CN112930404A - 用于治疗剂分析的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了用于分析具有三维基质的生物样品中的试剂(例如，治疗剂)的方法和系统。

Description

用于治疗剂分析的方法和系统

交叉引用

本申请要求于2018年9月5日提交的美国临时专利申请No.62/727,295的优先权，其通过引用整体并入本文。

背景技术

治疗剂例如小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)正在将治疗领域从癌症转向神经系统病症。然而，很少有分子获得FDA批准。递送验证和脱靶敲低的挑战代表了临床实用性的重大障碍。批量RNA测序可以确定总体转录变化；然而，小的影响往往在噪声中消失。此外，由于使样品均质化，批量RNA测序无法将影响定位于特定组织、细胞类型或单个细胞。靶向核糖核酸分子(RNA-FISH)的荧光原位杂交可以将转录变化定位于特定细胞，然而，其低多重性限制了观察到的靶标数量。最后，RNA-FISH可需要长探针(250-1,500个碱基)，因此它无法直接检测和定位这些20-50个碱基的小分子。

发明内容

本公开内容提供了用于在具有三维基质的生物样品中检测治疗剂的方法和系统。

根据一个方面，本文提供一种用于鉴定反义核酸分子和靶分子的方法，其包括：(a)提供具有或疑似具有所述靶分子和所述反义核酸分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)使用与所述反义核酸分子和所述靶分子分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述反义核酸分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述靶分子相对于参考的水平升高或降低；以及(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义核酸分子和所述靶分子各自在所述生物样品中的位置的输出。

在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前，提供所述生物样品，使所述生物样品与具有所述反义核酸分子的溶液接触，以及在所述生物样品与所述溶液接触后，生成所述3D基质。在一些实施方案中，所述靶分子是靶核酸分子。

在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针鉴定所述靶核酸分子的靶序列，从而提供所述第二组信号。在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针对所述靶核酸分子进行测序，从而鉴定所述靶序列。在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针鉴定所述反义核酸分子的反义序列，从而提供所述第一组信号。在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针对所述反义核酸分子进行测序，从而鉴定所述反义序列。

在一些实施方案中，所述靶分子是靶多肽或靶蛋白。在一些实施方案中，所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。在一些实施方案中，所述反义核酸分子是治疗剂。在一些实施方案中，所述输出是图像或视频。在一些实施方案中，所述反义核酸分子是核糖核酸、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基(methocy)-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或2’-氟脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述反义核酸分子的长度为15至60个核苷酸。

根据另一方面，本文提供了一种用于鉴定反义核糖核酸(RNA)分子与靶核酸RNA分子共定位的方法，包括：(a)提供具有或疑似具有所述靶RNA分子和所述靶RNA分子的所述反义RNA分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述反义RNA分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述靶RNA分子相对于参考的水平升高或降低；以及(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义RNA分子与所述靶RNA分子在所述生物样品中共定位的输出。

在一些实施方案中，所述方法还包括，在(a)之前，提供所述生物样品，使所述生物样品与具有所述反义RNA分子的溶液接触，以及在所述生物样品与所述溶液接触后，生成所述3D基质。在一些实施方案中，所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。在一些实施方案中，(b)包括使用检测探针鉴定所述反义RNA分子的反义序列，从而提供所述第一组信号。在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针对所述反义RNA分子进行测序，从而鉴定所述反义序列。在一些实施方案中，(b)包括使用检测探针鉴定所述靶RNA分子的靶序列，从而提供所述第二组信号。在一些实施方案中，(b)包括使用所述检测探针对所述靶RNA分子进行测序，从而鉴定所述靶序列。在一些实施方案中，所述反义核酸分子是治疗剂。在一些实施方案中，所述输出是图像或视频。在一些实施方案中，所述反义RNA分子是修饰的反义核酸分子。在一些实施方案中，所述修饰的反义核酸分子是核糖核酸、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或2’-氟脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，所述反义RNA分子的长度为15至60个核苷酸。

根据另一方面，本文提供了一种用于鉴定靶核酸的两个或更多个遗传畸变的方法，其包括：(a)提供具有或疑似具有所述靶核酸的至少第一遗传畸变和第二遗传畸变的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)使用检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述第一遗传畸变在所述生物样品中的第一相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述第二遗传畸变在所述生物样品中的第二相对位置；以及(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变各自在所述生物样品中的位置的输出。

在一些实施方案中，将所述检测探针靶向于所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变的相同序列。在一些实施方案中，所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变至少具有单个核苷酸差异。在一些实施方案中，与所述第二遗传畸变相比，所述第一遗传畸变包含另外的序列。在一些实施方案中，所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

根据另一方面，本文提供了一种用于鉴定反义核酸分子的两个或多个位置的方法，其包括：(a)提供具有所述反义核酸分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)使用检测探针检测所述生物样品内的所述反义核酸分子的一组信号；(c)从所述生物样品内的至少第一位置和第二位置检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一位置和所述第二位置在不同的亚细胞区室(sub-cellular compartment)内；以及(d)使用所述反义核酸分子的所述一组信号以及所述第一位置和所述第二位置的所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义核酸分子与所述第一位置和所述第二位置共定位的输出。

在一些实施方案中，所述反义核酸分子的长度为15至60个核苷酸。在一些实施方案中，所述亚细胞区室包括线粒体、内质网、P体、高尔基体、囊泡、内体、溶酶体、细胞核、微管或其组合。在一些实施方案中，所述反义核酸分子是治疗剂。在一些实施方案中，所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

根据另一方面，本文提供了一种用于鉴定生物样品中的共定位分子的方法，其包括：(a)提供具有或疑似具有靶分子和能够与所述靶分子结合或相互作用的试剂的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)使用与所述靶分子和所述试剂分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述靶分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述试剂在所述生物样品中的相对位置；以及(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述靶分子与所述试剂在所述生物样品中共定位的输出。

在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是多核苷酸、多肽或小分子。

根据另一方面，本文提供了一种用于鉴定生物样品中的试剂和所述试剂的代谢物的方法，其包括：(a)提供具有或疑似具有所述试剂和所述试剂的所述代谢物的所述生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；(b)使用与所述靶分子和所述试剂分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述试剂在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述代谢物在所述生物样品中的相对位置；以及(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述试剂和所述代谢物各自的位置的输出。

在一些实施方案中，所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是多核苷酸、多肽或小分子。

本公开内容的另一个方面提供了一种包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他地方的任何方法。

本公开内容的另一个方面提供了一种系统，其包括一个或多个计算机处理器和与其耦合的计算机存储器。所述计算机存储器包括机器可执行代码，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他地方的任何方法。

根据下文的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将认识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，而所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和说明书本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。在通过引用而并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相抵触的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类相抵触的材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用了本发明的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图(本文中也称为“图”)，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在附图中：

图1A描绘了针对脑细胞类型的荧光原位测序(FISSEQ)建立的培养模型的示例图像。可以开发最小靶向的FISSEQ敲低测定法，以测试脑细胞类型上的RNAi和反义模式。

图1B描绘了亚细胞区室的示例图像。

图1C描绘了基于(1)定位；以及(2)细胞类型上的普遍性和表达变化评分的示例基因。

图2A描绘了在ICV组织模型中使用最小靶向的FISSEQ敲低测定法筛选RNAi以及反义模式的物理-化学和受体介导的递送机制的示例图像。

图2B描绘了示例实验数据，其示出了响应于治疗性RNA剂量的靶mRNA水平。

图3A描述了使用FISSEQ探针进行遗传畸变(例如，基因变体)检测的示意图。

图3B描绘了示例实验数据，其示出了在FISSEQ测定中检测的两个基因变体。

图4A描绘了使用FISSEQ探针进行基因表达检测的示意图。

图4B描绘了基因表达空间分布的示例实验数据。

图5A描绘了细胞内的粗面内质网(ER)的示例图像。

图5B描绘了分布在细胞内的线粒体的示例图像。

图5C描绘了分布在细胞内的治疗性RNA的示例图像。

图6A描绘了在小鼠脑中进行的原位反义寡核苷酸(ASO)和敲低检测。图像示出在对照ASO注射的大脑上进行的ASO检测。背景信号示出对治疗性ASO特异的探针未结合靶标。

图6B描绘了在小鼠脑中进行的原位ASO和敲低检测。图像示出在经治疗性ASO注射的大脑上进行的ASO检测。注射部位处和通过小脑的信号证实了治疗性ASO检测和定位在预期的大脑区域。

图6C描绘了小鼠脑中的原位ASO和敲低检测。图像示出治疗性ASO的靶标MALAT 1在对照中以高丰度存在。

图6D描绘了小鼠脑中的原位ASO和敲低检测。图像示出在治疗性ASO的情况下MALAT1被敲低。

图6E描绘了从图6A和图6B中的图像量化的原始强度。

图6F描绘了从图6C和图6D中的图像量化的原始强度。

图7A描绘了通过FISSEQ检测到的星形胶质细胞(重复序列1)中的示例基因表达谱。

图7B描绘了通过FISSEQ检测到的星形胶质细胞(重复序列2)中的示例基因表达谱。

图7C描绘了通过FISSEQ检测到的星形胶质细胞(重复序列3)中的示例基因表达谱。

图7D描绘了通过FISSEQ检测到的星形胶质细胞(重复序列4)中的示例基因表达谱。

图7E描绘了通过批量RNA测序检测的星形胶质细胞(重复序列5)中的示例基因表达谱。重复序列1-4的数据与批量RNA测序数据相关。

图8A描绘了星形胶质细胞培养物中的ASO敲低和定位，以及H₂O、对照ASO和治疗性ASO对敲低MALAT1的剂量响应。图像示出了在用H₂O处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图8B描绘了星形胶质细胞培养物中的ASO敲低和定位，以及H₂O、对照ASO和治疗性ASO对敲低MALAT1的剂量响应。图像示出了在用对照ASO处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图8C描绘了星形胶质细胞培养物中的ASO敲低和定位，以及H₂O、对照ASO和治疗性ASO对敲低MALAT1的剂量响应。图像示出了在用0.5μM治疗性ASO处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图8D描绘了星形胶质细胞培养物中的ASO敲低和定位，以及H₂O、对照ASO和治疗性ASO对敲低MALAT1的剂量响应。图像示出了在用5.0μM治疗性ASO处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图8E描绘了星形胶质细胞培养物中的ASO敲低和定位，以及H₂O、对照ASO和治疗性ASO对敲低MALAT1的剂量响应。实验数据示出了从图8A-图8D中的图像量化的每单位面积的强度。

图9A描绘了与qPCR相关的星形胶质细胞培养物中的ASO敲低：FISSEQ检测到与对照ASO相比，来自治疗性ASO 5μM的MALAT1降低了约7倍。图像示出了在用对照ASO处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图9B描绘了与qPCR相关的星形胶质细胞培养物中的ASO敲低：FISSEQ检测到与对照ASO相比，来自治疗性ASO 5μM的MALAT1降低了约7倍。图像示出了在用治疗性ASO处理的细胞培养物中进行的MALAT1检测。

图9C描绘了与qPCR相关的星形胶质细胞培养物中的ASO敲低：FISSEQ检测到与对照ASO相比，来自治疗性ASO 5μM的MALAT1降低了约7倍。qPCR数据显示为柱状图。测试了两个重复序列。

图10示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。

具体实施方式

虽然本文已经示出并描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应理解，可采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

如本说明书和权利要求书所用，除非另有明确说明，否则单数形式“一”和“所述”包括复数个指称物。例如，术语“一细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，术语“扩增”通常是指产生一个或多个核酸拷贝(或“扩增产物”)。一个或多个拷贝可通过核酸延伸来产生。这样的延伸可为单轮延伸或多轮延伸。扩增产物可通过聚合酶链反应(PCR)产生。

如本文所用，术语“逆转录”通常是指通过逆转录酶(或反转录酶)的作用从核糖核酸(RNA)分子产生脱氧核糖核酸(DNA)分子。

如本文所用，术语“核酸”通常是指包含多个核苷酸或核苷酸类似物的核酸分子。核酸可以是聚合形式的核苷酸。核酸可包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸或其类似物。核酸可为寡核苷酸或多核苷酸。核酸可具有各种三维结构并且可执行各种功能。核酸的非限制性示例包括DNA、RNA、基因或基因片段的编码或非编码区、连锁分析中定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。核酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在核酸组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核酸的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。核酸可在聚合后被进一步修饰，例如使用用于固定的官能性部分通过缀合修饰。

如本文所用，术语“受试者”通常是指具有可测试或可检测的遗传信息的实体或介质。受试者可为个人或个体。受试者可为脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物的非限制性示例包括鼠类、猿类和人类。受试者可为动物，例如农场动物。受试者可为宠物，例如狗、猫、小鼠、大鼠或鸟。受试者的其他示例包括食物、植物、土壤和水。受试者可表现出疾病。或者，受试者可无症状。

可从受试者获得包含核酸的任何合适的生物样品。包含核酸的任何合适的生物样品都可用于本文所述的方法和系统。生物样品可为固体物质(例如生物组织)或可为流体(例如生物流体)。通常，生物流体可包括与活生物体相关的任何流体。生物样品的非限制性示例包括从受试者的任何解剖位置(例如组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液组分，例如白细胞、红细胞、血小板)、从受试者的任何解剖位置获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾、呼吸、骨髓、粪便、精液、阴道液、来源于肿瘤组织的间质液、乳腺、胰腺、脑脊髓液、组织、咽拭子、活组织检查、胎盘液、羊水、肝、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰、脓、微生物群、胎粪、母乳、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、眼泪、眼液、汗液、粘液、耳垢、油、腺分泌物、脊髓液、头发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、强调液(emphatic fluid)和/或其他分泌物或身体组织。生物样品可为无细胞样品。这样的无细胞样品可包括DNA和/或RNA。

如本文所用，术语“反应性基团”或“官能性部分”，通常是指第一反应物上的能够与第二反应物上的另一官能性部分或反应性基团发生化学反应以形成共价键或离子键的任何部分。“反应性基团”和“官能性部分”可互换使用。例如，基质形成材料的单体或聚合物的反应性基团可与目标底物或靶标上的官能性部分(或另一个反应性基团)发生化学反应以形成共价键或离子键。然后目标底物或靶标可通过由反应性基团和官能性部分形成的键固定在基质上。合适的反应性基团或官能性部分的示例包括亲电体或亲核体，所述亲电体或亲核体可通过分别与目标底物上的相应亲核体或亲电体反应而形成共价键。合适的亲电反应性基团的非限制性示例可包括例如酯(包括活化的酯(例如，琥珀酰亚胺基酯))、酰胺、丙烯酰胺、酰基叠氮化物、酰基卤化物、酰基腈、醛、酮、烷基卤化物、烷基磺酸盐、酸酐、芳基卤化物、氮丙啶、硼酸盐、碳二亚胺、重氮烷烃、环氧化物、卤代乙酰胺、卤代铂酸盐、卤代三嗪、酰亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、甲硅烷基卤化物、磺酸酯、磺酰基卤化物等。合适的亲核反应性基团的非限制性示例可包括例如胺、苯胺、硫醇、醇、酚、肼(hyrazine)、羟胺、羧酸、二醇、杂环化合物等。

如本领域普通技术人员所确定的，术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内，该误差将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差之内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％。或者，特别是关于生物系统或过程，术语“约”可以意指在数值的数量级内，如在值的5倍之内或在2倍之内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示在该特定值可接受的误差范围内。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或更多个数值中的第一数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3相当于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。

每当术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一数值之前时，术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1相当于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。

本公开内容提供了用于荧光原位测序(FISSEQ)的方法和系统。FISSEQ可用于在组织和细胞培养物中利用治疗剂在空间上定位转录变化。FISSEQ是指可以在组织微环境内递送总体转录组、基因组和蛋白质组图谱的三维(3D)空间全景式(panomic)分子检测技术。FISSEQ结果可以包括样品的图像渲染，以及标有其坐标和检测到的任何变异的序列。这些变异的示例包括，但不限于，单核苷酸多态性(SNP)、缺失和插入。FISSEQ具有在“组学”规模上测量基因和蛋白质的能力，可以提供对组织内细胞变异、细胞鉴定、细胞图谱创建、细胞形态学、外来实体(如病原体和病毒)的鉴定以及疾病进展映射的更深入了解。

FISSEQ可以在基质内原位检测3D排列的靶标，其中检测信号可以是荧光信号。FISSEQ可以采用的测序方法可以是合成测序、连接测序或杂交测序。在FISSEQ中检测到的靶标可以是目标生物分子或其衍生物(例如，与目标生物分子结合的探针)。FISSEQ的示例过程可以包括使生物样品内具有相对3D空间关系的多个核酸与基质形成材料接触，以基本保持相对3D空间关系；使用所述基质形成材料形成3D聚合基质，所述3D聚合基质包括与所述3D聚合基质共价或非共价附接的多个核酸中的核酸；以及检测来自核酸或其衍生物的信号以鉴定核酸。本文所述的核酸可以是生物样品内的内源性核酸或合成核酸。例如，可以将内源性核酸附接于3D基质。再例如，可以将内源性核酸扩增，例如，通过原位滚环扩增(RCA)，并且可将扩增产物附接于3D基质，然后进行检测。在美国专利号US10138509B2中公开了制备核酸的三维基质并在该基质内扩增和检测此类核酸的方法，该专利通过引用整体并入本文。

靶向的FISSEQ通常是指使用靶向一组目标靶标的探针通过FISSEQ对一组目标靶标进行检测。例如，可以将作为逆转录引物的探针设计成特异性地靶向一组目标转录物，而不是靶向所有转录物。靶向的FISSEQ可具有针对更大的单分子(per-molecule)敏感性的潜力，因为否则将被包含与生物现象无关的cDNA或DNA序列的RCA扩增子所占据的细胞体积可以被重新分配给目标RNA或DNA种类的子集。此外，对于RNA捕获，逆转录的随机六聚体引发可能不是特别有效。在一些情况下，靶向的FISSEQ的敏感性可以等于或大于使用随机六聚体的FISSEQ的敏感性的约5倍、10倍、20倍、40倍、80倍、120倍、160倍、200倍、400倍、1000倍、5000倍或更高。此外，对于RNA捕获，逆转录的随机六聚体引发可以不是有效的。其他序列捕获方法和探针设计可以具有更好的捕获效率。对于DNA捕获，靶向捕获也可以受益于增强的单分子敏感性。

与全转录组RNA FISSEQ或全基因组DNA FISSEQ相比，靶向的FISSEQ也可以是实质上更快的测定。在一些情况下，靶向的FISSEQ可以为全转录组RNA FISSEQ或全基因组DNAFISSEQ约2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍或20倍快。作为一个示例，全转录组FISSEQ可需要足够长的测序读取序列以进行高精度的短读取比对。换言之，测序读取序列可需要足够长来从计算方面确定起始分子种类，如通过将测序读取序列与基因组或转录组参考序列数据库进行比对。在这种全组学应用中，RNA-seq读取序列可需要为约20-30个碱基长，而基因组读取序列可需要更长，如50-100个碱基长，以恢复基本准确的比对。对于条形码分子标记物的靶向FISSEQ，在条形码标记物可以是具有4^N复杂性的核酸序列(给定N个碱基的测序读取序列)的情况下，则可以需要短得多的测序读取序列来进行分子鉴定。例如，可以使用5个核苷酸的条形码序列(4^5＝1024)来识别1024个分子种类，而可以使用8个核苷酸条形码来鉴定多达65,536个分子种类，该数量大于人类基因组中不同基因的总数。因此，设计用于检测人类转录组中每个基因的靶向FISSEQ测定可以快将近4倍(8个碱基对30个碱基)，而在人类基因组中则快多达超过12倍(8个碱基对100个碱基)。当靶向特定RNA种类进行逆转录时，潜在cDNA序列的空间可以是整个转录组的重要子集，因此，只需较少的测序碱基即可鉴定靶分子。当靶向特定的DNA基因座或核苷酸进行测序或重测序时，捕获序列的空间可以是整个基因组序列或细胞DNA序列的重要子集。在可以检测探针中包含的分子“条形码”序列而不是内源性序列的情况下，靶向的FISSEQ可以是根据每个测序周期的信息的有效读出。由于条形码序列是预先确定的，因此也可以将其设计为具有错误检测和校正机制的特征。使用靶向的FISSEQ和探针设计的方法在美国专利申请号16/285,292中公开，其通过引用整体并入本文。

FISSEQ用于药物开发应用

FISSEQ可以能够实现全景式的、大规模的多重分子测量。因此，FISSEQ可以为增强我们对患病和健康生物样本之间差异的理解创造新的可能性。健康和患病样本的配对测量可以使用于药物治疗的分子靶标能够得到治愈，包括在健康和患病样本之间显示出丰度或定位差异的分子，以及可能已知或认为用于调节那些分子的丰度或定位的分子(如通过调节生物系统的基因调节性、发育性(developmental)或代谢信号处理途径)。以相同的方式，例如在细胞和组织的物理性质、细胞和组织的组成以及细胞和组织的组织机构方面的其他变化，可用于产生药物开发的靶标，这些靶标可能已知的或显示用于调节这些性质。

通过将疾病状态映射到细胞的分子谱和组织的细胞谱的变化，FISSEQ可以能够实现疾病状态的分层，这可以帮助例如通过确定群组构成构建临床试验(以及为后续的临床使用指导提供依据)。

最后，FISSEQ可用于开发用于药物开发的模型系统，包括用于靶向模式的开发。例如，FISSEQ可用于选择靶基因，如可以在所有细胞中广泛表达或以另一种所需模式表达的靶基因，用于基于RNAi的治疗开发，其中可以筛选靶向模式的文库，以定位药物递送位点。

FISSEQ用于药代动力学测量

原位测序，当应用于原位治疗分子的检测时，可以能够使在药代动力学研究方面取得重大进展，该研究通常被理解是为对生物体吸收药物、它们经历的生物转化、药物及其代谢物在组织中的分布以及它们在一段时间内的代谢以及药物及其代谢物的消除的过程的研究。

FISSEQ的全景式性质可以使得细胞和组织内的药物及其代谢物能够直接检测。可以使用FISSEQ直接检测核酸药物，如通过对核酸药物或衍生核酸(如生物化学转化的模板)(例如，使用将内源性核酸转化为测序模板的步骤，包括但不限于片段化、衔接子连接、逆转录、第二链化、环化)和/或作为扩增的模板(例如，通过扩增子的生成)的荧光测序。核酸药物的示例包括，但不限于，用于短干扰RNA机制(siRNA)、RNA干扰(RNAi)、CRISPR/Cas9的那些核酸药物和其他核酸导向的核酸结合药物，基因治疗、适体、核酶、反义分子、诱饵分子的核酸方面，和免疫增强药物。其他类型的非核酸药物包括，但不限于，小分子和生物制剂(包括蛋白质和激素药物)，以及包括生物分子方面的其他药物，可以例如通过使用DNA条形码化的亲和性结合剂与核酸测序模板关联。用于FISSEQ中检测的亲和性结合剂可以包括，但不限于，抗体和其他类别的天然或工程化的免疫蛋白，以及适体。

在某些实施方案中，可以借助于修饰或官能化，如序列或结构修饰、PEG修饰、融合蛋白和其他蛋白质衍生物、生物分子的化学修饰等，使用FISSEQ检测药物的一个或多个方面，其可用于调节药物的代谢或定位。

使用FISSEQ，可以借助测序测定法的固有多重性来实现药物的多重检测，其中核酸可以包含巨大的分子同一性信息编码空间，例如当通过杂交反应通过测序进行检测时，包括那些通过HCR(例如循环HCR反应(CHCR))、连接测序、合成测序扩增的那些，并包括所有其他使用原位发出并在多于一个的检测时间点组织的荧光信号进行序列判别的方法。

对药物及其代谢物的时空组织的FISSEQ检测可以使得能够对与药物及其代谢物的定位以及药物及其代谢物的代谢有关的化合物或组合物进行筛选、开发和工程化。例如，FISSEQ药代动力学研究可以利用一种或多种具有物理化学或受体介导的递送机制特征的药物化合物，其中时空定位的方面可以与递送或定位确定机制相关，例如出于测量和/或改善药物定位特异性的目的。可以使用除FISSEQ以外的方法直接检测药物及其代谢物，以便用为药效动力学研究目的而收集的FISSEQ数据进行数据整合。

为了确定治疗分子在组织、细胞和亚细胞空间尺度上的时空分布，可以以任意的空间分辨率对药物及其代谢物的空间组织进行检测，所述空间分辨率范围从器官水平定位到具有纳米级精度的亚细胞定位。药物及其代谢物的时空定位可以广泛用于药代动力学研究目的，包括，但不限于，用于包括在器官或组织水平，在细胞水平(例如对于某种细胞类型或具有某种生物分子谱特征的细胞)，以及在亚细胞水平上(例如对于治疗模式的位点)检测药物在疾病部位上的定位，例如，用于通过测量结合分数来推断活性。

FISSEQ用于药效动力学测量

原位测序也可以促进药效动力学的研究，其通常是指对药物的生物反应的研究，包括在一段时间内(如在治疗过程期间和中止治疗后)预期的和非预期的、治疗性的、有害的或中性的那些研究。药物起效的作用通常可以落入许多类别之一，包括，但不限于：刺激作用，如通过直接受体激动作用和下游作用；抑制作用，如通过直接受体激动作用和下游作用(例如，反向激动剂)；阻断或拮抗作用，如当药物结合受体但不将其激活时；稳定作用，如当药物似乎既不作为刺激剂也不作为抑制剂时。通过直接有益的化学反应(如自由基清除)或通过直接有害的化学反应(这可例如通过诱导的毒性或致死性损伤而导致细胞的损坏或破坏)，可以通过交换或替换物质或将其积累以形成储备来实现药物起效的作用。此外，这些作用可以在分子水平上通过多种机制之一介导，包括，但不限于，与蛋白质(如酶、结构蛋白、载体、转运或离子通道、信号传导蛋白和受体)相互作用；配体结合；以及其他机制，例如通过破坏脂质或膜结构，通过与核酸的相互作用，或通过其他化学反应。

药效动力学也可以涉及对药物治疗的定量反应，包括治疗窗口，与最小有效剂量和发生不良反应的剂量之间的差异有关的剂量反应方面；以及药物治疗的时间方面，如活性的持续时间。

FISSEQ可以使得能够直接测量药物的分子机制和作用。鉴于FISSEQ技术具有全景式、大规模多重的性质，可以有可能同时测量药物治疗对多种分子靶标的丰度和定位的作用。分子靶标可以包括那些涉及疾病机制或所需应答的其他标志物、毒性或不良应答的机制的分子靶标以及控制基因，所述控制基因在其丰度和定位方面均认为与药物治疗无关，其可用于数据归一化或对FISSEQ数据进行其他统计学解释的目的。可以测定RNA、蛋白质、DNA和小分子靶标。根据一方面，该测定可以是全组学的或非靶向的，如随机引发的RNA-FISSEQ测定。

FISSEQ也可以使得能够直接测量药物的细胞、组织、器官和生物体水平的表型反应，例如这些特征的组成或空间组织的变化。例如，使用FISSEQ，可以检测组织架构中的变化，例如组织或器官内细胞类型的组成或组织以及细胞分子表达谱和活性的变化。FISSEQ可用于，例如通过检测代谢物或信号传导分子，以及通过检测受体及其状态以及受体介导的信号传导的其他细胞内和细胞外成分来检测细胞-细胞信号传导的变化。FISSEQ可用于检测生物体内细胞外基质的组成和组织、细胞周围的结构和运输环境的变化。

FISSEQ也可以使推断药物的分子机制和作用得以实现。通过共同检测药物及其代谢物以及检测内源性分子(例如RNA、DNA和蛋白质)，可推断结合和其他邻近介导的反应。例如，FISSEQ文库可以被构建用于两种或更多种分析物的共同检测和/或邻近检测，以测量药物的结合性质。

通过使用具有足够序列分辨率的FISSEQ测定，可测量由药物治疗导致的核酸分子的序列变化(例如，遗传畸变)，例如等位基因特异性表达、选择性剪接和外显子跳跃，以及序列中的突变或工程化改变。

药物作用可以是期望的或不期望的。不期望的作用可以包括，但不限于，突变、例如与其他药物或遗传或环境背景等相互作用的可能性增加，以及其他有害或破坏性作用。FISSEQ可用于检测与毒性和其他不期望作用、免疫和细胞免疫应答、致敏作用及其他不期望作用有关的区室中治疗性化合物的积累。

此外，通过包含性地测量响应于药物治疗而发生的分子变化，可指导治疗的发展，如通过使用佐剂或辅助药物来增强期望的作用或补救不期望的作用。

数据整合

用于本文所述目的的FISSEQ数据可以与其他类型的信息组合，如批量和/或单细胞分析物检测。可以将一种或多种药物或药物组合物的FISSEQ测定与内源性生物分子测定组合，从而能够对药物(包括其药代动力学和药效动力学特性)进行有力的表征。

治疗剂和分子靶标

本文提供了用于检测治疗剂及其分子靶标的方法和系统。分子靶标可以是生物样品中任何目标分子，其可以直接结合或可以不直接结合治疗剂。分子靶标可以在疾病中起作用。在一些情况下，分子靶标可以直接与治疗剂结合，并且分子靶标及其治疗剂可以在生物样品内共定位。在一些情况下，分子靶标可以在受直接与治疗剂结合的上游分子影响的信号传导途径的下游，因此分子靶标可以不直接与治疗剂结合。

治疗剂可以是核酸治疗剂、蛋白质治疗剂、肽治疗剂或小分子治疗剂。在各种情况下，可以通过本文所述的FISSEQ检测核酸治疗剂或其衍生物(例如，核酸治疗剂的核酸序列的扩增产物或特异性靶向该核酸治疗剂的探针)。在治疗剂不包含核酸序列的情况下，例如蛋白质治疗剂、肽治疗剂或小分子治疗剂，可以将治疗剂连接至核酸序列以通过本文所述的FISSEQ进行检测。

在一些情况下，分子靶标可以是核酸靶标。核酸靶标可以是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。核酸靶标可以是单链或双链的。核酸靶标可为天然存在的核酸或非天然存在的核酸，例如使用合成方法制备的核酸。核酸靶标可为生物样品中的内源性核酸，例如基因组DNA、信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小细胞质RNA(scRNA)和小核RNA(snRNA)。治疗剂可以直接结合至核酸靶标。治疗剂可以影响核酸靶标的功能或表达水平。在一些情况下，治疗剂可以不直接结合至核酸靶标，而是影响核酸靶标的功能或表达水平。例如，与核酸靶标结合的治疗剂可以是反义寡核苷酸。如本文所用，“反义寡核苷酸”是指包含目的核酸靶序列的反向互补序列的核酸序列。反义寡核苷酸可以结合至核酸靶标，并影响其结构或功能。反义寡核苷酸与活性靶基因或其转录物的结合可通过多种过程引起表达降低。结合可以通过转录的阻断(在基因结合的情况下)、mRNA转录物的降解(例如，通过小干扰RNA(siRNA)或RNase-H依赖性反义)发生，或可以通过mRNA翻译、pre-mRNA剪接位点或用于其他功能性RNA(包括miRNA)的成熟的核酸酶切割位点的阻断(例如，通过吗啉代寡核苷酸或其他RNase-H独立性反义)而发生。反义寡核苷酸可以是单链或双链的。反义寡核苷酸的示例包括RNase-H依赖性反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、miRNA和短发夹RNA(shRNA)。反义寡核苷酸可以是DNA。核酸靶标可以被蛋白质治疗剂(例如，核酸结合蛋白)结合，并且在这种情况下，蛋白质治疗剂可以与核酸序列直接或间接连接。与蛋白质治疗剂直接或间接连接的核酸序列可以通过FISSEQ检测。

在一些情况下，分子靶标可以是蛋白质。在分子靶标是蛋白质的情况下，可以将与蛋白质结合的治疗剂(例如，抗体或其片段和小分子)连接至核酸序列，然后可以通过本文提供的方法和系统对其进行检测。在一些情况下，用于蛋白质靶标的治疗剂可以是蛋白质治疗剂。蛋白质治疗剂的示例包括，但不限于，单克隆抗体、融合蛋白(例如Fc融合蛋白)、细胞因子和激素。在一些情况下，蛋白质靶标的治疗剂可以是适体。在一些其他情况下，蛋白质靶标的治疗剂可以是小分子。

对于小分子检测，可以产生对小分子特异的DNA条形码化亲和性结合试剂。另一种方法可以是开发动态小分子生物传感器，该传感器在靶标配体的存在下可以发生构象变化。如本文所使用的生物传感器可以指响应小分子诱导物的存在而调节基因表达的遗传编码的生物传感器。生物传感器可以是包括遗传编码的生物传感器的小分子诱导系统的一部分。这种生物传感器系统可以通过转录抑制或激活，将小分子的活性或丰度转移到某些RNA种类的转录水平。例如，生物传感器可以是蛋白质，其中蛋白质充当转录抑制因子或激活因子。在一些情况下，转录抑制因子或激活因子可以由小分子调节，而小分子进而调节RNA转录。在这种情况下，某些RNA转录物/种类的丰度和/或存在可用于确定调节性小分子的水平和/或存在。

为了将小分子(例如，治疗剂或代谢物)保留在原位以进行检测，需要开发用于将小分子交联到膨胀的水凝胶基质上的化学方法，这使得在膨胀期间能够通过稀释生物分子使样品透性化。此外，与钙成像一样，可以设计使原位与体内界线模糊的FISSEQ实验。例如，荧光生物传感器可用于测量体内代谢物丰度和定位的动力学，其可与原位基因表达或基因型的单个时间点测量组合。生物传感器也可以通过如下记录小分子在RNA中的丰度和定位：如通过结合时激活转录，或通过将此信息直接编码到基因组中(例如使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术)。在前者情况下，可以使用FISSEQ原位检测包含关于体内代谢物浓度的信息的RNA分子。在后者情况下，可以使用FISSEQ原位检测修饰的基因组序列。

可以使用本文所述的FISSEQ来检测或分析来自核酸靶标或治疗剂的核酸序列。具有该核酸序列的核酸分子可存在于三维(3D)基质中并与3D基质共价连接，从而使各核酸的相对位置固定(例如固定化)在3D基质中。以此方式，可提供任何序列的共价结合的核酸的3D基质。各核酸可在基质材料内具有其自身的三维坐标，并且各核酸可代表信息。以此方式，大量信息可存储在3D基质中。诸如DNA或RNA的单个信息编码核酸靶标可原位(即，在基质内)进行扩增和测序，从而可在合适的3D基质中存储和读取大量信息。

核酸分子(分子靶标或治疗剂)可被扩增以在3D基质内产生扩增产物或扩增子。核酸靶标可使用核酸扩增(例如聚合酶链反应(PCR))进行扩增。核酸分子可与探针(例如，检测探针)结合，并且探针可随后被扩增以产生扩增产物或扩增子。在一些情况下，核酸分子为RNA分子，并且RNA分子可被逆转录以产生cDNA。用于结合靶RNA分子的探针(例如，检测探针)可以用作逆转录引物。然后cDNA可进行扩增或与探针接触。扩增产物或扩增子可例如通过共聚或交联连接至基质。这可产生结构稳定且化学稳定的核酸3D基质。核酸3D基质可允许延长信息存储和读出周期。核酸/扩增子基质可允许在三个维度上对大范围的样品阵列进行高通量测序。在一些情况下，RNA分子可直接被探针靶向，无需逆转录。探针可以直接或间接用报告剂标记，以用于检测，如本文所述。

分析方法

本文提供了用于分析或鉴定生物样品中的试剂的方法和系统。所述试剂可以是治疗剂，例如，反义核糖核酸(RNA)和小分子抑制剂。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于鉴定反义核酸分子和靶分子的方法。该方法可以包括提供具有或疑似具有靶分子和反义核酸分子的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可以使用与反义核酸分子和靶分子分离的检测探针从生物样品中检测第一组信号和第二组信号。第一组信号可以鉴定反义核酸分子在生物样品中的相对位置。第二组信号可以鉴定靶分子相对于参考的水平升高或降低。接下来，第一组信号和第二组信号可用于提供指示反义核酸分子和靶分子各自在生物样品中的位置的输出。

在一些情况下，该方法还可以包括在提供生物样品之前，使生物样品与具有反义核酸分子的溶液接触。接下来，在生物样品与溶液接触后，可以生成3D基质。

靶分子可以是靶核酸分子。靶核酸分子可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。检测探针可用于鉴定靶核酸分子的靶序列，从而提供第二组信号。检测探针可用于对靶核酸分子进行测序，从而鉴定靶序列。检测探针可用于鉴定反义核酸分子的反义序列，从而提供第一组信号。检测探针可用于对反义核酸分子进行测序，从而鉴定反义序列。

靶分子可以是靶多肽或靶蛋白。生物样品可以是细胞、细胞衍生物或组织。反义核酸分子可以是治疗剂。输出可以是图像或视频。反义核酸分子可以是核糖核酸、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或2’-氟脱氧核糖核酸。

反义核酸分子的长度可以是15至20、20至30、30至40、40至50或50至60个核苷酸。在一些情况下，反义核酸分子的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定反义核糖核酸(RNA)分子与靶RNA分子共定位的方法。该方法可以包括提供具有或疑似具有靶RNA分子和靶RNA分子的反义RNA分子的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可以从生物样品中检测第一组信号和第二组信号。第一组信号可以鉴定反义RNA分子在生物样品中的相对位置。第二组信号可以鉴定靶RNA分子的水平相对于参考的升高或降低。第一组信号和第二组信号可用于提供指示反义RNA分子与靶RNA分子在生物样品中共定位的输出。

在一些情况下，该方法还可以包括在提供生物样品之前，使生物样品与具有反义RNA分子的溶液接触。接下来，在生物样品与溶液接触后，可以生成3D基质。

生物样品可以是细胞、细胞衍生物或组织。检测探针可用于鉴定反义RNA分子的反义序列，从而提供第一组信号。检测探针可用于对反义RNA分子进行测序，从而鉴定反义序列。检测探针可用于鉴定靶RNA分子的靶序列，从而提供第二组信号。检测探针可用于对靶RNA分子进行测序，从而鉴定靶序列。

反义RNA分子可以是治疗剂。输出可以是图像或视频。反义RNA分子可以是修饰的反义核酸分子。修饰的反义核酸分子可以是硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或2’-氟脱氧核糖核酸。反义RNA分子的长度可以是15至20、20至30、30至40、40至50或50至60个核苷酸。在一些情况下，反义RNA分子的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定靶核酸的两个或更多个遗传畸变的方法。该方法可以包括提供具有或疑似具有靶核酸的至少第一遗传畸变和第二遗传畸变的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可使用检测探针从生物样品中检测第一组信号和第二组信号。第一组信号可以鉴定第一遗传畸变在生物样品中的第一相对位置。第二组信号可以鉴定第二遗传畸变在生物样品中的第二相对位置。接下来，第一组信号和第二组信号可用于提供指示第一遗传畸变和第二遗传畸变各自在生物样品中的位置的输出。

检测探针可以靶向于第一遗传畸变和第二遗传畸变的相同序列。第一遗传畸变和第二遗传畸变可以至少具有单个核苷酸差异。与第二遗传畸变相比，第一遗传畸变可以包含另外的序列。生物样品可以是细胞、细胞衍生物或组织。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定反义核酸分子的两个或更多个位置的方法。该方法可以包括提供具有反义核酸分子的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可以使用检测探针检测生物样品内的反义核酸分子的一组信号。可以从生物样品内的至少第一位置和第二位置检测第一组信号和第二组信号。第一位置和第二位置可以在不同的亚细胞区室内。反义核酸分子的一组信号以及第一位置和第二位置的第一组信号和第二组信号可用于提供指示反义核酸分子与第一位置和第二位置共定位的输出。

反义核酸分子的长度可以是15至20、20至30、30至40、40至50或50至60个核苷酸。在一些情况下，反义核酸分子的长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。亚细胞区室可以包括线粒体、内质网、P体、高尔基体、囊泡、内体、溶酶体、细胞核、微管或其组合。反义核酸分子可以是治疗剂。生物样品可以是细胞、细胞衍生物或组织。

在一些实施方案中，本公开提供了一种用于鉴定生物样品中共定位分子的方法。该方法可以包括提供具有或疑似具有靶分子和能够与靶分子结合或相互作用的试剂的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可使用与靶分子和试剂分离的检测探针从生物样品中检测第一组信号和第二组信号。第一组信号可以鉴定靶分子在生物样品中的相对位置。第二组信号可以鉴定试剂在生物样品中的相对位置。第一组信号和第二组信号可用于提供指示靶分子与试剂在生物样品中共定位的输出。

试剂可以是治疗剂。治疗剂可以是多核苷酸、多肽或小分子。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定生物样品中的试剂和该试剂的代谢物的方法。该方法可以包括提供具有或疑似具有该试剂和该试剂的代谢物的生物样品。生物样品可以包含三维(3D)基质。接下来，可使用与靶分子和试剂分离的检测探针从生物样品中检测第一组信号和第二组信号。第一组信号可以鉴定试剂在生物样品中的相对位置。第二组信号可以鉴定代谢物在生物样品中的相对位置。接下来，第一组信号和第二组信号可用于提供指示试剂和代谢物各自位置的输出。生物样品可以是细胞、细胞衍生物或组织。试剂可以是治疗剂。治疗剂可以是多核苷酸、多肽或小分子。

三维基质

本公开内容提供了一种三维(3D)基质。3D基质可包含多个核酸。3D基质可包含与其共价或非共价附接的多个核酸。

在一些情况下，可使用基质形成材料形成3D基质。基质形成材料可为可聚合的单体或聚合物，或可交联的聚合物。基质形成材料可为聚丙烯酰胺、丙烯酰胺单体、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、琼脂糖、葡聚糖(dextran)或聚乙二醇。基质形成材料可使用专用于基质形成材料的方法以及方法、试剂和条件，通过基质形成材料的聚合和/或交联而形成基质。基质形成材料可形成聚合物基质。基质形成材料可形成聚合电解质凝胶。基质形成材料可形成水凝胶凝胶基质。

基质形成材料可形成3D基质，所述3D基质包括多个核酸，同时保持核酸的空间关系。在这方面，可将多个核酸固定在基质材料内。多个核酸可通过使核酸与基质形成材料共聚而固定在基质材料内。多个核酸还可通过使核酸交联到基质材料上或以其他方式与基质形成材料交联而固定在基质材料内。多个核酸也可通过共价附接或通过配体-蛋白质与基质的相互作用而固定在基质内。

根据一个方面，基质可为多孔的，从而允许将试剂引入基质内的核酸位点处以扩增核酸。多孔基质可根据各种方法制备。例如，使用合适的丙烯酰胺:双丙烯酰胺的比率控制交联密度，可以使聚丙烯酰胺凝胶基质与丙烯酰胺基(acrydite)改性的链霉亲和素单体和生物素化的DNA分子共聚。通过添加另外的交联剂，例如官能化的聚乙二醇，可实现对分子筛尺寸和密度的另外的控制。

根据一个方面，3D基质可为足够光学透明的，或可具有适于标准测序化学和用于高通量信息读出的深三维成像的光学性质。利用荧光成像的测序化学的示例包括ABISoLiD(Life Technologies)，其中模板上的测序引物与带有可裂解终止子的经荧光标记的八聚体的库连接。连接后，可使用四个颜色通道(FITC、Cy3、Texas红和Cy5)对模板成像。然后可切除终止子，留下自由端以参与下一个连接-延伸循环。确定所有二核苷酸组合后，可将图像映射到颜色代码空间，以确定每个模板的特定碱基调用。工作流程可使用自动流控技术和成像设备(即，SoLiD 5500W Genome Analyzer，ABI Life Technologies)来实现。测序平台的另一个示例使用合成测序，其中可使用DNA聚合酶引入具有可裂解终止子的单核苷酸池。成像后，可裂解终止子，并可重复该循环。然后可分析荧光图像，从而为流通池中的各DNA扩增子调用碱基(HiSeq，Illumia)。

在一些方面，可在基质形成材料(例如水凝胶子单元)的存在下固定生物样品。“固定”生物样品意指将生物样品(例如细胞或组织)暴露于固定剂，使得细胞组分变得彼此交联。“水凝胶”或“水凝胶网络”意指不溶于水的聚合物链的网络，有时建立为其中水是分散介质的胶体凝胶。换句话说，水凝胶是一类可吸收大量水而不溶解的聚合材料。水凝胶可包含超过99％的水，并可包含天然或合成聚合物，或其组合。由于其大量的水含量，水凝胶还可具有与天然组织非常相似的柔韧度。“水凝胶子单元”或“水凝胶前体”是指可交联或“聚合”形成3D水凝胶网络的亲水性单体、预聚物或聚合物。不受任何科学理论的束缚，在水凝胶子单元的存在下对生物样品的固定可使生物样品的组分与水凝胶子单元交联，从而将分子组分固定在适当的位置，从而保留组织架构和细胞形态。

在一些情况下，可先将生物样品固定并/或透性化，然后可将基质形成材料添加到生物样品中。

在不存在或存在水凝胶子单元(例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等)的情况下，可使用任何方便的固定试剂或“固定剂”来固定生物样品。通常，固定剂可稀释在缓冲液中，例如盐水、磷酸盐缓冲液(PB)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸缓冲液、磷酸钾缓冲液等(通常以约1-10％的浓度，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或10％)，例如4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液；2％多聚甲醛/0.2％苦味酸/0.1M磷酸盐缓冲液；4％多聚甲醛/0.2％高碘酸盐/1.2％赖氨酸在0.1M磷酸盐缓冲液中；4％多聚甲醛/0.05％戊二醛在磷酸盐缓冲液中，等等。所使用的固定剂的类型和暴露于固定剂的持续时间取决于样本中目标分子对由固定剂变性的敏感性，并且可使用常规的组织化学或免疫组织化学技术容易地确定。

固定剂/水凝胶组合物可包含任何水凝胶子单元，例如但不限于聚(乙二醇)及其衍生物(例如PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、聚脂族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚四氢呋喃(polytetramethyleneoxide)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(丙烯酸羟乙酯)和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等。诸如亲水性纳米颗粒的试剂可用于改善水凝胶的渗透性，同时保持可图案化，所述试剂例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PLG)、聚(乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)等。诸如PEG的嵌段共聚物、可降解的PEO、聚乳酸(PLA)的材料和其他类似材料可用于增加水凝胶的特定特性。可包括交联剂(例如双丙烯酰胺、双吖丙啶等)和引发剂(例如偶氮二异丁腈(AIBN)、核黄素、L-精氨酸等)以促进在随后的聚合步骤中相互作用的大分子之间的共价键合。

生物样品(例如细胞或组织)在固定后可被透性化。可进行透性化以促进进入细胞质或细胞内分子、细胞的组分或结构。透性化可使试剂(例如磷酸化选择性抗体、核酸缀合抗体、核酸探针、引物等)进入细胞，并在细胞内达到如下的浓度：所述浓度高于在不进行这样的透性化处理的情况下通常可以渗透到细胞中的浓度。在一些实施方案中，可在透性化后储存细胞。在一些情况下，可使细胞与一种或多种试剂接触，以在透性化后允许一种或多种试剂渗透而无需任何储存步骤，然后进行分析。在一些实施方案中，可在至少约60％、70％、80％、90％或更高的甲醇(或乙醇)的存在下对细胞进行透性化，并在冰上培育一段时间。培育时间段可为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60分钟或更多分钟。

在一些实施方案中，细胞的透性化可通过任何合适的方法进行。可进行适当的透性化剂选择以及培育条件和时间的优化。合适的方法包括但不限于，暴露于去污剂(例如CHAPS、胆酸、脱氧胆酸、洋地黄皂苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、月桂基硫酸盐、甘氨脱氧胆酸、正月桂酰肌氨酸、皂苷和triton X-100)或有机醇(例如甲醇和乙醇)。其他透性化方法可包括使用某些使膜具有渗透性的肽或毒素。透性化也可通过向细胞中加入有机醇来进行。

说明性地而非限制地，透性化还可例如通过使用表面活性剂、去污剂、磷脂、磷脂结合蛋白、酶、病毒膜融合蛋白等；通过使用渗透活性剂；通过使用化学交联剂；通过包括电穿孔等的物理化学方法，或通过其他透性化方法来实现。

因此，例如，可使用任何多种技术对细胞进行透性化，例如暴露于一种或多种浓度低于裂解细胞和溶解膜所用浓度(即，低于临界胶束浓度)的去污剂(例如洋地黄皂苷、Triton X-100^TM、NP-40^TM、辛基葡糖苷等)中。也可使用某些转染试剂，例如二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。ATP也可用于使完整细胞透性化。用作固定剂的低浓度化学品(例如甲醛)也可用于使完整细胞透性化。

本文所述的核酸(例如，RNA分子、cDNA分子、引物或探针)可包含官能性部分。核酸可通过官能性部分连接到3D基质上。所述官能性部分可通过缀合化学与3D基质上的反应性基团反应。在一些情况下，官能性部分可通过缀合化学附接至目标靶标上。在一些情况下，官能性部分可直接附接至天然核酸分子上的反应性基团。在一些情况下，官能性部分可通过中间化学品或基团间接连接至靶标。本文所述的缀合策略不限于核酸靶标，并且也可用于蛋白质或小分子靶标。在核酸合成或延伸反应期间，可将包含官能性部分的核苷酸类似物引入核酸(例如，cDNA分子、探针或引物)的生长链中。

本公开内容提供了用于原位修饰核酸以包含官能性部分的方法。在一些情况下，官能性部分可包含可聚合基团。在一些情况下，官能性部分可包含自由基可聚合基团。在一些情况下，官能性部分可包含胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、硝酮、烯烃、四嗪、四唑或其他点击反应性基团。在一些情况下，官能性部分可随后原位连接至3D基质。所述官能性部分可进一步用于保留样品中两个或更多个分子之间的绝对或相对空间关系。

载体

基质可与载体结合使用。载体可以是固体或半固体载体。例如，基质可以以这样的方式聚合，使得基质的一个表面附接至载体(例如，玻璃表面、流通池、载玻片、孔)，而基质的另一个表面暴露。或者，基质可以夹在两个载体之间。根据一些方面，基质可包含在容器内。在一些情况下，生物样品可固定在载体上。

本公开内容的载体可制成各种形状。在某些实施方案中，载体为基本上平面的。载体的示例包括板，例如载玻片、微量滴定板、流通池、盖玻片、微芯片等；容器，例如微量离心管、试管等，管、片、垫、膜等。另外，载体可为例如生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合。

载体可以由可用作固体或半固体基础以附接生物样品或分子(例如多核苷酸、扩增子、DNA球)和/或聚合物(包括生物聚合物)的任何材料制成。材料的示例类型包括，但不限于，玻璃、改性玻璃、功能化玻璃、无机玻璃、包括惰性和/或磁性颗粒的微球、塑料、多糖、尼龙、硝化纤维、陶瓷、树脂、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光纤或光纤束以及多孔微量滴定板。示例塑料的具体类型包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯和Teflon^TM。具体类型的示例性的基于二氧化硅的材料包括硅和各种形式的改性硅。

载体的表面可为平面的，或包含凹的或凸的区域。

检测探针

本文所述的核酸序列(例如，靶核酸分子、治疗剂或与治疗剂连接的核酸序列)可以通过检测探针结合。检测探针可以用于随后的目标核酸序列的检测(例如通过成像或测序)。

检测探针可以是核酸探针。检测探针可以是挂锁式探针、分子倒置探针、分子信标探针、反转录(reverse transpiration)引物、第二链合成引物或本文所述的用于核酸合成(例如，扩增)的其他引物。检测探针可以相对于另一个序列优先结合一个序列。当与序列杂交时，检测探针可以发射信号，以允许序列的鉴定和/或特定位置的鉴定。检测探针可以直接连接至报告剂。检测探针可以不直接连接至报告剂。检测探针可用于合成或扩增可进行本文所述的测序反应的核酸。检测探针可以与另外的探针结合，以用于检测。

检测探针可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物，或其任何组合。检测探针可以具有特定的长度。检测探针可以小于或等于约80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个核苷酸长。检测探针可以大于或等于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50个或更多核苷酸长。检测探针可以具有任何构造，包括但不限于线性、圆形和茎环型。

检测探针可以包含条形码。条形码可以是唯一的分子鉴定物。在一些情况下，检测探针池用于FISSEQ检测，池中的每个探针都有唯一的条形码序列。条形码的长度可以是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、30个或更多个核苷酸。

在一些情况下，检测探针可以是蛋白质探针。例如，在一些情况下，待检测的靶标是蛋白质，并且探针分子可以是可以与蛋白质靶标结合的抗体、抗体片段或抗体衍生物。检测探针也可以是核酸结合蛋白。核酸结合蛋白可以优先结合特定序列。核酸结合蛋白可以非特异性结合。核酸蛋白可以结合特定的核苷酸或核苷酸衍生物，或者可以结合特定的核酸结构。

扩增

在一些情况下，可以扩增核酸靶标或其衍生物。例如，可以将RNA靶分子逆转录以生成cDNA分子，并且可以原位扩增该cDNA分子。任何类型的核酸扩增反应均可用于在本文描述的方法或系统中进行扩增反应并产生扩增产物。此外，核酸的扩增可为线性的、指数的或其组合。核酸扩增方法的非限制性示例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应、连接酶链反应、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增(MDA)。在一些情况下，扩增产物可为DNA。在靶RNA扩增的情况下，可通过RNA的逆转录获得DNA，并且随后的DNA扩增可用于产生扩增的DNA产物。扩增的DNA产物可指示生物样品中靶RNA的存在。在DNA扩增的情况下，可采用任何DNA扩增方法。DNA扩增方法的非限制性示例包括聚合酶链反应(PCR)、PCR的变体(例如，实时PCR、等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、嵌套PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、微型引物PCR、多重PCR、嵌套PCR、重叠延伸PCR、热不对称交错PCR、降落PCR)和连接酶链反应(LCR)。在一些情况下，DNA扩增为线性的。在一些情况下，DNA扩增为指数的。在一些情况下，DNA扩增可通过嵌套PCR实现，这可提高检测扩增的DNA产物的灵敏度。

核酸序列的扩增可在基质内进行。扩增核酸的方法可包括原位滚环扩增。在一些方面，扩增核酸的方法可包括使用PCR，例如锚定PCR、RACE PCR或连接链反应(LCR)。替代的扩增方法包括但不限于自我维持的序列复制、转录扩增系统、Q-β复制酶、递归PCR或任何其他核酸扩增方法。

3D基质内的核酸可在足以扩增核酸的合适反应条件下与试剂接触。基质可为多孔的，以允许试剂迁移到基质中以接触核酸。在一些方面，核酸可通过使用常规方法使扩增引物与核酸序列的3’末端的扩增位点选择性地杂交而扩增。扩增引物的长度可以为6至100，甚至最高达1,000个核苷酸，但通常为10至40个核苷酸，尽管使用了不同长度的寡核苷酸。在一些情况下，扩增引物的长度可以为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，扩增引物的长度可以为至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300个或更多个核苷酸。扩增引物可杂交至与DNA分子杂交的核酸探针，使得扩增引物可用于扩增核酸探针的序列。扩增引物可存在于待添加至基质的溶液中，或其可在形成基质期间添加以与核酸充分相邻地存在以允许杂交和扩增。

DNA聚合酶可用于扩增反应。可使用任何合适的DNA聚合酶，包括市售的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常是指能够以模板结合方式将核苷酸引入DNA链的酶。DNA聚合酶的非限制性示例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段及其变体、修饰产物及其衍生物。

检测

本公开内容提供了用于核酸检测的样品处理方法和系统。可鉴定核酸靶标的序列。各种方法可用于核酸检测，包括杂交、成像和测序。

报告剂可通过共价或非共价相互作用与核酸、包括扩增产物连接。非共价相互作用的非限制性示例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键键合及其组合。报告剂可与初始反应物结合，并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。随着核酸扩增的进行，报告剂可为可检测的(或不可检测的)。报告剂可为光学可检测的。光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性示例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、荧光香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶(homidium)、光神霉素、多吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、二氢乙锭、乙锭均二聚体(ethidium homodimer)-1和乙锭均二聚体-2、单叠氮化乙锭和ACMA、Hoechst33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、荧光金(hydroxystilbamidine)、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)、若丹明、四甲基若丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、Texas红、Phar-红、别藻蓝素(APC)、Sybr绿I、Sybr绿II、Sybr金、CellTracker绿、7-AAD、乙锭均二聚体I、乙锭均二聚体II、乙锭均二聚体III、溴化乙锭、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、对称二苯代乙烯、荧光黄、级联蓝、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯、荧光镧系元素络合物(例如包括铕和铽的那些)、羧基四氯荧光素、5和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-(或6-)碘乙酰胺基荧光素、5-{[[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、5和/或6羧基若丹明(ROX)、7-氨基甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸酯-4-氨基-萘二甲酰亚胺、藻胆蛋白，AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他荧光团。

在一些实施方案中，报告剂可为当与核酸靶标或其衍生物(例如，扩增产物)杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。探针可与本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)连接，并且还可包括能够阻断相关染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性示例包括TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针或Lion探针。

在一些方面，用于确定靶核酸分子的核酸序列的方法包括测序。在一些方面，合成测序、连接测序或杂交测序用于确定靶核酸分子的核酸序列。如本文所公开的，在测序之前，可采用各种扩增方法来产生更大量的特别是有限的核酸样品。例如，扩增方法可产生靶向的扩增子库。

为了进行连接测序，可杂交并鉴定标记的核酸片段，以确定靶核酸分子的序列。为了进行合成测序(SBS)，可使用标记的核苷酸来确定靶核酸分子的序列。靶核酸分子可与引物杂交，并在聚合酶和含有阻断基团的标记核苷酸的存在下培育。引物可延伸，使得引入核苷酸。阻断基团的存在可仅允许一轮引入，即，允许引入单个核苷酸。标记的存在可允许鉴定引入的核苷酸。如本文所用，标记可为本文所述的任何光学活性染料。可添加一种碱基，或可同时添加所有四种碱基，特别是当每种碱基都与可区分的标记关联时。在通过其相应的标记鉴定引入的核苷酸后，可除去标记和阻断基团，从而允许随后一轮的引入和鉴定。因此，期望具有方便可切割的连接子(linker)将标签连接至碱基。如本文公开的那些，特别是肽连接子。另外，使用可除去的阻断基团是有利的，使得可进行多轮鉴定，从而允许鉴定靶核酸序列的至少一部分。本文公开的组合物和方法对于这种SBS方法特别有用。另外，所述组合物和方法对于从阵列测序可特别有用，其中可同时从阵列上的多个位置“读取”多个序列，因为可基于其可鉴定的标记来鉴定各位置处的各核苷酸。示例方法记载在US 2009/0088327、US 2010/0028885和US 2009/0325172中，其各自通过引用并入本文。

计算机系统

本公开内容提供了被编程为执行本公开内容的方法的计算机系统。图10示出了被编程或以其他方式配置为分析如本文所述的治疗剂的功能和定位的计算机系统1001。计算机系统1001可调节本公开内容的的方法的各个方面。计算机系统1001可为用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可为移动电子设备。

计算机系统1001包括中央处理单元(CPU，在本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1005，其可为单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1001还包括存储器或存储器位置1010(例如随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1015(例如硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1020(例如网络适配器)以及外围设备1025，例如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1010、存储单元1015、接口1020和外围设备1025通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU1005通信。存储单元1015可为用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1001可借助于通信接口1020可操作地耦合到计算机网络(“网络”)1030。网络1030可为因特网、互联网和/或外联网、或内联网和/或与因特网通信的外联网。在一些情况下，网络1030为电信和/或数据网络。网络1030可包括一个或多个计算机服务器，其可启用分布式计算，例如云计算。在一些情况下，网络1030可在计算机系统1001的帮助下实现对等网络，所述对等网络可使耦合到计算机系统1001的设备能够充当客户端或服务器。

CPU1005可执行一系列机器可读指令，其可体现在程序或软件中。指令可被存储在诸如存储器1010的存储器位置。指令可定向到CPU1005，其可随后编程或以其他方式配置CPU1005以实现本公开内容的方法。由CPU1005执行的操作的示例可包括获取、解码、执行和写回。

CPU1005可为诸如集成电路的电路的一部分。系统1001的一个或多个其他部件可被包括在电路中。在一些情况下，电路为专用集成电路(ASIC)。

存储单元1015可存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1015可存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1001可包括位于计算机系统1001外部，例如位于通过内联网或因特网与计算机系统1001通信的远程服务器上的一个或多个另外的数据存储单元。

计算机系统1001可通过网络1030与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1001可与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如便携式PC)、平板PC或平板电脑(例如

iPad、

Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如

iPhone、支持Android的设备、

)或个人数字助理。用户可通过网络1030访问计算机系统1001。

如本文所述的方法可通过存储在计算机系统1001的电子存储位置(例如存储器1010或电子存储单元1015)上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读取代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可由处理器1005执行。在一些情况下，可从存储单元1015中检索代码并将其存储在存储器1010中，以供处理器1005随时访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1015，并将机器可执行指令存储在存储器1010中。

代码可被预编译，并配置为用于具有适于执行该代码的处理器的机器，或可在运行时期间被编译。代码可以编程语言形式提供，可选择所述编程语言使得代码能够以预编译或实时编译(as-compiled)的方式执行。

本文提供的系统和方法的各方面(例如计算机系统1001)可体现在编程中。技术的各方面可视为通常被承载在机器可读介质上或以机器可读介质的类型体现的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可被存储在电子存储单元，例如存储器(例如只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”类型的介质可包括计算机、处理器等的任何或全部有形存储器，或其相关模块，例如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可通过因特网或其他各种电信网络进行通信。例如，这样的通信可使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元件的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路(air-link)在本地设备之间的物理接口上所使用的光波、电波和电磁波。诸如有线或无线链路、光学链路等携带这种波的物理元件也可视为承载软件的介质。如本文所使用，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。

因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，例如任何计算机中的任何存储设备等，例如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，例如这种计算机平台的主存储器。有形的传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的电线。载波传输介质可采用电信号或电磁信号或声波或光波的形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、打孔卡纸磁带、带孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒带、传输数据或指令的载波、传输此类载波的电缆或链路，或计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的多种都可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送给处理器以供执行。

计算机系统1001可包括电子显示器1035或与之通信，电子显示器1035包括用户界面(UI)1040，用户界面(UI)1040用于提供例如测定条件和协议。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。

本公开内容的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。算法可通过软件在由中央处理单元1005执行时来实现。例如，可执行该算法以利用本公开内容中公开的方法和系统来检测核酸序列。任选地，可执行算法以控制或实施本文描述的系统的部件(例如光源、检测器、试剂流等)的操作，以进行核酸序列的检测。

实施例

实施例1-治疗模式的药效动力学(PD)测定

可以开发RNA干扰(RNAi)和反义模式的最小靶向的FISSEQ PD敲低测定，以检测细胞或组织中目标反义药物的PD。图1A示出了对于脑细胞类型的FISSEQ建立的培养模型的示例图像。通过FISSEQ在脑细胞中检测了由反义寡核苷酸(ASO)直接或间接靶向的基因的表达水平。例如，检测了靶基因的mRNA。图1B示出了图1A所示的脑细胞的细胞核。基于靶基因的亚细胞定位(例如，细胞质或细胞核)以及在不同细胞类型上的普遍性和表达变化分析靶基因。图1C示出了受ASO影响的基因，它们的亚细胞定位和表达水平的变化。

可以开发最小靶向的FISSEQ PD敲低测定以筛选RNAi以及反义模式的物理-化学和受体介导的递送机制。图2A示出了在脑室内(ICV)组织模型中使用最低靶向的FISSEQ敲低测定以筛选RNAi以及反义模式的物理-化学和受体介导的递送机制的示例图像。测量了两个不同区域，海马角(CA)区域和齿状回(DG)区域中的靶基因mRNA水平。图2B示出了示例实验数据，其示出了在两个不同区域中响应于治疗性RNA剂量的靶mRNA水平。

验证的培养模型可用于开发PD测定，用于等位基因特异性表达和外显子跳跃。图3A示出了用于靶基因不同变体的等位基因特异性表达和外显子跳跃的靶向的FISSEQ的示例。在等位基因特异性表达检测中，可以设计靶向RNA上具有不同变体(例如，图3A中的A相对于G)的位置附近区域的探针，并且可以通过测序检测不同的变体。在外显子跳跃检测中，可以设计靶向与待跳跃或保留的外显子相邻区域的探针，并且可以通过测序检测外显子的存在或缺失。图3B示出了靶基因两个不同变体(变体1和变体2)的空间信息和表达水平的实验图像。如图像中所示的不同强度所表示的，通过不同的荧光信号(例如，荧光色)检测两个不同的变体。

实施例2-脑细胞组织的图谱

靶向FISSEQ可用于检测目标基因以鉴定细胞类型。图4A示出了靶向脑样品中目标基因的RNA的靶向FISSEQ探针的示例设计。可以检测目标基因的空间信息和表达水平。图4B示出了基因表达空间分布的示例FISSEQ数据。使用本实施例中示出的测定方法，可以检测细胞类型内每个目标基因的基因表达空间分布，并可以生成细胞类型基因表达签名的空间图谱。此外，全转录组FISSEQ可用于基因表达签名的从头发现。在全转录组FISSEQ中，可以检测细胞类型中所有的mRNA，而不是选定的mRNA。例如，所有的mRNA可以被具有聚脱氧胸苷序列的探针靶向。此外，可以基于全转录组剖析对靶向的FISSEQ文库进行迭代数据驱动型管理，以实现基因表达签名，从而获得更精细的空间分辨率并区分细微的细胞类型差异。基因表达空间分布也可以用于检测，例如，免疫应答、炎症、用于靶向递送的细胞膜蛋白的分布。

实施例3-治疗剂与亚细胞区室的共定位

FISSEQ可用于检测治疗剂(例如，小型治疗性RNA)与亚细胞解剖特征例如线粒体、粗糙ER、P体和其他相关细胞区室的共定位(针对治疗模式和/或毒性)。图5A示出了RNAi与粗糙ER的共定位的示例图像。图4B示出了细胞内线粒体的示例图像。图5C示出了在细胞内使用FISSEQ检测的治疗性RNA的示例图像。

实施例4-小RNA定位和转录作用的空间原位全景式测序

该实施例提供了一种在单细胞水平上共定位反义寡核苷酸(ASO)及其基因靶标的转录激活/抑制的测定。该测定可以在组织和细胞培养中均起作用。在该实施例中，展示了治疗性ASO与对照ASO的选择性检测(F＝255,589，p<0.001)和在同一测定中的MALAT1敲低(F＝99,577，p<0.001)。此外，通过qPCR验证了敲低作用检测，并针对批量RNA测序验证了基因检测(r＝0.82，p<0.4)。这些方法可以筛选具有空前保真度的治疗性候选分子，并对其全局和局部药代动力学(PK)和药效动力学(PD)进行区分。

如图6A-图6F所示，数据示出了小鼠脑中原位反义寡核苷酸(ASO)和敲低检测：设计用于检测治疗性ASO的寡核苷酸FISSEQ对背景噪声中的对照ASO是选择性的(ANOVA单向F＝255,589，p<0.001)。图6A示出了用对照ASO处理的小鼠脑样品的背景信号。靶向治疗性ASO的探针不与对照ASO结合。图6B示出了如通过靶向治疗性ASO的探针所检测的治疗性ASO，其位于注射部位(上方箭头)并通过小脑，并且还示出了如所预期的小脑中的高浓度(下方箭头)。此外，图6C示出了用对照ASO处理的小鼠脑样品中MALAT1表达的高丰度，而图6D示出了在用治疗性ASO处理的小鼠脑样品中MALAT1被敲低。图6E示出了从图6A和图6B的图像量化的原始强度。图6F示出了从图6C和图6D的图像量化的原始强度。该测定验证了MALAT1被治疗性物(相对于非活性对照)显著敲低(ANOVA单向F＝99,577，p<0.001)。

图7A-图7D示出了通过FISSEQ检测的星形胶质细胞中基因表达谱的四个重复序列。计数表示检测的唯一条形码的计数，该条形码用于指示每个基因的转录物。图7E示出了通过批量RNA测序检测的星形胶质细胞中的基因表达谱。FPKM表示每百万个映射读取序列的转录物的每千碱基的片段。如图7A-图7E所示，FISSEQ基因表达与批量RNA测序相关：星形胶质细胞细胞培养物的批量NGS测序(图7E)与相同细胞培养物(Spearman Sign Rank r＝0.82,p<0.4)的FISSEQ的四个重复序列(图7A-图7D)一致。在该实施例中测试的基因包括MALAT1、MBP、MOG、PDGFRA、PPIB和SLC1A3。

如图8A-图8E所示，数据示出了MALAT1的ASO敲低和在星形胶质细胞细胞培养物剂量反应中的定位：H₂O(图8A)、对照ASO(图8B)和以0.5μM(图8C)或5μM(图8D)的治疗性ASO在细胞培养物中对敲低MALAT1的剂量响应。图8E示出了图8A-图8D中所示信号的量化强度。数据示出了强度随着治疗性ASO浓度的增加而降低，表明在治疗性ASO较高的浓度下，敲低水平更高。

图9A示出了用对照ASO处理的细胞培养物中的MALAT1检测。图9B示出了用治疗性ASO处理的细胞培养物中的MALAT1检测。图9C示出了MALAT1表达水平的qPCR数据的条形图。如图9A-图9C所示，数据示出了与qPCR相关的星形胶质细胞培养物中的ASO敲低：与对照ASO相比，FISSEQ从以5μM的治疗性ASO检测到MALAT1降低了约7倍(两个重复序列精确泊松试验p<0.01)。降低对应于同一细胞培养批次中的qPCR的7倍降低。

在该实施例中描述的测定可用于将小RNA及其转录作用原位共定位于同一样品中。使用空间全景式测序，可以同时研究这些治疗的药代动力学(PK)、药效动力学(PD)、途径分析和脱靶效应，这可以有意义地扩展可能的研究和临床实验。空间全景式测序可以在精准健康中具有广泛的应用。除RNAi治疗外；例如，免疫肿瘤学可以是治疗肿瘤的强有力手段，然而，“免疫原性”癌症亚型、基质细胞和脉管系统的复杂空间密度产生了有效和无效T细胞岛。NGS批量测序将这些亚型混合在一起，无法区分预测治疗作用的遗传、转录和脉管系统神经支配。相比之下，亚细胞空间测序可以创建特定肿瘤环境的转录、遗传、蛋白质组学和脉管系统图，以描绘岛的亚型并鉴定有效治疗的组合。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。并非意图通过说明书中提供的具体示例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意图以限制性的意义进行解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在会想到许多变化、改变和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。因此，预期本发明还应涵盖任何这样的替代方案、修改、变化或等同方案。旨在由所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (42)

1.一种用于鉴定反义核酸分子和靶分子的方法，包括：

(a)提供具有或疑似具有所述靶分子和所述反义核酸分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)使用与所述反义核酸分子和所述靶分子分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述反义核酸分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述靶分子的水平相对于参考的升高或降低；以及

(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义核酸分子和所述靶分子各自在所述生物样品中的位置的输出。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括，在(a)之前，提供所述生物样品，使所述生物样品与具有所述反义核酸分子的溶液接触，以及在所述生物样品与所述溶液接触后生成所述3D基质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶分子是靶核酸分子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针鉴定所述靶核酸分子的靶序列，从而提供所述第二组信号。

5.根据权利要求4所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针对所述靶核酸分子进行测序，从而鉴定所述靶序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针鉴定所述反义核酸分子的反义序列，从而提供所述第一组信号。

7.根据权利要求6所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针对所述反义核酸分子进行测序，从而鉴定所述反义序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶分子是靶多肽或靶蛋白。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述反义核酸分子是治疗剂。

11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述输出是图像或视频。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述反义核酸分子是核糖核酸、硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或者2’-氟脱氧核糖核酸。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述反义核酸分子的长度为15至60个核苷酸。

14.一种用于鉴定反义核糖核酸(RNA)分子与靶核酸RNA分子共定位的方法，包括：

(a)提供具有或疑似具有所述靶RNA分子和所述靶RNA分子的所述反义RNA分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述反义RNA分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述靶RNA分子的水平相对于参考的升高或降低；以及

(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义RNA分子与所述靶RNA分子在所述生物样品中共定位的输出。

15.根据权利要求14所述的方法，还包括，在(a)之前，提供所述生物样品，使所述生物样品与具有所述反义RNA分子的溶液接触，以及在所述生物样品与所述溶液接触后，生成所述3D基质。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中(b)包括使用检测探针鉴定所述反义RNA分子的反义序列，从而提供所述第一组信号。

18.根据权利要求17所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针对所述反义RNA分子进行测序，从而鉴定所述反义序列。

19.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中(b)包括使用检测探针鉴定所述靶RNA分子的靶序列，从而提供所述第二组信号。

20.根据权利要求19所述的方法，其中(b)包括使用所述检测探针对所述靶RNA分子进行测序，从而鉴定所述靶序列。

21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述反义RNA分子是治疗剂。

22.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述输出是图像或视频。

23.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述反义RNA分子是修饰的反义核酸分子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述修饰的反义核酸分子是硫代磷酸酯脱氧核糖核酸、锁定核酸、2’-O-甲氧基-乙基核糖核酸、2’-O-甲基核糖核酸或者2’-氟脱氧核糖核酸。

25.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述反义RNA分子的长度为15至60个核苷酸。

26.一种用于鉴定靶核酸的两个或更多个遗传畸变的方法，包括：

(a)提供具有或疑似具有所述靶核酸的至少第一遗传畸变和第二遗传畸变的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)使用检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述第一遗传畸变在所述生物样品中的第一相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述第二遗传畸变在所述生物样品中的第二相对位置；以及

(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变各自在所述生物样品中的位置的输出。

27.根据权利要求26所述的方法，其中将所述检测探针靶向于所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变的相同序列。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述第一遗传畸变和所述第二遗传畸变至少具有单个核苷酸差异。

29.根据权利要求26或27所述的方法，其中与所述第二遗传畸变相比，所述第一遗传畸变包含另外的序列。

30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

31.一种用于鉴定反义核酸分子的两个或多个位置的方法，包括：

(a)提供具有所述反义核酸分子的生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)使用检测探针检测所述生物样品内的所述反义核酸分子的一组信号；

(c)从所述生物样品内的至少第一位置和第二位置检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一位置和所述第二位置在不同的亚细胞区室内；以及

(d)使用所述反义核酸分子的所述一组信号以及所述第一位置和所述第二位置的所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述反义核酸分子与所述第一位置和所述第二位置共定位的输出。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述反义核酸分子的长度为15至60个核苷酸。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述亚细胞区室包括线粒体、内质网、P体、高尔基体、囊泡、内体、溶酶体、细胞核、微管或其组合。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述反义核酸分子是治疗剂。

35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

36.一种鉴定生物样品中的共定位分子的方法，包括：

(a)提供具有或疑似具有靶分子和能够与所述靶分子结合或与所述靶分子相互作用的试剂的所述生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)使用与所述靶分子和所述试剂分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述靶分子在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述试剂在所述生物样品中的相对位置；以及

(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述靶分子与所述试剂在所述生物样品中共定位的输出。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述试剂是治疗剂。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述治疗剂是多核苷酸、多肽或小分子。

39.一种用于鉴定生物样品中的试剂和所述试剂的代谢物的方法，包括：

(a)提供具有或疑似具有所述试剂和所述试剂的所述代谢物的所述生物样品，其中所述生物样品包含三维(3D)基质；

(b)使用与所述靶分子和所述试剂分离的检测探针从所述生物样品中检测第一组信号和第二组信号，其中所述第一组信号鉴定所述试剂在所述生物样品中的相对位置，并且其中所述第二组信号鉴定所述代谢物在所述生物样品中的相对位置；以及

(c)使用所述第一组信号和所述第二组信号提供指示所述试剂和所述代谢物各自的位置的输出。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述生物样品是细胞、细胞衍生物或组织。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述试剂是治疗剂。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述治疗剂是多核苷酸、多肽或小分子。

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