JP2002122596A

JP2002122596A - 生体関連物質検出用マイクロアレイ

Info

Publication number: JP2002122596A
Application number: JP2000314813A
Authority: JP
Inventors: Chiho Ito; 千穂伊藤; Takashi Akita; 隆秋田; Yoko Miyauchi; 陽子宮内; Atsushi Takahashi; 厚高橋
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2000-10-16
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2002-04-26

Abstract

(57)【要約】【課題】微量な生体関連物質を優れた感度で検出す
る。【解決手段】複数の中空状繊維を長手方向に配列し、
当該中空状繊維の内壁及び／又は中空部に生体関連物質
検出プローブを固定化してなる生体関連物質検出用マイ
クロアレイにおいて、上記中空状繊維の外壁に反射膜を
形成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸分子、オリゴ
ペプチド及びタンパク質等の生体関連物質を検出するた
めの生体関連物質検出用マイクロアレイ及び生体関連物
質検出装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、DNA及びRNA等の核酸分子、オリゴ
ペプチド並びにタンパク質等の生体関連物質を検出する
ため、DNAマイクロアレイ法（DNAチップ法）が開発さ
れ、注目を浴びている。DNAマイクロアレイ法では、平
面基盤上に多数の核酸分子をプローブとして高密度に整
列させて固定化し、研究対象の細胞等から抽出した後に
蛍光色素等で標識した核酸分子を当該平面基盤上でハイ
ブリダゼーションさせる。この方法では、プローブであ
る核酸分子にハイブリダイズすることによる蛍光を、高
解像度解析装置で検出する。これにより、サンプル中の
それぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。この新しい方
法の導入により、反応検体の微量化と、その反応検体を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量することが
可能となってきた。

【０００３】ところで、DNAマイクロアレイ法では、多
数の核酸分子をプローブとして高密度に整列させて平面
基盤上に固定化したDNAチップが用いられる。このDNAチ
ップとしては、ガラス基板の一主面をマトリックス状に
区画し、各区画にプローブとなる核酸分子を固定化した
ものや、シリコン基板をフォトリソグラフィー技術によ
り区画し、各区画にプローブとなる核酸分子を固定化し
たものが知られている（米国特許 5,445,934号、米国特
許 5,774,305号公報等参照）。また、DNAチップとして
は、ガラスや高分子からなる中空状繊維に核酸分子を固
定化して該繊維を接着剤と共に簀巻き状にし、中空状繊
維の中心軸と交差する方向に切断してなるものも知られ
ている（特開平11-108928号公報、WO 00/40942号参
照）。これらDNAチップは、各区画又は繊維の内部に、
検出対象の生体関連物質と親和性のあるプローブを固定
化している。

【０００４】このように構成されたDNAチップは、蛍光
標識等を付加した検出対象の生体関連物質、例えば、蛍
光標識を結合したDNAを含む溶液を所定の条件下で作用
させることによって、プローブDNAと検出対象のDNAとを
ハイブリダイズさせることができる。そして、DNAチッ
プに対して外部から光を照射し、DNAに結合させた蛍光
標識から放射する蛍光を高解像度解析装置で検出するこ
とによって、DNAチップ上において検出対象のDNAがハイ
ブリダイズした位置を検出することができる。

【０００５】しかしながら、これらに代表されるDNAチ
ップを用いた場合、検出感度が低いといった問題があっ
た。従来のDNAチップでは、特に、検出対象の生体関連
物質が微量である場合が多く、高解像度解析装置を用い
たとしても、高精度の分析を行うことができない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、上
述したような実状に鑑みてなされたものであり、微量な
生体関連物質を優れた感度で検出することができる生体
関連物質検出用マイクロアレイ及び生体関連物質検出装
置を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ため、本発明者が鋭意検討した結果、検出対象の生体関
連物質以外からの光成分が、検出対象の光に対するノイ
ズ成分となり、また、検出対象の生体関連物質が放射す
る光が隣接する領域に対してノイズ成分となるといった
知見を得るに至った。生体関連物質検出用マイクロアレ
イにおいて、検出対象の生体関連物質が放射する光の漏
洩を防止することによって、高精度な分析が可能となる
ことを見出し本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、複数の中空状繊維
を、当該中空状繊維の中心軸と平行な方向に配列し、当
該中空状繊維の内壁及び／又は中空部に生体関連物質検
出プローブを固定化してなる生体関連物質検出用マイク
ロアレイにおいて、上記中空状繊維の外壁に反射膜が形
成されていることを特徴とするものである。

【０００９】ここで、上記反射膜は、金属薄膜又は高反
射率を有する塗膜からなるものであっても良い。また、
上記反射膜は、７０％以上の反射率を示すものであるこ
とが好ましい。本発明において、上記複数の中空状繊維
は、マトリックス状に配列されたものであっても良い。
また、上記複数の中空状繊維は、中心軸に交差する方向
から切断されてなる切断面を外方に臨ませてなるもので
あっても良い。

【００１０】本発明において、上記複数の中空状繊維を
包埋する樹脂に、当該樹脂から生ずる光の強度を低下さ
せる光強度低下剤を含有させることが好ましい。一方、
本発明は、請求項１〜７いずれか１項記載の生体関連物
質検出用マイクロアレイと、上記生体関連物質検出用マ
イクロアレイから出射された蛍光を検出する光学検出手
段とを備える生体関連物質検出装置である。

【００１１】また、本発明は、中空状繊維の内壁及び／
又は中空部に生体関連物質検出プローブを固定化してな
る生体関連物質検出用マイクロアレイを用い、当該生体
関連物質検出プローブと検出対象の生体関連物質とのハ
イブリッドを形成し、当該ハイブリッドから放射された
光を中空状繊維の外壁で反射させて、当該ハイブリッド
から放射された光と当該反射光とを検出することを特徴
とする生体関連物質検出方法である。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を適用した生体関連
物質検出用マイクロアレイについて詳細に説明する。生
体関連物質検出用マイクロアレイ１は、図１及び図２に
示すように、マトリックス状に配列した複数のスポット
孔２を備え、これらスポット孔２の内壁及び／又は中空
部に生体関連物質プローブ（図示せず。）を固定化した
ものである。スポット孔２は、外壁に反射膜３が形成さ
れた中空状繊維を、中心軸と交差する方向に切断してな
るものである。したがって、複数のスポット孔２は、反
射膜３によって囲まれている。ここで、マトリックス状
とは、ＸＹ平面を想定した場合にＸ軸方向及びＹ軸方向
ともに平行となるような配置と、ＸＹ平面におけるラン
ダムな配置とを含む意味である。すなわち、本発明にお
いて、複数のスポット孔２は、所定の規則性をもって整
然と配置されていても良いし、ランダムに配置されてい
ても良い。

【００１３】反射膜３は、スポット孔２内部の光を反射
できるとともに、スポット孔２内部に対して照射された
外部からの光を遮光できるものであればよく、対象の光
の波長に対して７０％以上の反射率を示すものが好まし
く、９０％以上の反射率を示すものがより好ましい。反
射膜３は、例えば、金属薄膜や塗膜から形成することが
できる。ここで、対象の光とは、スポット孔２内におけ
る励起光及び／又は蛍光を意味し、４００ｎｍ〜７５０
ｎｍの波長域のものが挙げられる。

【００１４】金属薄膜としては、対象の光に対して高い
反射率を示す材料、例えば、金、銀、銅、アルミニウ
ム、プラチニウム等を用いて形成されることが好まし
い。特に、金属薄膜としては、経済性の観点と、４００
ｎｍ〜７５０ｎｍのすべての波長域に高い反射率を有す
る観点とから、銀又はアルミニウムを用いて形成される
ことが好ましい。また、金属薄膜の厚さは、金属薄膜に
十分な反射率があれば特に限定されるものではないが、
０．０１〜５μｍであることが好ましい。

【００１５】金属薄膜の形成方法としては、真空蒸着
法、スパッタリング法及びイオンプレーティング法等の
物理気相成長法や、熱及びプラズマ等を用いた化学気相
成長法、無電解めっき、電気めっき等を挙げることがで
きる。

【００１６】一方、塗膜としては、対象の光に対して７
０％以上の反射率を示すものが好ましく、さらに、９０
％以上の反射率を示すものがより好ましい。特に、塗膜
としては、４００〜７５０ｎｍの全ての波長に高い反射
率を示す観点から白色であることが好ましい。白色の塗
膜層としては、例えば、結合剤に白色顔料を添加してな
る塗料を塗布することにより形成される。ここで、白色
顔料としては、ＣａＣＯ₃、ＴｉＯ₂、ＺｎＯ及びＺｎＡ
ｌ₂Ｏ₄等を使用することができる。これら白色顔料は、
塗料中に塗料不揮発成分の３０〜９０重量％の割合で分
散することが好ましい。結合剤としては、特に限定され
ず、いかなるものも使用することができる。結合剤とし
ては、例えば、アルキッド系、アクリル系、不飽和ポリ
エステル系、エポキシ系、ポリウレタン系、シリコ−ン
系、塩化ビニル系、フッ素系、ポリエーテルサルフォン
系、ポリアミド系、ポリイミド系、ポリオレフィン系、
ポリエチレンテレフタレート系等を挙げることができ
る。

【００１７】塗膜の形成方法としては、特に限定される
ものではなく、例えば、スプレーコート法やディップコ
ート法等を使用することができる。また、塗膜の厚み
は、塗膜に十分な反射率があれば特に限定されるもので
はないが、１〜１０μｍであることが好ましい。

【００１８】ところで、中空状繊維は、多孔質及び非多
孔質のいずれであってもよく、例えば、メチルメタクリ
レート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート
等のメタクリレート系モノマー、メチルアクリレート、
エチルアクリレート等のアクリレート系モノマーの単独
重合体若しくはこれらの共重合体、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ノボルネン／エチレン共重合体、ポリエチレ
ンテレフタレート、ポリカーボネート又はガラス等から
形成されるものが挙げられる。

【００１９】中空状繊維の外径は、１ｍｍ以下であるこ
とが好ましく、０．５ｍｍ以下であることがより好まし
く、０．３ｍｍ以下であることが最も好ましい。生体関
連物質検出用マイクロアレイにおいて、単位面積あたり
のスポット孔２の数を多くする観点からは、中空状繊維
の外径を０．５ｍｍ以下とすることが好ましく、０．３
ｍｍ以下とすることがより好ましい。また、中空状繊維
の外径は、０．０５ｍｍ以上であることが好ましく、
０．１ｍｍ以上であることがより好ましい。中空状繊維
の外径が０．０５ｍｍ未満である場合には、中空状繊維
の賦形が困難となる不都合を生じる。

【００２０】中空状繊維は、無処理の状態でそのまま用
いてもよいが、必要に応じて、プラズマ処理やγ線、電
子線などの放射線処理を施したものであってもよい。さ
らに、中空状繊維は、必要に応じて反応性官能基を導入
したものであってもよい。

【００２１】中空状繊維の内壁及び／又は中空部に固定
化される生体関連物質プローブとしては、以下の(1)〜
(３)の物質からなる群から選択されるいずれかのものが
挙げられる。 (1) 核酸、アミノ酸、糖又は脂質 (2) 上記(1)の物質のうち少なくとも１種類の成分から
なる重合物 (3) 上記(1)又は(2)の物質と相互作用を有する物質

【００２２】これらの中でも、生体関連物質プローブと
しては、核酸分子を用いることが好ましい。言い換える
と、生体関連物質検出用マイクロアレイ１は、核酸分子
を検出する際に使用されることが好ましい。核酸分子と
しては、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）やリボ核
酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチ
ド核酸（ＯＰＮＡ）等が挙げられる。本発明に用いる生
体関連物質プローブは、市販のものであってもく、ま
た、in vitroで合成したもの或いは細胞から抽出したも
のいずれでもよい。

【００２３】生体関連物質プローブとして核酸を用いる
場合には、公知の方法を用いて細胞からＤＮＡやＲＮＡ
を調製すればよい。例えば、ＤＮＡを調製する公知の方
法としては、Blinらの方法（Blin et al., Nucleic Aci
ds Res. 3: 2303 (1976)）等を例示することができる。
また、ＲＮＡを調製する公知の方法としては、Favaloro
らの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718
(1980)）等を例示することができる。生体関連物質プ
ローブとして用いる核酸分子は、これらに代表される方
法を適宜使用して調製すればよい。

【００２４】さらに、核酸分子としては、鎖状或いは環
状のプラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、これらを制限酵
素により或いは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内
で合成されたＤＮＡ、若しくは化学合成したオリゴヌク
レオチド等を用いることもできる。

【００２５】中空状繊維における内壁及び／又は中空部
に生体関連物質プローブを固定化する方法としては、従
来より公知の方法を適宜使用することができる。具体的
には、中空状繊維と生体関連物質プローブとの間におけ
る化学的及び／又は物理的な相互作用、すなわち、中空
状繊維が有する官能基と、生体関連物質プローブとの間
の化学的及び／又は物理的な相互作用を利用することが
できる。

【００２６】また、中空状繊維の中空部内に生体関連物
質プローブを含む溶液を注入した後、中空状繊維の内壁
面等に存在する官能基と生体関連物質プローブを構成す
る成分との間に相互作用を生じさせることもできる。例
えば、無修飾の核酸を中空状繊維の内壁に固定化する場
合には、中空状繊維の中空部に核酸を注入した後、ベー
キングや紫外線照射を行う。また、アミノ基で修飾され
た核酸を中空状繊維の内壁に固定化する場合には、グル
タルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド(EDC)等の架橋剤を用い
て、中空状繊維の内壁に存在する官能基とアミノ基とを
結合させることができる。

【００２７】さらに、中空状繊維における内壁及び／又
は中空部に固定化された生体関連物質プローブに対し
て、例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理な
どを施すことにより、当該生体関連物質プローブを変性
させることができる。これに加えて、生体関連物質を細
胞、菌体などの生材料から抽出した場合には、不要な細
胞成分等を除去するといった処理を行うことも好まし
い。なお、生体関連物質プローブを変成する処理と、不
要な細胞成分等を除去する処理とは、別々に実施しても
よいが、同時に実施してもよい。また、これらの処理
は、生体関連物質プローブを中空状繊維に固定化する前
に適宜実施してもよい。

【００２８】また、核酸等の生体関連物質プローブをゲ
ルに固定化させ、このゲルを中空部に導入することによ
って、中空状繊維の内壁及び／又は中空部に核酸等の生
体関連物質プローブを固定化してもよい。使用可能なゲ
ルとしては、特に限定されず、例えば、アクリルアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエ
タノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノ−ル、Ｎ−
メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒ
ドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、
アリルデキストリン等の単量体の１種類または２種類以
上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチ
レングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性
単量体を共重合したゲル等が挙げられる。

【００２９】具体的に、この場合、先ず、核酸の末端に
重合可能な官能基を導入したものを調整した後、この核
酸、上記単量体及び重合開始剤を含む溶液を調製する。
次に、この溶液を中空状繊維の中空部又は多孔質部に注
入後、重合ゲル化させる。これによって、中空状繊維の
内壁及び／又は中空部に核酸を固定化することができ
る。

【００３０】以上のように構成された本発明に係る生体
関連物質検出用マイクロアレイ１は、複数の中空状繊維
を中心軸と平行な方向にマトリックス状に配列し、この
状態で複数の中空状繊維を樹脂等により包埋することに
より中空状繊維集合体を作製し、その後、中心軸と交差
する断面で当該中空状繊維集合体を切断することにより
作製することができる。生体関連物質プローブは、予め
中空状繊維の内壁等に固定化しても良いし、中空状繊維
集合体を作製した後に個々の中空状繊維の内壁等に固定
化しても良い。

【００３１】複数の中空状繊維を中心軸と平行な方向に
マトリックス状に配列する方法としては、中空状繊維の
外径よりも大の開口部がマトリックス状に形成されてな
る一対のガイド部材を、開口部を対向させるように冶具
で固定し、これら一対のガイド部材の間に複数の中空状
繊維を掛け渡す方法が挙げられる。すなわち、一対のガ
イド板における対向する開口部間に中空状繊維を掛け渡
すことによって、複数の中空状繊維を中心軸と平行な方
向にマトリックス状に配列することができる。

【００３２】また、複数の中空状繊維を中心軸と平行な
方向にマトリックス状に配列する方法としては、複数の
中空状繊維を中心軸と平行に一列に配列し、これを簀巻
き状にする方法を例示することもできる。この方法で
は、一列に配列した複数の中空状繊維を簀巻き状とする
ことによって、複数の中空状繊維を中心軸と平行な方向
にマトリックス状に配列することができる。

【００３３】中心軸と平行な方向にマトリックス状に配
列した複数の中空状繊維を包埋する際には、ウレタン樹
脂、エポキシ樹脂及びシリコン樹脂等の架橋型樹脂や、
アクリレートモノマー及びポリマー等の重合型樹脂を使
用することができる。また、これらの樹脂には、当該樹
脂から生じる蛍光等の光成分の強度を低下させる光強度
低下剤を添加することが好ましい。ここで、樹脂から生
ずる光成分とは、波長が検出対象の光波長と重なる光で
あって、励起光に起因する樹脂からの散乱光、反射光や
樹脂自体から発生する蛍光等を意味する。

【００３４】光強度低下剤としては、所定の波長領域の
光を吸収する光吸収剤、及び蛍光体の励起を誘引する消
光剤を例示することができる。また、光強度低下剤とし
ては、無機顔料、有機顔料及び金属酸化物を挙げること
ができる。具体的に、光強度低下剤としては、カーボン
ブラック、アセチレンブラック及び鉄黒等の黒色のも
の、クロム黄、亜鉛黄、黄土、ハンザイエロー、パーマ
ネントイエロー及びベンジンイエロー等の黄色のもの、
オレンジレーキ、モリブテンオレンジ、ベンジンオレン
ジの橙色のもの、べんがら、カドミウムレッド、アンチ
モン朱、パーマネントレッド、リソールレッド、レーキ
レッド、ブリリアントスカーレット及びチオインジゴレ
ッド等の赤色のもの、群生、コバルトブルー、フタロシ
アニンブルー及びインジゴ等の青色のもの、クロムグリ
ーン、ビリジアンナフトールグリーン及びフタロシアニ
ングリーン等の緑色のものを例示することができる。

【００３５】なかでも、光強度低下剤としては、樹脂中
に均一に分散し、且つ、樹脂中を通る光の経路を長くす
ることによって光強度を効率よく低下させられる観点か
ら、表面積が大きく、粒径の小さいカーボンブラックを
使用することが好ましい。

【００３６】中空状繊維集合体は、特に当該中心軸と直
交する方向で切断することが好ましい。この切断加工に
は、ミクロトーム装置等を使用することができる。これ
らの装置によれば、中空状繊維集合体を厚さ１０〜２０
００μｍで切断することができ、生体関連物質検出用マ
イクロアレイ１を作製することができる。

【００３７】このように作製された生体関連物質検出用
マイクロアレイ１を用いて生体関連物質を検出するに
は、検出対象の生体関連物質に対するハイブリッド形成
能を有する生体関連物質プローブをスポット孔２の内壁
等に固定化した生体関連物質検出用マイクロアレイ１を
用いる。

【００３８】先ず、蛍光標識した生体関連物質を含む溶
液を生体関連物質検出用マイクロアレイ１に作用させ、
生体関連物質プローブと蛍光標識した生体関連物質との
ハイブリッドを形成させる。

【００３９】そして、蛍光検出手段を用いて、この生体
関連物質検出用マイクロアレイ１における蛍光を検出す
る。蛍光検出手段としては、蛍光顕微鏡、蛍光プレート
リーダー、蛍光レーザースキャナー等を用いることがで
きる。これら蛍光検出手段は、生体関連物質検出用マイ
クロアレイ１に対して励起光を照射し、励起光の一部が
蛍光標識に吸収されて放出した蛍光を検出する。

【００４０】このとき、本発明の生体関連物質検出用マ
イクロアレイ１においては、中空状繊維の外壁に反射膜
３が形成されているため、蛍光体に吸収されなかった残
りの励起光および蛍光標識からの蛍光はスポット孔２内
側に反射することになる。このため、スポット孔２内の
蛍光が損失することなく、スポット孔２から放射される
蛍光強度を増大させることができる。また、蛍光体に吸
収されなかった残りの励起光を反射膜３により反射でき
るため、励起光の利用効率を向上させることができる。
さらに、この生体関連物質検出用マイクロアレイ１にお
いては、中空状繊維の外壁に反射膜３が形成されている
ため、外部からの光を遮光することができる。このた
め、外部の光がスポット孔２内に漏れてノイズ成分とな
ることを確実に防止することができる。

【００４１】したがって、生体関連物質検出用マイクロ
アレイ１においては、非常に高感度な蛍光検出手段を使
用することなく、安価な蛍光検出手段を用いてもスポッ
ト孔２からの蛍光を良好に検出することができる。言い
換えると、この生体関連物質検出用マイクロアレイ１で
は、スポット孔２内に捕捉された生体関連物質が微量で
あっても、優れた蛍光強度を示すこととなる。したがっ
て、この生体関連物質検出用マイクロアレイ１を用いる
ことによって、非常に微量な生体関連物質を検出するこ
とが可能となる。

【００４２】さらに、この生体関連物質検出用マイクロ
アレイにおいては、中空状繊維集合体を作製する際の樹
脂にカーボンブラック、鉄黒及びチタンブラック等の光
強度低下剤を添加することによって、スポット孔間の光
の影響を低減させることができる。したがって、この場
合には、蛍光検出手段による検出感度をより向上させる
ことができる。

【００４３】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。ただし、本発明はこれら実施例によりその技術範囲
が限定されるものではない。以下、実施例、比較例の蛍
光顕微鏡観察は、浜松ホトニクス製冷却CCDカメラ C
4880-37(512×512 素子、24μm正方画素)及びNikon製
蛍光顕微鏡E600（対物レンズ１０倍開口数０．３）を
用いて行った。フィルターには、Nikon社製蛍光試薬専
用フィルタブロック（励起波長：535±25nm、検出波
長：610±38nm（Cy3フィルター））を用いた。

【００４４】〔実施例1〕（１）反射膜の形成外径２３０μm、内径１３０μmのポリメチルメタクリレ
ート（ＰＭＭＡ）からなる中空状繊維（三菱レイヨン社
製ＰＭＭＡ、溶融紡糸品）の全周面にアルミニウムから
なる反射膜を成膜した。このとき、先ず、真空チャンバ
ー内に中空状繊維を載置したガラス板を固定し、当該真
空チャンバー内を真空度３×１０^-6torrに脱気して、ガ
ラス板上に載置された中空状繊維の一方側面にアルミニ
ウムを蒸着した。次に、ガラス板上の中空状繊維を反転
させ、アルミニウムが蒸着されていない他方側面にアル
ミニウムを蒸着した。このとき、蒸着源としては、アル
ミニウム約0.1gを入れたタンタル製バスケットを用い
た。蒸着したアルミニウムの膜厚は、ガラス板上でタリ
ステップを用いて測定したところ約１５００オングスト
ロームであった。

【００４５】（２）中空状繊維集合体の作製直径0.32mmの孔が0.42mmピッチで縦横７列に合計49個穿
設された、厚さ0.1mmの多孔ガイド板２枚を準備した。
これら多孔ガイド板の全ての孔に、（１）で得られた中
空状繊維49本を通過させ、2枚の繊維ガイド板の間隔を5
0mmとし治具に固定した。そして、2枚の多孔ガイド板間
に掛け渡された中空状繊維にテンションを付与した状態
で、これら中空状繊維の両端を固定した。つぎに、日本
ポリウレタン工業（株）社製ニッポラン4276／日本ポリ
ウレタン工業（株）社製コロネート4403＝６２／３８
（重量比）で配合したポリウレタンウレタン接着剤を流
し込み硬化させることによって中空状繊維集合体を作製
した。

【００４６】（３）蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドの合成は、PEバイオシステムズ社の
自動合成機DNA/RNA synthesizer (model394)を用いて行
い、DNA合成の最終ステップで、5'末端にCy3を導入した
GCAT配列のオリゴヌクレオチドを合成した。これらは、
一般的手法によって脱保護及び精製して使用した（特開
平2000-245961号公報参照）。

【００４７】（４）メタクリレート基を有する蛍光体の
調製（３）で得られたオリゴヌクレオチド（500nmol/ml）50
μl、グリシジルメタクリレート5μl及びジメチルホル
ムアミド5μlを混合し、70℃で2時間反応させて、メタ
クリレート基を有する蛍光体を調製した。そして、これ
に水190μlを加えて、100nmol/mlのメタクリレート基を
有する蛍光体(GMA変性Cy3)溶液を得た。

【００４８】（５）生体関連物質固定化ゲル保持繊維配
列体及び該薄片の調製＜モノマー液及び重合開始剤液の調整＞下記の質量比で
混合して、モノマー液及び重合開始剤液を調製した。ａ）モノマー液アクリルアミド０．７６質量部メチレンビスアクリルアミド０．０４質量部水４．２質量部ｂ）重合開始剤液 2,2'-アゾビス（2-アミジノプロパン）二塩酸塩０．０１質量部水４．９９質量部

【００４９】＜重合液の調製及び重合反応＞上述のモノ
マー液ａ）、重合開始剤液ｂ）を体積比で等量混合し、
さらに下記に示す濃度になるように（３）で調製したＧ
ＭＡ変性Ｃｙ３溶液を混合して重合液１〜３を調製し
た。ａ）重合液１ＧＭＡ変性Ｃｙ３濃度０nmol/ml ｂ）重合液２ＧＭＡ変性Ｃｙ３濃度０．０５nmol/ml ｃ）重合液３ＧＭＡ変性Ｃｙ３濃度５nmol/ml

【００５０】得られた重合液１〜３を（２）で得られた
中空状繊維集合体における中空状繊維に充填した。そし
て、この中空状繊維集合体を、内部が水蒸気で飽和され
た密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間放置すること
により重合反応を行った。その後、中空状繊維集合体を
中心軸と直交する方向にスライスして厚さ約750μmの生
体関連物質検出用マイクロアレイを得た。中空状繊維に
充填された重合液の種類と位置との関係を図３に示す。

【００５１】〔比較例１〕中空状繊維の側面に反射膜を
形成しない以外は、実施例１と同様の方法で、厚さ約75
0μmの生体関連物質検出用マイクロアレイを作製した。〔結果〕上記方法で得た実施例１及び比較例１の生体関
連物質検出用マイクロアレイを、蛍光顕微鏡E600／CCD
カメラC488-37で４倍で観察・露光時間１秒で撮影し、
検出光強度を測定した結果を表１に示す。ただし、表１
中「Ｏ．Ｅ．」と示すのは、ＣＣＤカメラの検出可能な
光量を超えて定量化できなかったことを示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】表１から判るように、比較例１において
は、５nmol/mlの蛍光体濃度のスポットの近傍である０n
mol/mlのスポット（図３中１行及び３行のスポット）と
０．０５nmol/mlのスポットの間で有意差は得られなか
った。これは、比較例１において、５nmol/mlの蛍光体
濃度のスポットの蛍光が、当該スポットに隣接するスポ
ットに対して影響してしまい、０nmol/mlのスポットに
おける蛍光として検出されてしまうためである。

【００５４】これに対して、実施例１においては、比較
例１と異なり、蛍光体を含ませない場合（表１中０nmol
/ml）と０．０５nmol/mlの蛍光体濃度とを、有意差をも
って検出することができた。すなわち、実施例１では、
蛍光体濃度５nmol/mlのスポットの蛍光が、当該スポッ
トに隣接するスポットに対して影響していない。この結
果より、実施例１の生体関連物質検出用マイクロアレイ
は、微量な生体関連物質を高感度に検出することができ
ることが判った。

【００５５】〔実施例２〕実施例２では、日本ポリウレ
タン工業（株）ニッポラン4276／日本ポリウレタン工業
（株）コロネート4403／三菱化学社製カーボンブラック
（ MA100））＝６２／３８／２．５（重量比）で配合し
たポリウレタンウレタン接着剤を用いて中空状繊維集合
体を作製した以外は、実施例１と同様にして、生体関連
物質検出用マイクロアレイを作製した。

【００５６】〔比較例２〕比較例２では、中空状繊維の
側面に反射膜を形成しない以外は、実施例２と同様の方
法で、厚さ約750μmの生体関連物質検出用マイクロアレ
イを作製した。〔結果〕上記方法で得た実施例２及び比較例２の生体関
連物質検出用マイクロアレイを用いて、各スポットの蛍
光強度を測定した。この測定は、蛍光顕微鏡を用いて、
１０倍の対物レンズを用い、絞りを用いて励起光を約１
００ミクロンに絞り、検出しようとするスポットに照射
して、任意の露光時間でCCDカメラC488-37で撮影し、露
光時間１秒のときの蛍光強度に規格化した。結果を表２
に示す。

【００５７】

【表２】

【００５８】表2から判るように、実施例２では、比較
例２と比較して、蛍光強度が著しく増強されている。特
に、蛍光体を含むスポットにおいては、より著しく蛍光
強度が増強されている。このことから、スポットを反射
膜により囲うとともに、各スポットの間隔にカーボンブ
ラックを含有させることによって、励起光の利用効率を
向上させてより高感度に検出することができる。

【００５９】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
係る生体関連物質検出用マイクロアレイでは、中空状繊
維の外壁に反射膜を形成しているため、中空状繊維の中
空部に対する外部からの光の影響を防止できるとともに
中空状繊維の中空部で放出された光を効率よく検出する
ことができる。したがって、この生体関連物質検出用マ
イクロアレイは、微量の生体関連物質であっても非常に
高感度に検出できるものとなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る生体関連物質検出用マイクロアレ
イの一例を模式的に示す斜視図である。

【図２】生体関連物質検出用マイクロアレイの一部を拡
大して示す要部平面図である。

【図３】実施例１で作製した生体関連物質検出用マイク
ロアレイを示す平面図である。

【符号の説明】

１生体関連物質検出用マイクロアレイ２スポット孔３反射膜

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者宮内陽子広島県大竹市御幸町20番１号三菱レイヨン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者高橋厚広島県大竹市御幸町20番１号三菱レイヨン株式会社中央技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 BB15 BB20 CC02 CC12 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR38 QR55 QR84 QS34 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の中空状繊維を、当該中空状繊維の
中心軸と平行な方向に配列し、当該中空状繊維の内壁及
び／又は中空部に生体関連物質検出プローブを固定化し
てなる生体関連物質検出用マイクロアレイにおいて、上記中空状繊維の外壁に反射膜が形成されていることを
特徴とする生体関連物質検出用マイクロアレイ。
【請求項２】上記反射膜は、金属薄膜からなることを
特徴とする請求項１記載の生体関連物質検出用マイクロ
アレイ。
【請求項３】上記反射膜は、高反射率を有する塗膜か
らなることを特徴とする請求項１記載の生体関連物質検
出用マイクロアレイ。
【請求項４】上記反射膜は、７０％以上の反射率を示
すものであることを特徴とする請求項１記載の生体関連
物質検出用マイクロアレイ。
【請求項５】上記複数の中空状繊維は、マトリックス
状に配列していることを特徴とする請求項１記載の生体
関連物質検出用マイクロアレイ。
【請求項６】上記複数の中空状繊維は、中心軸に交差
する方向から切断されてなる切断面を外方に臨ませてな
ることを特徴とする請求項１記載の生体関連物質検出用
マイクロアレイ。
【請求項７】上記複数の中空状繊維を包埋する樹脂
に、当該樹脂から生ずる光の強度を低下させる光強度低
下剤を含有させたことを特徴とする請求項１記載の生体
関連物質検出用マイクロアレイ。
【請求項８】請求項１〜７いずれか１項記載の生体関
連物質検出用マイクロアレイと、上記生体関連物質検出用マイクロアレイから出射された
蛍光を検出する光学検出手段とを備える生体関連物質検
出装置。
【請求項９】中空状繊維の内壁及び／又は中空部に生
体関連物質検出プローブを固定化してなる生体関連物質
検出用マイクロアレイを用い、当該生体関連物質検出プ
ローブと検出対象の生体関連物質とのハイブリッドを形
成し、当該ハイブリッドから放射された光を中空状繊維の外壁
で反射させて、当該ハイブリッドから放射された光と当
該反射光とを検出することを特徴とする生体関連物質検
出方法。