CN105606576A - 采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤：提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告DNA；将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养；在细胞占所述培养皿底部的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉，再把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉；采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，并采用单光子计数器测量并计算细胞内显示的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的信息。

Description

采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法
技术领域
本发明涉及一种检测细胞内特定mRNA的方法，特别涉及一种通过分子探针荧光寿命成像来检测细胞内特定mRNA的方法。
背景技术
癌症是全世界人类死亡的重要病因，因此癌症的早期检测和治疗成为医学和生物研究领域的一个重要挑战。研究者已经证明，内生性癌症相关的mRNA是患癌的重要指标，而且他们的表达水平能够揭示癌症进程与预后信息。因此，对细胞内癌症相关的mRNA的识别和鉴定能够为癌症的早期诊断和治疗提供重要的信息。目前，已经有很多方法来识别和鉴定mRNA，比如Northern印迹，微阵列分析技术，以及RT-PCR技术。但是，这些方法步骤繁琐，对检测的细胞的量要求很大，不能很好地对单个细胞进行实时检测。
目前，一些基于荧光强度的测量方法也已经被发展起来用于检测活细胞内的mRNA。其中一种方法就是纳米信标（nanoflares）。这种方法在2007年被首次提出，用于细胞内mRNA的检测，并且现在已经被广泛用于细胞内其他分子的鉴定标识以及鉴定特异性的细胞。然而，尽管荧光强度能够区分出样品的荧光基团浓度的差别，但是灵敏度有限，不能区分出荧光强度差别小的样品。与此同时，荧光强度的检测方法还会受到例如激发光强度、检测器增益、光路和样品的光损失，样品荧光基团浓度、光漂白等因素的影响，造成检测误差。
发明内容
有鉴于此，确有必要提供一种检测稳定，不受多种因素干扰的检测方法。
一种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤：提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告DNA；将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养；在细胞占所述培养皿底部的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉，再把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉；采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，并采用单光子计数器测量并计算细胞内荧光分子的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的信息。
相对于现有技术，本发明提供的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法具有以下优点：通过采用检测细胞的荧光寿命的方法检测细胞内mRNA的信息是否存在，测量稳定性强、准确度高；细胞无需特殊处理，操作简便。
附图说明
图1是分子探针的结构示意图及遇到靶mRNA后的结构示意图。
图2是分子探针、报告DNA链和对照组探针进入细胞后的荧光寿命成像图。
图3是分子探针和对照组探针进入细胞后的荧光寿命衰减曲线。
如下具体实施例将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明提供的采用分子探针检测细胞内mRNA的方法作进一步说明。
本发明提供一种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤：
S1，提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告DNA；
S2，将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养；
S3，在培养生长的细胞占所述培养皿底部面积的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉；
S4，把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉；
S5，采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，利用单光子计数器测量并计算细胞内显示的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的信息。
在步骤S1中，所述分子探针包含一纳米金、识别DNA及修饰有荧光分子的报告DNA组成。具体地，所述识别DNA包覆于所述纳米金的表面，并通过识别DNA末端的巯基与纳米金相连，所述修饰有荧光分子的报告DNA与该识别DNA通过碱基互补杂交。所述第一培养基还包含L-15培养基与10%胎牛血清(FBS)的混合物。该分子探针在第一培养基中的浓度为0.5nM-2nM。进一步，所述含有分子探针的第一培养基可通过0.2μm的无菌醋酸过滤器过滤，以去除杂质和细菌。本实施例中，采用的识别DNA为5’-TCAATTCAATGTAGACAGACGTCTTTTGAGGTTTTTT-thiol-3’，3’端修饰巯基，用于与金连接；所采用的报告DNA为5’-cy5-CCTCAAAAGACGTCTG-3’，5’端修饰cy5荧光分子；所述第一培养基为10%FBS+90%L-15，所述分子探针在第一培养基中的浓度为1nM。
在步骤S2中，所述细胞为用于待检测的试验细胞，所述第二培养基为10%的胎牛血清与90%的L-15的混合物。该细胞在培养皿中培养的气相条件为100%的空气，培养温度为37°，本实施例中，所采用的细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231。
在步骤S3中，所述细胞在培养皿中生长，当细胞生长铺张至培养皿底部面积的60%-80%时，可利用移液枪将培养皿中的第二培养基吸掉。
在步骤S4中，当细胞在第一培养基中培养时，分子探针会不断被细胞内吞进入细胞。在一段时间内，随着培养时间的延长，进入细胞的分子探针的数量越多，后续检测荧光寿命成像时也越容易观察。当细胞在第一培养基中培养结束后，利用移液枪将培养皿中的第一培养基吸掉。
进一步，在第一培养基被吸掉后，还可包括一清洗细胞的步骤。在第一培养基被吸掉后，在细胞的膜表面可能会吸附残余的培养基和分子探针成分，为了去除残余成分，可采用缓冲液对细胞进行清洗。本实施例中，清洗细胞采用的缓冲液为0.01M的磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
进一步，还可包括对细胞内细胞核进行染色的步骤。对细胞核进行染色后，可利用激光共聚焦显微镜发射405nm的激发光激发DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染料有利于在后续测量荧光寿命分布时对细胞定位和聚焦。待细胞染色后可进一步对所述细胞进行清洗，以去除杂色。本实施例中，采用DAPI染料对细胞核染色，染色时间为15分钟，并采用0.01M的PBS对染色后的细胞进行清洗。
在步骤S5中，在测量及计算细胞内显示的荧光寿命时，采用激发光激发细胞内报告DNA上修饰的荧光分子，并收集荧光分子发射光，根据光子的能量衰减计算荧光寿命，得到荧光寿命成像图，并根据该荧光寿命成像图得到检测细胞内的mRNA是否存在的信息。本实施例中，所所述激发光的波长为640nm，收集的荧光分子发射光的波长范围为690±35nm。
请参阅图1，进一步对分子探针检测荧光寿命成像的原理作进一步说明。荧光寿命成像(FluorescenceLifetimeImagingMicroscopy,FLIM)是一种提供荧光基团在空间上的寿命分布的图像技术。荧光寿命是荧光基团内在属性，只与荧光基团周围的微环境相关而不会受到其他影响强度的因素的影响。通过检测荧光寿命的方法来识别细胞中的特定mRNA的方法：分子探针中报告DNA上的荧光分子距离纳米金表面的距离约2nm，其荧光被纳米金淬灭，荧光寿命大幅缩短。当分子探针遇到靶mRNA时，由于靶mRNA与识别DNA互补的碱基多于报告DNA与识别DNA互补的碱基，所以，靶mRNA与识别DNA的亲和力更大，因此，靶mRNA与识别DNA相结合，报告DNA被释放出来，荧光分子不再受纳米金的影响，荧光寿命变长。通过检测荧光分子的荧光寿命可以获得细胞内靶mRNA是否存在的信息。具体地，图1中所示的Ex8-recognition为识别DNA，Ex8-flare为报告DNA，TargetmRNA为靶mRNA。所述荧光分子可为cy5，cy3，但并不局限于此。
请参阅图2，在采用分子探针进行检测的过程中，进一步还引入了对照组进行对比分析。图2中所示ex8-flare图为分子探针进入细胞后的荧光寿命成像图，图2中所示nanoflare图为细胞中只放入报告DNA的荧光寿命成像图，图2中所示control图为对照组探针(即识别DNA序列与靶mRNA不互补)进入细胞后的荧光寿命成像图。从图2中可以看出，分子探针处理的细胞荧光寿命分布颜色与报告DNA链处理的细胞荧光寿命分布颜色相同，对照组细胞的荧光寿命成像图中荧光寿命主要分布于寿命较短区域。可以理解，当分子探针进入细胞后，识别DNA与靶mRNA结合，报告DNA掉下，荧光寿命恢复，因此呈现出与报告DNA链处理的细胞相同的荧光寿命分布，而对照组的识别DNA与靶mRNA序列不互补，报告DNA不能被释放，荧光寿命仍然受到纳米金的影响，呈现较短的荧光寿命。
请参阅图3，通过对荧光衰减曲线进行拟合，可以得出，分子探针处理的细胞内的荧光衰减曲线呈双指数衰减，而对照组则呈三指数衰减。这说明分子探针处理的细胞中识别DNA与靶mRNA结合，报告DNA链上的荧光分子游离于细胞中，不受纳米金的影响。而对照组中的分子探针识别DNA没有与靶mRNA结合，荧光基团受纳米金淬灭，寿命分裂。本实施例中，所采用的靶mRNA为BRAC1mRNA，对照组识别DNA为5’-CCCTGTTAGTCGTAGCAGACGTCTTTTGAGGTTTTTT-thiol-3’。
本发明提供的采用分子探针检测细胞内mRNA的方法，通过采用检测细胞的荧光寿命的方法检测细胞内mRNA的信息是否存在，测量稳定性强，不会受到激发光强度、检测器增益、光路和样品的光损失、样品荧光基团浓度、光漂白等因素影响；检测范围广泛，不限于特异的mRNA，还可检测miRNA以及所有与识别DNA亲和力大于识别DNA与报告DNA亲和力的生物分子；细胞无需特殊处理，操作简便，直接将分子探针分散于细胞培养基与细胞混合培养一段时间即可。
另外，本领域技术人员还可在本发明精神内作其它变化，当然这些依据本发明精神所作的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围内。

Claims (10)

1.一种采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其包括以下步骤：
提供一掺有分子探针的第一培养基，所述分子探针包括修饰有荧光分子的报告DNA；
将细胞置入含有第二培养基的培养皿中培养；
在生长的细胞占所述培养皿底部面积的60%-80%时，将该培养皿中的第二培养基吸掉；
把所述第一培养基放入该培养皿中，细胞继续培养2-6个小时后，再将该第一培养基吸掉；
采用激光共聚焦显微镜对细胞成像，利用单光子计数器测量并计算细胞内荧光分子的荧光寿命，得到荧光寿命成像图，根据该荧光寿命成像图检测细胞中的特定mRNA是否存在的信息。
2.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，所述分子探针还包括一纳米金和识别DNA。
3.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，在测量及计算细胞内显示的荧光寿命时，采用激发光激发细胞内报告DNA上修饰的荧光分子，并收集荧光分子发射光。
4.如权利要求3所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，所述激发光的波长为640nm，所述收集的荧光分子发射光的波长范围为690±35nm。
5.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，所述细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231。
6.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，在吸掉第一培养基后并在检测之前，进一步包括采用DAPI染料对细胞核进行染色的步骤。
7.如权利要求6所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，在细胞核经DAPI染料染色后，进一步包括采用激光共聚焦显微镜发射405nm的激发光激发DAPI染料。
8.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，该细胞在培养皿中培养的气相条件为100%的空气，培养温度为37°。
9.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，所述分子探针在第一培养基中的浓度为0.5nM-2nM。
10.如权利要求1所述的采用分子探针检测细胞内特定mRNA的方法，其特征在于，在第一培养基被吸掉后，还包括一清洗细胞的步骤。
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