CN104122189B - 一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法。该方法是将细胞种植在96孔板上进行卷烟烟气染毒后直接固定、染色、上高内涵成像系统进行检测。根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定对图片进行分析，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率。本方法需要的细胞量少，不需要消化细胞和制作微核片，并且检测速度快，样本量大、准确率高。
Description
技术领域
本发明涉及用高内涵成像系统检测卷烟主流烟气总粒相物(TPM)体外细胞微核方法，属于卷烟烟气安全性评价技术领域。
背景技术
体外细胞微核试验是目前用于卷烟烟气安全性评估的体外毒理学检测试验之一，用于评价卷烟烟气的遗传毒性。传统微核试验是利用细胞生物学方法经显微制片后在显微镜下直接计数待测材料微核率。传统微核检测方法需要的细胞量大，并且需要将细胞消化下来后进行微核制片，这样细胞损失多、损伤大，并且后期是人工阅片，存在检测样本量受限、准确度不高和效率低的问题。而近年来，随着微核检测范围的拓展，检测样品需求大大增加，传统微核试验就难以满足快速高通量检测需要。
随着科学技术的发展，多种微核的自动化阅片方法得到研究。在2010年的OECD（The Organisation for Economic Co-operation and Development）中提到可使用自动化的系统器对微核进行计数和检测，为微核试验的统一标准提供了新的研究方向[OECDGUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS 487: In Vitro Mammalia CellMicronucleus Test, 2010]。微核自动化检测方法目前主要有流式细胞仪检测、计算机图像分析系统检测等。流式细胞仪法的优势是速度快，灵敏度高，但由于流式细胞仪是将细胞裂解后对细胞核进行分析，更适用于无核细胞或单核细胞的微核计数[Bryce, S.M., etal., In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides acomprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. MutationResearch/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2007. 630(1): p.78-91.]。计算机图像分析系统通过计算机对单一染色的微核图片各定量参数的计算分析，计数细胞核及微核[Varga, D., et al., An automated scoring procedure for themicronucleus test by image analysis. Mutagenesis, 2004. 19(5): p. 391-397.]。但目前尚没有较完善的有核细胞微核图像分析系统，其原因是细胞内部空间结构复杂，须经多次分割才能提取出微核，同时易受条件因素的影响。
高内涵成像系统是基于成像的单细胞水平多参数细胞分析方法，它可以在保持细胞结构和功能完整性的前提下，应用高分辨率的荧光数码影像系统同时检测被筛选样品对细胞形态、生长、分化、代谢及信号转导各个环节的影响，确定药物的生物学活性和潜在的毒性。高内涵筛选起初作为新药研究领域传统生物化学高通量筛选的补充技术，现在作为一种多细胞样品无偏成像的方法，在生命科学领域具有更广泛的应用[Zanella, F., J.B.Lorens, and W. Link, High content screening: seeing is believing. Trends inbiotechnology, 2010. 28(5): p. 237-245.]。然而未见采用高内涵成像系统应用于卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核检测的研究。
发明内容
本发明的目的就是针对上述的微核试验的不足，并基于体外细胞微核试验原理和高内涵成像系统原理，建立一种高内涵成像系统检测卷烟烟气染毒的体外细胞微核方法。本方法需要的细胞量少，不需要消化细胞和制作微核片，并且检测速度快，样本量大、准确率高。
本发明的方法是将细胞种植在96孔板上进行卷烟烟气染毒后直接固定、染色、上高内涵成像系统进行检测。根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定对图片进行分析，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率。
本发明的方法包括以下步骤：
（1）按照烟草国标方法平衡卷烟，选取重量和吸阻一致的烟支，按国标方法，全自动转盘式吸烟机上抽吸20支卷烟， 用剑桥滤片捕集器中剑桥滤片捕集烟气的总粒相物，将剑桥滤片用DMSO浸泡，超声波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/ml DMSO，-80℃低温保存备用；
（2）按常规方法传代培养CHO细胞，待细胞长满时将细胞密度约5×104个细胞/ml的 CHO细胞种于96孔板，置于37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养24 h；
（3）用25-200μg/ml的TPM处理处于对数生长期的CHO细胞培养物，每组设三个平行，所有组中都加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素B以对细胞分裂进行阻断，置于37℃、体积浓度为5％CO2培养箱中培养24 h；
（4）用PBS 洗涤生长于96孔板上的CHO细胞，接着用质量浓度4％多聚甲醛溶液（临用前配制）固定10 min，用PBS洗涤2次；
（5）用含0.2％TritonX-100的PBS溶液透化固定细胞10 min，PBS洗涤细胞2次，洗涤时间不少于5min；
（6）用0.1μg/ml FITC染料对细胞质进行染色，染色20 min，再用PBS洗涤96孔板2次；
（7）用含1μg/ml DAPI（对细胞核进行染色），100 ug/ml RNase A（水解细胞内的RNA以降低细胞核的荧光背景）的PBS染色20 min；
（8）用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和DAPI荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；
（9）在图片扫描完成后使用微核分析软件进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定软件对图片进行单核细胞、双核细胞、多核细胞进行分类识别，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率；同时将DAPI与FITC通道获取的图片重叠在一张图片上以观察完整的细胞状态，从而对软件分类识别的结果进行验证。
本方法与传统的微核试验方法相比，需要的细胞量少，不需要消化细胞和制作微核片，并且检测速度快，样本量大、准确率高；与现有的流式细胞仪自动检测微核方法相比，其试验结果客观可视、样品保存时间长；与计算机图像分析系统检测微核相比，具有操作简单，结果稳定等优点。
附图说明
图1是本发明的高内涵成像系统对市售卷烟烟气进行体外细胞微核检测的微核图。
其中A代表DAPI通道获取的图像、B代表FITC通道获取的图像、 C是对DAPI通道获取的图像分析图、 D是DAPI及FITC通道获取的图像重叠图。通过高内涵成像系统扫描DAPI通道的荧光信号，DAPI将细胞核染为蓝色（图A）。在胞质阻滞微核实验法中，含有微核的双核细胞为我们所需要统计分析的对象。因此根据HSC软件分别设置细胞核的大小、距离及荧光强度，从而分辨出单核细胞（图C中的灰色）、双核细胞（图C中的橙色）、多核细胞（图C中的绿色）、有丝分裂期细胞（图C中的紫色）及微核（图C中的红色）。为了验证软件分析是否可靠，同时扫描FITC通道的荧光信号，FITC将细胞质染为绿色（图B），再将DAPI通道获取的荧光图像与FITC通道获取的荧光图像重叠（图D），将图像获取结果与软件分析的结果相对应，可见用两者结果一致。
具体实施方式
1.实验材料：中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO细胞）由中国科学院昆明动物研究所提供。
2.主要实验器材：全自动转盘式吸烟机（RM200，Borgwaldt公司）； 高内涵成像系统（ImageXpress MICRO，Molecular Devices公司）； CO2培养箱（Thermo公司）；二级生物安全柜（Heal Force公司）；倒置显微镜（TS100-F-HMC型，Nikon公司）；96孔板、细胞培养瓶（美国Corning公司）；XS204型分析天平（感量0.0001g，Mettler Toledo公司）；离心机（DT5-5型，北京时代北利离心机有限公司）。
3.实验方法：本发明的方法包括以下步骤：
（1）按照烟草国标方法平衡卷烟48小时，选取重量和吸阻一致的烟支，按国标方法，全自动转盘式吸烟机上抽吸20支卷烟， 用剑桥滤片捕集器中剑桥滤片捕集烟气的总粒相物，将剑桥滤片用DMSO浸泡，超声波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/ml DMSO，-80℃低温保存备用；
（2）按常规方法传代培养CHO细胞，待细胞长满时将细胞密度约5×104个细胞/ml的 CHO细胞种于96孔板，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；
（3）用25-200μg/ml的TPM处理处于对数生长期的CHO细胞培养物，每组设三个平行，所有组中都加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素B以对细胞分裂进行阻断，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；
（4）用PBS 洗涤生长于96孔板上的CHO细胞，接着用质量浓度4％多聚甲醛溶液（临用前配制）固定10 min，用PBS洗涤2次；
（5）用含0.2％TritonX-100的PBS溶液透化固定细胞10 min，PBS洗涤细胞2次，洗涤时间不少于5min；
（6）用0.1μg/ml FITC染料对细胞质进行染色，染色20 min，再用PBS洗涤96孔板2次；
（7）用含1μg/ml DAPI（对细胞核进行染色），100 ug/ml RNase A（水解细胞内的RNA以降低细胞核的荧光背景）的PBS染色20 min；
（8）用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和DAPI荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；
（9）在图片扫描完成后使用HCS的微核分析软件进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定对图片进行分析，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率。
实施例1：
某一国产卷烟的主流烟气总粒相物(TPM)的高内涵成像系统体外细胞微核试验。
按照上述步骤（1）制备卷烟的主流烟气总粒相物(TPM)，然后按照步骤（2）进行细胞培养，然后设置25、50、100、150、200μg/ml的TPM对细胞进行染毒，所有组中都加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素B，并于体积浓度5％CO2，37℃条件下培养24 h，之后按照步骤（4）对细胞进行固定，按照步骤（5）对细胞进行通透，按照步骤（6）（7）对细胞进行细胞核染色，之后用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和DAPI荧光双通道对细胞进行扫描获取图片，在图片扫描完成后使用HCS的微核分析软件进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数。根据以上设定对图片进行分析，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率。高内涵成像系统法（HCS）检测出的某一国产卷烟不同浓度TPM诱导的微核率见表1。
表1.高内涵成像系统法检测出的某一国产卷烟不同浓度TPM诱导的微核率（‰）
由表1知，随着TPM浓度升高，其诱导的微核率增加，呈显著的剂量反应关系。
实施例2 某一国产卷烟的主流烟气总粒相物(TPM)的高内涵成像系统体外细胞微核试验。具体实施方式参照实施例1。高内涵成像系统法（HCS）检测出的某一国产卷烟不同浓度TPM诱导的微核率见表2。
表2.高内涵成像系统法检测出的某一国产卷烟不同浓度TPM诱导的微核率（‰）
由表2知，随着TPM浓度升高，其诱导的微核率增加，呈显著的剂量反应关系。
Claims (1)
1.一种检测卷烟主流烟气总粒相物的体外细胞微核方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）按照烟草国标方法平衡卷烟，选取重量和吸阻一致的烟支，全自动转盘式吸烟机上抽吸20支卷烟， 用剑桥滤片捕集器中剑桥滤片捕集烟气的总粒相物，将剑桥滤片用DMSO浸泡，超声波提取20 min，最后定容至 10 mg TPM/ml DMSO，-80℃低温保存备用；
（2）按常规方法传代培养CHO细胞，待细胞长满时将细胞密度约5×104个细胞/ml的 CHO细胞种于96孔板，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；
（3）用25-200μg/ml的TPM处理处于对数生长期的CHO细胞培养物，每组设三个平行，所有组中都加入终浓度为6μg/ml的细胞松弛素B以对细胞分裂进行阻断，置于37℃、体积浓度5％CO2培养箱中培养24 h；
（4）用PBS 洗涤生长于96孔板上的CHO细胞，接着用质量浓度4％多聚甲醛溶液固定10min，用PBS洗涤2次；
（5）用含0.2％TritonX-100的PBS溶液透化固定细胞10 min，PBS洗涤细胞2次，洗涤时间不少于5min；
（6）用0.1μg/ml FITC染料对细胞质进行染色，染色20 min，再用PBS洗涤96孔板2次；
（7）用含1μg/ml DAPI、100 ug/ml RNase A的PBS对细胞核进行染色20 min；
（8）用高内涵成像系统进行检测，选择FITC和DAPI荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；
（9）在图片扫描完成后使用微核分析软件进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数，根据以上设定对图片进行单核细胞、双核细胞、多核细胞进行分类识别，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率；同时将DAPI与FITC通道获取的图片重叠在一张图片上以观察完整的细胞状态，从而对分类识别的结果进行验证。
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