JP2000270877A - 核酸固定化ゲル保持多孔質繊維並びに該多孔質繊維配列体及びその薄片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 核酸固定化ゲル保持多孔質繊維並びに核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体及びその薄片。 【効果】 核酸が任意に高密度且つ正確に配列された核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体の繊維断面を有する
薄片を再現性よく効率的に得ることができる。この薄片
を用いて、検体中の核酸の種類および量を調べることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸が固定化され
た高分子材料に関する。詳しくは、多孔質繊維の空隙部
分に核酸固定化ゲルが保持された核酸固定化ゲル保持多
孔質繊維並びに核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体及
びその薄片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができるが、その有力な方法の一
つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝
子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸
間ハイブリダイゼーション反応や各種のPCR反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。しかしな
がら、これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限が
ある。したがって、今日のゲノムプロジェクトを通して
明らかにされつつあるような、一個体レベルという極め
て多数の遺伝子から構成される複雑な反応系全体からみ
ると、上記方法により遺伝子の総合的・系統的解析を行
うことは困難である。最近になって、多数遺伝子の一括
発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡ
チップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開
発され、注目を集めている。

【０００３】これらの方法は、いずれも核酸：核酸間ハ
イブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法で
ある点で原理的には従来の方法と同じであるが、マイク
ロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数の
ＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられ
ている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体
的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子
等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片上でハ
イブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色
素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方
法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺
伝子量を迅速に推定できる。即ち、この新しい方法の本
質は、基本的には反応試料の微量化と、その反応試料を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量しうる形に
配列・整列する技術との統合であると理解される。核酸
を基盤上に固定化するための技術としては、上記ノーザ
ン法同様、ナイロンシート等の上に高密度に固定化する
方法の他、更に密度を高めるため、ガラス等の基盤の上
にポリリジン等をコーティングして固定化する方法、あ
るいはシリコン等の基盤の上に短鎖の核酸を直接固相合
成していく方法などが開発されている。

【０００４】しかし、例えば、ガラス等の固体表面を化
学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティン
グ固定化する方法[Science 270, 467-470(1995)]は、ス
ポット密度でシート法より優れるものの、スポット密度
及びスポット当たり固定できる核酸量がシリコン基盤上
における直接合成法(U.S.Patent 5,445,934、U.S.Paten
t 5,774,305）と比較して少量であり、再現が困難であ
る点が指摘されている。他方、シリコン等の基盤の上に
フォトリソグラフィー技術を用い、多種の短鎖核酸をそ
の場で規則正しく固相合成していく方法に関しては、単
位面積当たりに合成しうる核酸種数（スポット密度）及
びスポット当たりの固定化量（合成量）、並びに再現性
等において、スポッティング法より優れるとされるもの
の、固定化しうる化合物種は、フォトリソグラフィーに
より制御可能な比較的短鎖の核酸に限られる。さらに、
高価な製造装置と多段の製造プロセスにより、チップ当
たりの大きなコストダウンが困難とされる。その他、微
小な担体上に核酸を固相合成しライブラリー化する手法
として、微小なビーズを利用する方法が知られている。
この方法は、チップ法より長鎖の核酸を多種・安価に合
成することが可能であり、またｃＤＮＡ等より長鎖の核
酸も固定可能と考えられる。しかしながら、チップ法と
異なり、指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整
列させたものを作製することは困難である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下、鎖
長によらず核酸を所定の濃度に固定化でき、測定可能な
形に高密度に再現よく配列化可能で、安価な大量製造に
適応しうる新たな体系的方法論の確立は、今後重要性を
増すと考えられる遺伝子解析に強く求められるものであ
り、本発明が解決しようとする課題である。具体的に
は、本発明が解決しようとする課題は、ナイロンシート
やガラス基盤のような二次元担体上への微量スポッティ
ングや微量分注による核酸配列体製造法に比べ、核酸固
定化量が高く、単位面積あたり配列される核酸分子種の
高密度化が可能で、大量生産により適した配列体、すな
わち核酸が固定化された二次元的（平面的）配列体（固
定化核酸二次元配列体という）の製造法の確立である。
また、本発明が解決しようとする課題はシリコン基盤上
へのフォトリソグラフィーと固相合成との組み合わせに
よる高密度オリゴ核酸配列体製造法と比べ、ｃＤＮＡを
含む長鎖の核酸にも適応可能で、製造コストのより低い
固定化核酸二次元配列体製造法の確立である。そこで、
本発明は、核酸固定化ゲル保持多孔質繊維並びに核酸固
定化ゲル保持多孔質繊維配列体及びその薄片を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、核酸整列
化プロセスと固定化プロセスとを同一の二次元担体上で
行う従来法の発想を改め、核酸の固定化プロセスを一次
元構造体としての繊維上（1本の繊維上）に独立して行
い、それらの整列化プロセスに各種の繊維賦形技術を導
入することにより三次元構造体としての繊維束を作製
し、得られる繊維束の切片化プロセスを経ることで、固
定化核酸二次元高密度配列体を作製し得ることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、多孔質繊維の空隙部
分に核酸固定化ゲルが保持された核酸固定化ゲル保持多
孔質繊維である。さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲ
ル保持多孔質繊維の束を含む核酸固定化ゲル保持多孔質
繊維配列体である。該配列体としては、例えば列体中の
繊維が規則的に配列されたものが挙げられ、１ｃｍ²あ
たり１００本以上の繊維を含むものが挙げられる。ま
た、核酸固定化ゲルに含まれる核酸の種類としては、各
繊維の全部又は一部において異なるものが挙げられる。
さらに、本発明は、前記核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
配列体の繊維軸と交差する切断面を有する、前記核酸固
定化ゲル保持多孔質繊維配列体の薄片である。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、核酸が固定化されたゲルを保持する繊維であ
って、該繊維が多孔質のもの（以下、「核酸固定化ゲル
保持多孔質繊維」ともいう。）である。多孔質とは、繊
維に無数に存在する空隙（隙間）を意味する。本発明に
おいて、ゲルに固定化する対象となる核酸としては、デ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核酸（ＲＮＡ）が挙げ
られる。本発明に用いる核酸は、市販のものでもよく、
また、生細胞などから得られた核酸でもよい。

【０００９】生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、
公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blinらの
方法（ Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (19
76)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Faval
oroらの方法（ Favaloro etal., Methods Enzymol.65:
718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核
酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮ
Ａや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化
学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合
成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド
等を用いることもできる。

【００１０】本発明に用いることができるゲルの種類は
特に制限されないが、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ
−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールア
クリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキス
トリン等の単量体の一種類または二種類以上と、メチレ
ンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコー
ルジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体とを共重
合したゲルを用いることができる。その他本発明におい
て使用できるゲルとして、例えばアガロース、アルギン
酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを
挙げることができる。

【００１１】本発明では、核酸をそのままゲルに固定化
してもよく、また、核酸に化学的修飾を施した誘導体
や、必要に応じて変成させた核酸を固定化してもよい。
核酸のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方
法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよ
く、核酸を一旦高分子体や無機粒子などの担体にに共有
結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲ
ルに固定化してもよい。例えば、核酸の末端基にビニル
基を導入し（ＷＯ98/39351）、アクリルアミド等のゲル
の構成成分と共重合させることができる。共重合におい
ては、単量体、多官能性単量体及び重合開始剤と共に共
重合する方法、単量体及び重合開始剤と共に共重合した
のち、架橋剤でゲル化する方法などがある。

【００１２】また、アガロースを臭化シアン法でイミド
カルボネート化しておき、末端アミノ化した核酸のアミ
ノ基と結合させてからゲル化することもできる。この
際、核酸固定化したアガロースと他のゲル（例えばアク
リルアミドゲル等）との混合ゲルにしてもよい。その他
の方法としては、高分子粒子や無機粒子等の担体に核酸
を結合し、該粒子を上述のゲルに包括固定化する方法が
挙げられる。例えば、ビオチン化した核酸とアビジン化
したアガロースビーズ（シグマ社製 アビジン化アガロ
ース等）を反応させることによって、核酸が固定化され
たアガロースビーズを得ることができる。核酸固定化ア
ガロースビーズはアクリルアミドゲル等に包括固定化す
ることができる。

【００１３】また、ゲルや担体への結合においては、グ
ルタルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド(EDC)等の架橋剤を用い
て結合させることもできる。核酸の一般的な化学的修飾
としては、アミノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニン化
等が知られているが[Current Protocols In Molecular
Biology, Ed.; Frederick M. Ausubel et al.(1990)、
脱アイソトープ実験プロトコール(1)ＤＩＧハイブリダ
イゼーション（秀潤社）]、本発明ではこれらのいずれ
の修飾法も採用することができる。一例として、核酸へ
のアミノ基導入に関して説明する。

【００１４】アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本
鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例
えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であ
ってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239
号公報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等
に記載の方法にしたがって調製することができる。この
方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例
えば、アミノリンクII（商標名）；ＰＥバイオシステム
ズジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロンテ
ック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸
にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の
方法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）にし
たがって調製することができる。

【００１５】本発明において、核酸固定化ゲル保持多孔
質繊維として用いることができる多孔質繊維状材料とし
ては、多孔質繊維の空隙部分に核酸固定化ゲルを保持で
きるものであれば特に限定されるものではないが、合成
繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊
維、及び天然繊維等が挙げられる。合成繊維の代表例と
しては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド
等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレ
ート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグ
リコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリ
ロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンや
ポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリ
ビニルアルコール系の各種繊維、ポリ塩化ビニリデン系
の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の
各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンや
ポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、
ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維な
どが挙げられる。また、衣料用以外の繊維、例えば、ポ
リメチルメタクリレートやポリスチレンなどの透明非晶
質高分子を主材料とした光学繊維なども用いることがで
きる。

【００１６】半合成繊維の代表例としては、ジアセテー
ト、トリアセテート、キチン、キトサン等を原料とした
セルロース系誘導体系各種繊維、プロミックスと呼称さ
れる蛋白質系の各種繊維などが挙げられる。再生繊維の
代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、あ
るいは有機溶剤法により得られるセルロース系の各種再
生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）などが
挙げられる。無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、
炭素繊維などが挙げられる。天然繊維の代表例として
は、綿、亜麻、苧麻、黄麻などの植物繊維、羊毛、絹な
どの動物繊維、石綿などの鉱物繊維などが挙げられる。

【００１７】本発明に用いる多孔質繊維状材料は、特に
その形態が規定されるものではなく、その多孔質繊維断
面形状が円形断面でもよく、扁平断面や中空断面などの
異形断面でもよい。本発明に用いる繊維は、無処理の状
態でそのまま用いてもよいが、必要に応じて、反応性官
能基を導入した繊維であってもよく、また、プラズマ処
理やγ線、電子線などの放射線処理を施した繊維であっ
てもよい。核酸固定化ゲル保持多孔質繊維を作製する方
法は、特に制限されるものではないが、例えば、単量
体、多官能性単量体、開始剤及び核酸または末端にビニ
ル基を有する核酸を混合した液に繊維を浸し重合、ゲル
化させる方法が挙げられる。また、単量体、多官能性単
量体、開始剤及び高分子粒子や無機粒子等の担体に核酸
を結合したものを混合した液に繊維を浸し重合、ゲル化
させる方法が挙げられる。

【００１８】その他に、単量体、開始剤及び末端にビニ
ル基を有する核酸を共重合したものと架橋剤を混合した
液に繊維を浸しゲル化する方法、単量体を開始剤で重合
したもの、架橋剤および核酸または高分子粒子や無機粒
子等の担体に核酸を結合した粒子を混合した液に繊維を
浸しゲル化する方法、核酸を固定化したアガロース等を
加熱溶解し、繊維を浸し、冷却ゲル化させる方法等が挙
げられる。

【００１９】上述の方法により得られた核酸固定化ゲル
保持多孔質繊維は、ゲルが破壊されない限りにおいて適
当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカ
リ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定化
された核酸を変成させる。あるいは、細胞、菌体などの
生材料から得られた核酸を使用する場合は、不要な細胞
成分などを除去する。そして、処理後の核酸固定化ゲル
保持多孔質繊維を核酸を検出する材料として用いること
ができる。なお、これらの処理は別々に実施してもよ
く、同時に実施してもよい。また、核酸を含む試料をゲ
ルに固定化する前に実施してもよいし、核酸を含む試料
をゲルに固定化した後、繊維に保持する前に適宜実施し
てもよい。

【００２０】上記の通り調製された核酸固定化ゲル保持
多孔質繊維は、本発明の核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
配列体を構成する基本単位とすることができる。そし
て、これらの核酸固定化ゲル保持多孔質繊維を集束した
後に接着して、核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体と
なすことができる。この際、核酸固定化ゲル保持多孔質
繊維を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することに
より、例えば、縦横に核酸固定化ゲル保持多孔質繊維が
整然と規則的に配列した核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
配列体を得ることができる。核酸固定化ゲル保持多孔質
繊維配列体の形状は特に限定されるものではないが、通
常は、核酸固定化ゲル保持多孔質繊維を規則的に配列さ
せることにより正方形又は長方形に形成される。

【００２１】「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中
に含まれる核酸固定化ゲル保持多孔質繊維の本数が一定
となるように順序よく配列させることをいう。例えば、
直径１ｍｍの核酸固定化ゲル保持多孔質繊維を束にして
断面が縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となるように配
列させようとする場合は、その正方形の枠内（１ｃ
ｍ²）における１辺に含まれる核酸固定化ゲル保持多孔
質繊維の数を10本とし、この10本の核酸固定化ゲル保持
多孔質繊維を1列に束ねて1層のシートとした後、このシ
ートが10層になるように重ねる。その結果、縦に10本、
横に10本、合計100本の核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
を配列させることができる。但し、核酸固定化ゲル保持
多孔質繊維を規則的に配列させる手法は、上記のように
シートを重層するものに限定されるものではない。

【００２２】この場合に、特定の核酸が固定化された核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維の位置があらかじめ決めら
れた状態で配列することが望ましいが、必ずしもそのよ
うに配列させる必要はない。その理由は、配列体を形成
した段階では特定の核酸を固定化した核酸固定化ゲル保
持多孔質繊維がどの位置に存在するのかが不明でも、配
列体の断面を切断した後、一旦ハイブリダイゼーション
手法等を用いて断面における核酸の配置位置を決定する
ことにより、特定の核酸が固定された核酸固定化ゲル保
持多孔質繊維の位置を確認することができるためであ
る。従って、この手法を用いて、一度、薄片内に配置さ
れた複数種類の核酸の位置を決定しておけば、同一配列
体から得られる薄片はすべて同一の位置配置であるの
で、同一配列体から得られるすべての薄片の核酸の位置
配置がわかる。

【００２３】なお、本発明において束にする核酸固定化
ゲル保持多孔質繊維の本数は１００本以上、好ましくは
１,０００〜１０,０００,０００本であり、目的に応じ
て適宜設定することができる。但し、配列体における核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維の密度が、１ｃｍ²当たり
１００〜１,０００,０００本となるように調製すること
が好ましい。そして、高密度に核酸が固定化された配列
体の薄片を得るべく核酸固定化ゲル保持多孔質繊維を配
列させるためには、核酸固定化ゲル保持多孔質繊維の太
さは細い方が好ましい。本発明の好ましい実施態様にお
いては、核酸固定化ゲル保持多孔質繊維１本の太さは１
ｍｍ以下であることが必要である。

【００２４】核酸固定化ゲル保持多孔質繊維が直径５０
μｍのモノフィラメントの場合、１ｃｍあたり２００本
の繊維を配列させることができるため、１ｃｍ²の正方
形内に配列させることのできる繊維の本数は40,000本で
ある。したがって、この場合は１ｃｍ²あたり最高40,00
0種類の核酸を固定化することができる。一方、マルチ
フィラメントにおいては８３ｄｔｅｘ／３６フィラメン
トや８２ｄｔｅｘ／４５フィラメント等をそのまま用い
ることもできる。ゲルに固定化されている核酸の種類
は、配列体中の各繊維ごとにそれぞれ異なるものとする
ことが可能であり、また、同一の核酸が固定化された繊
維から任意の本数の繊維を選択し、その選択された繊維
を束ねて適宜配列させることも可能である。即ち、本発
明によれば、固定化された核酸の種類と配列の順序に関
しては、目的に応じて任意に設定することが可能であ
る。

【００２５】本発明においては、上記の核酸固定化ゲル
保持多孔質繊維配列体を繊維軸と交差する方向、好まし
くは繊維軸に対して垂直方向に切断することにより、核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体断面を有する薄片を
得ることができる。この際の切断方法としては、例え
ば、ミクロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方
法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することが
できるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜
２,０００μｍである。

【００２６】得られた核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配
列体断面を有する薄片には、該配列体を構成する核酸固
定化ゲル保持多孔質繊維の数に応じた核酸が存在する。
薄片の断面積あたりの核酸の数に関しては、用いる核酸
固定化ゲル保持多孔質繊維の外径や配列体作製時の方法
等を適宜選択することにより、薄片断面積１ｃｍ²あた
り１００以上、更には１０００以上の核酸が固定化され
た薄片を作製することも可能である。

【００２７】これら薄片は、固定化された核酸をプロー
ブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを
行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸
の検出に用いることができる。本発明で言うプローブと
は、狭義には検出すべき遺伝子の塩基配列に相補的な塩
基配列を有する核酸を指す。即ち、本発明の核酸固定化
繊維配列体断面を有する薄片を検体と反応させてハイブ
リダイゼーションを行い、プローブと相補的な検体中に
存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブ
リッドを検出することにより、目的とする塩基配列を有
する検体中の核酸を検出することができる。また、本発
明で言うプローブとは、広義には検体中に存在するする
タンパク質や低分子化合物等と特異的に結合することが
できる核酸を指す。従って、これらの薄片の利用法とし
ては、固定化された核酸（プローブ）とハイブリッドを
形成する核酸を検出するための利用に留まらず、固定化
された核酸と特異的に結合するタンパク質や低分子化合
物等の各種試料（例えば生体成分等）を検出するための
利用が挙げられる。

【００２８】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。

【００２９】

【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的
範囲が限定されるものではない。 参考例１ オリゴヌクレオチド及び5'末端にアミノ基またはビオチ
ンを有するオリゴヌク レオチドの調製：以下に示したオリゴヌクレオチド（プ
ローブＡ、プローブＢ）を合成した。 プローブＡ: GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配列番号１） プローブＢ: GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列番号２）

【００３０】オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシ
ステムズ社の自動合成機DNA/RNA synthesizer (model39
4)を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノ
リンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社）を
用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの５′未端にＮＨ
₂（ＣＨ₂）₆−を導入しアミノ化したプローブを、およ
びビオチンアミダイトを用いてビオチン化したプローブ
を調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精
製して使用した。

【００３１】実施例１ 核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
の作製 参考例１で得られた５'末端にビオチン基を有するオリ
ゴヌクレオチドを含む、以下の組成からなる水溶液を作
製した。 アクリルアミド 3.7重量部 メチレンビスアクリルアミド 0.3重量部 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 0.1重量部 ビオチン化オリゴヌクレオチド（プローブＡまたはプローブＢ） 0.005重量部 アビジン化アガロース（６％）懸濁液 1.0 重量部

【００３２】本溶液にポリエチレン製多孔質繊維（外径
２００μｍ）を浸した後、内部が水蒸気で飽和された密
閉ガラス容器に移し、８０℃にて４時間放置することに
より重合反応を行った。その結果、オリゴヌクレオチド
（プローブＡまたはプローブＢ）がビオチン−アビジン
結合を介して固定化されたゲルを多孔質繊維の空隙部分
に保持した繊維が得られた。

【００３３】実施例２ 核酸固定化ゲル保持多孔質繊維
配列体の作製 実施例１で得たプローブＡまたはプローブＢが固定化さ
れたゲルを保持する多孔質繊維２０本を、テフロン板状
に互いに重なることなく、且つ密着させて配列し両端を
固定した。これに、ポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリ
ウレタン工業(株)コロネート4403、ニッポラン4223)を
薄く塗布し、ポリウレタン樹脂が十分に固まった後、こ
れをテフロン板上から剥がし、プローブＡが固定化され
た核酸固定化ゲル保持多孔質繊維が一列に配列したシー
ト状物を得た。一方、プローブＢが固定化された核酸固
定化ゲル保持多孔質繊維についても、同様の操作により
シート状物を得た。次いで、これらのシート状物を図１
（３）の配列となるように２０枚積層し、上記接着剤を
使用して接着し、縦横各々２０本ずつ、計４００本の繊
維が規則的に正方に配列した核酸固定化ゲル保持多孔質
繊維配列体を得た。

【００３４】実施例３ 核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体の薄片の作製：実
施例２で得られた核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体
を、繊維軸に直角方向にミクロトームを用いて１００μ
ｍの厚さに切り出すことにより、縦横各々２０本、計４
００本の繊維断面が規則的に正方に配列された核酸固定
化ゲル保持多孔質繊維配列体の薄片を得た(図1(4))。

【００３５】参考例２ 試料核酸の標識：試料核酸のモデルとして、参考例１で
合成したオリゴヌクレオチド（プローブＡ、プローブ
Ｂ）の配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、
Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTCG（配列番号３） オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC（配列番号４）

【００３６】これらのオリゴヌクレオチドの5'末端を、
参考例４と同様にしてアミノリンクII（商標名）（ＰＥ
バイオシステムズジャパン社）を用いてそれぞれのオリ
ゴヌクレオチドの５′未端にＮＨ₂（ＣＨ₂）₆−を導入
した後、以下のようにしてディゴキシゲニン(DIG: Digo
xigenin、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で
標識した。末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドをそ
れぞれ100 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)に終濃度2 mMになる
ように溶かした。等量のDigoxigenin-3-O-methylcarbon
yl-ε-aminocapronic acid-N-hydroxy-succinimide est
er (26mg/mlジメチルホルムアミド溶液)を加え、室温に
て一晩静置した。

【００３７】量を100μlに調整し、2μlのグリコーゲン
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、10μl
の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの冷エタノールを加
え、15,000rpm 15分の遠心により沈殿を回収した。沈殿
に500μlの70%エタノールを加え15,000rpm 5分の遠心に
より沈殿を再びチューブの底に集めた。沈殿を風乾し、
100μlの10 mM Tris-HCl (pH7.5),1 mM EDTAに溶かし
た。こうして得られたDIG標識オリゴヌクレオチドを試
料核酸のモデルとして用いた。

【００３８】参考例３ ハイブリダイゼーション：実施例３で作製した核酸固定
化ゲル保持繊維配列体の薄片をハイブリダイゼーション
用のバッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイゼ
ーション溶液を注ぎ込み、４５℃で30分間プレハイブリ
ダイゼーションを行った。参考例２で得られたＤＩＧ標
識ＤＮＡを加え、４５℃で １５時間ハイブリダイゼー
ションを行った。

【００３９】ハイブリダイゼーション溶液組成： 5xSSC(0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、pH7.0） 5%ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社） 0.1% N-ラウロイルザルコシンナトリウム 0.02% SDS（ラウリル硫酸ナトリウム） 50% ホルムアミド

【００４０】参考例４ 検出：ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定化ゲル
保持多孔質繊維配列体の薄片を、あらかじめ保温してお
いた５０ｍｌの0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液に移し、振盪
しながら20分間の洗浄を４５℃で３回行った。DIG緩衝
液１を加え、室温で振盪しながらSDSの除去を行った。
これを再度繰り返した後、DIG緩衝液２を加え１時間振
盪した。緩衝液を除いた後、DIG緩衝液２に10000分の１
量の抗DIGアルカリフォスファターゼ標識抗体溶液を加
えた溶液１０mlを加え、30分間ゆっくり振盪させること
により抗原抗体反応を行わせた。次に0.2% Tween 20を
含むDIG緩衝液１で15分間２回振盪することにより洗浄
し、引き続き DIG緩衝液３に３分間浸した。 DIG緩衝液
３を除いた後、AMPPDを含むDIG緩衝液３mlを加え、10分
間平衡化した。

【００４１】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、37℃で１時間おいた後、X線フィル
ム用のバインダーにX線フィルムとともに挟みフィルム
を感光させた。その結果、プローブＡが配置された場所
には、オリゴヌクレオチドＣが結合し、プローブＢが配
置された場所には、オリゴヌクレオチドＤが結合してい
ることが確認された。 DIG緩衝液１： 0.1 Mマレイン酸、0.15M塩化ナトリウム
(pH7.5) DIG緩衝液２： DIG緩衝液１に0.5%濃度でブロッキング
試薬を添加したもの DIG緩衝液３： 0.1 Mトリス−塩酸(pH9.5)、0.1 M塩化
ナトリウム、0.05M塩化マグネシウム ブロッキング試薬 ： 抗DIGアルカリフォスファター
ゼ標識抗体溶液および AMPPDはDIG Detectionキット
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)中の試薬
である。

【００４２】

【発明の効果】本発明により、核酸固定化ゲル保持多孔
質繊維並びに核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体及び
その薄片が提供される。本発明によれば、核酸が任意に
高密度且つ正確に配列された核酸固定化ゲル保持多孔質
繊維配列体の繊維断面を有する薄片を再現性よく効率的
に得ることができる。この薄片を用いて、検体中の核酸
の種類および量を調べることができる。

【００４３】本発明を従来法と比較した利点、有用性と
しては、例えば、固定化プロセスを二次元平面上で行わ
ず、一次元構造体としての繊維上で分離・独立して行う
ことにより、鎖長によらず核酸の定量的固定が可能とな
ったこと、整列化プロセスに各種の繊維賦形技術、ない
し織物作製技術の導入による高密度化が可能となったこ
と、また、その結果得られる選られる三次元構造体とし
ての繊維束から目的とする二次元配列体を作製するた
め、従来法にはない薄片化プロセスが新たに導入された
が、それに伴いスポッティング法のような誤差の多い微
量分注操作が不要となり、連続切片化を通した多量生産
が可能となったこと等があげられる。

【００４４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> A POROUS FIBER HOLDING NUCLEIC ACID-FIXED GEL, AN ARRAY OF THE FI BERS AND A SLICE OF THE ARRAY <130> P99-0169 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27

【００４５】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は核酸固定化ゲル保持多孔質繊維並びに核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体及びその薄片の模式
図である。(1)はプローブＡが固定化された核酸固定化
ゲル保持多孔質繊維、(2)はプローブＢが固定化された
核酸固定化ゲル保持多孔質繊維、(3)はこれら２種の核
酸固定化ゲル保持多孔質繊維からなる核酸固定化ゲル保
持多孔質繊維配列体、及び(4)はこの核酸固定化ゲル保
持多孔質繊維配列体を繊維軸に対して垂直方向に切断し
た断面を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村瀬 圭 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 (72)発明者 渡辺 文昭 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 (72)発明者 藤井 渉 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 HA14 HA19 4B029 AA23 BB20 CC03 CC10 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QS25 QS32 QS34

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多孔質繊維の空隙部分に核酸固定化ゲル
   が保持された核酸固定化ゲル保持多孔質繊維。
2. 【請求項２】 請求項１記載の核酸固定化ゲル保持多孔
   質繊維の束を含む核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列
   体。
3. 【請求項３】 繊維配列体中の繊維が規則的に配列され
   たものである請求項２記載の核酸固定化ゲル保持多孔質
   繊維配列体。
4. 【請求項４】繊維の束が、１ｃｍ²あたり１００本以上
   の繊維を含むものである請求項２又は３記載の核酸固定
   化ゲル保持多孔質繊維配列体。
5. 【請求項５】 核酸の種類が、各繊維の全部又は一部に
   おいて異なるものである請求項２〜４のいずれか１項に
   記載の核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体。
6. 【請求項６】 請求項２〜５のいずれか１項に記載の核
   酸固定化ゲル保持多孔質繊維配列体の繊維軸と交差する
   切断面を有する、前記核酸固定化ゲル保持多孔質繊維配
   列体の薄片。