃，16000rpm离心10分钟，取30μL上清加入30μL上样缓冲液(5×Protein Loding Buffer)充分混合后100℃沸水浴10分钟，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶：浓缩胶5％，分离胶12％)电泳上样10μL，浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min，湿转，250mA，90min，5％的脱脂奶粉，37℃振荡2小时封闭，将封闭好的PVDF膜用TBST室温震荡淋洗3次，每次10min，洗去多余的脱脂奶粉后浸没在小鼠抗6×His单克隆抗体(一抗)中(单克隆抗体由生工生物提供，货号D191001，稀释比例1:4000)，37℃震荡孵育1小时，再用TBST室温震荡淋洗3次，每次10min，洗去多余一抗，将洗好后的PVDF膜浸没在HRP标记的山羊抗小鼠IgG(二抗)中(多克隆抗体由生工生物提供，货号D110087，稀释比例1:8000)，37℃震荡孵育30分钟，再用TBST室温震荡淋洗3次，每次10分钟，洗去多余二抗，TMB显色(TMB显色试剂盒由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，货号：C510025)，显色结果参照图5所示，结果表明，本发明实施例1提供的快速筛选方法有效。
实施例2
与实施例1相比，区别仅在于目的基因不同，其他条件和筛选方法同实施例1。
实验结果参照图2所示，曝光结果显示2号，3号和5号菌落表达较强，1号菌落表达较弱，4号菌落表达最弱，6号为阳性对照(有组氨酸标签的纯化蛋白)，Western blot验证结果参照图6所示，结果表明，本发明实施例1提供的快速筛选方法有效。
实施例3
与实施例1相比，区别仅在于目的基因不同，其他条件和筛选方法同实施例1。观察结果确定9个样品(包括阳性对照)中的阳性菌斑序号。
实验结果参照图3所示，曝光结果显示3号和8号菌落有表达，1号，2号，4号，5号，6号和7号菌落未检测到目的蛋白。
实施例4
与实施例1相比，区别仅在于，平板上抗生素的浓度为1‰，其他条件和筛选方法同实施例1。
实验结果参照图4所示，曝光结果显示1号，2号，4号和5号菌落有表达，其中1号和2号菌落表达较弱，4号和5号菌落表达较强，3号菌落未检测到目的蛋白，6号为阳性对照。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于，平板上抗生素的浓度为0.8‰，其他条件和筛选方法同实施例1。
实施例6
与实施例1相比，区别仅在于，诱导剂选自阿拉伯糖，其他条件和筛选方法同实施例1。
实施例7
与实施例1相比，区别仅在于，涂板步骤：取1.2μL 0.1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)加至步骤(2)中热激后的感受态细胞中，轻微吹打混合均匀后取出30μL菌液，用玻璃涂布珠在平板中涂布均匀，37℃培养箱，倒置，培养24小时。其他条件和筛选方法同实施例1。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于，平板上抗生素的浓度为0.3‰，其他条件和筛选方法同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于，平板上抗生素的浓度为1.2‰，其他条件和筛选方法同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于，涂板步骤：取1.5μL 0.1M的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)加至步骤(2)中热激后的感受态细胞中，轻微吹打混合均匀后取出30μL菌液，用玻璃涂布珠在平板中涂布均匀，37℃培养箱，倒置，培养24小时。其他条件和筛选方法同实施例1。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，其包括：将热激后的带有目标质粒的感受态细胞直接与诱导剂混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培养，然后从平板上挑取多个单克隆菌落分别接种于无抗性培养基中，然后将无抗性培养基中的菌液进行细胞裂解，获得沉淀液，对沉淀液进行Dot blot分析以确定阳性菌斑；所述平板上含抗生素的浓度为0.5‰~1‰。
2.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，感受态细胞与诱导剂的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布体积为30-100μL。
3.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，每100μl所述带有目标质粒的感受态细胞与终浓度为0.5mM-2mM的所述诱导剂混合。
4.根据权利要求3所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞。
5.根据权利要求3所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述诱导剂选自异丙基巯基半乳糖、巯甲基半乳糖苷、 O-硝基半乳糖苷、阿拉伯糖、色氨酸或磷酸盐。
6.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，对菌液进行细胞裂解获得沉淀液的方法包括：采用超声细胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、热休克法或化学裂解液法使得菌液的细胞破碎，然后离心得到沉淀物，经缓冲液溶解沉淀后获得沉淀液。
7.根据权利要求6所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述缓冲液为8-10M的尿素溶液。
8.根据权利要求6所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，取5-30μL的菌液进行细胞裂解。
9.根据权利要求8所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述裂解是在0-4℃下超声15-20min，然后进行离心收集沉淀物。
10.根据权利要求1所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，对沉淀液进行Dot blot分析包括：将所述沉淀液直接点在PVDF膜上，干燥后，进行封闭，依次与一抗和二抗孵育，曝光。
11.根据权利要求10所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述方法还包括：根据曝光的结果判断菌株是否表达目的蛋白。
12.根据权利要求10所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述一抗为小鼠抗6×His单克隆抗体，所述二抗为山羊抗小鼠IgG。
13.根据权利要求10所述的快速筛选原核蛋白表达菌的方法，其特征在于，所述曝光是采用ECL发光试剂盒或DAB显色试剂盒。
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