CN104964910A - 一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，2）细胞培养，3）细胞染毒，4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，使操作方法更简便；针对间接标记法中较强的非特异荧光干扰的问题，确立了直接免疫荧光标记的方法，使检测过程更快速方便，检测结果也更稳定；本发明省去了间接标记法中标记第一抗体和第二抗体的步骤，缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明用流式细胞仪检测γH2AX的相对荧光强度，结果更客观、准确，统计学精度高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞DNA损伤标志物γH2AX的检测方法，并将其用于卷烟烟气中化合物的基因毒性检测，具体说是一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法。
背景技术
严重的细胞DNA损伤主要出现于以下几种情况：1）细胞在物理、化学或生物等因素作用下直接诱导或是通过复制压力诱导形成的双链断裂（DSBs），2）细胞自身调控的程序性DSBs，3）逆转录病毒转染细胞过程中产生的DSBs。而以上三种情况的细胞DNA损伤均可诱导γH2AX的磷酸化（CH2AX）和簇集形成焦点，这一过程可发生在几分钟之内，γH2AX所形成的焦点数量与造成的DNA双链断裂数量存在一一对应关系。因此，γH2AX被认为是检测细胞DNA 双链断裂的特异性指标。
目前，检测γH2AX的方法主要包括：免疫荧光法，免疫印迹法，流式细胞技术间接标记法。但这些技术存在操作步骤繁琐，易受非特异荧光干扰，多次洗涤细胞的丢失量大，且试验周期长等问题。
发明内容
本发明正是针对上述问题，提供一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法。并将其用于卷烟烟气中化合物的基因毒性检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，包括以下工艺步骤：
1）配制实验试剂：（1）细胞培养液；（2）预冷的70%乙醇；（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）；（4）0.5%的TritonX-100；
2）细胞培养：CHO细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM 培养液中，放置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
3）细胞染毒：将指数生长期的CHO细胞（也适用于人肺癌上皮细胞A549细胞），按1×106个/孔的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，进行细胞染毒，每个处理组设三个平行，染毒时间为24 h；
4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，具体步骤如下：
a、细胞提取：细胞染毒24 h后弃去染毒液，加入500 μL0.25%胰酶，消化1-2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次；
b、乙醇固定：准备70%的乙醇，-20℃预冷，在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于-20℃冰箱固定过夜；
c、TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次。加入0.5%的TritonX-100 100μL破膜；
d、加入FITC直标的Anti-H2AX（购至Biolegend公司）10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测；
e、流式细胞仪检测: 流式细胞仪参数设置：设置激发光：488 nm；检测发射光通道：SYTOX荧光：FL1 channel（530/30 band-pass filter）；EMA荧光：FL3 channel（670 long-pass filter），每个批次试验须根据细胞状态调整荧光补偿和光电倍增参数，但批次内保持其参数设置不变。
5）结果与分析：通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率：
。
本发明中所用的实验试剂配制方法如下：
（1）细胞培养液：DMEM 培养液+10%的胎牛血清（FBS）+100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 链霉素；
（2）预冷的70%乙醇：取无水乙醇70 mL，用去离子水定容至100 mL，混匀后放置于-20 ℃冰箱中预冷24 h；
（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2g KCL，0.2g KH2PO4，8g NaCL，2.9g Na2HPO4·12H2O，加双蒸水至1L，PH 7.2～7.4，高压灭菌；
（4）0.5%的TritonX-100：取0.5 mL TritonX-100，加入99.5 mL的PBS，37℃水浴震荡至溶解。
所述染毒毒素可为卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺NNK、杂环胺AαC。
本发明所用溶液中除已明确标明的以外所涉及的%均为体积百分比。与现有技术相比，本发明方法具有如下优良效果：
在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，使操作方法更简便；针对间接标记法中较强的非特异荧光干扰的问题，确立了流式直接免疫荧光标记的方法，减少了细胞的丢失，检测过程更快速方便，检测结果也更稳定；本发明省去了间接标记法中标记第一抗体和第二抗体的步骤，缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明用流式细胞仪分析γH2AX的相对荧光强度，结果更客观、准确，统计学精度高。
附图说明
图1为本发明的工艺步骤图。
具体实施方式
实例1 对NNK进行评价
收集处于指数生长期的CHO细胞以1×106个/孔细胞接种于6孔板中，于细胞培养箱中培养24h后进行NNK染毒，染毒时间为 24 h。实验中以NNK的剂量分别为0 μg/mL，25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL和400 μg/mL染毒CHO细胞，每种条件设3个平行孔，置于37 ℃、5％CO2的细胞培养箱中培养24 h。细胞染毒结束后，加入500 μL0.25%胰酶，消化1-2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次。乙醇固定：准备70%的乙醇，-20 ℃预冷。在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于-20 ℃冰箱固定24 h。TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次。加入0.5%的TritonX-100 100μL破膜。加入FITC直标的Anti-H2AX（购至Biolegend公司）10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测。流式细胞仪检测：流式细胞仪参数设置：设置激发光：488 nm；检测发射光通道：SYTOX荧光：FL1 channel（530/30 band-pass filter）；EMA荧光：FL3 channel（670 long-pass filter），每个批次试验须根据细胞状态调整荧光补偿和光电倍增参数，但批次内保持其参数设置不变。通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率。
表1显示的是NNK染毒CHO细胞后γH2AX的焦点数 (平均值和标准差)。
实例2 对AαC进行评价
收集处于指数生长期的CHO细胞以1×106个/孔细胞接种于6孔板中，于细胞培养箱中培养24 h后进行AαC染毒，染毒时间为24 h。实验中以AαC的剂量分别为0 μg/mL，2.5 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL和40 μg/mL染毒CHO细胞，每种条件设3个平行孔，置于37 ℃、5％CO2的细胞培养箱中培养24 h。细胞染毒结束后，加入500 μL0.25%胰酶，消化1-2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次。乙醇固定：准备70%的乙醇，-20 ℃预冷。在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于-20 ℃冰箱固定过夜。TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次。加入0.5%的TritonX-100 100 μL破膜。加入FITC直标的Anti-H2AX（购至Biolegend公司）10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测。流式细胞仪检测：流式细胞仪参数设置：设置激发光：488 nm；检测发射光通道：SYTOX荧光：FL1 channel（530/30 band-pass filter）；EMA荧光：FL3 channel（670 long-pass filter），每个批次试验须根据细胞状态调整荧光补偿和光电倍增参数，但批次内保持其参数设置不变。通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率。
表2显示的是AαC染毒CHO细胞后γH2AX的焦点数 (平均值和标准差)。
表1 NNK染毒CHO细胞后γH2AX的焦点数
表2AαC染毒CHO细胞后γH2AX的焦点数
Claims (4)
1.一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：
1）配制实验试剂：（1）细胞培养液；（2）预冷的70%乙醇；（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）；（4）0.5%的TritonX-100；
2）细胞培养：CHO细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM 培养液中，放置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
3）细胞染毒：将指数生长期的CHO细胞，按1×106个/孔的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，进行细胞染毒，每个处理组设三个平行，染毒时间为24 h；
4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，具体步骤如下：
a、细胞提取：细胞染毒24 h后弃去染毒液，加入500 μL0.25%胰酶，消化1-2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次；
b、乙醇固定：准备70%的乙醇，-20℃预冷，在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于-20℃冰箱固定过夜；
c、TritonX-100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次，加入0.5%的TritonX-100 100μL破膜；
d、加入FITC直标的Anti-H2AX 10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测；
e、流式细胞仪检测；
5）结果与分析：通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率：
。
2.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：实验试剂的配制方法如下：
（1）细胞培养液：DMEM 培养液+10%的胎牛血清（FBS）+100 IU/mL 青霉素+100 μg/mL 链霉素；
（2）预冷的70%乙醇：取无水乙醇70 mL，用去离子水定容至100 mL，混匀后放置于-20 ℃冰箱中预冷24 h；
（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）：0.2g KCL，0.2g KH2PO4，8g NaCL，2.9g Na2HPO4·12H2O，加双蒸水至1L，PH 7.2～7.4，高压灭菌；
（4）0.5%的TritonX-100：取0.5 mL TritonX-100，加入99.5 mL的PBS，37℃水浴震荡至溶解。
3.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：所述染毒毒素为卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺NNK、杂环胺AαC。
4.根据权利要求1所述的基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：流式细胞仪参数设置：设置激发光：488 nm；检测发射光通道：SYTOX荧光：FL1 channel:530/30 band-pass filter；EMA荧光：FL3 channel:670 long-pass filter。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151007 |