JP2003344405A - プローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ及びこれを用いた検体検出方法 - Google Patents
プローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ及びこれを用いた検体検出方法Info
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- JP2003344405A JP2003344405A JP2002153697A JP2002153697A JP2003344405A JP 2003344405 A JP2003344405 A JP 2003344405A JP 2002153697 A JP2002153697 A JP 2002153697A JP 2002153697 A JP2002153697 A JP 2002153697A JP 2003344405 A JP2003344405 A JP 2003344405A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ゲル保持マイクロアレイについて、ハイブリ
ダイゼーション反応を正確に定量化できるマイクロアレ
イ、並びにこのマイクロアレイを用いた検体検出方法の
提供。 【解決手段】 区画化された複数のスポットがプローブ
固定化用ゲルから成るマイクロアレイにおいて、プロー
ブが固定化されたゲルスポットと共にプローブが固定化
されていないブランクゲルスポットが一部配置されてい
る固定化ゲル保持マイクロアレイ、並びにこのプローブ
固定化ゲル保持マイクロアレイを用い、蛍光物質で標識
された検体とプローブ間のハイブリダイゼーション反応
を定量化することにより検体の検出を行う検体検出方
法。
ダイゼーション反応を正確に定量化できるマイクロアレ
イ、並びにこのマイクロアレイを用いた検体検出方法の
提供。 【解決手段】 区画化された複数のスポットがプローブ
固定化用ゲルから成るマイクロアレイにおいて、プロー
ブが固定化されたゲルスポットと共にプローブが固定化
されていないブランクゲルスポットが一部配置されてい
る固定化ゲル保持マイクロアレイ、並びにこのプローブ
固定化ゲル保持マイクロアレイを用い、蛍光物質で標識
された検体とプローブ間のハイブリダイゼーション反応
を定量化することにより検体の検出を行う検体検出方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プローブが固定化
されたゲルをベースとするマイクロアレイ及び該マイク
ロアレイを用いた検体検出方法に関する。
されたゲルをベースとするマイクロアレイ及び該マイク
ロアレイを用いた検体検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、ヒトゲノムの解読が進み、様々な
疾病や体質と特定の遺伝子配列との因果関係が明らかに
されつつある。それによって、例えば、発病の予測、薬
剤に対する副作用の予測等を行うことが考えられてい
る。遺伝子の分析手段としては、例えば、ゲルを媒体と
した電気泳動法が生化学の分野において古くから使用さ
れている。また、近年、ガラスキャピラリーにアクリル
アミド等のハイドロゲルを充填し、キャピラリーの両端
に高電圧を印加して、微量の生体物質を短い時間で分離
分析可能なキャピラリーゲル電気泳動法が開発されてい
る。また、多数の遺伝子の発現状態やゲノムの変異を一
括して検出できる有用なツールとしてＤＮＡマイクロア
レイが利用されている。ＤＮＡマイクロアレイとして
は、リソグラフィー技術を応用して区画化された多数の
セル上にＤＮＡ合成を行ったもの（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５１ ７６７−７７３）、基盤上に溝又は穴で区画を形
成し、該区画の内壁にプローブを固定化したもの（特開
平１１−１０８９２８号、特開２０００−７８９９８号
公報参照）、マイクロアレイ上の一区画に多くのプロー
ブを固定化するために、アクリルアミド、アガロース等
のゲルにプローブを固定したマイクロアレイ（ＵＳＰ
５，７７０，７２１、特開２０００−６０５５４号公報
参照）、中空繊維の中空部にゲルが保持された繊維型マ
イクロアレイ（特開２０００−２７０８７８号、特開２
０００−２７０８７９号公報参照）等、多数の形状が知
られている。繊維型マイクロアレイは、核酸固定化ゲル
を保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作成し、こ
の配列体を配列体の繊維軸と交差する方向に切断する事
により薄片を得るものである。この薄片は固定化核酸二
次元高密度配列体、すなわちＤＮＡマイクロアレイとし
て使用される。ＤＮＡマイクロアレイは、固定化された
ＤＮＡをプローブとして、検体とハイブリダイゼーショ
ン反応を行いハイブリッドの形成を確認することによ
り、検体中の特定の塩基配列の検出を行うことができ
る。ハイブリッド形成の確認には、ハイブリッドを特異
的に認識できる公知の手段、例えば、検体に蛍光物質を
導入し、検体とプローブのハイブリダイゼーション反応
量を蛍光強度として測定する方法を用いることができ
る。
疾病や体質と特定の遺伝子配列との因果関係が明らかに
されつつある。それによって、例えば、発病の予測、薬
剤に対する副作用の予測等を行うことが考えられてい
る。遺伝子の分析手段としては、例えば、ゲルを媒体と
した電気泳動法が生化学の分野において古くから使用さ
れている。また、近年、ガラスキャピラリーにアクリル
アミド等のハイドロゲルを充填し、キャピラリーの両端
に高電圧を印加して、微量の生体物質を短い時間で分離
分析可能なキャピラリーゲル電気泳動法が開発されてい
る。また、多数の遺伝子の発現状態やゲノムの変異を一
括して検出できる有用なツールとしてＤＮＡマイクロア
レイが利用されている。ＤＮＡマイクロアレイとして
は、リソグラフィー技術を応用して区画化された多数の
セル上にＤＮＡ合成を行ったもの（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
５１ ７６７−７７３）、基盤上に溝又は穴で区画を形
成し、該区画の内壁にプローブを固定化したもの（特開
平１１−１０８９２８号、特開２０００−７８９９８号
公報参照）、マイクロアレイ上の一区画に多くのプロー
ブを固定化するために、アクリルアミド、アガロース等
のゲルにプローブを固定したマイクロアレイ（ＵＳＰ
５，７７０，７２１、特開２０００−６０５５４号公報
参照）、中空繊維の中空部にゲルが保持された繊維型マ
イクロアレイ（特開２０００−２７０８７８号、特開２
０００−２７０８７９号公報参照）等、多数の形状が知
られている。繊維型マイクロアレイは、核酸固定化ゲル
を保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作成し、こ
の配列体を配列体の繊維軸と交差する方向に切断する事
により薄片を得るものである。この薄片は固定化核酸二
次元高密度配列体、すなわちＤＮＡマイクロアレイとし
て使用される。ＤＮＡマイクロアレイは、固定化された
ＤＮＡをプローブとして、検体とハイブリダイゼーショ
ン反応を行いハイブリッドの形成を確認することによ
り、検体中の特定の塩基配列の検出を行うことができ
る。ハイブリッド形成の確認には、ハイブリッドを特異
的に認識できる公知の手段、例えば、検体に蛍光物質を
導入し、検体とプローブのハイブリダイゼーション反応
量を蛍光強度として測定する方法を用いることができ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ガラス等の基盤上にプ
ローブが固定化されたマイクロアレイのハイブリダイゼ
ーション反応の定量化は、基盤上の蛍光強度をバックグ
ラウンド値として用いる。しかし、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄工程において、バッファー成分である塩
が析出すること等により、スポット部以外の部分（基盤
そのもの）の蛍光強度の値にむらが生じ、バックグラウ
ンド値がばらつくという問題があった。
ローブが固定化されたマイクロアレイのハイブリダイゼ
ーション反応の定量化は、基盤上の蛍光強度をバックグ
ラウンド値として用いる。しかし、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄工程において、バッファー成分である塩
が析出すること等により、スポット部以外の部分（基盤
そのもの）の蛍光強度の値にむらが生じ、バックグラウ
ンド値がばらつくという問題があった。
【０００４】バックグラウンド値については、マイクロ
アレイの蛍光強度のヒストグラムを測定し、最も度数が
高い値をバックグラウンド値として採用する方法、及び
各スポットのごく周囲の蛍光強度をバックグラウンド値
として採用する方法がある。しかし、前者の方法は、上
述したように塩の析出等によりバックグラウンド値が大
きくばらつくため正確にハイブリダイゼーション反応を
定量化するのが困難であった。また、後者の方法も前者
より程度は小さいものの同様の問題があった。
アレイの蛍光強度のヒストグラムを測定し、最も度数が
高い値をバックグラウンド値として採用する方法、及び
各スポットのごく周囲の蛍光強度をバックグラウンド値
として採用する方法がある。しかし、前者の方法は、上
述したように塩の析出等によりバックグラウンド値が大
きくばらつくため正確にハイブリダイゼーション反応を
定量化するのが困難であった。また、後者の方法も前者
より程度は小さいものの同様の問題があった。
【０００５】プローブが固定化されたゲルが保持されて
いるマイクロアレイ（ゲル保持マイクロアレイ）は、マ
イクロアレイ上の一区画に多くのプローブを固定化でき
有利であり、基盤板上にゲルが接着しているもの、溝ま
たは貫通孔にゲルが保持されているものなどが知られて
いる。しかし、これらのマイクロアレイは、スポット部
（ゲル）と基盤板の材質が異なるため、バックグラウン
ド値を基盤板の蛍光強度とすると、上記基盤に係る問題
に加えて、ハイブリダイゼーション反応によって増加し
た蛍光量（ハイブリダイゼーション反応量）を正確に測
定できないという問題があった。
いるマイクロアレイ（ゲル保持マイクロアレイ）は、マ
イクロアレイ上の一区画に多くのプローブを固定化でき
有利であり、基盤板上にゲルが接着しているもの、溝ま
たは貫通孔にゲルが保持されているものなどが知られて
いる。しかし、これらのマイクロアレイは、スポット部
（ゲル）と基盤板の材質が異なるため、バックグラウン
ド値を基盤板の蛍光強度とすると、上記基盤に係る問題
に加えて、ハイブリダイゼーション反応によって増加し
た蛍光量（ハイブリダイゼーション反応量）を正確に測
定できないという問題があった。
【０００６】したがって、本発明は、ゲル保持マイクロ
アレイについて、ハイブリダイゼーション反応を正確に
定量化できるマイクロアレイ、並びにこのマイクロアレ
イを用いた検体検出方法を提供することを課題とする。
アレイについて、ハイブリダイゼーション反応を正確に
定量化できるマイクロアレイ、並びにこのマイクロアレ
イを用いた検体検出方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、プローブ固
定化ゲル保持マイクロアレイに、プローブを含まないブ
ランクスポットを配置し、ブランクスポットの蛍光強度
をバックグラウンドとすることにより、ハイブリダイゼ
ーション反応量をより正確に定量化できることを見出
し、本発明にいたった。
定化ゲル保持マイクロアレイに、プローブを含まないブ
ランクスポットを配置し、ブランクスポットの蛍光強度
をバックグラウンドとすることにより、ハイブリダイゼ
ーション反応量をより正確に定量化できることを見出
し、本発明にいたった。
【０００８】すなわち、本発明は、区画化された複数の
スポットがプローブ固定化用ゲルから成るマイクロアレ
イにおいて、プローブが固定化されたゲルスポットと共
にプローブが固定化されていないブランクゲルスポット
が一部配置されていることを特徴とするプローブ固定化
ゲル保持マイクロアレイ、である。上記において、プロ
ーブは、例えば、核酸である。また、スポットは、例え
ば、溝または貫通孔により形成され、貫通孔としては中
空繊維の中空部が挙げられる。
スポットがプローブ固定化用ゲルから成るマイクロアレ
イにおいて、プローブが固定化されたゲルスポットと共
にプローブが固定化されていないブランクゲルスポット
が一部配置されていることを特徴とするプローブ固定化
ゲル保持マイクロアレイ、である。上記において、プロ
ーブは、例えば、核酸である。また、スポットは、例え
ば、溝または貫通孔により形成され、貫通孔としては中
空繊維の中空部が挙げられる。
【０００９】また、本発明は、上記のプローブ固定化ゲ
ル保持マイクロアレイを用い、蛍光物質で標識された検
体とプローブ間のハイブリダイゼーション反応を定量化
することにより検体の検出を行う検体検出方法、であ
る。ハイブリダイゼーション反応量は、ハイブリダイゼ
ーションゲルスポット蛍光強度からブランクゲルスポッ
ト蛍光強度を引いた値とすることができる。
ル保持マイクロアレイを用い、蛍光物質で標識された検
体とプローブ間のハイブリダイゼーション反応を定量化
することにより検体の検出を行う検体検出方法、であ
る。ハイブリダイゼーション反応量は、ハイブリダイゼ
ーションゲルスポット蛍光強度からブランクゲルスポッ
ト蛍光強度を引いた値とすることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のプローブ固定化ゲル保持
マイクロアレイは、基盤上にゲルが接着しているマイク
ロアレイ、基盤に形成された溝にゲルが保持されたマイ
クロアレイ、基盤に形成された貫通孔にゲルが保持され
たマイクロアレイのいずれでもよい。
マイクロアレイは、基盤上にゲルが接着しているマイク
ロアレイ、基盤に形成された溝にゲルが保持されたマイ
クロアレイ、基盤に形成された貫通孔にゲルが保持され
たマイクロアレイのいずれでもよい。
【００１１】ゲルの組成は、特に制限されないが、例え
ば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイ
ルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノ
プロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビ
ニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、
（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の
一種類または二種類以上とメチレンビス（メタ）アクリ
ルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート等の多官能性単量体を共重合したゲルを用いること
ができる。その他、例えば，アガロース、アルギン酸、
デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを用い
ることができる。
ば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミ
ド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイ
ルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノ
プロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビ
ニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、
（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の
一種類または二種類以上とメチレンビス（メタ）アクリ
ルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート等の多官能性単量体を共重合したゲルを用いること
ができる。その他、例えば，アガロース、アルギン酸、
デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを用い
ることができる。
【００１２】ゲルに保持するプローブとしては、デオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸が
代表的であるが、その他、市販品又は生細胞等から得ら
れたアミノ酸、糖、脂質等の生体関連物質でもよい。
シリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸が
代表的であるが、その他、市販品又は生細胞等から得ら
れたアミノ酸、糖、脂質等の生体関連物質でもよい。
【００１３】プローブとして核酸を用いる場合には、生
細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、ＤＮＡの抽出に
ついては、Ｂｌｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．３．２３０３（１９７６））等により、ま
た、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８
（１９８０））等により行うことができる。さらには、
鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ
が用いられる。また、制限酵素若しくは化学的に切断し
たＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮ
Ａ又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いること
もできる。
細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、ＤＮＡの抽出に
ついては、Ｂｌｉｎらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．３．２３０３（１９７６））等により、ま
た、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５．７１８
（１９８０））等により行うことができる。さらには、
鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ
が用いられる。また、制限酵素若しくは化学的に切断し
たＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮ
Ａ又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いること
もできる。
【００１４】プローブのゲルへの固定化は、ゲルにプロ
ーブを物理的に包括する方法、ゲル構成成分へのプロー
ブの直接的な結合を利用する方法等がある。
ーブを物理的に包括する方法、ゲル構成成分へのプロー
ブの直接的な結合を利用する方法等がある。
【００１５】直接的な結合を利用する方法としては、例
えば、核酸等の末端基にビニル基を導入し、ゲル構成成
分と共重合させることができる（ＷＯ９８／３９３５１
号公報参照）。共重合においては、多官能性単量体と共
に重合開始剤を用いて共重合する方法、単量体及び重合
開始剤と共に共重合したのち、架橋剤でゲル化する方法
などがある。
えば、核酸等の末端基にビニル基を導入し、ゲル構成成
分と共重合させることができる（ＷＯ９８／３９３５１
号公報参照）。共重合においては、多官能性単量体と共
に重合開始剤を用いて共重合する方法、単量体及び重合
開始剤と共に共重合したのち、架橋剤でゲル化する方法
などがある。
【００１６】本発明のマイクロアレイ中、プローブを含
まないブランクゲルスポットの数は、少なくとも一個あ
ればよいが、通常、１〜１０個の範囲でよい。
まないブランクゲルスポットの数は、少なくとも一個あ
ればよいが、通常、１〜１０個の範囲でよい。
【００１７】マイクロアレイの検出は、レーザースキャ
ンタイプの検出器またはＣＣＤタイプの検出器いずれを
用いてもよい。
ンタイプの検出器またはＣＣＤタイプの検出器いずれを
用いてもよい。
【００１８】検出後の画像データについては、画像解析
ソフトを用いて解析する。ハイブリダイゼーション反応
量は、ブランクゲルスポットエリア内のピクセル平均蛍
光強度をバックグラウンド値とし、プローブを含むハイ
ブリダイゼーションゲルスポットエリア内のピクセル平
均蛍光強度を数値化した後、ハイブリダイゼーションス
ポット平均蛍光強度からバックグラウンド値を引いた値
として算出する。このハイブリダイゼーション反応量に
より検体中の特定の塩基配列の有無を検出することが可
能である。
ソフトを用いて解析する。ハイブリダイゼーション反応
量は、ブランクゲルスポットエリア内のピクセル平均蛍
光強度をバックグラウンド値とし、プローブを含むハイ
ブリダイゼーションゲルスポットエリア内のピクセル平
均蛍光強度を数値化した後、ハイブリダイゼーションス
ポット平均蛍光強度からバックグラウンド値を引いた値
として算出する。このハイブリダイゼーション反応量に
より検体中の特定の塩基配列の有無を検出することが可
能である。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
する。但し、本発明はこれら実施例により、その技術的
範囲が限定されるものではない。
する。但し、本発明はこれら実施例により、その技術的
範囲が限定されるものではない。
【００２０】＜実施例１＞
（１）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製中空繊
維の作製 単量体組成比 メチルメタクリレート（ＭＭＡ）／メチ
ルアクリレート（ＭＡ）＝８２／１８からなる、質量分
子量約９万のアクリル樹脂を原料として、環状吐出口を
有する紡糸ノズルから押出機を使用して溶融押出して外
径３００μｍ、内径２００μｍの中空繊維を得た。得ら
れたＰＭＭＡ製中空繊維を縦横各々３本ずつ計９本整列
させ、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業
社製 コロネート４４０３を３８部及びニッポラン４２
７６を６２部混合した包埋樹脂）により包埋して中空繊
維が正方に規則的に配列した中空繊維配列体を得た。
維の作製 単量体組成比 メチルメタクリレート（ＭＭＡ）／メチ
ルアクリレート（ＭＡ）＝８２／１８からなる、質量分
子量約９万のアクリル樹脂を原料として、環状吐出口を
有する紡糸ノズルから押出機を使用して溶融押出して外
径３００μｍ、内径２００μｍの中空繊維を得た。得ら
れたＰＭＭＡ製中空繊維を縦横各々３本ずつ計９本整列
させ、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業
社製 コロネート４４０３を３８部及びニッポラン４２
７６を６２部混合した包埋樹脂）により包埋して中空繊
維が正方に規則的に配列した中空繊維配列体を得た。
【００２１】（２）メタクリレート基を有するオリゴヌ
クレオチドの調製 自動合成機ＤＮＡ／ＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐ
Ｅバイオシステム社製ｍｏｄｅｌ ３９４）を用いＤＮ
Ａ合成を行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、各オリゴ
ヌクレオチドの５’末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入
し、以下に示すオリゴヌクレオチドプローブＡ（配列番
号１）を合成した（５’末端のアミノ化はアミノリンク
ＩＩＴＭ（アプライドバイオシステム社製）を使用）。
このプローブは、一般的手法により脱保護及び精製して
使用した。 caaccaacca caactacata cacatac （配列番号１）
クレオチドの調製 自動合成機ＤＮＡ／ＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐ
Ｅバイオシステム社製ｍｏｄｅｌ ３９４）を用いＤＮ
Ａ合成を行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、各オリゴ
ヌクレオチドの５’末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入
し、以下に示すオリゴヌクレオチドプローブＡ（配列番
号１）を合成した（５’末端のアミノ化はアミノリンク
ＩＩＴＭ（アプライドバイオシステム社製）を使用）。
このプローブは、一般的手法により脱保護及び精製して
使用した。 caaccaacca caactacata cacatac （配列番号１）
【００２２】得られたオリゴヌクレオチドプローブＡ
（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５μｌ及びグリシジルメタク
リレート０．５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させ
た。反応終了後、水を加えて全量を２５μｌとし、１０
０ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有するプローブ
溶液（ＧＭＡ変性オリゴヌクレオチドプローブＡ）を得
た。
（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５μｌ及びグリシジルメタク
リレート０．５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させ
た。反応終了後、水を加えて全量を２５μｌとし、１０
０ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有するプローブ
溶液（ＧＭＡ変性オリゴヌクレオチドプローブＡ）を得
た。
【００２３】（４）モノマー液及び重合開始剤液の調製
表１に示す組成からなる重合液１、２を調製した。モノ
マー溶液Ａ及び重合開始剤液は、下記のとおり調製し
た。 〔モノマー液Ａ〕ジメチルアクリルアミド０．４５ｇ、
メチレンビスアクリルアミド０．０５ｇをグリセリン／
純水＝５０／５０（質量比）混合溶媒に溶解し全量を１
０ｍｌとした。 〔重合開始剤液〕アゾビス（２−イミダゾリン−２−イ
ル）プロパン）ジヒドロクロライド １ｇを純水に溶解
し、全量を１０ｍｌとした。
マー溶液Ａ及び重合開始剤液は、下記のとおり調製し
た。 〔モノマー液Ａ〕ジメチルアクリルアミド０．４５ｇ、
メチレンビスアクリルアミド０．０５ｇをグリセリン／
純水＝５０／５０（質量比）混合溶媒に溶解し全量を１
０ｍｌとした。 〔重合開始剤液〕アゾビス（２−イミダゾリン−２−イ
ル）プロパン）ジヒドロクロライド １ｇを純水に溶解
し、全量を１０ｍｌとした。
【００２４】
【表１】
【００２５】（５）重合液の充填及び重合
（３）で得られた中空繊維配列体中の各中空繊維の中空
部に重合液１、２を充填した後、内部が水蒸気で飽和さ
れた密閉ガラス容器に移し、５５℃で１時間放置するこ
とにより重合反応を行った。ここで、重合液１は中央１
列の３本の中空繊維に充填し、残りの中空繊維について
は、重合液２を充填した。重合後、ゲル充填中空繊維配
列体をミクロトームを用いて厚さ５００μｍの薄片とし
た。
部に重合液１、２を充填した後、内部が水蒸気で飽和さ
れた密閉ガラス容器に移し、５５℃で１時間放置するこ
とにより重合反応を行った。ここで、重合液１は中央１
列の３本の中空繊維に充填し、残りの中空繊維について
は、重合液２を充填した。重合後、ゲル充填中空繊維配
列体をミクロトームを用いて厚さ５００μｍの薄片とし
た。
【００２６】（６）ハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドプローブＡの塩基配列に相補なオリ
ゴヌクレオチドＢ（配列番号２）を検体として下記のハ
イブリダイゼーション溶液に２００ｆｍｏｌ／ｍｌの濃
度で溶解した。オリゴヌクレオチドＢ（配列番号２）は
（１）と同じように自動合成装置を用いて合成し、５’
にｃｙ３を導入した。合成後、一般的手法により脱保護
及び精製したものを使用した。 gtatgtgtat gtagttgtgg ttggttg （配列番号２） ［ハイブリダイゼーション溶液］ ５ｘＳＳＣ（０．７５ｍｏｌ／ｌ、塩化ナトリウム、
０．０７５ｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）０．０２％ＳＤＳラウリル硫酸ナトリウム） ハイブリパックにオリゴヌクレオチドＢを溶解したハイ
ブリダイゼーション溶液１ｍｌを添加し、熱シールをし
て６５℃で２０時間ハイブリダイゼーション反応を行っ
た。
ゴヌクレオチドＢ（配列番号２）を検体として下記のハ
イブリダイゼーション溶液に２００ｆｍｏｌ／ｍｌの濃
度で溶解した。オリゴヌクレオチドＢ（配列番号２）は
（１）と同じように自動合成装置を用いて合成し、５’
にｃｙ３を導入した。合成後、一般的手法により脱保護
及び精製したものを使用した。 gtatgtgtat gtagttgtgg ttggttg （配列番号２） ［ハイブリダイゼーション溶液］ ５ｘＳＳＣ（０．７５ｍｏｌ／ｌ、塩化ナトリウム、
０．０７５ｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０）０．０２％ＳＤＳラウリル硫酸ナトリウム） ハイブリパックにオリゴヌクレオチドＢを溶解したハイ
ブリダイゼーション溶液１ｍｌを添加し、熱シールをし
て６５℃で２０時間ハイブリダイゼーション反応を行っ
た。
【００２７】（７）洗浄
ハイブリパックから、繊維配列体薄片を取り出し、０．
２×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳ ２５℃ ６０分で
洗浄を行った。洗浄溶液の容量は１０ｍｌとした。
２×ＳＳＣ ０．２％ＳＤＳ ２５℃ ６０分で
洗浄を行った。洗浄溶液の容量は１０ｍｌとした。
【００２８】（８）検出
洗浄後の薄片を、無蛍光スライドガラスにのせ、数滴滅
菌水を薄片上に滴下し、カバーガラスをかぶせた。スラ
イドガラスをｇｅｎｏｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社
製、ＤＮＡチップ検出器（ＧｅｎｅＴａｃＩＶ）にセッ
ティングして、ｃｙ３用レーザーを用いて検出した。画
像は１ピクセル１０μｍの大きさに設定した。
菌水を薄片上に滴下し、カバーガラスをかぶせた。スラ
イドガラスをｇｅｎｏｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社
製、ＤＮＡチップ検出器（ＧｅｎｅＴａｃＩＶ）にセッ
ティングして、ｃｙ３用レーザーを用いて検出した。画
像は１ピクセル１０μｍの大きさに設定した。
【００２９】（９）ハイブリダイゼーション反応量の算
出 ブランクゲルスポットエリア内の蛍光強度の平均値をバ
ックグラウンドとし、オリゴヌクレオチドプローブＡが
固定化されたスポットエリア内の蛍光強度平均値から差
し引いた値を算出した。画像解析は、画像解析用ソフト
Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ（プラネトロン社製）を用
いて行った。結果を表２に示した。
出 ブランクゲルスポットエリア内の蛍光強度の平均値をバ
ックグラウンドとし、オリゴヌクレオチドプローブＡが
固定化されたスポットエリア内の蛍光強度平均値から差
し引いた値を算出した。画像解析は、画像解析用ソフト
Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ（プラネトロン社製）を用
いて行った。結果を表２に示した。
【００３０】
【表２】
【００３１】表２に示したように、基盤よりもブランク
ゲルスポットの蛍光強度が低い検出画像を解析する場
合、基板の蛍光強度（輝度のヒストグラムで度数が最も
高い値）をバックグラウンドとして計算すると、基盤よ
り低い蛍光強度のハイブリダイゼーションスポットが定
量できない。すなわち、本実施例の検出画像の輝度のヒ
ストグラムを算出すると、基盤の蛍光強度（輝度の度数
が最も高い値）は２２２７２である。この値をバックグ
ラウンドとすると、２２２７２以下の蛍光強度の変化を
定量することができなくなる。
ゲルスポットの蛍光強度が低い検出画像を解析する場
合、基板の蛍光強度（輝度のヒストグラムで度数が最も
高い値）をバックグラウンドとして計算すると、基盤よ
り低い蛍光強度のハイブリダイゼーションスポットが定
量できない。すなわち、本実施例の検出画像の輝度のヒ
ストグラムを算出すると、基盤の蛍光強度（輝度の度数
が最も高い値）は２２２７２である。この値をバックグ
ラウンドとすると、２２２７２以下の蛍光強度の変化を
定量することができなくなる。
【００３２】
【発明の効果】このように、ブランクゲルスポットをプ
ローブ固定化ゲル保持マイクロアレイに配置し、これを
バックグラウンドとすることにより、従来の方法よりも
ハイブリダイゼーション反応量がより正確に定量化でき
る。
ローブ固定化ゲル保持マイクロアレイに配置し、これを
バックグラウンドとすることにより、従来の方法よりも
ハイブリダイゼーション反応量がより正確に定量化でき
る。
【００３３】
【配列表】
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gel-microarray immobilized probe and detection method using that a
rray
<400> 2
caaccaacca caactacata cacatac 27
<210>2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>2
gtatgtgtat gtagttgtgg ttggttg 27
【図１】実施例１における検出画像である。スポットＸ
はブランクゲルスポット、スポットＹはハイブリダイゼ
ーションゲルスポットを示す。
はブランクゲルスポット、スポットＹはハイブリダイゼ
ーションゲルスポットを示す。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２
37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ
Ｆターム(参考） 2G054 AA06 CA22 EA03 GA04
4B024 AA11 CA09 HA14 HA19
4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03
CC12 FA15
4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR56
QR84 QS34 QS36 QS39 QX02
Claims (6)
- 【請求項１】 区画化された複数のスポットがプローブ
固定化用ゲルから成るマイクロアレイにおいて、プロー
ブが固定化されたゲルスポットと共にプローブが固定化
されていないブランクゲルスポットが一部配置されてい
ることを特徴とするプローブ固定化ゲル保持マイクロア
レイ。 - 【請求項２】 請求項１記載のプローブ固定化ゲル保持
マイクロアレイを用い、蛍光物質で標識された検体とプ
ローブ間のハイブリダイゼーション反応を定量化するこ
とにより検体の検出を行う検体検出方法。 - 【請求項３】 ハイブリダイゼーションゲルスポット蛍
光強度からブランクゲルスポット蛍光強度を引いた値を
ハイブリダイゼーション反応量とする請求項２記載の検
体検出方法。 - 【請求項４】 プローブが核酸である請求項１記載のプ
ローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ。 - 【請求項５】 スポットが溝または貫通孔により形成さ
れている請求項１または４記載のプローブ固定化ゲル保
持マイクロアレイ。 - 【請求項６】 貫通孔が中空繊維の中空部である請求項
５記載のプローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002153697A JP2003344405A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | プローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ及びこれを用いた検体検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002153697A JP2003344405A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | プローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ及びこれを用いた検体検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003344405A true JP2003344405A (ja) | 2003-12-03 |
Family
ID=29770674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002153697A Pending JP2003344405A (ja) | 2002-05-28 | 2002-05-28 | プローブ固定化ゲル保持マイクロアレイ及びこれを用いた検体検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003344405A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006003349A (ja) * | 2004-05-18 | 2006-01-05 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Ｄｎａマイクロアレイ処理装置 |
| JP2006275576A (ja) * | 2005-03-28 | 2006-10-12 | Casio Comput Co Ltd | 生体高分子分析装置 |
| JP2011182650A (ja) * | 2010-03-04 | 2011-09-22 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用プローブ及びマイクロアレイ |
| JP2015194402A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | Ｉｃｐ発光分光分析装置 |
-
2002
- 2002-05-28 JP JP2002153697A patent/JP2003344405A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006003349A (ja) * | 2004-05-18 | 2006-01-05 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Ｄｎａマイクロアレイ処理装置 |
| JP4627455B2 (ja) * | 2004-05-18 | 2011-02-09 | 三菱レイヨン株式会社 | Ｄｎａマイクロアレイ処理装置 |
| JP2006275576A (ja) * | 2005-03-28 | 2006-10-12 | Casio Comput Co Ltd | 生体高分子分析装置 |
| JP4701781B2 (ja) * | 2005-03-28 | 2011-06-15 | カシオ計算機株式会社 | 生体高分子分析装置及び生体高分子分析方法 |
| JP2011182650A (ja) * | 2010-03-04 | 2011-09-22 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 有害又は有毒渦鞭毛藻類検出用プローブ及びマイクロアレイ |
| JP2015194402A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | 株式会社日立ハイテクサイエンス | Ｉｃｐ発光分光分析装置 |
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