JP4627455B2 - Ｄｎａマイクロアレイ処理装置 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション・洗浄処理装置に関する。

多数遺伝子の一括発現解析を行う方法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法がある。この方法は、マイクロアレイと呼ばれるスライドガラスやシリコン等の平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものを用い、個々の固定化されたＤＮＡ断片において、核酸：核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出及び定量を行う方法である。

マイクロアレイ法の使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを含有した検体溶液をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーションを行い、互いに相補的な核酸同士を結合させ、ハイブリットを形成した区画を高解像度解析装置で高速に読みとることにより、核酸検出及び定量を行う方法が挙げられる。

マイクロアレイは上述の平面基盤片のもの以外に、例えば、検査対象となる物質の探査針として機能するプローブが固定化された高分子ゲルが、表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイが知られている。その一例として、孔部が中空繊維により形成されているＤＮＡマイクロアレイ（繊維型ＤＮＡマイクロアレイ）が知られている（特許文献１）。

特許文献１には、以下の（１）〜（４）の工程を順次行うこと含む繊維型ＤＮＡマイクロアレイの製造を開示している。

（１） 複数本の中空糸を準備し、それら中空糸を束状とする。

（２） その束を樹脂等で固定した中空糸配列体を作成する。

（３） その配列体の片端部から、キャプチャープローブを含むアクリルアミド等の重合性モノマー溶液を各中空糸の中空部に導入し、中空部内で重合反応を実施する。

（４） 中空糸配列体の樹脂固定化部を中空糸の長手方向と交差する方向で切断を繰り返す。

繊維型ＤＮＡマイクロアレイは、マイクロアレイ表面にキャプチャープローブが固定化された高分子ゲルが露出している。よってハイブリダイゼーション、洗浄処理、分析処理において、表面に露出した繊細なゲル部を損傷しないように十分注意して取り扱う必要がある。そのため例えば図２に示すようなホルダを使用することによりマイクロアレイを保護することが好ましい。

一方、DNAマイクロアレイのハイブリダイゼーション、洗浄処理に関して、スライドガラス基板片上に、多数のＤＮＡ断片を高密度に整列固定化したマイクロアレイ（以下、ガラス製ＤＮＡマイクロアレイと称する）については、例えば特許文献２に開示されている容器を用いてそれら作業が実施可能である。

大量のマイクロアレイを処理する場合は、操作が簡便で、且つ効率よく処理することが重要である。よってガラス製ＤＮＡマイクロアレイは、特許文献３に開示されている装置を用いて実施可能である。

しかしながら、繊維型ＤＮＡマイクロアレイにおいて、操作が簡便で、且つ効率よく処理可能な装置が開示されていない。また、上記特許文献３に開示されている装置は、ガラス製ＤＮＡマイクロアレイを水平の状態で処理しているため装置占有面積当たりのマイクロアレイ同時処理可能数が少ない。よって、効率のよく処理可能な装置とは言い難い。すなわち、複数枚のマイクロアレイを処理するために、装置占有面積当たりの同時処理可能数が多い、ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション・洗浄処理装置の開発が望まれていた。
特開2001-133453号公報 特開2003-125751号公報 特開2003-57257号公報

従って、本発明の目的は、表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイを用いて、大量の分析を実施する際に、操作が簡便で、且つ効率よくハイブリダイゼーション・洗浄処理が可能な装置を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション／洗浄処理が可能な以下の装置を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション及び洗浄処理を行う装置であって、
複数枚の前記ＤＮＡマイクロアレイの各々が収容される複数の区画をするハイブリダイゼーション・洗浄用プレートと、
前記区画に保持された液体を設定温度に保持可能な温度調整機構と、
前記洗浄液を注入するための洗浄液注入用ノズルと、
前記洗浄液を排出するための洗浄液吸引用ノズルと、
前記洗浄液注入用ノズルへ洗浄液を送液するための送液ポンプと、
前記洗浄液注入ノズルへ送液される洗浄液の種類を少なくとも1種類以上切り替えることが可能な切り替えバルブと、
前記洗浄液吸引ノズルから洗浄液を吸引移液するための吸引ポンプと、
洗浄液、洗浄廃液を溜めておくための液ボトルと、
前記洗浄液注入用ノズルと洗浄液吸引用ノズルが固定されたノズルブロックを、前記ハイブリダイゼーション／洗浄用プレートに対して水平および垂直方向に移動させる移動機構と、
を含むＤＮＡマイクロアレイ処理装置。

また、ＤＮＡマイクロアレイ処理装置は、洗浄液注入用ノズルから区画内に注入される洗浄液を、所定の温度に加熱／冷却し供給可能な機構を有することを特徴とする。洗浄液をあらかじめ所定の温度、例えばハイブリダイゼーション／洗浄用プレートが保たれている温度と同じ温度に加熱／冷却しＤＮＡマイクロアレイが挿入収納された区画に注入することにより、精密で効率の良いＤＮＡマイクロアレイの洗浄が行える。

さらに、ＤＮＡマイクロアレイ処理装置は、洗浄液の加熱／冷却機構が、洗浄液注入用ノズルが装着されたノズルブロックに組み込まれていることを特徴とする。このような構造とすることにより、洗浄液はＤＮＡマイクロアレイが挿入収納された区画に注入される直前で所定の温度に調節されるため、送液過程での液温変化等を生じにくく、更に精密に洗浄液の温度を管理することが可能となる。

本発明により、操作が簡便で、且つ効率よく、複数枚のＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション／洗浄処理が可能な、ＤＮＡマイクロアレイ処理装置が提供される。

以下、図面を使用して本発明を詳細に説明する。

図１は、表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイ本体（１０）の模式図である。ＤＮＡマイクロアレイ本体（１０）の詳細な製造方法の一例は、特許文献１に記載されている。

ＤＮＡマイクロアレイ本体（１０）は、表面にプローブが固定化された高分子ゲルが露出している。ここでプローブとは、例えば検体中の目的の物質を探り出すために用いる探査針をいう。プローブとしては核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、ペプチド核酸等が使用できる。ハイブリダイゼーション、洗浄処理、分析処理においては、表面に露出した繊細な高分子ゲル部を損傷しないよう注意する必要がある。そのため、図２に例示するようにＤＮＡマイクロアレイ本体（１０）はホルダ（２０）に挿入保護した状態で用いることが好ましい。

ホルダ（２０）には、マイクロアレイが誤方向に挿入することを防止する目的で凹マーカー部（２１）が形成されている。ホルダ（２０）を挿入する相手、即ちマイクロアレイ本体には、その凹マーカー部（２１）と互いに嵌り合う凸マーカー部を設けておく。それによりホルダ（２０）を誤った方向で挿入した場合、ホルダ（２０）が凸マーカー部で押し上げられ、誤った方向で挿入したことが容易に判別可能となる。

図３Ａは、複数個のＤＮＡマイクロアレイを、それぞれ個別に密閉可能な区画内に垂直に収容し、プローブが固定化された高分子ゲル部がハイブリダイゼーション溶液で浸漬された状態で収容可能なハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の上面である。また、その断面図を図３Ｂ及び図３Ｃに示した。

複数枚のＤＮＡマイクロアレイを、それぞれ個別に密閉可能な区画（３１）の中に、ＤＮＡマイクロアレイを収容し、プローブが固定化された高分子ゲル部がハイブリダイゼーション溶液で浸漬するためのスロット（３２）が形成されている。

区画（３１）は、密閉前はその上部のみが開放された開口部（３１ａ）となっている。この開口部（３１ａ）から区画（３１）内のスロット（３２）へのＤＮＡマイクロアレイの挿入、ハイブリダイゼーション液の注入を行う。また、それら作業が終了した後、この開口部（３１ａ）を塞ぐことで各区画を密閉することもできる。

各区画の密閉方法として、個々にぴったりと合った構造のキャップを嵌め込んでも良い。例えば市販の粘着フィルムや熱融着フィルムを用い、ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の開口部（３１ａ）をすべて一括して塞ぐ方法が簡便かつ確実で好ましい。
さらに、押さえ板により、前記、粘着フィルム，熱融着フィルムを押さえ込めば、より確実な密閉が可能となる。また、各区画の保温のために、押さえ板内にヒーターを設けて良い。

スロット（３２）の底部には、前述したホルダ（２０）の誤方向挿入防止凹部（２１）と嵌り合う、誤方向挿入防止凸部（３３）が形成されている。ホルダ（２０）が誤った方向に挿入され、誤方向挿入防止凹部（２１）と誤方向挿入防止凸部（３３）が嵌り合わない位置関係になると、ホルダ（２０）が誤方向挿入防止凸部（３３）で上方に押し上げられホルダ（２０）が開口部（３１ａ）から突出する。それにより誤った方向で挿入したことが容易に判別できる。

ハイブリダイゼーション／洗浄用プレートを構成する材料としては、例えば、ハイブリダイゼーション、抗原抗体反応等の検出反応を阻害する物質を含むものでなければ特に限定はない。たとえばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネイトなどの熱可塑性の樹脂材料を用い、射出成形などで安価に大量に製造することができる。

図４Ａは、ＤＮＡマイクロアレイ処理装置（４０）の上面である。また図４Ｂは処理装置（４０）の側面図である。上部カバー（４１）の内部にはプレート装着溝（４２）にハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）が装着されている。上部カバー（４１）はハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）をプレート装着溝（４２）から着脱する際には開き、ハイブリダイゼーション処理や洗浄処理の際には閉じることで外乱からの保護、周囲温度安定化を行う。

プレート装着溝（４２）には、装着されたハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）を設定した温度に保持するための温度調整機構を具備している。温度調整機構の一例として、温度調節が加熱のみで冷却は自然放熱で十分な場合は、プレート装着溝（４２）の周りを電気ヒーターで覆う方法が挙げられる。また、冷却も必要な場合は、プレート装着溝（４２）の周りをジャケット構造とし、所定の温度に加熱または冷却された熱媒体を循環させる方法が挙げられる。

プレート装着溝（４２）裏壁面に加熱／冷却を電源の極性反転で容易に反転可能なペルチェ素子を貼り付け温度調整に用いると、機構の熱容量が少なく急速な昇温／降温が可能で、構造も単純となり特に好ましい。

また、洗浄液注入用ノズルからハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の区画内に注入される洗浄液を、所定の温度に加熱／冷却する手段として、例えば洗浄液をハイブリダイゼーション／洗浄用プレートが保たれている温度と同じ温度に加熱／冷却する場合には、前述のプレート装着溝（４２）の周りを覆った温度調節機構の一部を液体の熱交換ユニットとして用いると、洗浄液を、所定の温度に加熱／冷却機構を簡素化することができる。

ＤＮＡマイクロアレイ処理装置（４０）には、ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）に供給される洗浄液が充填された洗浄液ボトルＡ（４３）、洗浄液ボトルＢ（４４）と、ハイブリダイゼーション・洗浄用プレートから吸引された廃液を収納する廃液ボトル（４５）が接続されている。

洗浄液ボトルＡ（４３）、洗浄液ボトルＢ（４４）には異なった組成の洗浄溶液が収納される。それらは切り替えバルブ（図示せず）によって注入ノズルに送液される洗浄液の種類を切り替えることができる。ここでは洗浄液の種類は２種類で図示しているが、１種類でも２種類以上でも良く特に制限はない。

ＤＮＡマイクロアレイ処理装置（４０）の上面には、プレート装着溝（４２）に装着されたハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の加熱、冷却温度、温度保持時間、温度切り替え、洗浄時間、一区画への注入液量、洗浄液注入後静置時間、ノズルアーム移動量等のシーケンスを入力するためのシーケンス入力部（４６）がある。シーケンス入力部は、シーケンスを入力するためのキー（４６ａ）、入力されたシーケンス及びシーケンスの進行状態を表示する表示パネル（４６ｂ）を備えている。

図５Ａ及び図５Ｂは、ＤＮＡマイクロアレイ処理装置のハイブリダイゼーション／洗浄用プレート装着部の詳細図である。ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）上部には、洗浄液注入用ノズル（４７ａ）、洗浄液吸引用ノズル（４７ｂ）が固定されたノズルブロック（４７）が位置し、ノズルブロック（４７）はノズルアーム（４８）に固定されている。

ノズルアーム（４８）はネジ送りやベルト送り、リニアモーター等のアクチェータ等により、ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）に対し水平および垂直方向に任意に移動させることができる。垂直方向の移動については一定の間隔の昇降を繰り返すのであれば、電磁シリンダなどを用いても良い。

次に図５の装置を使用した洗浄方法を説明する。

まず、ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の区画（３１）に、ＤＮＡマイクロアレイを挿入する。次いでハイブリダイゼーション溶液を開口部（３１ａ）に注入した後、内部の液体の蒸発防止、コンタミネーション防止のために各区画を粘着フィルムや熱融着フィルム（５０）で密閉する。所定の条件（温度、時間等）でハイブリダイゼーションを実施し、次に各区画の所定の位置でノズルブロック（４７）を降下させ、洗浄液注入用ノズル（４７ａ）及び洗浄液吸引用ノズル（４７ｂ）により洗浄操作を実施する。ここで例えば洗浄液注入用ノズル（４７ａ）及び洗浄液吸引用ノズル（４７ｂ）の先端を注射針のように尖らせておくことにより、上述のフィルム（５０）を貫通、ノズル先端から内部への洗浄液注入、洗浄廃液の吸引を行うことができる。
また、押さえ板に、区画（３１）に対応する穴を設けておけば、押さえ板により、上述のフィルム（５０）を押さえ込んだまま、洗浄操作が可能となる。

このノズルブロック（４７）に洗浄液の加熱／冷却を行う熱交換ユニットを内蔵すると、洗浄液はＤＮＡマイクロアレイが挿入収納された区画に注入される直前の部分で所定の温度に調節される。よって洗浄液の加熱／冷却を行う熱交換ユニットをノズルブロック（４７）から離れた場所に設置する場合に比べ、送液ポンプやチューブでの放熱、吸熱等による洗浄液温度の変化を生じ難く好ましい。

ノズルブロック（４７）の温度調整機構の一例としては、前述したようにハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）の温度調節と同じ機構をとることができるが、加熱／冷却が必要な場合はノズルブロック（４７）をコンパクトにまとめる上で、ペルチェ素子を温度調整に用いることが特に好ましい。

また、洗浄液をハイブリダイゼーション／洗浄用プレート（３０）が保たれている温度と同じ温度に加熱／冷却し供給する場合には、前述のプレート装着溝（４２）の周りを覆った温度調節機構の一部を液体の熱交換ユニットとして用いる方法と、洗浄液の加熱／冷却を行う熱交換ユニットをノズルブロック（４７）に内蔵した機構を併用すると、熱交換面積、熱交換時間を増大させることができ、洗浄サイクルにおける液温変動の抑制、温度制御精度向上において更に好ましい。

ここで、プレート装着溝（４２）の温度調節機構の一部を液体の熱交換ユニットとして用いる方法、ノズルブロック内に洗浄液の加熱／冷却を行う熱交換ユニットを組み込む方法、及び両者を併用する方法において、これらの熱交換ユニットは、既に温度調節が成された熱交換ユニット内部の洗浄液が、洗浄液ボトルから供給ポンプ等によって熱交換ユニットに供給される温度調節が成されていない洗浄液によってピストンフロー的に押出される構造、例えば、熱交換ユニット内流路が１本の細い連続流路、あるいは一本の細い流路から、さらに細い複数の流路に分割され、また１本の流路に収束される構造する等とすることが好ましい。

このような構造とすると、洗浄液ボトルから供給ポンプ等によって熱交換ユニットに供給された温度調節が成されていない洗浄液と、熱交換ユニット内の温度調節が成された洗浄液が攪拌混合されるのを防ぐことができ、温度の異なった洗浄液の混合による注入洗浄液温度の変動抑制、温度制御の精度向上面、更に洗浄液の種類を変更した場合に、熱交換ユニット内の液滞留部が少なく、洗浄液を迅速に置換することができ特に好ましい。

ＤＮＡマイクロアレイ本体の模式図である。 ＤＮＡマイクロアレイ本体収納された状態のホルダを示す斜視図である。 複数枚のホルダを収納するハイブリダイゼーション／洗浄用プレートの構造図である。 ＤＮＡマイクロアレイ処理装置の概観図である。 ＤＮＡマイクロアレイ処理装置のハイブリダイゼーション／洗浄用プレート装着部の詳細図である。

符号の説明

１０・・・・・ＤＮＡマイクロアレイ本体
１１・・・・・高分子ゲル
２０・・・・・ホルダ
２１・・・・・凹マーカー部
３０・・・・・ハイブリダイゼーション／洗浄用プレート
３１・・・・・区画
３１ａ・・・・開口部
３２・・・・・スロット
３３・・・・・誤方向挿入防止凸部
４０・・・・・ＤＮＡマイクロアレイ処理装置
４１・・・・・上部カバー
４２・・・・・プレート装着溝
４３・・・・・洗浄液ボトルＡ
４４・・・・・洗浄液ボトルＢ
４５・・・・・廃液ボトル
４６・・・・・シーケンス入力部
４６ａ・・・・キー
４６ｂ・・・・表示パネル
４７・・・・・ノズルブロック
４７ａ・・・・洗浄液注入用ノズル
４７ｂ・・・・洗浄液吸引用ノズル
４８・・・・・ノズルアーム
５０・・・・・フィルム

Claims (2)

1. 表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイの洗浄処理を行う装置であって、
   前記ＤＮＡマイクロアレイを垂直方向に収容する容器と、
   収容された前記ＤＮＡマイクロアレイの表裏の一方の側に配置される、前記容器に洗浄液を注入するための洗浄液注入用ノズルと、
   収容された前記ＤＮＡマイクロアレイの表裏の他方の側に配置される、前記容器から前記洗浄液を排出するための洗浄液吸引用ノズルと、
   前記洗浄液注入用ノズル及び前記洗浄液吸引用ノズルが固定されたノズルブロックと、
   を含むＤＮＡマイクロアレイ処理装置。
2. 表裏を貫通する複数の孔部の各々に、プローブが固定された高分子ゲルが保持された構造を有するＤＮＡマイクロアレイの洗浄処理を行う方法であって、
   前記ＤＮＡマイクロアレイを垂直方向に容器に収容する工程と、
   洗浄液注入用ノズル及び洗浄液吸引用ノズルが固定されたノズルブロックを動かして各ノズルを配置する工程と、
   前記ＤＮＡマイクロアレイの表裏の一方の側に配置された洗浄液注入用ノズルで前記容器に洗浄液を注入しつつ、前記ＤＮＡマイクロアレイの表裏の他方の側に配置された洗浄液吸引用ノズルで前記容器から前記洗浄液を排出する工程と、
   を含むＤＮＡマイクロアレイ処理方法。

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