CN103364380A

CN103364380A - 一种目标物的标记及识别的方法

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Publication number: CN103364380A
Application number: CN2013102180057A
Authority: CN
Inventors: 赵凤英; 马万云; 陈瓞延
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-06-04
Also published as: CN103364380B

Abstract

本发明提供一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：将细胞进行固定及预处理；通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物和第四目标物，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物、第三目标物和第五目标物，其中，第一目标物与第三目标物相互交叠，第二目标物与第四目标物相互交叠，第五目标物与其他目标物无交叠，第一目标物与第四目标物的体积不相同，第二目标物与第三目标物的体积不相同；通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像和第二荧光图像；以及，合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，计算所述目标物的体积，通过荧光图像是否重叠以及其体积的大小来识别所述多个目标物。

Description

一种目标物的标记及识别的方法

技术领域

本发明涉及一种目标物的标记及识别的方法，尤其为一种采用荧光标记及识别目标物的方法。

背景技术

多项研究表明，染色体在细胞核中占据一个明显的区域，被称之为染色体域。染色体域在进化上是保守的，并且在细胞间期，它的空间构象也是非随机的。基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。多数生物的基因在染色体上作线状排列。基因密度高的染色体往往分布在靠近细胞核中心的位置，而基因密度低的染色体则往往分布在外围。此外，染色体在细胞核中的分布位置也与染色体本身的大小有一定关系。有证据表明，染色体的这些非随机空间分布形式在基因表达调控中起着重要作用。除此之外，对其他遗传物质的空间组织形式的研究也将使人们更为深刻的了解相关生物学过程。人们发现着丝粒在调控基因沉默的表观遗传机制中同样起着至关重要的作用。

三维荧光原位杂交（3D fluorescence in situ hybridization,3D-FISH）是基于荧光原位杂交(FISH)技术发展而来，其为一将DNA探针运用于经过预处理的，三维形态保存完好样本的实验技术。其基本原理为：根据核苷酸碱基互补配对原则，使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交，然后用合适的检测方法将荧光信号检出，达到目标物在三维空间定位的目的。该方法可以三维、原位的特异性标记细胞内特定的遗传物质。随着这项技术在相关领域的运用，人们要求能够同时标记数量较多的目标物。

当采用“一对一”（一种颜色荧光团标记一种目标物）的标记方式时，由于采用的样品信号探测仪器如激光共聚焦显微镜，最多也只能配置四到五个探测通道，这意味着最多只有三到四个目标物可以被同时标记并识别出来（最后一个通道用来探测细胞核），而这往往不能满足实验需要。

而其他方法比如组合标记（3D-M-FISH）、序列杂交（ReFISH），确实在一定程度上解决了多个目标物同时标记的问题。但是，3D-M-FISH方法的实现依赖于特殊的图像处理软件，并且该软件价格不菲。而ReFISH方法要求操作者能够两次准确无误的找到并标记同一个细胞核，这是一项非常耗时且对操作者的技术要求较高的工作。可见，这些方法中标记目标物的数量受限于所选的标记方法和所采用的实验仪器。

发明内容

综上所述，确有必要提供一种同时标记多个目标物且简单易行的目标物的标记及识别的方法。

一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：将细胞进行固定及预处理；通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物和第四目标物，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物、第三目标物和第五目标物，其中，第一目标物与第三目标物相互交叠，第二目标物与第四目标物相互交叠，第五目标物与第一目标物、第二目标物、第三目标物及第四目标物无交叠，第一目标物与第四目标物的体积不相同，第二目标物与第三目标物的体积不相同；通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到多个荧光图像；以及，合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第五目标物。

一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：将细胞进行固定及预处理；通过三个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物、第四目标物和第六目标物，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物、第三目标物和第五目标物，其中，第一目标物与第三目标物相互交叠，第二目标物与第四目标物相互交叠，第五目标物及第六目标物与第一目标物、第二目标物、第三目标物、第四目标物均无交叠，第一目标物的体积大于第四目标物的体积，第二目标物的体积大于第三目标物的体积；通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像、第二荧光图像和背景荧光图像；以及，合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第六目标物。

一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：将细胞进行固定及预处理；通过两个带有同种颜色的荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物和第二目标物，其中，第一目标物与第二目标物的体积不相同；通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到一荧光图像；以及，分别计算所述荧光图像中的第一目标物和第二目标物的体积，通过计算的第一目标物和第二目标物体积的大小来识别所述第一目标物与第二目标物。

与现有技术相比较，本发明提供的目标物的标记及识别的方法可以通过少数种颜色的荧光染料对多个目标物同时标记和识别，该方法步骤简单、无需繁冗的计算、对实验仪器及软件处理要求较低、容易操作，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明第一实施例目标物的标记及识别的方法流程图。

图2是本发明第一实施例所述多个染色体及着丝粒的区段图。

图3是本发明第一实施例通过第一荧光染料标记的第一目标物和第四目标物的第一荧光图像。

图4是本发明第一实施例通过第二荧光染料标记的第二目标物、第三目标物和第五目标物的第二荧光图像。

图5是本发明第一实施例通过第三荧光染料标记的细胞核区的背景荧光图像。

图6为本发明第一实施例提供的所述识别第一至第五目标物的流程示意图。

图7为本发明第一实施例提供的所述第一荧光图像、第二荧光图像和背景荧光图像的合并图像。

图8为本发明第一实施例提供的第一至第五目标物的三维荧光图像。

图9为图8所述第一至第五目标物的三维重构图。

图10为本发明第二实施例目标物的标记及识别的方法流程图。

图11为本发明第二实施例提供的所述识别第一至第六目标物的流程示意图。

具体实施方式

以下将结合附图详细说明本发明提供的目标物的标记及识别的方法。

请参阅图1，本发明第一实施例提供一种目标物的标记及识别的方法，所述目标物的标记及识别的方法包括以下步骤：

S11，将细胞进行固定及预处理；

S12，通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物A和第四目标物B’，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物A’、第三目标物B和第五目标物C，其中，第一目标物A与第三目标物B相互交叠，第二目标物A’与第四目标物B’相互交叠，第五目标物C与第一目标物A、第二目标物A’、第三目标物B及第四目标物B’无交叠，第一目标物A与第四目标物B’的体积不相同，第二目标物A’与第三目标物B的体积不相同；

S13，通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像和第二荧光图像；以及

S14，合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像的荧光信号是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第五目标物。

在步骤S11中，所述细胞包括人外周血淋巴细胞、人或小鼠骨髓淋巴细胞，人或小鼠卵母细胞等。可以理解，所述细胞不限于上述列举细胞，可以为所有动植物细胞。本实施例中，所述细胞为正常人的外周血淋巴细胞。

所述将细胞进行固定及预处理包括以下步骤：

S110，提供一样品，从该样品中分离得到所述细胞，将所述细胞配制成一悬浮液；

S111，将所述悬浮液涂片于一载玻片，并进行第一次孵育处理；

S112，将载有细胞的载玻片浸入一固定液并保持一段时间以使细胞固定；

S113，将固定后的细胞用一溶剂进行第一次洗涤处理；

S114，将第一次洗涤处理后的细胞进行第二次孵育处理；

S115，将经过第二次孵育处理后的细胞进行浸渍处理；

S116，将浸渍后的细胞进行冻融处理；

S117，将冻融后的细胞进行第二次洗涤处理；

S118，将第二次洗涤处理后的细胞进行第三次孵育处理；以及

S119，将第三次孵育处理后的细胞保存。

在步骤S110中，所述从样品中分离得到所述细胞的方法为Ficoll密度梯度离心法，包括以下步骤：先将样品与细胞分离液混合，然后经过离心分离得到所述细胞。其中，所述细胞分离液的密度决定于所述细胞的种类。本实施例中，所述样品为人全血，所述细胞分离液为人淋巴细胞分离液(购买于Solarbio公司，密度为1.077g/L)。由于通过该方法分离获得细胞的多少与温度有关，因而，所述该分离方法一般在室温下进行，以保证细胞的获得率在80%以上。可以理解，所述从样品中分离得到所述细胞的方法不限于上述Ficoll密度梯度离心法，也可以为其他方法，比如Percoll密度梯度离心法，只要通过该方法可以从样品中分离得到细胞即可。

先将胎牛血清(Fetal Calf Serum，缩写为FCS，购买于sigma-aldrich公司)加入到细胞培养基，然后加入一定量的所述细胞配制所述悬浮液，其中，所述悬浮液中细胞的浓度为10⁴~10⁵个。本实施例中，所述细胞培养基为RPMI细胞培养基(Roswell Park Memorial Institute，购买于sigma-aldrich公司)，所述含有FCS的细胞培养基中FCS的体积浓度为50%。

在步骤S111中，所述载玻片为一防脱载玻片。所述防脱载玻片的表面带有氨基酸，该氨基酸可以使得所述细胞较好的黏附于所述载玻片。所述第一次孵育处理具体为：将所述细胞在温度为37℃，通入5%CO₂的培养箱中孵育一段时间。所述第一次孵育处理的时间为20分钟~180分钟，优选为150分钟。所述细胞经过所述第一次孵育处理后可较好的黏附于所述载玻片，并且同时维持细胞的原来的三维形态。

本实施例中，取200微升所述悬浮液涂片于一防脱载玻片，所述第一次孵育处理的时间为150分钟。

在步骤S112中，所述固定液包括中性甲醛固定液、乙醇固定液、乙醇-甲醛固定液、醋酸钠-升汞-甲醛固定液等。所述载有细胞的载玻片浸入所述固定液的时间为8分钟~15分钟，优选为10分钟，从而使细胞固定于所述载玻片的表面。所述细胞通过所述固定液处理，可以有效地防止所述细胞从载玻片脱落。

本实施例中，所述固定液为多聚甲醛固定液，该多聚甲醛固定液为采用0.003mol/L磷酸盐缓冲液配制的多聚甲醛溶液，其中，多聚甲醛的体积百分数为4%，将所述载有细胞的载玻片室温下浸入所述固定液后并保持10分钟。所述多聚甲醛通过自由氨基酸基团形成分子间交联，从而产生一种相互连接的网络结构，该网络结构可以使得所述细胞维持较好的三维形态，从而使得后续标记和识别所述细胞中的目标物的结果更加准确。

在步骤S113中，所述洗涤的溶剂为磷酸盐缓冲液。所述第一次洗涤处理的次数为1次~5次，每次洗涤的时间为5分钟。经过该第一次洗涤处理，所述载有细胞的载玻片表面洁净，不带有多余的杂质。

本实施例中，将固定后的细胞用摩尔浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液进行第一次洗涤处理，所述第一次洗涤处理的次数为3次。

在步骤S114中，所述第二次孵育处理具体为将细胞在聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)溶液中室温下保持一段时间。所述第二次孵育处理的时间为15分钟~30分钟，优选为20分钟。所述细胞经过所述第二次孵育处理可以增加细胞膜的通透性，而使得外界物质可以较容易的进入细胞的内部。

本实施例中，所述Triton X-100溶液为通过0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制，其中所述Triton X-100的体积百分比为0.5%，所述第二次孵育处理的时间为20分钟。

在步骤S115中，所述浸渍处理具体为将所述细胞于一甘油溶液中浸渍1小时以上，以使所述细胞与所述甘油充分接触并浸润。所述浸渍处理起到保护所述细胞的作用，以避免细胞在冻融处理时出现损伤。

本实施例中，所述甘油溶液为通过0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制的甘油溶液，其中所述甘油与磷酸盐缓冲液的体积比为1：4，所述浸渍时间为1小时。

在步骤S116中，所述冻融处理包括将所述细胞用液氮反复冻融数次。所述冻融的次数为3次~5次。所述冻融处理的目的为进一步增加细胞膜的通透性，以利于探针穿过细胞膜进入细胞的内部。

本实施例中，将所述细胞用液氮反复冻融4次，所述冻融步骤具体为先在液氮中保持30秒，然后在室温下保持数分钟直到细胞表面冰层融化。

在步骤S117中，所述第二次洗涤处理使用的溶剂为Triton X-100溶液。所述第二次洗涤处理的次数为1次~5次，每次洗涤的时间为5分钟，以去除所述细胞中的杂质。

本实施例中，所述Triton X-100溶液为通过0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制的Triton X-100溶液，其中所述Triton X-100的体积百分比为0.05%，所述第二次洗涤处理的次数为3次。

在步骤S118中，所述第三次孵育处理具体为将细胞于一盐酸溶液中室温下保持一段时间。所述第三次孵育处理的时间为3分钟~8分钟，优选为5分钟，以使得所述细胞内的环境呈酸性，而有利于后续的探针与目标DNA杂交。

本实施例中，所述盐酸溶液为摩尔浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，所述第三次孵育处理的时间为5分钟。

在步骤S119中，将所述细胞保存于pH值为7.0的体积浓度为50%的甲酰胺溶液中并过夜。所述保存的时间不超过4个月，优选的，只要不少于24小时即可。所述甲酰胺溶液为通过0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制的甲酰胺溶液，其中所述甲酰胺与磷酸盐缓冲液的体积比为1：1。上述细胞保存于pH值为7.0的环境下，是为了使得所述细胞仍维持原来的三维形态，从而使得后续标记和识别所述细胞中的目标物的结果更加准确。

在步骤S12中，所述目标物是指DNA序列或者含有DNA序列的物质。在所述细胞中，DNA序列一般将染色体作为载体。着丝粒为染色体的一个区域，该区域在基因表达调控中起着重要作用。而在DNA序列上具有遗传效应的片段称为基因。所述目标物可以为全染色体、着丝粒、单个基因位点或基因片段。本实施例中，所需标记的所述第一目标物A为21#全染色体(chromosome 21#)，所述第二目标物A’为18#全染色体(chromosome 18#)，所述第三目标物B为21#着丝粒(centromere 21#)，所述第四目标物B’为18#着丝粒(centromere 18#)，所述第五目标物C为13#着丝粒(centromere 13#)。

所述带有第一荧光染料的探针是指一探针与一第一荧光染料的通过化学键相结合的复合结构。类似的，所述带有第二荧光染料的探针是指一探针与一第二荧光染料的通过化学键相结合的复合结构。所述探针为一单链的类DNA的序列。该探针与靶DNA序列相互配对而将所述目标物有效的标记。可以理解，在耙DNA序列确定的情况下，可以通过选择相应的探针而将其标记。

所述第一荧光染料或第二荧光染料包括4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、4',5'-双(N,N-二(羧甲基)氨甲基)荧光素(Calcein)等荧光染料。所述第一荧光染料及第二荧光染料在一定波长的激光的激发下而发射出具有一定波长的荧光。所述第一荧光染料或第二荧光染料具有不同的发射波长，只要保证所述第一荧光染料的发射波长的全宽半峰值与所述第二荧光染料的全宽半峰值不重叠即可。本实施例中，所述第一荧光染料为FITC荧光染料，该FITC荧光染料发出的荧光为绿光，所述第二荧光染料为TRITC荧光染料，该TRITC荧光染料发出的荧光为红光。

所述两个目标物相互交叠是指所述两种目标物在空间上相互交叉重叠。所述第五目标物C与其它四个目标物无交叠是指该第五目标物C与其它四个目标物在空间上均没有交叉重叠。所述两个目标物相互交叠是指所述两种目标物中的一种目标物是另一种目标物的一部分，该两种目标物在空间上发生重叠。可以理解，所述两个目标物相互交叠也可以是两种目标物在空间上相互交叉而发生重叠，即，一种目标物与另一种目标物不存在从属关系。本实施例中，所述多个染色体与其对应的着丝粒在空间上发生重叠(具体请参见图2)。

所述两个目标物的体积不同是指所述两个目标物具有一定的体积差异。定义两个目标物中体积较大的目标物的体积为1，那么，该两个目标物的体积差异是指两个目标物的体积差值的绝对值与具有较大的体积的目标物的体积的比值。所述两个目标物之间的体积差异大于30%，优选的，大于50%。

所述通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物A和第四目标物B’，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物A’、第三目标物B和第五目标物C包括以下步骤：

S120，将所述多个带有第一荧光染料的探针及多个带有第二荧光染料的探针混合，再将所述混合后的多个带有荧光染料的探针加到带有经过固定和预处理细胞的载玻片上；

S121，对细胞中的遗传物质进行变性处理；

S122，所述多个带有第一荧光染料的探针及多个带有第二荧光染料的探针与所述细胞中的第一至第五目标物分别进行杂交；以及

S123，对细胞进行复染处理。

在步骤S120中，将所述多个带有第一荧光染料的探针及多个带有第二荧光染料的探针覆盖所述经过固定和预处理的细胞，并用橡胶水泥(Rubber cement)封片。

在步骤S121中，所述细胞中的遗传物质是指细胞中的脱氧核糖核酸(DNA)，该DNA为两股脱氧核糖核酸长链通过氢键结合的双链螺旋结构。该遗传物质DNA进行变性处理后，双链螺旋结构会分解为两个单链的DNA。所述变性处理可为通过加热或碱处理DNA而得到单链DNA。本实施例中，将所述细胞在75℃的环境下保持5分钟~10分钟以使DNA变性。

在步骤S122中，所述杂交处理是指将经过变性处理得到的单链DNA中的部分片段或整个单链DNA与所述带有第一荧光染料的探针或带有第二荧光染料的探针进行相互配对结合，而将该单链DNA中的部分片段或整个单链DNA通过带有第一荧光染料的探针或带有第二荧光染料的探针标记。具体的，所述杂交处理的条件为在37℃保持1天~3天。本实施例中，所述杂交处理的条件为在37℃保持48小时。

进一步，在杂交后还包括一洗涤处理的步骤。所述洗涤处理具体为将经过杂交后的细胞于磷酸盐缓冲溶液中进行多次洗涤，以去除杂质。

在步骤S123中，与探针杂交后的所述细胞通过一第三荧光染料进行复染，使得包含遗传物质的核区整体分散有所述第三荧光染料。所述细胞的核区通过该复染处理后，当采用适当的激发波长的光时，该核区整体呈现一种颜色，也就是说，所述细胞通过复染以便在成像时提供背景颜色，进而使得结果更精确。所述第三荧光染料不限，可为FITC、TRITC、DAPI等，只要该第三荧光染料发出的荧光可以被仪器探测到即可。本实施例中，所述第三荧光染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。

在步骤S13中，所述荧光成像系统包括多个激光器及一三维荧光显微镜。所述激光器包括氩离子激光器、固体激光器和激光二极管等。所述三维荧光显微镜包括激光共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜等。所述三维荧光显微镜包括两个目标探测通道和一个背景探测通道，所述两个目标探测通道具体为第一目标探测通道和第二目标探测通道。

所述多个激光器分别发射出具有特定激发波长的光。该具有特定激发波长的光激发所述第一荧光染料、第二荧光染料及第三荧光染料，而分别发射出第一发射光、第二发射光和第三发射光。该第一发射光、第二发射光和第三发射光分别通过所述三维荧光显微镜的第一目标探测通道、第二目标探测通道和背景探测通道分别收集，得到第一荧光图像、第二荧光图像、以及背景荧光图像。

本实施例中，所述多个带有第一荧光染料的探针包括带有FITC的对应于21#全染色体的探针和带有FITC的对应于18#着丝粒的探针，所述带有第二荧光染料的探针包括带有TRITC的对应于18#全染色体的探针、带有TRITC的对应于21#着丝粒的探针和带有TRITC的对应于13#着丝粒的探针。采用的激光器为氩离子激光器、固体激光器和激光二极管，其发射的光的波长分别为488nm、561nm、405nm，所述三维荧光显微镜为激光共聚焦显微镜，其包括一第一通道、一第二通道以及一第三通道。请参见图3-5，为通过所述多个带有荧光染料的探针分别标记的第一至第五目标物的荧光图像。

请参阅图6，在步骤S14中所述识别所述第一至第五目标物具体包括以下步骤：

S141，判别第一目标物A和第四目标物B’：对该第一荧光图像中的第一目标物A和第四目标物B’的体积进行计算，通过计算结果判定体积较大的为第一目标物A，体积较小的为第四目标物B’；

S142，判别第二目标物A’和第三目标物B：对该第二荧光图像中与第一荧光图像发生重叠的两种目标物的体积进行计算，通过计算结果判定体积较大的为第二目标物A’，体积较小的为第三目标物B；以及

S143，判别第五目标物C：将所述多个探测通道的得到的第一荧光图像、第二荧光图像、以及背景荧光图像进行合并，并比较第一荧光图像与第二荧光图像是否发生重叠，其中，判定第二荧光图像中不与第一荧光图像发生重叠的为第五目标物C。

所述目标物的体积计算满足以下公式：

Figure 2013102180057100002DEST_PATH_IMAGE001

其中，为目标物的体积，

Figure 2013102180057100002DEST_PATH_IMAGE003

为像素点在x方向的长度，

Figure 2013102180057100002DEST_PATH_IMAGE004

为像素点在y方向的长度，

Figure 2013102180057100002DEST_PATH_IMAGE005

为z方向的步长，n为目标物所含像素点的个数。

本实施例中，具体请参见图6，将绿色、红色和蓝色信号图像合并后，所述红色信号标记的三种目标物中，不与绿色信号标记图像发生交叠的目标物C判定为13#着丝粒。对所述绿色信号标记的两种目标物的体积分别进行计算，该两种目标物的体积分别为5.42 μm³、1.57 μm³，判定体积为5.42 μm³的目标物A为21#全染色体，体积为1.57 μm³的目标物B’为18#着丝粒。对与绿色信号标记图像发生交叠的红色信号标记的两种目标物的体积分别进行计算，得到的该两种目标物的体积分别为6.79 μm³、1.82 μm³，判定体积为6.79 μm³的目标物A’为18#全染色体，体积为1.82 μm³的目标物B为21#着丝粒。

进一步的，还包括定位所述第一至第五目标物的步骤。

请参见图8-9，为所述第一至第五目标物的三维荧光图像及三维重构图。通过一三维图形重构处理对所述第一至第五目标物进行精确的定位，而得到所述第一至第五目标物的三维重构图形。请参见图9，所述第二目标物A’与第四目标物B’发生重叠，第四目标物B’基本被第二目标物A’覆盖。

可以理解，在步骤S141中通过计算得到的体积来判别所述第一目标物A与第四目标物B’，也可以为：通过计算结果判定体积较大的为第四目标物B’，体积较小的为第一目标物A。这一判别过程中涉及的所述第四目标物B’与第一目标物A的体积大小关系与其本身的特性相关。类似的，在步骤S142中判别第二目标物A’与第三目标物B也是如此。所述步骤S141~S143不限于上述顺序，比如：S141也可以在步骤S143之后进行。

请参阅图10，本发明第二实施例提供一种目标物的标记及识别的方法，所述目标物的标记及识别的方法包括以下步骤：

S21，将细胞进行固定及预处理；

S22，通过三个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物A、第四目标物B’和第六目标物C’，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物A’、第三目标物B和第五目标物C，其中，第一目标物A与第三目标物B相互交叠，第二目标物A’与第四目标物B’相互交叠，第五目标物C及第六目标物C’与第一目标物A、第二目标物A’、第三目标物B、第四目标物B’均无交叠，第一目标物A与第四目标物B’的体积不相同，第二目标物A’与第三目标物B的体积不相同；

S23，通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像和第二荧光图像；以及

S24，合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像的荧光信号是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第六目标物。

本实施例中步骤S21至S23与所述第一实施例中所述目标物的标记及识别的方法的步骤S11至S13基本相同，不同之处在于，步骤S22中通过三种带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的三种目标物(即，第一目标物A、第四目标物B’和第六目标物C’)，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的三种目标物(即，第二目标物A’、第三目标物B和第五目标物C)，以及步骤S24识别所述第一至第六目标物。

请参阅图11，在步骤S24中先将所述第一目标探测通道得到的第一荧光图像、所述第二目标探测通道得到的第二荧光图像与所述背景探测通道的背景荧光图像合并，然后识别第一至第六目标物。所述识别第一至第六目标物的方法具体如下：

首先，分别对第一荧光图像中与第二荧光图像发生交叠的两种目标物进行体积计算，通过计算结果判定体积较大的为第一目标物A，体积较小的为第四目标物B’；

然后，分别对第二荧光图像中与第一荧光图像发生交叠的两种目标物进行体积计算，通过计算结果判定体积较大的为第二目标物A’，体积较小的为第三目标物B；

最后，所述第一荧光图像中不与第二荧光图像交叠的目标物判定为第六目标物C’，所述第二荧光图像中不与第一荧光图像交叠的目标物判定为第五目标物C。

本发明第三实施例提供一种目标物的标记及识别的方法，所述目标物的标记及识别的方法包括以下步骤：

S31，将细胞进行固定及预处理；

S32，通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物A和第四目标物B’，通过两个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物A’和第三目标物B，其中，第一目标物A与第四目标物B’的体积不相同，第二目标物A’与第三目标物B的体积不相同；

S33，通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像和第二荧光图像；以及

S34，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第四目标物。

本实施例中步骤S31至S33与所述第一实施例中所述目标物的标记及识别的方法的步骤S11至S13基本相同，不同之处在于，步骤S32中通过两种带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的两种目标物(即，第一目标物A和第四目标物B’)，通过两个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的两种目标物(即，第二目标物A’和第三目标物B)，以及步骤S34通过计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第四目标物。

在本实施例中，所述第一目标物A、第二目标物A’、第三目标物B和第四目标物B’之间交叠与否，不影响识别目标物。只要所述第一至第四目标物两两之间存在一定的体积差异即可识别所述第一至第四目标物。

可以理解，本方法还适用于通过两种颜色的荧光染料标记和识别三个的目标物，其中，两个目标物之间存在体积差异。具体步骤与所述第三实施例所述方法的步骤基本相同，不同之处在于，通过带有第一种颜色的荧光染料标记两个存在体积差异的第一目标物和第二目标物，通过带有第二种颜色的荧光染料标记第三目标物。

可以理解，本方法还适用于利用一种颜色的荧光染料标记和识别两个体积不相同的目标物，具体步骤与所述第三实施例所述方法的步骤基本相同，不同之处在于，分别计算所述第一目标物和第二目标物的体积，通过第一目标物和第二目标物的体积大小判断该第一目标物和第二目标物。

该方法可以通过少数种颜色的荧光染料对多个目标物同时标记和识别，该方法步骤简单、无需繁冗的计算、对实验仪器及软件处理要求较低、容易操作、并且可对基因进行准确定位。

另外，本领域技术人员还可在本发明精神内作其它变化，当然这些依据本发明精神所作的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围内。

Claims

1.一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：

将细胞进行固定及预处理；

通过两个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物和第四目标物，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物、第三目标物和第五目标物，其中，第一目标物与第三目标物相互交叠，第二目标物与第四目标物相互交叠，第五目标物与第一目标物、第二目标物、第三目标物及第四目标物无交叠，第一目标物与第四目标物的体积不相同，第二目标物与第三目标物的体积不相同；

通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到第一荧光图像和第二荧光图像；以及

合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第五目标物。

2.如权利要求1所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述第一至第五目标物为全染色体、着丝粒、单个基因位点或基因片段。

3.如权利要求1所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述将细胞进行固定及预处理具体包括以下步骤：

提供一样品，从该样品中分离得到所述细胞，将所述细胞配制成一悬浮液；

将所述悬浮液涂片于一载玻片，并进行第一次孵育处理，所述载玻片为一防脱载玻片；

将载有细胞的载玻片浸入一固定液并保持一段时间以使细胞固定；

将固定后的细胞用一溶剂进行第一次洗涤处理；

将第一次洗涤处理后的细胞进行第二次孵育处理；

将经过第二次孵育处理后的细胞进行浸渍处理；

将浸渍后的细胞进行冻融处理；

将冻融后的细胞进行第二次洗涤处理；

将第二次洗涤处理后的细胞进行第三次孵育处理；以及

将第三次孵育处理后的细胞保存。

4.如权利要求3所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述第一次孵育处理为将所述细胞在温度为37℃，通入5%CO₂的培养箱中孵育20分钟~180分钟。

5.如权利要求3所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述保存第三次孵育处理后的细胞具体为将所述细胞保存于pH值为7.0的体积浓度为50%的甲酰胺溶液中至少24小时。

6.如权利要求1所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述识别和定位所述第一至第五目标物具体为：

判别第一目标物和第四目标物：对该第一荧光图像中的第一目标物和第四目标物的体积进行计算，通过计算结果判定体积较大的为第一目标物，体积较小的为第四目标物；

判别第二目标物和第三目标物：对该第二荧光图像中与第一荧光图像发生重叠的两种目标物的体积进行计算，通过计算结果判定体积较大的为第二目标物，体积较小的为第三目标物；以及

判别第五目标物：将所述多个探测通道的得到的第一荧光图像和第二荧光图像进行合并，并比较第一荧光图像与第二荧光图像是否发生重叠，其中，判定第二荧光图像中不与第一荧光图像发生重叠的为第五目标物。

7.如权利要求1所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述第一至第四目标物的体积计算满足以下公式：

Figure 2013102180057100001DEST_PATH_IMAGE001

其中，为目标物的体积，

Figure 2013102180057100001DEST_PATH_IMAGE003

为像素点在x方向的长度，

为像素点在y方向的长度，

Figure 2013102180057100001DEST_PATH_IMAGE005

为z方向步长，n为目标物所含像素点的个数。

8.一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：

将细胞进行固定及预处理；

通过三个带有第一荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物、第四目标物和第六目标物，通过三个带有第二荧光染料的探针分别标记细胞中的第二目标物、第三目标物和第五目标物，其中，第一目标物与第三目标物相互交叠，第二目标物与第四目标物相互交叠，第五目标物及第六目标物与第一目标物、第二目标物、第三目标物、第四目标物均无交叠，第一目标物与第四目标物的体积不相同，第二目标物与第三目标物的体积不相同；

合并所述第一荧光图像和第二荧光图像，分别计算所述第一至第四目标物的体积，通过第一荧光图像和第二荧光图像是否重叠以及上述计算的目标物体积的大小来识别所述第一至第六目标物。

9.如权利要求8所述的目标物的标记及识别的方法，其特征在于，所述识别第一至第六目标物具体包括以下步骤：

所述第一荧光图像中不与第二荧光图像交叠的目标物判定为第六目标物，所述第二荧光图像中不与第一荧光图像交叠的目标物判定为第五目标物；

分别对第一荧光图像中与第二荧光图像发生交叠的两种目标物进行体积计算，通过计算结果判定体积较大的为第一目标物，体积较小的为第四目标物；以及

分别对第二荧光图像中与第一荧光图像发生交叠的两种目标物进行体积计算，通过计算结果判定体积较大的为第二目标物，体积较小的为第三目标物。

10.一种目标物的标记及识别的方法，包括以下步骤：

将细胞进行固定及预处理；

通过两个带有同种颜色的荧光染料的探针分别标记细胞中的第一目标物和第二目标物，其中，第一目标物与第二目标物的体积不相同；

通过一荧光成像系统对所述细胞进行荧光成像得到一荧光图像；以及

分别计算所述荧光图像中的第一目标物和第二目标物的体积，通过计算的第一目标物和第二目标物体积的大小来识别所述第一目标物与第二目标物。