KR100898623B1 - 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판에 고정화시키는방법 - Google Patents

금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판에 고정화시키는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판에 고정화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, (a) 금 나노입자와 바이오 물질을 혼합하여 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 기판상에 스팟팅(spotting)하여, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 상기 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 기판에 고정시키는 단계를 포함하는, 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판상에 고정화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 3차원 구조로 인하여 금 나노입자가 더욱 많은 바이오 물질과 결합함으로 인해서 기존의 방법에 비하여 바이오 물질의 고정화 용량을 증가시킬 수 있으며, 금 나노입자와 기판과의 흡착에 의한 결합으로 인하여 기존의 공유결합에 비하여 고정화가 균일하고 안정적으로 형성되는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 바이오칩의 고정화 상태를 은 나노입자의 증폭에 의해 단시간 내에 간단하게 검사할 수 있다.
금 나노입자, 고정, 바이오칩

Description

금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판에 고정화시키는 방법{Method for Immobilzing Biomolecules on Substrate Using Gold Nanoparticles}
도 1은 본 발명에 따른 금 나노입자와 아민 DNA의 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 유리기판상에 고정화시키는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 금 나노입자와 양쪽 말단이 각각 Cy5 및 아민으로 치환된 DNA의 복합체를 제조한 후, 상기 복합체를 알데히드 유리기판 및 아민 유리기판에 고정화시킨 상태를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 3에서 제조한 금 나노입자-DNA칩 상에 목적 DNA 1 및 목적 DNA 2를 각각 혼성화시킨 결과를 스캐닝한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 3에서 제조한 금 나노입자-DNA칩의 불량 스팟과 양호한 스팟에 대해 은 나노입자의 증폭을 통하여 고정화 상태를 검사한 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 금 나노입자를 이용하지 않고 바이오 물질을 고정화시킬 경우와 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 고정화시킬 경우의 고정화 비율(a)과 혼성화 비율(b)을 비교한 그래프이다.
발명의 분야
본 발명은 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판에 고정화시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는, (a) 금 나노입자와 바이오 물질을 혼합하여 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 제조하는 단계 및 (b) 상기 복합체를 기판상에 스팟팅(spotting)하여, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 상기 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 기판에 고정시키는 단계를 포함하는, 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 기판상에 고정화시키는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
바이오칩은 표면 개질된 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 등의 고분자 기판을 포함하는 여러 가지 종류의 고체 표면에 DNA, 단백질 등의 바이오 물질을 정해진 위치에 고밀도로 부착시켜 미세 집적시킨 것을 통칭한다. 이러한 바이오칩은 짧은 시간 내에 많은 샘플들을 동시에 분석할 수 있기 때문에 다방면에 응용이 될 수 있다.
최근 그 응용 가능성이 급격히 확대되고 있는 바이오칩의 성능은 크게 다음의 특이성, 민감성 그리고 재연성의 세 가지로 구분될 수 있다. 구체적으로는 첫째, 바이오칩은 검사하고자 하는 목적 물질을 정확하게 분석할 수 있어야 한다. 즉, 샘플 내에 존재하는 많은 다른 물질과 구분될 수 있도록 목적물질만을 감지할 수 있는 높은 특이성을 가지고 있어야 한다. 둘째, 통상적으로 바이오칩의 대상 샘플이 인간의 유전자나 단백질 추출용액이므로 매우 낮은 농도의 목적물질도 충분히 감지할 수 있는 민감성을 가지고 있어야 한다. 셋째, 바이오칩 제품은 제작되는 시기나 제작자에 상관없이 항상 일정하고 동일한 성능을 보이는 재연성이 있어야 한다.
이러한 특이성, 민감성 및 재연성을 포함하는 바이오칩의 성능에 큰 영향을 미치는 것 중의 하나가 고정화 방법이다. DNA 칩의 경우, 여러 가지 고정화 기술들이 개발되어 왔으며, 대표적으로 덴드리머(dendrimer) 그리고 가상-3D(pseudo-3D) 구조들을 이용하여 고정화 밀도를 늘리고, 혼성화 효율을 높이는 기술들이 개발되어 왔다. 기존에 개발되어온 고정화 기술들은, 대부분 화학적인 합성 방법에 기본을 두고 있기 때문에, 특별한 합성 기술을 필요로 하고 절차가 복잡하며 통상적으로 많은 시간을 요하는 단점이 있다.
한편, DNA 칩에 있어서 또 하나의 커다란 이슈는 칩 상의 고정화 상태를 손쉽게 검사할 수 있는 기술의 개발이다. 기존에 개발된 검사 방법은 크게 다음과 같은 두 가지 방법으로 나뉠 수 있다. 첫째로, DNA 칩 중의 일부를 무작위로 샘플링을 한 후, 실제 목적 유전자와 반응을 시킨 후 반응 결과를 형광 등으로 분석함으로써 고정화 상태를 유추하여 평가하는 방법이 있다. 또 다른 방법은 DNA 고정화 용액에 DNA 반응과는 무관한 별도의 형광 염료 등을 혼합한 후 고정화를 수행하고, 상기 형광염료의 고정화 상태를 조사함으로써 고정화 용액 내의 캡쳐(capture) DNA의 고정화 상태를 유추 평가하는 방법이다. 그러나, 상기 샘플링에 의한 고정화 검 사 방법은 실제 형광이 레이블링된 목적 샘플을 사용하기 때문에 비용이 많이 들고 혼성화 반응을 수행하는 데 많은 시간이 소요되는 단점이 있고, 상기 형광 염료를 혼합하는 방법 또한 추가적인 형과 염료 비용이 소요되고 형광스캐닝 등의 추가 작업을 요한다는 단점이 있다.
최근, 금 나노입자로 말단이 SH로 개질된 DNA를 실리콘 기판에 고정화시키는 방법이 공개된바 있다 (C. Minard-Basquin et al., IEE Proc.-Nanobiotechnol, 97:103, 2005). 그러나, 이러한 방법은 DNA를 SH로 개질하는데 3~4일이라는 비교적 긴 시간이 소요되고, 실리콘 기판이라는 한정된 기판에만 DNA를 고정화할 수 있다는 단점이 있다.
따라서, 당업계에서는 상기의 문제점들을 해결하기 위하여, 간편하게 바이오 물질을 기판에 고정화할 수 있는 방법, 상기 방법을 이용하게 제조된 바이오칩 및 상기 바이오 물질의 고정화 상태를 용이하면서도 단시간 내에 수행할 수 있는 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 측정방법에 대한 요구가 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 금 나노입자를 이용하여 바이오물질을 흡착을 통해 기판상에 고정함으로써 간편하게 바이오물질을 기판에 고정화할 수 있고, 상기 고정화를 통하여 제조된 바이오칩에서 바이오 물질의 고정화 정도를 은 나노입자의 증폭을 이용하여 간편하고 단시간 내에 측정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 기판상에 고정화시키는 방법, 상기 방법으로 제조된 바이오칩 및 상기 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 측정방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 금 나노입자와 바이오 물질의 혼합하여 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 복합체를 기판상에 스팟팅(spotting)하여, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 상기 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 기판에 고정시키는 단계를 포함하는, 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 기판상에 고정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오 물질은 DNA, RNA, PNA 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 DNA 또는 RNA는 아민기가 도입된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 알데히드기 또는 아민기로 개질된 것임을 특징으로 할 수 있고, 상기 알데히드기로 개질된 기판과의 공유결합에 의해 바이오 물질이 추가로 고정되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 아민기로 개질된 기판과의 교차결합에 의해 바이오 물질이 추가로 고정되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 상기 방법으로 제조되고, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오 물질 복합체가 기판에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 제조되고, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오물질 복합체가 기판에 고정되어 있으며, 동시에 알데히드기로 개질된 기판에 바이오 물질이 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 제조되고, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오물질 복합체가 기판에 고정되어 있으며, 동시에 아민기로 개질된 기판에 바이오 물질이 교차결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 (a) 은 이온을 포함하는 용액과 은 이온을 환원시키는 용액을 혼합하여 은 나노입자 증폭을 위한 혼합용액을 제조하는 단계, (b) 상기 바이오칩과 (a) 단계의 혼합용액을 반응시켜 은 나노입자를 증폭시키는 단계 및 (c) 은 나노입자 증폭결과를 측정하여 바이오 물질의 고정화 상태를 확인하는 단계를 포함하는, 바이오칩에서 바이오물질의 고정화 상태를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 은 이온을 포함하는 용액은 초산은(silver acetate) 용액이고, 상기 은 이온을 환원시키는 용액은 하이드로퀴논(hydroquinone) 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-아민기 도입 DNA 복합체가 금 나노입자를 링커로 기판에 고정되어 있는 DNA칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 혼성화 반응의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA칩은 알데히드기로 개질된 기판에 아민기 도입 DNA가 추가로 공유결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 DNA칩은 아민기로 개질된 기판에 아민기 도입 DNA가 추가로 교차결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 바이오 물질을 기판에 고정화할 때, 금 나노입자를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 금 나노입자는 3차원 구조를 가짐으로 인하여 바이오 물질이 결합할 수 있는 넓은 표면적을 제공할 수 있고, 그에 따라 상기 바이오 물질이 고밀도로 금 나노입자에 고정화될 수 있도록 한다. 또한, 상기 금 나노입자는 흡착에 의해 기판상에 손쉽게 결합되므로, 바이오 물질을 기판에 간편하게 고정화하고(도 1), 은 나노입자의 증폭을 통하여 본 발명에 따른 바이오칩의 고정화 상태를 측정가능하게 한다.
본 발명에서는 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 기판에 고정화하기 위하여, 우선 금 나노입자와 바이오물질의 복합체(이하, 금 나노입자-바이오물질 복합체라 함)를 제공한다. 상기 금 나노입자-바이오물질 복합체는 금 나노입자와 바이오물질을 혼합한 후, 상온에서 반응시키는 것만으로도 간편하게 생성되며, 이는 기본적으로 금 나노입자는 표면이 음전하를 띠고 있으므로 정전기적인 힘에 의하여 양전하를 띠는 부분이 있는 바이오 물질들과 쉽게 결합을 하는 특징이 있기 때문이다.
본 발명에 따른 일 구현예로서, 바이오물질은 DNA, 기판은 유리기판을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기와 같이 금 나노입자가 알데히드로 개질된 알데히드 유리기판 및 아민으로 개질된 아민 유리기판에 흡착하는 특성을 이용하여 금 나노입자에 결합된 DNA를 유리기판에 용이하게 고정화시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서는 금 나노입자가 유리기판 표면에 흡착하는 것과 동시에, 금 나노입자에 결합된 DNA의 일부가 알데히드 유리기판 및 아민 유리기판에 각각 공유결합 및 교차결합을 형성함으로써, 결과적으로 금 나노입자-DNA 복합체 전체를 상기 알데히드 유리기판 및 아민 유리기판에 고정화시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
일반적으로, 말단에 아민기를 함유하지 않는 DNA를 사용할 경우, 상기 DNA의 염기부분이 정전기적 힘에 의해 금 나노입자의 표면과 결합할 수는 있으나, 고정화된 DNA의 염기부분이 목적 DNA와 혼성화 반응을 하게되면, 상기 고정화된 DNA는 금 나노입자의 표면으로부터 탈착하게 된다. 이와 같은 DNA의 탈착현상을 방지하기 위하여, 금 나노입자와 결합할 DNA 사슬 끝에 아민기를 도입하였다. 이 경우, DNA 사슬 끝에 도입된 아민이 금 나노입자와 결합함으로써, 상기 유리기판에 고정화된 DNA의 염기부분이 혼성화 반응에 관여하더라도 상기 고정화된 DNA는 유리기판에 그대로 존재할 수 있다 (Li, H. et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 14036:14039, 2005).
따라서, 상기 공유결합을 이용한 고정화 방법을 사용할 경우, 일부 DNA는 염 기 부분을 통하여 금 나노입자와 결합하는 동시에 DNA 사슬 끝에 도입된 아민기가 유리표면의 알데히드와 공유결합을 형성할 수도 있다.
한편, 본 발명에서 바이오물질로서 사용될 수 있는 DNA 및 RNA는 핵산으로서 유전정보를 갖는 고분자이며, 뉴클레오티드라는 수많은 단위체로 구성된다는 공통점이 있다. 다만, DNA와 RNA는 뉴클레오티드에 포함된 당의 종류가 다르고, DNA는 RNA와는 달리 두 가닥으로 이루어져 있는 이중나선 구조라는 점에 차이가 있으나, 본 발명의 바이오 물질로서 DNA를 고정화시키는 공정에 RNA를 적용하는 것은 당업자에게 있어서 자명한 사항이라 할 것이다.
본 발명에 따른 다른 일 구현예로서, 바이오물질은 단백질 및 PNA, 기판은 유리기판을 사용할 수 있다.
단백질 및 PNA는 그 자체로서 아민기를 가지므로, 상술한 바와 같이 별도로 아민기를 도입할 필요없이, 금 나노입자와 단백질의 복합체를 제조한 뒤, 상기 복합체를 알데히드 유리기판 및 아민 유리기판에 고정화할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 고정화 방법을 이용하여 제조된 바이오칩에 있어서, 상기 바이오칩에서 바이오물질이 기판에 고정화된 상태를 검사할 수 있는 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 측정방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 측정방법에 따르면, 금 나노입자-바이오물질 복합체를 이용하여 상기 바이오물질의 고정화를 수행할 경우, 고정화된 금 나노입자 주변에서 은 나노입자의 증폭을 실행함으로써, 용이하게 바이오물질의 고정화 상태를 검사할 수 있다. 또한, 기존의 약 4~6시간이 소요되는 목 적 DNA 혼성화 반응을 통한 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 측정방법에 비해서 현저하게 단축된 시간인 약 20분 내로 바이오물질의 고정화 상태를 검사하는 것이 가능하다. 뿐만 아니라, 고가의 형광스캐너를 필요로 하는 기존의 형광분석을 통한 고정화 상태 검사방법에 비해서, 증폭된 은 나노입자는 광학현미경 또는 육안을 통해서도 검사가 가능하기 때문에, 비용적인 측면에서도 매우 효율적인 방법이라 하겠다.
한편, 기존의 바이오칩에서 바이오 물질의 고정화 방법에서는 고정화된 바이오 물질의 배향을 좋게 하기 위해서 염이 포함된 버퍼를 사용하게 되는데, 이럴 경우 염이 결정화되면서 불량 스팟이 발생할 확률이 크다. 반면에, 본 발명에 따라 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 고정화하면, 버퍼를 사용하지 않아도 될 뿐만 아니라 나노 스케일의 입자를 사용함으로 인하여 바이오 물질의 고정화가 균일하고 안정적으로 형성할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는, 바이오물질로서 DNA를 사용하였으나, RNA, PNA, 단백질 등 다양한 바이오 물질이 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 하기 실시예에서는, 기판으로서 유리기판을 사용하였으나, 일반적으로 바이오칩을 제조하기 위한 여러 종류의 기판이 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 하기 실시예에서는, 스팟방법으로서 마이크로어레이 스팟터(Microarray Spotter: VersArray ChipWriterTMCompact system, Bio-Rad)를 이용하는 스팟방법을 사용하였으나, 바이오 물질을 기판에 스팟하기 위한 다양한 방법을 사용하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
실시예 1 : 금 나노입자의 제조
구연산나트륨(sodium citrate)을 이용하여 HAuCl4을 환원시켜 금 나노입자를 제조하였다(Mucic, R.C. et al., J. Am. Chem. Soc., 12674:12675, 1998). 제조된 금 나노입자는 TEM 및 UV 값을 이용하여 각각 그 크기 및 농도를 측정한 결과, 상기 금 나노입자는 13 ± 2 nm의 크기를 가지고, 6.3nM의 농도를 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 금 나노입자-DNA칩의 제조
<단계 1> 금 나노입자-DNA 복합체 제조
실시예 1에서 제조된 금 나노입자와 서열번호 1 및 2의 양쪽 끝이 각각 Cy5와 아민(NH2)으로 레이블링(labling)된 DNA 1 및 DNA 2(표 1)를 각각 혼합한 후, 12시간 동안 반응시켜, 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체를 제조하였다.
DNA 프로브 프로브의 염기서열 (5'-3')
DNA 1 Cy5 - TCCAGCTACCAGAAAAAAAAAA - NH2(서열번호 1)
DNA 2 Cy5 - GCTACCAGTCCAAAAAAAAAAA - NH2(서열번호 2)
<단계 2> 알데히드로 개질된 기판에의 고정화를 이용한 바이오칩 제조
단계 1에서 제조된 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체를 마이크로어레이 스팟터(Microarray Spotter: VersArray ChipWriterTMCompact system, Bio-Rad)에 탑재하고, 알데히드로 개질된 유리기판의 표면상에 스팟팅한 후 (도 2의 (a)), 빛이 차단된 장소에서 12시간 동안 반응시켜 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체를 유리기판에 고정화하였다. 상기 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체가 고정된 유리기판을 SDS(sodium dodecyl sulfate)용액 및 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음, NaBH4(Sodium borohydride)을 이용하여 상기 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체와 유리기판의 공유결합을 유도하였다. 그 후 SDS와 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음 건조시켜 금 나노입자-DNA칩을 스캐너로 확인하였다 (도 2의 (b)).
<단계 3> 아민으로 개질된 기판에의 고정화를 이용한 바이오칩 제조
단계 1에서 제조된 제조된 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체 을 마이크로어레이 스팟터 (Microarray Spotter: VersArray ChipWriterTMCompact system, Bio-Rad)에 탑재하고, 아민으로 개질된 유리기판의 표면상에 스팟팅한 후(도 2의 (c)), 빛이 차단된 장소에서 12시간 동안 반응시켜 상기 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체를 유리기판에 고정화하였다. 금 나노입자-DNA 1 복합체 및 금 나노입자-DNA 2 복합체가 고정된 유리기판을 UV cross linker를 이용하여 교차결합을 시킨 후 SDS용액 및 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음, 건조시켜 금 나노입자-DNA칩을 스캐너로 확인하였다 (도 2의 (d)).
실시예 3 : 금 나노입자-DNA칩의 특이적인 혼성화 반응
<단계 1> 혼성화 반응의 특이성 측정을 위한 금 나노입자-DNA칩 제조
DNA 프로브 이름 프로브의 염기서열 (5'-3')
DNA 1' NH2 - AAAAAAAAAAGACCATCGACCT (서열번호 3)
DNA 2' NH2 - AAAAAAAAAAACCTGACCATCG (서열번호 4)
목적 DNA 1 Cy3 - AGGTCGATGGTC (서열번호 5)
목적 DNA 2 Cy3 - CGATGGTCAGGT (서열번호 6)
혼성화 반응의 특이성 측정을 위하여, 서열번호 3 및 4에 각각 아민기가 도입된 DNA 1' 및 DNA 2'(표 2)를 각각 금 나노입자와 약 12시간 동안 반응시킨 후, 금 나노입자-DNA 1' 복합체 및 금 나노입자-DNA 2' 복합체를 제조하였다. 그 후 제조된 금 나노입자-DNA 1' 복합체 및 금 나노입자-DNA 2' 복합체를 마이크로어레이 스팟터 (Microarray Spotter: VersArray ChipWriterTMCompact system, Bio-Rad 사)에 탑재하고, 알데히드로 개질된 유리기판의 표면상에 스팟팅한 후(도 3의 (a)), 빛이 차단된 장소에서 12시간 동안 반응시켜 금 나노입자-DNA 1' 복합체 및 금 나노입자-DNA 2' 복합체를 상기 알데히드 유리기판에 고정화하였다. 상기 금 나노입자-DNA 1' 복합체 및 금 나노입자-DNA 2' 복합체가 고정화된 유리기판을 SDS용액 및 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음, NaBH4로 공유결합을 유도하였다. 그 후 SDS와 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음 건조시켜 금 나노입자-DNA칩을 제조하였다.
<단계 2> 특이적 혼성화 반응 측정
서열번호 5 및 6에 각각 Cy3를 레이블시킨 목적 DNA 1 및 목적 DNA 2(표 2)를 각각 100nM 농도로 희석한 다음, 이 중 30μl를 단계 1에서 제조된 바이오칩에 첨가하고, 상기 바이오칩과의 혼성화 반응을 측정하였다. 37℃에서 3시간 반응시킨 후, 상기 바이오칩을 세척 버퍼{0.005% Triton X-100 and 6X SSPE (0.9 M NaCl, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA, pH 7.4)}로 10분간 세척하고, 증류수로 10분간 세척한 후, 건조시켰다.
그 후, 혼성화 정도와 특이성 정도를 스캐너로 확인한 결과, 목적 DNA 1(목적)은 정확하게 DNA 1'에만 반응을 하고 DNA 2'에는 전혀 결합하지 않았고(도 3의 (b)), 목적 DNA 2는 DNA 2'에 특이적으로 반응하였다 (도 3의(c)). 결국, 목적 DNA는 염기서열에 따라서 금 나노입자-DNA 복합체의 DNA와만 특이적으로 반응하고 금 입자 또는 유리 표면에 비특이적으로 결합하지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 4 : 바이오칩의 바이오물질 고정화 상태 검사
<단계 1> 바이오물질 고정화 상태 검사를 위한 바이오칩 제조
실시예 3의 단계 1에서 제조한 바이오칩(도 4의 (a)) 중에서 불량 스팟과 양호한 스팟을 가지는 두 가지의 바이오칩을 준비하였다.
<단계 2> 은 나노입자 증폭 처리를 통한 고정화 상태 측정
은 나노입자 증폭을 위한 용액 A(silver salt, Sigma, USA)와 B(hydroquinone initiator, Sigma, USA)의 혼합용액을 제조한 후, 실시예 3의 단계 1에서 제조한 바이오칩 중에서 불량한 스팟과 양호한 스팟을 가지는 두 가지의 바이오칩과 상기 혼합용액을 각각 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 그 결과, 불량 스팟의 경우는 은 나노입자 증폭 결과가 제대로 나오지 않았고(도 4의 (b)), 양호한 스팟의 경우는 은 나노입자 증폭 결과가 제대로 나온 것을 확인하였다 (도 4의 (c)).
비교예 1: 금 나노입자 사용 유·무에 따른 DNA 고정화 비율의 비교
양쪽 끝이 각각 아민과 Cy5로 치환된 표 1의 DNA 1, 고정화 버퍼 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 혼합하여 제조한 샘플과 실시예 2의 금 나노입자-DNA 1 복합체를 준비한 후, 상기 샘플 및 금 나노입자-DNA 1 복합체를 각각 마이크로어레이 스팟터를 이용하여 알데히드 유리기판에 스팟팅한 다음 12시간 동안 반응시켰다. 상기 샘플 및 금 나노입자-DNA 복합체가 각각 스팟팅된 유리기판을 SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액과 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음, NaBH4로 공유결합을 유도하였다. 그 후 SDS와 증류수로 각각 순차적으로 세척한 다음 건조시켜 DNA칩 및 금 나노입자-DNA칩을 제조한 다음, 형광 스캐너로 상기 DNA칩 및 금 나노입자-DNA칩의 고정화 정도를 C.y5의 형광 세기로 측정하였다.
상기 DNA칩과 금 나노입자-DNA칩의 DNA 고정화 비율을 비교한 결과, 금 나노입자를 이용하여 DNA를 고정화한 금 나노입자-DNA칩의 고정화 비율이 높게 나타났으며, 3차원 구조의 금 나노입자 표면에 DNA가 결합함으로 인하여 더욱 많은 양의 DNA가 고정화되었음을 알 수 있었다 (도 5의 (a))
비교예 2: 금 나노입자 사용 유·무에 따른 혼성화 비율의 비교
한쪽 끝이 아민으로 치환된 표 2의 DNA 1', 고정화 버퍼 및 DMSO를 혼합한 샘플과 실시예 3의 <단계 1>의 금 나노입자-DNA 1'를 준비한 후, 상기 샘플 및 금 나노입자-DNA 1' 복합체를 각각 마이크로어레이 스팟터를 이용하여 알데히드 유리기판에 스팟팅한 다음 12시간 동안 반응시켰다. 상기 샘플 및 금 나노입자-DNA 1' 복합체가 각각 스팟팅된 유리기판을 SDS(Sodium dodecyl sulfate)용액과 증류수로 순차적으로 세척한 다음, NaBH4로 공유결합을 유도하였다. 그 후 SDS와 증류수로 순차적으로 세척한 다음 건조시켜 DNA칩 및 금 나노입자-DNA칩을 제조한 다음, 혼성화 반응을 측정하였다.
Cy3 형광 레이블링된 목적 DNA 1 을 100nM 농도로 희석한 다음, 이 중 30μl를 37℃에서 3시간 동안 상기 제조된 DNA칩 및 금 나노입자-DNA칩에 반응시킨 후, 상기 DNA칩 및 금 나노입자-DNA칩을 세척 버퍼{0.005% Triton X-100 and 6X SSPE (0.9 M NaCl, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA, pH 7.4)}로 10분간 세척하고, 증류수로 10분간 세척한 후, 건조시켰다.
상기 DNA칩과 금 나노입자-DNA칩의 DNA 혼성화 비율을 비교한 결과, 금 나노입자를 이용하여 DNA를 고정화한 금 나노입자-DNA칩의 혼성성화 비율이 높게 나타났다 (도 5의 (b)).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따 라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 3차원 구조로 인하여 금 나노입자가 더욱 많은 바이오 물질과 결합함으로 인해서 기존의 방법에 비하여 바이오 물 질의 고정화 용량을 증가시킬 수 있으며, 금 나노입자와 기판과의 흡착에 의한 결합으로 인하여 기존의 공유결합에 비하여 고정화가 균일하고 안정적으로 형성되는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 바이오칩의 고정화 상태를 은 나노입자의 증폭에 의해 단시간 내에 간단하게 검사할 수 있다.
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Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 금 나노입자를 이용하여 바이오 물질을 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판상에 고정화시키는 방법:
    (a) 금 나노입자와 바이오 물질을 혼합하여 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 복합체를 기판상에 스팟팅(spotting)하여, 금 나노입자와 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판의 흡착을 통해 상기 금 나노입자-바이오 물질 복합체를 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판에 고정시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오 물질은 DNA, RNA, PNA 및 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 DNA 또는 RNA는 아민기가 도입된 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이오 물질은 알데히드기로 개질된 기판과 공유결합에 의해 추가로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이오 물질은 아민기로 개질된 기판과 교차결합에 의해 추가로 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 금 나노입자와 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오 물질 복합체가 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩.
  8. 제5항의 방법에 의해 제조되고, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오물질 복합체가 기판에 고정되어 있으며, 동시에 알데히드기로 개질된 기판에 바이오 물질이 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩.
  9. 제6항의 방법에 의해 제조되고, 금 나노입자와 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-바이오물질 복합체가 기판에 고정되어 있으며, 동시에 아민기로 개질된 기판에 바이오 물질이 교차결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이오칩.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 금 나노입자와 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판의 흡착을 통해 금 나노입자-아민기 도입 DNA 복합체가 알데히드기 또는 아민기로 개질된 기판에 고정되어 있는 DNA칩을 이용하되, 상기 DNA칩은 알데히드기로 개질된 기판에 아민기 도입 DNA가 추가로 공유결합되어 있거나, 아민기로 개질된 기판에 아민기 도입 DNA가 추가로 교차결합되어 있는 것을 특징으로 하는 혼성화 반응의 검출방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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