JP4036611B2 - 生体関連物質マイクロアレイ及びそれを用いた検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質及び色素を含むゲルが保持された繊維配列体薄片からなる生体関連物質マイクロアレイ及びそれを用いた検出方法に関する。該マイクロアレイは、臨床検査、食品検査等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸間ハイブリダイゼーション反応や各種のＰＣＲ反応を利用した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限があるが、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発されてきた。
【０００３】
本発明者らは、先に新規なマイクロアレイを開発した（特開2000-270877号、特開2000-270878号、特開2000-270879号公報）。これらの発明は、核酸固定化ゲルを繊維の表面又は空隙部に保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作製し、これを配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより薄片を得るものである。この薄片は核酸固定化二次元高密度配列体、すなわちDNAマイクロアレイとして使用される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記繊維配列体薄片は、透明なゲルを利用したマイクロアレイであるので、マイクロアレイの製造工程又は該マイクロアレイを利用した検査時等に、ゲルの脱落、収縮、変形等を生じても、視覚的に検出することは容易ではなかった。
また、捕捉プローブと検体のハイブリッド形成を検出する方法においては、該捕捉プローブが、蛍光標識した検体とハイブリッドを形成した後、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出するのが一般的手法であるが、蛍光標識強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいては、繊維により区分された各区画位置に対応する蛍光を正確に認識することが困難であり、蛍光強度を容易且つ正確に検出することは困難であった。さらには、蛍光検出装置の照射面積中での励起光の強度斑や光学系の構成に起因する蛍光強度斑が発生し、ハイブリッド形成の検出が正確に実施できない問題があった。
【０００５】
本発明は、製造工程でのゲルの脱落等を容易に検出でき、ハイブリダイゼーション操作での泡の付着やゲルの変形、脱落等を容易に検出できる視認性の改良された生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体薄片を提供することを課題とする。同時に、繊維により区分された各区画位置に対応する蛍光を正確に認識することができ、蛍光強度を容易且つ正確に検出することのできる生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体薄片を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、繊維により区分された各区画に配置されるゲルに、予め色素、例えば、蛍光色素を固定化することにより、製造時及びハイブリダイゼーション時におけるゲルの充填、変形、脱落状態等を、蛍光顕微鏡を用いて容易に検出できることを見出し本発明に至った。
また、マイクロアレイに固定化された生体関連物質と検体のハイブリッド形成を検出する検出方法においては、繊維によって区分された各区画位置（座標）を正確に認識することができ、且つ各区画位置（座標）に対応する蛍光強度を正確に検出することができることを見出した。
さらには、マイクロアレイに固定化された生体関連物質と検体のハイブリッド形成を検出する検出方法において、蛍光検出装置、例えば光源に起因する蛍光強度斑を容易に検出、補正することができるため、ハイブリッド形成の検出が定量的に行えることを見出し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、〔１〕生体関連物質及び色素を含むゲルが保持された繊維の複数を収束してなる繊維配列体を、繊維軸と交差する方向に切断することにより得られる生体関連物質マイクロアレイである。生体関連物質としては、核酸、固定化される色素としては、350 nm〜500 nmの蛍光波長を有するものが例示される。そのような蛍光色素として、フルオレセイン誘導体又はクマリン誘導体が例示できる。また、ゲルとしては、水溶性モノマーからなるものが挙げられる。そのようなモノマーの例として、アクリルアミドモノマーが例示できる。繊維としては、中空繊維、多孔質繊維又は多孔質中空繊維が挙げられる。
さらに、本発明は、〔２〕以下の工程を含む前記生体関連物質マイクロアレイの各区画に保持された捕捉プローブと検体のハイブリッド生成を検出する方法。
（１）予めゲルに固定化した色素が励起可能な波長の光を、マイクロアレイに露光して、前記色素から放射される蛍光を検出する。
（２）マイクロアレイを構成する繊維により区分された各区画の位置情報を取得する。
（３）得られた位置情報を用いて、捕捉プローブと検体ハイブリッドの検出を行う。
〔３〕以下の工程を含む、前記生体関連物質マイクロアレイの各区画に保持された捕捉プローブと蛍光標識検体のハイブリッド生成を検出する方法。
（１）予めゲルに固定化した色素が励起可能な第１の波長の光を、マイクロアレイに露光して前記色素から放射される蛍光を検出する。
（２）第１の工程の蛍光の強度及び/又は強度分布の情報を取得する。
（３）捕捉プローブと蛍光標識検体とのハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光標識検体が励起可能な第２の波長の光により、ハイブリッド生成を検出する。
（４）得られた蛍光強度を、第２の工程で得られた蛍光の強度及び/又は強度分布の情報によって補正する。
〔４〕 前記生体関連物質マイクロアレイの検品方法において、ゲルに固定化した色素が励起可能な波長の光を、マイクロアレイに露光して、放射される蛍光を検出することにより、マイクロアレイの各区画のゲルの形状を評価することを特徴とする生体関連物質マイクロアレイの検品方法、である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ゲルに固定化する対象となる生体関連物質としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）等の核酸、蛋白質、多糖類等が挙げられる。これらは、市販品又は生細胞等から得られたもの何れでもよい。
例えば、生体関連物質として核酸を用いる場合には、生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法により実施することができる。例えば、ＤＮＡの抽出については、Blinらの方法(Nucleic Acids Res.3.2303(1976))等により、また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法(Methods.Enzymol.65.718(1980))等が例示できる。
更には、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡを使用することもできる。前記ＤＮＡは、制限酵素若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【０００９】
本発明に用いることができるゲルは、特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等から選択された少なくとも一種類以上の単量体と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。
その他、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル又はこれらを架橋したゲルを用いることができる。
【００１０】
本発明では、生体関連物質をそのままゲルに固定化してもよく、また、生体関連物質に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた生体関連物質を固定化してもよい。生体関連物質のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよく、生体関連物質を一旦高分子体や無機粒子等の担体に共有結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲルに固定化してもよい。
【００１１】
例えば、生体関連物質として核酸をゲル構成成分へ直接的に結合させるには、核酸の末端基にビニル基を導入し（WO98/39351号公報参照）、アクリルアミド等のゲルの構成成分と共重合させることにより行うことができる。
核酸の末端基へのビニル基の導入をグリシジル基を介して行う場合、予め核酸を修飾しておく必要があるが、修飾に際しては、グリシジル基と反応するものであれば特に制限を受けない。例えば、アミノ基が導入されたものを用いることができる。
【００１２】
アミノ基の導入法に関して、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、アミノ基と一本鎖のＤＮＡの結合部位は、ＤＮＡの５’末端、３’末端、鎖中、リン酸ジエステル部位又は塩基部位が考えられるが、ＤＮＡの５’末端又は３’末端で結合することが好ましい。該一本鎖ＤＮＡ誘導体は、特公平3-74239号、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等各公報記載の方法に従い調製することができる。
前記方法の他に、例えば、市販のアミノ基導入用試薬、例えば、アミノリンクＩＩ（ＰＥバイオシステムズジャパン社製）、Amino Modifiers（クロンテック社製）等を用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸に、アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の方法(Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983))に従い調製することができる。
【００１３】
本発明に用いることができる色素は、主に天然色素、合成染料に分類される。
天然色素の代表例としてはフラボン誘導体、カルコン誘導体、アントラキノン誘導体、インジゴ誘導体等が挙げられる。合成染料の代表例としてはアゾ染料、アントラキノン染料、インジゴイド染料、ジフェニルメタン染料、トリフェニル染料、キサンテン染料、アクリジン染料等が挙げられる。特に、上記の染料色素には蛍光を有する色素も存在する。
本発明に用いることができる蛍光色素の種類は蛍光を発する色素であれば特に限定されるものではないが、例えば、ローダミン、Texas Red、Fluorescein 、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Oregon Green、Pacific Blue、R-Phycoerythrin、Rhodol Green、Coumarin誘導体、Amino Methyl Coumarin等が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられる色素の固定化方法は、色素をそのままゲルに固定化する方法又は色素に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた色素を固定化する方法が例示できる。色素のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方法やゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよい。また、色素を一旦、高分子粒子や無機粒子等の担体に共有結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲルに固定化しても良い。
【００１５】
色素をゲル構成成分へ直接的に結合させるには、例えば、Polyscience社製の Fluorecein Dimethacrylateや 1-Pyrenylmethyl Methacrylate等を用いアクリルアミド等のゲル構成成分と共重合させる方法、アミノ基を有する色素誘導体をグリシジルメタクリレート(GMA)と反応させることによって重合性ビニル基を導入しておき、アクリルアミド等のゲル構成成分と共重合させる方法、また、ゲルにアニオン性モノマーを導入し、カチオン性色素をイオン結合させる方法等を挙げることができる。
【００１６】
本発明によれば、蛍光標識を用いた検体をハイブリダイゼーションに供し、ハイブリットの検出を行う際に、予め特定の波長の蛍光色素をゲルに固定化することにより、ゲルの視認性を付与された高度な透明性を有するゲルを含む生体関連物質マイクロアレイを提供することができる。
前記検体の蛍光標識は、マイクロアレイを構成する部材（本発明では、捕捉プローブである生体関連物質を固定する支持体、即ちゲル、繊維、接着剤等をいう）の自家蛍光の影響を受けにくい500 nm以上の長波長の蛍光を用いることが好ましいため、予めゲルに固定化する蛍光色素の蛍光波長は、可視光の範囲で350 nm〜500 nmの短波長であることが好ましい。
予めゲルに固定化する蛍光色素の好ましい例としては、Fluorescein 、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)等のフルオレセイン誘導体、Amino Methyl Coumarin等クマリン誘導体が好ましい。
本発明において、固定化量される色素の量は特に限定されるものではなく、任意に調整することができる。通常、マイクロアレイの各区画を構成する各繊維断片ごとに、100fmol〜10atmolである。固定化する色素の量は、固定化する生体関連物質の量とは無関係に決定され、生体関連物質と等量又は比例する量である必要はないが、アレイに含まれる全ての繊維断片において、等しい量であることが好ましい。特に、検出装置の光学系に基づく光強度分布を補正する目的においては各繊維断片に等量の色素が含まれていることが必要である。
【００１７】
本発明に用いることができる繊維としては合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。
合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維等が挙げられる。また、衣料用以外の、例えば、ポリメチルメタクリレートやポリスチレン等の透明非晶質高分子を主材料とした光学繊維等も用いることができる。半合成繊維の代表例としては、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維等が挙げられる。
再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、或いは有機溶剤法によるセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）等が挙げられる。
無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、炭素繊維等が挙げられる。
天然繊維の代表例としては、綿、亜麻、苧麻、黄麻等の植物繊維、羊毛、絹等の動物繊維、石綿等の鉱物繊維等が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いる繊維の構造は、特にその形態が規定されるものではなく、またモノフィラメントであってもよく、マルチフィラメントであってもよい。さらに、短繊維を紡績した紡績糸でもよい。尚、マルチフィラメントや紡績糸の繊維を用いる場合には、生体関連物質固定化ゲルの保持に単繊維間の空隙等を利用することも可能である。
また本発明に用いる繊維は、多孔質な構造を有するものでも良い。断面形状も円形断面のみならず、扁平断面や中空断面等の異形断面でもよい。特にゲルを均一に固定化する観点から、中空であることが好ましい。
【００１９】
繊維にゲルを保持させるには、ゲル構成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量体、重合開始剤、色素及び生体関連物質成分を含む液に繊維を浸し重合、ゲル化させればよい。この際、色素及び／又は生体関連物質は、前記したように、例えばゲル構成成分であるアクリルアミド等の単量体や高分子粒子、無機粒子等の担体に結合させておくことが好ましい。
ゲル化は多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用いて行ってもよい。
その他、生体関連物質を固定化したアガロース等を加熱溶解し、繊維を浸し、冷却ゲル化させる方法等が挙げられる。
【００２０】
また、繊維が中空繊維及び多孔質中空繊維の場合、上述の各成分を含む液に繊維を浸漬する代わりに、該液をこれら繊維の中空部及び／又は多孔質部に注入又は吸引することにより充填した後、ゲル化させてもよい。
中空繊維、多孔質中空繊維の中空部及び／又は多孔質部にゲルを保持させる手順は、後述する繊維配列体となす前でもよいし、後でもよい。
【００２１】
前記の通り調整された生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維は、収束した後に密着して、生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維配列体となすことができる。この際、該繊維を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に該繊維が整然と規則的に配列した該繊維配列体を得ることができる。
【００２２】
本発明の薄片は、上記の生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維配列体を繊維軸と交差する方向、好ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することにより得ることができる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,０００μｍである。
このようにして得られた薄片は、例えば、蛍光顕微鏡で観察することにより、ゲルの変形、脱落等の形状を容易に観察することができる。
【００２３】
これら薄片は、ゲルに固定化された生体関連物質を捕捉プローブとして、検体と反応させてハイブリッドを形成させることにより、検体中の特定の生体関連物質の検出に用いることができる。
ここで言う捕捉プローブとは、広義には検体中に存在する蛋白質や低分子化合物等の検体試料側生体関連物質と特異的に結合することができるゲルに固定化した生体関連物質を指す。ゲルに固定化した生体関連物質が核酸である場合には、該薄片を検体と反応させてハイブリダイゼーションを行い、捕捉プローブと相補的な検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブリッドを検出することにより、目的とする塩基配列を有する検体中の核酸を検出することができる。
【００２４】
ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、検体中の生体関連物質に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープ等の標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
【００２５】
ハイブリッドの検出工程においては、まず、ゲルに固定化した色素を励起可能な第一の波長の光によってマイクロアレイを露光して、各繊維により区分された区画に保持されるゲルに固定化された色素から放射される蛍光を検出し、前記区画の位置情報（座標）を得ることができる。得られた位置情報により、各繊維により区分された区画は、例えばアレイのＸＹ平面上のＸＹ座標で表される。得られた位置情報を用いてハイブリッドの検出を、各繊維により区分された区画の位置ごとに検出することができる。
例えば、標識体が蛍光色素の場合には、該蛍光色素を励起可能で，かつ第一の波長と異なる光によってマイクロアレイを露光して、各繊維断片に固定化された生体関連物質にハイブリッドした蛍光標識検体を検出する。このとき、位置情報により区画の位置（座標）を特定し、その位置のハイブリッド量を検出することができる。また、マイクロアレイ上の蛍光強度の強度分布を予め検出し、前述の位置情報を用いて、各繊維断片の位置のハイブリッド量を定量化することができる。前記方法は、標識体の蛍光強度が低い場合にその蛍光強度を正確に検出する場合に特に有効であり、またマイクロアレイの配列精度が低い場合にも有効である。
【００２６】
また、本発明のマイクロアレイを用いたハイブリッドの検出工程において、検体が蛍光標識されている場合には、ゲルに固定化した色素を励起可能な第一の波長の光によってマイクロアレイを露光して、各繊維により区分された区画に保持されるゲルに固定化した色素から放射される蛍光を検出することにより、マイクロアレイ上での励起光の強度分布や検出装置に起因する蛍光の検出効率の分布の情報、励起光強度の時間変化等の情報を得ることができる。
前記情報を得た後、検体を標識した蛍光色素を励起可能な第２の波長によりマイクロアレイを露光し、各区画に固定化した生体関連物質にハイブリッドした検体の蛍光を検出する。前記情報を基に補正を行うことにより、正確に蛍光検出を実施することができる。
例えば、励起光源にキセノンランプ等を用いた場合には、マイクロアレイ前面に励起光を照射した場合には励起光強度の分布が生じる。したがって、第１の波長で励起したときの、ある繊維断片の位置の蛍光強度をＳ１（Ｘ１、Ｙ１）、第２の波長で励起したときの、同じ位置の蛍光強度をＳ２（Ｘ１、Ｙ１）、とするとＳ１とＳ２の比を取ることにより蛍光強度の分布斑を補正した補正されたハイブリッドの蛍光強度を得ることができる。また、同様に、励起光の時間変化についても補正することができる。
【００２７】
本発明のマイクロアレイは、生体関連物質及び色素が固定化されたゲルが保持された繊維の束を含む繊維配列体を繊維軸と交叉する方向に切断して得られる。
特に繊維が中空繊維の場合、繊維の中空部にゲルを保持させることにより、捕捉プローブを多く保持させることができるので好ましい。しかし、繊維束を切断して薄片を得る場合に、繊維やゲルが脱落する危険性がある。したがって、マイクロアレイが完全なものかを検査することが必要となる。その場合、ゲルが色素で染色されていれば、その色素を励起させる波長の光を薄片に照射して、色素から放射される蛍光を検出することによりゲルの形状、即ちゲルの脱落や欠落等を容易に調べることができる。
本発明におけるハイブリッド形成について、前記説明では核酸を例にその塩基対の相補的結合で説明した。しかし、生体関連物質が核酸以外の物質、例えば抗原−抗体反応を示す蛋白質である場合、抗体を捕捉プローブとするマイクロアレイは、その抗原と特異的に結合する。このような結合も本発明のハイブリッド形成を意味し、水素結合以外の疎水結合や錯体形成、静電的相互作用による結合等を本発明ではハイブリッドとして定義する。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２９】
参考例１
（ａ）メタクリレート基を有するオリゴヌクレオチド捕捉プローブの調製以下に示したオリゴヌクレオチド（捕捉プローブＡ、捕捉プローブＢ）を合成した。
捕捉プローブＡ:GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配列番号１）
捕捉プローブＢ:GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列番号２）
オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシステムズ社の自動合成機DNA/RNA synthesizer (model394)を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノリンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社）を用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの５′末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入しアミノ化した捕捉プローブを調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
得られた捕捉プローブＡ又はＢ（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５μｌ及びグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）０．５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させ、メタクリレート基を有するオリゴヌクレオチド捕捉プローブを調整し、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有する捕捉プローブ（ＧＭＡ変性捕捉プローブＡ及びＧＭＡ変性捕捉プローブＢ）の溶液を得た。
【００３０】
ｂ）試料核酸のモデルの調製
試料核酸のモデルとして、(a)で合成したオリゴヌクレオチド（捕捉プローブＡ、
捕捉プローブＢ）の配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。
オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTCG（配列番号３）
オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC（配列番号４）
オリゴヌクレオチドの合成は（ａ）と同様に行い、オリゴヌクレオチドＣの５′末端にＣｙ３をオリゴヌクレオチドＤの５′末端にＣｙ５を導入した蛍光標識試料核酸のモデルを調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
【００３１】
（ｃ）繊維配列体の調製
ポリエチレン製多孔質中空糸膜MHF200TL(三菱レイヨン株式会社製，外径290μm，内径200μm)５本を、テフロン板上に互いに重なることなく密着させて配列し両端を固定した。これにポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)コロネート4403,ニッポラン4223)を薄く塗布し、中空繊維を接着した。ポリウレタン樹脂が十分に固まった後これをテフロン板上から剥がし、多孔質中空繊維が一列に配列したシート状物を得た。これらのシート状物を５枚積層し、上記接着剤で接着し、縦横各々５本ずつ、計２５本の中空繊維が正方に規則的に配列した、多孔質中空繊維配列体を得た。
【００３２】
実施例１
（１）蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成
参考例（ａ）と同様にして５′末端にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を導入したＧＣＡＴの配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００３３】
（２）メタクリレート基を有する蛍光色素の調製
（１）で得られた５′末端にＦＩＴＣを有するオリゴヌクレオチド（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５０μｌ及び、グリシジルメタクリレート５μｌ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させて、メタクリレート基を有する蛍光色素を調製し、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有する蛍光色素（ＧＭＡ変性ＦＩＴＣ）の溶液を得た。
【００３４】
（３）生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体の調製
【００３５】
＜モノマー液及び重合開始剤液の調整＞
下記の質量比で混合して、モノマー液及び開始剤液を調製した。
ａ）モノマー液
アクリルアミド ０．７６ 質量部
メチレンビスアクリルアミド ０．０４ 質量部
水 ４．２ 質量部
ｂ） 開始剤液
2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 ０．０１ 質量部
水 ４．９９ 質量部
【００３６】
＜重合液の調製＞
上述のモノマー液ａ）、開始剤液ｂ）及び参考例１（ａ）で調製したＧＭＡ変性捕捉プローブＡ又はＧＭＡ変性捕捉プローブＢ、（２）で調製したＧＭＡ変性ＦＩＴＣを表１に示す体積比で混合して重合液１〜３を調製した。得られた重合液を参考例（ｃ）で得られた中空繊維配列体の所定列の中空繊維の中空部に充填し、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間放置することにより重合反応を行った。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（４）スライス及びゲルの充填状態の観察
（３）で得られたの配列体からミクロトームを用いて５００μｍの薄片を切り出した。この薄片を蛍光顕微鏡（ニコン製蛍光顕微鏡Ｅ４００）でＦＩＴＣ用フィルター（励起波長域４６５〜４９５ｎｍ、蛍光波長域５１５〜５５５ｎｍ）を用いて観察したところ、ゲルの充填状態が容易に観察できた。
【００３９】
（５）ハイブリダイゼーション
（４）で得られた薄片をハイブリダイゼーション用バッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、４５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
＜ ハイブリダイゼーション溶液組成＞
5xSSC(0.75mol/l塩化ナトリウム、0.075mol/lクエン酸ナトリウム、Ph7.0)
5%ブロッキング試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)
0.1%Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム
0.02% ＳＤＳ(ラウリル硫酸ナトリウム)
50% ホルムアミド
【００４１】
続いて、参考例（ｂ）で調製した蛍光標識試料核酸のモデルを５０pmol/mlの濃度になるように加え、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定化薄片をあらかじめ保温しておいた50mlの0.1 x SSC、0.1% SDS溶液に移し、振盪しながら４５℃、２０分間の洗浄を３回行った。
【００４２】
（６）検出
（５）で得られたハイブリダイゼーション後のチップをＣＹ３用フィルター（励起波長ピーク域５３５ｎｍ、半値幅５０ｎｍ、蛍光波長ピーク６１０ｎｍ、半値幅７５ｎｍ）で観察したところ、ＧＭＡ変性ＦＩＴＣの蛍光に妨げられることなく、配列体列番号２のみが蛍光を発生する画像が得られた。次に、（４）と同様に蛍光顕微鏡でＦＩＴＣ用フィルターを用いて観察し、ＣＹ３用フィルターで蛍光が観察されない列番号についても、ゲルが全ての中空糸に充填されていることを確認できた。同様にＣＹ５用フィルター（励起波長ピー域６２０ｎｍ、半値幅６０ｎｍ、蛍光波長ピーク７００ｎｍ、半値幅７５ｎｍ）で観察したところ、ＧＭＡ変性ＦＩＴＣの蛍光に妨げられることなく、配列体列番号４のみが蛍光を発生する画像が得られた。以上の結果より、薄片中の捕捉プローブＡを固定化した断面部にのみオリゴヌクレオチドＣが、捕捉プローブＢを固定化した断面部にのみオリゴヌクレオチドＤが、特異的にハイブリダイゼーションしていることが確認でき、なおかつハイブリダイゼーション操作の過程でのゲルの脱落や変形が無かったことが確認できた。
【００４３】
実施例２
実施例１におけるＧＭＡ変性ＦＩＴＣを Polysciences,Inc.社製Fluorescein Dimethacrylateに代えた以外は同様な条件で繊維配列体の薄片を得た。この薄片を蛍光顕微鏡で観察したところ、ゲルの充填状態が容易に観察できた。また実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施し、Fluoresceinの蛍光によりＣＹ３及びＣＹ５の蛍光検出が妨げられないことと、ハイブリダイゼーション操作の過程でのゲルの脱落や変形が無かったことが確認できた。
【００４４】
実施例３
（１）繊維により区分された区画の位置情報の取得と固定化色素の蛍光強度分布の測定
実施例1の（１）〜（５）と同様にハイブリダイゼーション反応を終了した。次に、実施例１に記載の蛍光顕微鏡にＣＣＤカメラを接続し、ＦＩＴＣ用フィルターを用いて蛍光画像を撮影した。撮影した画像は16bitのＴＩＦＦ形式で保存した。得られた画像を、画像処理ソフトを用いて処理し、各繊維断片のマイクロアレイ上の位置を測定した。つづいてそれぞれの各繊維断片上に位置において、固定化された蛍光色素の蛍光強度を数値化した。得られた蛍光強度は、励起光の強度分布や顕微鏡の光学系に起因する蛍光の強度分布等に起因する、分布を含むもので、中心は高く、周辺部は低い値であった。
【００４５】
（２）ハイブリッドの検出
（１）と同様にして，ＣＹ３フィルターを用いて、蛍光強度を測定した。つぎに、（１）で得られた各繊維断片のマイクロアレイ上の位置を用いて、各繊維断片に存在する蛍光標識検体の蛍光強度を数値化した。
【００４６】
（３）ハイブリッドの強度の補正
（１）で得られた各繊維断片ごとの蛍光強度で（２）で得られた蛍光標識検体の蛍光強度を除することにより、補正されたハイブリッドの強度分布を得ることができた。
【００４７】
比較例１
ＧＭＡ変性ＦＩＴＣを用いずに実施例１と同様の方法で薄片を得た。実施例１と同様にハイブリダイゼーションを行い、この薄片を顕微鏡でＣＹ３用フィルターを用いて観察したところ、配列体列番号２のみが蛍光を発生する画像が得られたが、配列体列番号２以外の列のゲルの欠落等充填状態を観察することは困難で、蛍光を発生しない列がハイブリッドを形成していないのか、ゲルが欠落しているのかを容易に判断することができなかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、マイクロアレイ中に存在するゲルの充填状態を容易に確認できる。これにより、マイクロアレイの検品作業の効率が著しく向上する。さらには、ハイブリダイゼーション後にゲルの充填状態を容易に確認できるため、ハイブリッドを形成していないのか、ゲルが欠落しているのかを容易に判断できる。
また、本発明により、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いアレイにおいても、蛍光強度を容易に正確に検出することが可能となる。さらには、蛍光検出装置の照射面積中での励起光の強度斑や光学系の構成に起因する蛍光強度斑を容易に補正することができ、ハイブリッド形成の検出が正確におこなえる。
【００４９】
【配列表】
【００５０】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体関連物質及び色素を含むゲルが保持された繊維配列体薄片からなる生体関連物質マイクロアレイ及びそれを用いた検出方法に関する。該マイクロアレイは、臨床検査、食品検査等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種生物におけるゲノムプロジェクトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各種の方法で調べることができる。その有力な方法の一つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸間ハイブリダイゼーション反応や各種のＰＣＲ反応を利用した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限があるが、今日のゲノムプロジェクトを通して明らかにされつつあるような、一個体レベルという極めて多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発されてきた。
【０００３】
本発明者らは、先に新規なマイクロアレイを開発した（特開2000-270877号、特開2000-270878号、特開2000-270879号公報）。これらの発明は、核酸固定化ゲルを繊維の表面又は空隙部に保持する核酸固定化ゲル保持繊維配列体を作製し、これを配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより薄片を得るものである。この薄片は核酸固定化二次元高密度配列体、すなわちDNAマイクロアレイとして使用される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記繊維配列体薄片は、透明なゲルを利用したマイクロアレイであるので、マイクロアレイの製造工程又は該マイクロアレイを利用した検査時等に、ゲルの脱落、収縮、変形等を生じても、視覚的に検出することは容易ではなかった。
また、捕捉プローブと検体のハイブリッド形成を検出する方法においては、該捕捉プローブが、蛍光標識した検体とハイブリッドを形成した後、蛍光レーザースキャナーや蛍光顕微鏡等の蛍光測定装置により蛍光量を検出するのが一般的手法であるが、蛍光標識強度の低い検体や配列精度の低いマイクロアレイにおいては、繊維により区分された各区画位置に対応する蛍光を正確に認識することが困難であり、蛍光強度を容易且つ正確に検出することは困難であった。さらには、蛍光検出装置の照射面積中での励起光の強度斑や光学系の構成に起因する蛍光強度斑が発生し、ハイブリッド形成の検出が正確に実施できない問題があった。
【０００５】
本発明は、製造工程でのゲルの脱落等を容易に検出でき、ハイブリダイゼーション操作での泡の付着やゲルの変形、脱落等を容易に検出できる視認性の改良された生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体薄片を提供することを課題とする。同時に、繊維により区分された各区画位置に対応する蛍光を正確に認識することができ、蛍光強度を容易且つ正確に検出することのできる生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体薄片を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、繊維により区分された各区画に配置されるゲルに、予め色素、例えば、蛍光色素を固定化することにより、製造時及びハイブリダイゼーション時におけるゲルの充填、変形、脱落状態等を、蛍光顕微鏡を用いて容易に検出できることを見出し本発明に至った。
また、マイクロアレイに固定化された生体関連物質と検体のハイブリッド形成を検出する検出方法においては、繊維によって区分された各区画位置（座標）を正確に認識することができ、且つ各区画位置（座標）に対応する蛍光強度を正確に検出することができることを見出した。
さらには、マイクロアレイに固定化された生体関連物質と検体のハイブリッド形成を検出する検出方法において、蛍光検出装置、例えば光源に起因する蛍光強度斑を容易に検出、補正することができるため、ハイブリッド形成の検出が定量的に行えることを見出し、本発明に至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、〔１〕生体関連物質及び色素を含むゲルが保持された繊維の複数を収束してなる繊維配列体を、繊維軸と交差する方向に切断することにより得られる生体関連物質マイクロアレイである。生体関連物質としては、核酸、固定化される色素としては、350 nm〜500 nmの蛍光波長を有するものが例示される。そのような蛍光色素として、フルオレセイン誘導体又はクマリン誘導体が例示できる。また、ゲルとしては、水溶性モノマーからなるものが挙げられる。そのようなモノマーの例として、アクリルアミドモノマーが例示できる。繊維としては、中空繊維、多孔質繊維又は多孔質中空繊維が挙げられる。
さらに、本発明は、〔２〕以下の工程を含む前記生体関連物質マイクロアレイの各区画に保持された捕捉プローブと検体のハイブリッド生成を検出する方法。
（１）予めゲルに固定化した色素が励起可能な波長の光を、マイクロアレイに露光して、前記色素から放射される蛍光を検出する。
（２）マイクロアレイを構成する繊維により区分された各区画の位置情報を取得する。
（３）得られた位置情報を用いて、捕捉プローブと検体ハイブリッドの検出を行う。
〔３〕以下の工程を含む、前記生体関連物質マイクロアレイの各区画に保持された捕捉プローブと蛍光標識検体のハイブリッド生成を検出する方法。
（１）予めゲルに固定化した色素が励起可能な第１の波長の光を、マイクロアレイに露光して前記色素から放射される蛍光を検出する。
（２）第１の工程の蛍光の強度及び/又は強度分布の情報を取得する。
（３）捕捉プローブと蛍光標識検体とのハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光標識検体が励起可能な第２の波長の光により、ハイブリッド生成を検出する。
（４）得られた蛍光強度を、第２の工程で得られた蛍光の強度及び/又は強度分布の情報によって補正する。
〔４〕 前記生体関連物質マイクロアレイの検品方法において、ゲルに固定化した色素が励起可能な波長の光を、マイクロアレイに露光して、放射される蛍光を検出することにより、マイクロアレイの各区画のゲルの形状を評価することを特徴とする生体関連物質マイクロアレイの検品方法、である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ゲルに固定化する対象となる生体関連物質としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）等の核酸、蛋白質、多糖類等が挙げられる。これらは、市販品又は生細胞等から得られたもの何れでもよい。
例えば、生体関連物質として核酸を用いる場合には、生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法により実施することができる。例えば、ＤＮＡの抽出については、Blinらの方法(Nucleic Acids Res.3.2303(1976))等により、また、ＲＮＡの抽出については、Favaloroらの方法(Methods.Enzymol.65.718(1980))等が例示できる。
更には、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡを使用することもできる。前記ＤＮＡは、制限酵素若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【０００９】
本発明に用いることができるゲルは、特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等から選択された少なくとも一種類以上の単量体と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。
その他、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル又はこれらを架橋したゲルを用いることができる。
【００１０】
本発明では、生体関連物質をそのままゲルに固定化してもよく、また、生体関連物質に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた生体関連物質を固定化してもよい。生体関連物質のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方法や、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよく、生体関連物質を一旦高分子体や無機粒子等の担体に共有結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲルに固定化してもよい。
【００１１】
例えば、生体関連物質として核酸をゲル構成成分へ直接的に結合させるには、核酸の末端基にビニル基を導入し（WO98/39351号公報参照）、アクリルアミド等のゲルの構成成分と共重合させることにより行うことができる。
核酸の末端基へのビニル基の導入をグリシジル基を介して行う場合、予め核酸を修飾しておく必要があるが、修飾に際しては、グリシジル基と反応するものであれば特に制限を受けない。例えば、アミノ基が導入されたものを用いることができる。
【００１２】
アミノ基の導入法に関して、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、アミノ基と一本鎖のＤＮＡの結合部位は、ＤＮＡの５’末端、３’末端、鎖中、リン酸ジエステル部位又は塩基部位が考えられるが、ＤＮＡの５’末端又は３’末端で結合することが好ましい。該一本鎖ＤＮＡ誘導体は、特公平3-74239号、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等各公報記載の方法に従い調製することができる。
前記方法の他に、例えば、市販のアミノ基導入用試薬、例えば、アミノリンクＩＩ（ＰＥバイオシステムズジャパン社製）、Amino Modifiers（クロンテック社製）等を用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸に、アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の方法(Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983))に従い調製することができる。
【００１３】
本発明に用いることができる色素は、主に天然色素、合成染料に分類される。
天然色素の代表例としてはフラボン誘導体、カルコン誘導体、アントラキノン誘導体、インジゴ誘導体等が挙げられる。合成染料の代表例としてはアゾ染料、アントラキノン染料、インジゴイド染料、ジフェニルメタン染料、トリフェニル染料、キサンテン染料、アクリジン染料等が挙げられる。特に、上記の染料色素には蛍光を有する色素も存在する。
本発明に用いることができる蛍光色素の種類は蛍光を発する色素であれば特に限定されるものではないが、例えば、ローダミン、Texas Red、Fluorescein 、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Oregon Green、Pacific Blue、R-Phycoerythrin、Rhodol Green、Coumarin誘導体、Amino Methyl Coumarin等が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられる色素の固定化方法は、色素をそのままゲルに固定化する方法又は色素に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変性させた色素を固定化する方法が例示できる。色素のゲルへの固定化には、ゲルに物理的に包括する方法やゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよい。また、色素を一旦、高分子粒子や無機粒子等の担体に共有結合あるいは非共有結合により結合させ、その担体をゲルに固定化しても良い。
【００１５】
色素をゲル構成成分へ直接的に結合させるには、例えば、Polyscience社製の Fluorecein Dimethacrylateや 1-Pyrenylmethyl Methacrylate等を用いアクリルアミド等のゲル構成成分と共重合させる方法、アミノ基を有する色素誘導体をグリシジルメタクリレート(GMA)と反応させることによって重合性ビニル基を導入しておき、アクリルアミド等のゲル構成成分と共重合させる方法、また、ゲルにアニオン性モノマーを導入し、カチオン性色素をイオン結合させる方法等を挙げることができる。
【００１６】
本発明によれば、蛍光標識を用いた検体をハイブリダイゼーションに供し、ハイブリットの検出を行う際に、予め特定の波長の蛍光色素をゲルに固定化することにより、ゲルの視認性を付与された高度な透明性を有するゲルを含む生体関連物質マイクロアレイを提供することができる。
前記検体の蛍光標識は、マイクロアレイを構成する部材（本発明では、捕捉プローブである生体関連物質を固定する支持体、即ちゲル、繊維、接着剤等をいう）の自家蛍光の影響を受けにくい500 nm以上の長波長の蛍光を用いることが好ましいため、予めゲルに固定化する蛍光色素の蛍光波長は、可視光の範囲で350 nm〜500 nmの短波長であることが好ましい。
予めゲルに固定化する蛍光色素の好ましい例としては、Fluorescein 、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)等のフルオレセイン誘導体、Amino Methyl Coumarin等クマリン誘導体が好ましい。
本発明において、固定化量される色素の量は特に限定されるものではなく、任意に調整することができる。通常、マイクロアレイの各区画を構成する各繊維断片ごとに、100fmol〜10atmolである。固定化する色素の量は、固定化する生体関連物質の量とは無関係に決定され、生体関連物質と等量又は比例する量である必要はないが、アレイに含まれる全ての繊維断片において、等しい量であることが好ましい。特に、検出装置の光学系に基づく光強度分布を補正する目的においては各繊維断片に等量の色素が含まれていることが必要である。
【００１７】
本発明に用いることができる繊維としては合成繊維、半合成繊維、再生繊維、無機繊維のごとき化学繊維、及び天然繊維等が挙げられる。
合成繊維の代表例としては、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系の各種繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等のポリエステル系の各種繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系の各種繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系の各種繊維、ポリビニルアルコール系の各種繊維繊維、ポリ塩化ビニリデン系の各種繊維、ポリ塩化ビニル系繊維、ポリウレタン系の各種繊維、フェノール系繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系の各種繊維等が挙げられる。また、衣料用以外の、例えば、ポリメチルメタクリレートやポリスチレン等の透明非晶質高分子を主材料とした光学繊維等も用いることができる。半合成繊維の代表例としては、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、キチン、キトサン等を原料としたセルロース系誘導体各種繊維、プロミックスと呼称される蛋白質系の各種繊維等が挙げられる。
再生繊維の代表例としては、ビスコース法や銅−アンモニア法、或いは有機溶剤法によるセルロース系の各種再生繊維（レーヨン、キュプラ、ポリノジック等）等が挙げられる。
無機繊維の代表例としては、ガラス繊維、炭素繊維等が挙げられる。
天然繊維の代表例としては、綿、亜麻、苧麻、黄麻等の植物繊維、羊毛、絹等の動物繊維、石綿等の鉱物繊維等が挙げられる。
【００１８】
本発明に用いる繊維の構造は、特にその形態が規定されるものではなく、またモノフィラメントであってもよく、マルチフィラメントであってもよい。さらに、短繊維を紡績した紡績糸でもよい。尚、マルチフィラメントや紡績糸の繊維を用いる場合には、生体関連物質固定化ゲルの保持に単繊維間の空隙等を利用することも可能である。
また本発明に用いる繊維は、多孔質な構造を有するものでも良い。断面形状も円形断面のみならず、扁平断面や中空断面等の異形断面でもよい。特にゲルを均一に固定化する観点から、中空であることが好ましい。
【００１９】
繊維にゲルを保持させるには、ゲル構成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量体、重合開始剤、色素及び生体関連物質成分を含む液に繊維を浸し重合、ゲル化させればよい。この際、色素及び／又は生体関連物質は、前記したように、例えばゲル構成成分であるアクリルアミド等の単量体や高分子粒子、無機粒子等の担体に結合させておくことが好ましい。
ゲル化は多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用いて行ってもよい。
その他、生体関連物質を固定化したアガロース等を加熱溶解し、繊維を浸し、冷却ゲル化させる方法等が挙げられる。
【００２０】
また、繊維が中空繊維及び多孔質中空繊維の場合、上述の各成分を含む液に繊維を浸漬する代わりに、該液をこれら繊維の中空部及び／又は多孔質部に注入又は吸引することにより充填した後、ゲル化させてもよい。
中空繊維、多孔質中空繊維の中空部及び／又は多孔質部にゲルを保持させる手順は、後述する繊維配列体となす前でもよいし、後でもよい。
【００２１】
前記の通り調整された生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維は、収束した後に密着して、生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維配列体となすことができる。この際、該繊維を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に該繊維が整然と規則的に配列した該繊維配列体を得ることができる。
【００２２】
本発明の薄片は、上記の生体関連物質及び色素固定化ゲル保持繊維配列体を繊維軸と交差する方向、好ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することにより得ることができる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられる。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,０００μｍである。
このようにして得られた薄片は、例えば、蛍光顕微鏡で観察することにより、ゲルの変形、脱落等の形状を容易に観察することができる。
【００２３】
これら薄片は、ゲルに固定化された生体関連物質を捕捉プローブとして、検体と反応させてハイブリッドを形成させることにより、検体中の特定の生体関連物質の検出に用いることができる。
ここで言う捕捉プローブとは、広義には検体中に存在する蛋白質や低分子化合物等の検体試料側生体関連物質と特異的に結合することができるゲルに固定化した生体関連物質を指す。ゲルに固定化した生体関連物質が核酸である場合には、該薄片を検体と反応させてハイブリダイゼーションを行い、捕捉プローブと相補的な検体中に存在する核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブリッドを検出することにより、目的とする塩基配列を有する検体中の核酸を検出することができる。
【００２４】
ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、検体中の生体関連物質に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープ等の標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
【００２５】
ハイブリッドの検出工程においては、まず、ゲルに固定化した色素を励起可能な第一の波長の光によってマイクロアレイを露光して、各繊維により区分された区画に保持されるゲルに固定化された色素から放射される蛍光を検出し、前記区画の位置情報（座標）を得ることができる。得られた位置情報により、各繊維により区分された区画は、例えばアレイのＸＹ平面上のＸＹ座標で表される。得られた位置情報を用いてハイブリッドの検出を、各繊維により区分された区画の位置ごとに検出することができる。
例えば、標識体が蛍光色素の場合には、該蛍光色素を励起可能で，かつ第一の波長と異なる光によってマイクロアレイを露光して、各繊維断片に固定化された生体関連物質にハイブリッドした蛍光標識検体を検出する。このとき、位置情報により区画の位置（座標）を特定し、その位置のハイブリッド量を検出することができる。また、マイクロアレイ上の蛍光強度の強度分布を予め検出し、前述の位置情報を用いて、各繊維断片の位置のハイブリッド量を定量化することができる。前記方法は、標識体の蛍光強度が低い場合にその蛍光強度を正確に検出する場合に特に有効であり、またマイクロアレイの配列精度が低い場合にも有効である。
【００２６】
また、本発明のマイクロアレイを用いたハイブリッドの検出工程において、検体が蛍光標識されている場合には、ゲルに固定化した色素を励起可能な第一の波長の光によってマイクロアレイを露光して、各繊維により区分された区画に保持されるゲルに固定化した色素から放射される蛍光を検出することにより、マイクロアレイ上での励起光の強度分布や検出装置に起因する蛍光の検出効率の分布の情報、励起光強度の時間変化等の情報を得ることができる。
前記情報を得た後、検体を標識した蛍光色素を励起可能な第２の波長によりマイクロアレイを露光し、各区画に固定化した生体関連物質にハイブリッドした検体の蛍光を検出する。前記情報を基に補正を行うことにより、正確に蛍光検出を実施することができる。
例えば、励起光源にキセノンランプ等を用いた場合には、マイクロアレイ前面に励起光を照射した場合には励起光強度の分布が生じる。したがって、第１の波長で励起したときの、ある繊維断片の位置の蛍光強度をＳ１（Ｘ１、Ｙ１）、第２の波長で励起したときの、同じ位置の蛍光強度をＳ２（Ｘ１、Ｙ１）、とするとＳ１とＳ２の比を取ることにより蛍光強度の分布斑を補正した補正されたハイブリッドの蛍光強度を得ることができる。また、同様に、励起光の時間変化についても補正することができる。
【００２７】
本発明のマイクロアレイは、生体関連物質及び色素が固定化されたゲルが保持された繊維の束を含む繊維配列体を繊維軸と交叉する方向に切断して得られる。
特に繊維が中空繊維の場合、繊維の中空部にゲルを保持させることにより、捕捉プローブを多く保持させることができるので好ましい。しかし、繊維束を切断して薄片を得る場合に、繊維やゲルが脱落する危険性がある。したがって、マイクロアレイが完全なものかを検査することが必要となる。その場合、ゲルが色素で染色されていれば、その色素を励起させる波長の光を薄片に照射して、色素から放射される蛍光を検出することによりゲルの形状、即ちゲルの脱落や欠落等を容易に調べることができる。
本発明におけるハイブリッド形成について、前記説明では核酸を例にその塩基対の相補的結合で説明した。しかし、生体関連物質が核酸以外の物質、例えば抗原−抗体反応を示す蛋白質である場合、抗体を捕捉プローブとするマイクロアレイは、その抗原と特異的に結合する。このような結合も本発明のハイブリッド形成を意味し、水素結合以外の疎水結合や錯体形成、静電的相互作用による結合等を本発明ではハイブリッドとして定義する。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２９】
参考例１
（ａ）メタクリレート基を有するオリゴヌクレオチド捕捉プローブの調製以下に示したオリゴヌクレオチド（捕捉プローブＡ、捕捉プローブＢ）を合成した。
捕捉プローブＡ:GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTC（配列番号１）
捕捉プローブＢ:GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配列番号２）
オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシステムズ社の自動合成機DNA/RNA synthesizer (model394)を用いて行い、ＤＮＡ合成の最終ステップで、アミノリンクII（商標名）（アプライドバイオシステム社）を用いてそれぞれのオリゴヌクレオチドの５′末端にＮＨ２（ＣＨ２）６−を導入しアミノ化した捕捉プローブを調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
得られた捕捉プローブＡ又はＢ（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５μｌ及びグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）０．５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させ、メタクリレート基を有するオリゴヌクレオチド捕捉プローブを調整し、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有する捕捉プローブ（ＧＭＡ変性捕捉プローブＡ及びＧＭＡ変性捕捉プローブＢ）の溶液を得た。
【００３０】
ｂ）試料核酸のモデルの調製
試料核酸のモデルとして、(a)で合成したオリゴヌクレオチド（捕捉プローブＡ、
捕捉プローブＢ）の配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。
オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTCG（配列番号３）
オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC（配列番号４）
オリゴヌクレオチドの合成は（ａ）と同様に行い、オリゴヌクレオチドＣの５′末端にＣｙ３をオリゴヌクレオチドＤの５′末端にＣｙ５を導入した蛍光標識試料核酸のモデルを調製した。これらは、一般的手法により脱保護及び精製して使用した。
【００３１】
（ｃ）繊維配列体の調製
ポリエチレン製多孔質中空糸膜MHF200TL(三菱レイヨン株式会社製，外径290μm，内径200μm)５本を、テフロン板上に互いに重なることなく密着させて配列し両端を固定した。これにポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)コロネート4403,ニッポラン4223)を薄く塗布し、中空繊維を接着した。ポリウレタン樹脂が十分に固まった後これをテフロン板上から剥がし、多孔質中空繊維が一列に配列したシート状物を得た。これらのシート状物を５枚積層し、上記接着剤で接着し、縦横各々５本ずつ、計２５本の中空繊維が正方に規則的に配列した、多孔質中空繊維配列体を得た。
【００３２】
実施例１
（１）蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成
参考例（ａ）と同様にして５′末端にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を導入したＧＣＡＴの配列のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００３３】
（２）メタクリレート基を有する蛍光色素の調製
（１）で得られた５′末端にＦＩＴＣを有するオリゴヌクレオチド（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５０μｌ及び、グリシジルメタクリレート５μｌ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５μｌを混合し、７０℃で２時間反応させて、メタクリレート基を有する蛍光色素を調製し、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有する蛍光色素（ＧＭＡ変性ＦＩＴＣ）の溶液を得た。
【００３４】
（３）生体関連物質固定化ゲル保持繊維配列体の調製
【００３５】
＜モノマー液及び重合開始剤液の調整＞
下記の質量比で混合して、モノマー液及び開始剤液を調製した。
ａ）モノマー液
アクリルアミド ０．７６ 質量部
メチレンビスアクリルアミド ０．０４ 質量部
水 ４．２ 質量部
ｂ） 開始剤液
2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩 ０．０１ 質量部
水 ４．９９ 質量部
【００３６】
＜重合液の調製＞
上述のモノマー液ａ）、開始剤液ｂ）及び参考例１（ａ）で調製したＧＭＡ変性捕捉プローブＡ又はＧＭＡ変性捕捉プローブＢ、（２）で調製したＧＭＡ変性ＦＩＴＣを表１に示す体積比で混合して重合液１〜３を調製した。得られた重合液を参考例（ｃ）で得られた中空繊維配列体の所定列の中空繊維の中空部に充填し、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間放置することにより重合反応を行った。
【００３７】
【表１】
（４）スライス及びゲルの充填状態の観察
（３）で得られたの配列体からミクロトームを用いて５００μｍの薄片を切り出した。この薄片を蛍光顕微鏡（ニコン製蛍光顕微鏡Ｅ４００）でＦＩＴＣ用フィルター（励起波長域４６５〜４９５ｎｍ、蛍光波長域５１５〜５５５ｎｍ）を用いて観察したところ、ゲルの充填状態が容易に観察できた。
【００３９】
（５）ハイブリダイゼーション
（４）で得られた薄片をハイブリダイゼーション用バッグに入れ、以下の組成からなるハイブリダイゼーション溶液を注ぎ込み、４５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
＜ ハイブリダイゼーション溶液組成＞
5xSSC(0.75mol/l塩化ナトリウム、0.075mol/lクエン酸ナトリウム、Ph7.0)
5%ブロッキング試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)
0.1%Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム
0.02% ＳＤＳ(ラウリル硫酸ナトリウム)
50% ホルムアミド
【００４１】
続いて、参考例（ｂ）で調製した蛍光標識試料核酸のモデルを５０pmol/mlの濃度になるように加え、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、核酸固定化薄片をあらかじめ保温しておいた50mlの0.1 x SSC、0.1% SDS溶液に移し、振盪しながら４５℃、２０分間の洗浄を３回行った。
【００４２】
（６）検出
（５）で得られたハイブリダイゼーション後のチップをＣＹ３用フィルター（励起波長ピーク域５３５ｎｍ、半値幅５０ｎｍ、蛍光波長ピーク６１０ｎｍ、半値幅７５ｎｍ）で観察したところ、ＧＭＡ変性ＦＩＴＣの蛍光に妨げられることなく、配列体列番号２のみが蛍光を発生する画像が得られた。次に、（４）と同様に蛍光顕微鏡でＦＩＴＣ用フィルターを用いて観察し、ＣＹ３用フィルターで蛍光が観察されない列番号についても、ゲルが全ての中空糸に充填されていることを確認できた。同様にＣＹ５用フィルター（励起波長ピー域６２０ｎｍ、半値幅６０ｎｍ、蛍光波長ピーク７００ｎｍ、半値幅７５ｎｍ）で観察したところ、ＧＭＡ変性ＦＩＴＣの蛍光に妨げられることなく、配列体列番号４のみが蛍光を発生する画像が得られた。以上の結果より、薄片中の捕捉プローブＡを固定化した断面部にのみオリゴヌクレオチドＣが、捕捉プローブＢを固定化した断面部にのみオリゴヌクレオチドＤが、特異的にハイブリダイゼーションしていることが確認でき、なおかつハイブリダイゼーション操作の過程でのゲルの脱落や変形が無かったことが確認できた。
【００４３】
実施例２
実施例１におけるＧＭＡ変性ＦＩＴＣを Polysciences,Inc.社製Fluorescein Dimethacrylateに代えた以外は同様な条件で繊維配列体の薄片を得た。この薄片を蛍光顕微鏡で観察したところ、ゲルの充填状態が容易に観察できた。また実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施し、Fluoresceinの蛍光によりＣＹ３及びＣＹ５の蛍光検出が妨げられないことと、ハイブリダイゼーション操作の過程でのゲルの脱落や変形が無かったことが確認できた。
【００４４】
実施例３
（１）繊維により区分された区画の位置情報の取得と固定化色素の蛍光強度分布の測定
実施例1の（１）〜（５）と同様にハイブリダイゼーション反応を終了した。次に、実施例１に記載の蛍光顕微鏡にＣＣＤカメラを接続し、ＦＩＴＣ用フィルターを用いて蛍光画像を撮影した。撮影した画像は16bitのＴＩＦＦ形式で保存した。得られた画像を、画像処理ソフトを用いて処理し、各繊維断片のマイクロアレイ上の位置を測定した。つづいてそれぞれの各繊維断片上に位置において、固定化された蛍光色素の蛍光強度を数値化した。得られた蛍光強度は、励起光の強度分布や顕微鏡の光学系に起因する蛍光の強度分布等に起因する、分布を含むもので、中心は高く、周辺部は低い値であった。
【００４５】
（２）ハイブリッドの検出
（１）と同様にして，ＣＹ３フィルターを用いて、蛍光強度を測定した。つぎに、（１）で得られた各繊維断片のマイクロアレイ上の位置を用いて、各繊維断片に存在する蛍光標識検体の蛍光強度を数値化した。
【００４６】
（３）ハイブリッドの強度の補正
（１）で得られた各繊維断片ごとの蛍光強度で（２）で得られた蛍光標識検体の蛍光強度を除することにより、補正されたハイブリッドの強度分布を得ることができた。
【００４７】
比較例１
ＧＭＡ変性ＦＩＴＣを用いずに実施例１と同様の方法で薄片を得た。実施例１と同様にハイブリダイゼーションを行い、この薄片を顕微鏡でＣＹ３用フィルターを用いて観察したところ、配列体列番号２のみが蛍光を発生する画像が得られたが、配列体列番号２以外の列のゲルの欠落等充填状態を観察することは困難で、蛍光を発生しない列がハイブリッドを形成していないのか、ゲルが欠落しているのかを容易に判断することができなかった。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、マイクロアレイ中に存在するゲルの充填状態を容易に確認できる。これにより、マイクロアレイの検品作業の効率が著しく向上する。さらには、ハイブリダイゼーション後にゲルの充填状態を容易に確認できるため、ハイブリッドを形成していないのか、ゲルが欠落しているのかを容易に判断できる。
また、本発明により、蛍光強度の低い検体や配列精度の低いアレイにおいても、蛍光強度を容易に正確に検出することが可能となる。さらには、蛍光検出装置の照射面積中での励起光の強度斑や光学系の構成に起因する蛍光強度斑を容易に補正することができ、ハイブリッド形成の検出が正確におこなえる。
【００４９】
【配列表】
【配列表のフリーテキスト】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
Claims (5)
- 複数の貫通孔が規則的に配列された薄片であって、それら貫通孔には、ゲルが保持されており、該ゲルには生体関連物質及び色素が保持されている、生体関連物質固定化薄片。
- 色素が、350nm〜500nmの蛍光波長を有する、請求項１記載の薄片。
- 貫通孔が中空繊維から構成されたものである、請求項１又は２記載の薄片。
- ゲルに保持された色素が励起可能な第１の波長光を、請求項１〜３のいずれかに記載の薄片に照射し、その色素に起因する蛍光画像を取得し、得られた蛍光画像を用いて、各ゲルを評価することを含む、生体関連物質固定化薄片の検品方法。
- 以下の工程を含む、検体の検出方法。
（１） ゲルに保持された色素が励起可能な第１の波長光を請求項１〜３のいずれかに記載の薄片に照射し、各貫通孔に保持されている色素に起因する蛍光強度値及び蛍光画像を取得する工程。
（２） 前記蛍光画像から薄片の貫通孔の位置情報を取得する工程。
（３） 色素標識した検体を薄片に供し、その検体と薄片の貫通孔に保持されている生体関連物質とを反応させる工程。
（４） 検体を標識した色素が励起可能な第２の波長光を薄片に照射し、薄片の各貫通孔毎に捕捉された検体の色素に起因する蛍光強度値を取得する工程。
（５） 各蛍光強度値を、各貫通孔に対応する第１の工程で得られた蛍光強度値で補正する工程。
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