JP2008128670A

JP2008128670A - 色素粒子保持ゲル保持貫通孔型マイクロアレイ

Info

Publication number: JP2008128670A
Application number: JP2006310530A
Authority: JP
Inventors: Chuhei Otsuki; 宙平大槻; Teruhiro Ishimaru; 輝太石丸; Naoyuki Togawa; 直之外川
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2006-11-16
Filing date: 2006-11-16
Publication date: 2008-06-05

Abstract

【課題】本発明は、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイにおいて、その製造時にゲル等の欠陥を容易に検出でき、且つ生体関連物質の検出に影響を与えないマイクロアレイを提供する。
【解決手段】キャプチャープローブ及び色素粒子が保持されたゲルが保持された貫通孔を有するマイクロアレイであって、色素粒子は蛍光色素粒子であり、且つ、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する蛍光波長領域とは異なる蛍光波長領域を持つ粒子である、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイを使用することにより、蛍光顕微鏡を用い、製造時、及び生体関連物質の検出が容易に可能となる。
【選択図】図２

Description

本発明は、各スポットの形状を正確に検査することができる、キャプチャープローブ及び色素粒子が保持されたゲルが充填された複数の貫通孔を有するマイクロアレイに関する。

近年、遺伝子、タンパク質、ペプチド、糖類、アプタマー等の生体関連物質を検出するツールとして、キャプチャープローブを保持したスポットを基板上に配列させたマイクロアレイが利用されている。その中でも、遺伝子ＤＮＡをキャプチャープローブとして、平面基盤に配列させたＤＮＡマイクロアレイは、将来の遺伝子検査ツールとして注目されている。本発明者らも、先に繊維を利用したマイクロアレイを開発している（特許文献１参照）。このマイクロアレイは、例えば、以下の方法により製造することができる。

（１）複数本の繊維を長手方向が同一となるように集束し、集束物を固定する。

（２）各繊維の繊維の表面及び／又は繊維の中空部に、核酸等のキャプチャープローブを固定化したゲルを保持する。

（３）集束物を繊維の長手方向と交叉する方向で切断を繰り返し、薄片を得る。

更に、本発明者らは、上記マイクロアレイのゲルの変形、脱落等を容易に検出する方法として、例えば、蛍光色素を固定化することにより、蛍光顕微鏡を用いて製造時、及びハイブリダイゼーション時におけるゲルの充填、変形、脱落状態等を容易に検出する方法を開発した。
ＷＯ００／５３７３６号

しかし、単に蛍光色素をゲルに保持し、ゲルの変形、脱落等を検出する方法では、生体関連物質を蛍光検出する場合、予めゲルに保持している蛍光色素が光学的ノイズとなり、生体関連物質の検出が正確にできないという難点を有していた。

本発明は、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイにおいて、その製造時にゲル等の欠陥、具体的には重合斑等によるゲル抜けを容易に検出でき、且つ生体関連物質の検出に影響を与えないマイクロアレイを提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体関連物質を検出する際に使用する蛍光波長領域とは異なる検出波長領域を有する色素粒子を、ゲルに保持することにより、蛍光顕微鏡を用いて製造時に製造時にゲル等の欠陥が容易に検査できることを可能とし、また生体関連物質の検出が容易に実現できることを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、キャプチャープローブ及び色素粒子が保持されたゲルが充填された複数の貫通孔を有するマイクロアレイであって、
該色素粒子は、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する蛍光波長領域とは異なる蛍光波長領域を持つ粒子である、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイ、である。

本発明により、マイクロアレイ中に存在するゲルの充填状態を容易に確認できるため、マイクロアレイの検品作業の効率が著しく向上する。また、ハイブリダイゼーション後にゲルの充填状態を容易に確認できるため、ハイブリッドを形成していないのか、ゲルが欠落しているのかを容易に判断できる。

本発明は、キャプチャープローブ及び色素粒子が保持されたゲルが充填された複数の貫通孔を有するマイクロアレイであって、該色素粒子は、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する蛍光波長領域とは異なる蛍光波長領域を持つ粒子である、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイ、である。

ゲル保持貫通孔型マイクロアレイとは、基盤に複数の貫通孔が配列されており、各貫通孔内にゲルが保持され、ゲルにはキャプチャープローブが保持されているマイクロアレイをいう。例えば、WO00/53736号に記載の、貫通孔が中空繊維により構成され、その中空繊維の中空部にゲルと共にキャプチャープローブが保持されたマイクロアレイである。

また、特開2000-60554号に記載の複数の貫通孔が形成された基盤の各貫通孔にゲルと共にキャプチャープローブが保持されたマイクロアレイである。

キャプチャープローブとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）などの核酸類、蛋白質、糖類などが挙げられる。これらは、市販品又は生細胞等から得られたもの何れでもよい。例えば、生体高分子として核酸を用いる場合には、生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)参照）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)参照）等により行うことができる。

更には、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡが用いられる。これらのＤＮＡは、制限酵素若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。

ゲルとしては、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等から選ばれた少なくとも一種類以上の単量体と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。また、アガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル又はこれらを架橋したゲルを用いることができる。

前記キャプチャープローブは、そのままゲルに固定化してもよく、また化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変成させたものを固定化してもよい。キャプチャープローブのゲルへの固定化は、ゲルに物理的に包括する方法、ゲルの構成成分（ネットワーク）への直接的な結合方法、キャプチャープローブを予め高分子体や無機粒子などの担体に共有結合又は非共有結合させ、その担体をゲルに固定化する方法等が挙げられる。例えば、キャプチャープローブとして、核酸をゲル構成成分へ、直接的に結合させるには、核酸の末端基にビニル基を導入し、アクリルアミド等のゲルの構成成分と共重合させる方法等が利用できる（WO98/39351号参照）。

色素粒子としては、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する波長領域とは異なる波長領域を持つ蛍光色素粒子である。

蛍光色素は、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する波長領域では、蛍光を発しない蛍光特性を有する色素であり、５００nmよりも短波長領域に蛍光波長領域を有する色素が望ましい。これは一般的に知られている蛍光色素、例えば、ローダミン、TexasRed、Fluorescein 、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Oregon Green、Pacific Blue、R-Phycoerythrin、Rhodol Green、Coumarin誘導体、Amino Methyl Coumarin、Cyber green 、Cy-dyeなどは、標識化色素として、一般的に用いられており、いずれも５００nmより長波長領域に、蛍光波長領域を有するからである。

また、色素粒子は粒子形態にてゲルに保持されている。このように粒子形態で保持させることで、特に結合性の官能基を導入しなくても、物理的にゲル中に包括させることが容易にできるからである。

色素粒子のサイズは、ゲル中に均一に分散し、且つゲル中に保持できるサイズであれば特に限定されない。ゲル保持貫通孔型マイクロアレイの場合は、ゲル形成性溶液と共に該色素粒子を貫通孔内へ導入する必要があるため、その際、管状体内部を該粒子が閉塞させないサイズであることが好ましい。また、ゲルに物理的に包括する方法で保持させる場合には、粒子サイズがゲルのポアサイズよりも小さいとゲルの中に粒子を十分に留めておくことは難しい。従って、色素粒子の好ましい粒子サイズとしては、５０nm以上５０００nm以下、更に好ましくは、１００nm以上２０００nm以下である。

次に上記ゲルマイクロアレイの一例である中空繊維を利用したマイクロアレイの製造方法に関して説明する。このマイクロアレイは、例えば、以下の方法により製造することができる。

（１）複数本の中空繊維を長手方向が同一となるように集束し、集束物を固定する。

（２）各中空繊維の中空部に、キャプチャープローブ及び蛍光色素粒子を固定化したゲルを保持する。

（３）集束物を繊維の長手方向と直交する方向で切断を繰り返し、薄片を得る。

第１の工程において、中空繊維の集束物を調製する方法としては、例えば、複数の穴の開いた多孔板を２枚以上準備し、それらの多孔板に繊維を通し、多孔板間の間隔を広げ、多孔板の間に包埋剤を加え、繊維束を固定し、集束物を調製する方法、繊維を等間隔に配置・固定した板状物を複数枚準備し、それらを積層して集束物を調製する方法等が挙げられる。

第２の工程において、第１の工程で調製した集束物の各中空繊維の中空部に、キャプチャープローブ及び蛍光色素粒子を含むゲル前駆体溶液を導入し、中空部内でゲル化させる。

第３の工程において、ミクロトーム等で集束物を繊維の長手方向と直交する方向で切断を繰り返し、薄片を得る。

このように製造されたゲル保持貫通孔型マイクロアレイは、蛍光色素で標識された検体を利用したハイブリダイゼーションを行う場合に、検出波長におけるゲルの高い透明性を損なうことなくゲルの視認性を付与できるので、ゲルスポットの形状等を検査する上で有用である。

本発明を実施例により更に詳細に説明する。

（１）繊維配列体の調製
ポリカーボネート中空繊維(三菱エンジニアリングプラスチック株式会社製，外径280μm，内径190μm)19本を、テフロン（登録商標）板上に互いに重なることなく密着させて配列し両端を固定した。これにポリウレタン樹脂接着剤(日本ポリウレタン工業(株)コロネート4403,ニッポラン4223)を薄く塗布し、中空繊維を接着した。ポリウレタン樹脂が十分に固まった後これをテフロン（登録商標）板上から剥がし、核酸固定化ゲルを保持した中空繊維が一列に配列したシート状物を得た。これらのシート状物を12枚積層し、上記接着剤で接着し、縦横各々12x19本、計２２８本の中空繊維が正方に規則的に配列した、中空繊維配列体を得た。

（２）色素粒子含有溶液の調製
色素粒子として、セラダイン社製のMiscellaneous Fluorescent Latex（ＣＭＦＢ２６１０）を使用した。（粒子サイズ；１．１μｍ、励起波長；３５８nm、発光波長；４１０nm）
まず、ＣＭＦＢ２６１０原液（ラテックス濃度１０ｗｔ％）を超純水で希釈して、表１に示した各濃度になるようにラテックス溶液をそれぞれ調製した。

＜表１＞

（３）ジメチルアクリルアミドモノマー溶液
次に、ジメチルアクリルアミドモノマー溶液を表２に従って調製した。

＜表２＞

（４）色素粒子含有溶液とモノマー溶液の混合
次に、中空繊維配列体へ導入するモノマー溶液の調製を３８４マイクロウェルプレートで行った。まず、図１に示す３８４マイクロウェルプレートの所定の各ウェルに、上記（２）で調製した各色素粒子含有溶液を６μｌ分注し、更に同じウェルに上記（３）で調製した溶液１８μｌを分注し、プレート振とう機で両液をウェル中で混合した。

このようにして、種々の濃度の色素粒子が所定ウェル（４ｘ１１箇所）に分注された３８４マイクロウェルプレートを作製した。

（５）マイクロアレイの作製
（４）で作製した色素粒子含有モノマー溶液を分注した３８４マイクロウェルプレートの溶液を分注した所定のウェルに、先に作製した中空繊維配列体の中空糸の先端を浸漬させ、溶液を吸い上げ、中空繊維中空部へ導入し、６０℃で３時間重合反応させた。重合反応終了後、配列体からミクロトームを用いて２５０μｍの薄片を切り出し、マイクロアレイを作製した。

（６）ゲルスポットの観察
色素粒子が中空繊維の中空部へ導入されているかを確認するために、顕微鏡（ニコン製生物顕微鏡Ｅ６００）でゲルスポットを観察し、色素粒子がゲルスポット内に包括されていることを目視で確認した（図２参照）。

（７）結果
下記機器を使用して、（５）で得られたマイクロアレイの各スポットが、短波長での励起（360nm付近）により、発した蛍光を認識できるかを確認するために、下記条件でスポット画像の観察とゲルスポットの蛍光シグナル強度を測定した。

＜使用機器＞
◆ 顕微鏡：ニコン製生物顕微鏡 E600
・対物レンズ × 4 NA 0.13
×10 NA 0.30
×20 NA 0.50
×40 NA 0.75
・フィルター１：UV-1A EX365/10 DM400 BA400 （短波長検出用フィルター）
２：Ｃｙ５フィルター（比較用）
◆ CCDカメラ：浜松ホトニクス製 C4880-37
＜短波長条件での検出結果＞
得られたスポット画像を図３に示した。色素粒子の各濃度水準に応じた蛍光シグナルが得られ、試料濃度１の粒子濃度；８３３ｐｐｍ（スポット中の濃度に換算した粒子濃度；２０８ｐｐｍ）で十分認識が可能な感度で検出できることを確認した。

＜Ｃｙ５励起波長での検出＞
次にＣｙ５励起波長で同様にスポットの検出を試みた。図４に示した通り、スポットの蛍光シグナルは検出されないことを確認した。一方、U-MNUA2フィルターを使用した励起波長３６５nmでスポットの検出を行うと、図５に示した通り、色素粒子由来の蛍光シグナルが確認出来た。

色素粒子含有溶液を所定エリアに分注したウェルプレートの図である。

×20 透過像スポット画像（試料濃度１）を示した図である。

励起波長３６５nmにおけるマイクロアレイのスポット画像を示した図である。

Ｃｙ５フィルターを使用した時の蛍光検出画像及び蛍光強度ラインプロファイルを示した図である。

励起波長３６５nmでの蛍光検出画像及び蛍光強度ラインプロファイルを示した図である。

Claims

キャプチャープローブ及び色素粒子が保持されたゲルが充填された複数の貫通孔を有するマイクロアレイであって、
該色素粒子は、キャプチャープローブとのハイブリットを検出する蛍光波長領域とは異なる蛍光波長領域を持つ粒子である、ゲル保持貫通孔型マイクロアレイ。