JP2005524849A - ラマン分光分析のフィンガープリントを備えた分析物質検出用のナノ粒子プローブ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年5月7日に出願された米国仮出願第60/378,538号(ケース番号02−338)、および2002年5月28日に出願された同第60/383,630号(ケース番号02−338−A)に基づく優先権の特典を主張する、2002年6月14日に出願された米国特許出願第10/172,428号の一部継続出願であり、これらはいずれもその全容を本願明細書に援用する。本出願中に記載の研究は、米空軍科学調査部(Air Force Office of Scientific Research )、DARPA、およびNSFの助成金により一部支援されている。したがって米国政府は、本発明に対して一部権利を有するものとする。
化学分子および生物分子に関する、高感度、高選択性の検出形式の開発は、過去10年間でなされたゲノミクスおよびプロテオミクスの進展のあらゆる可能性を実現させるために、最も重要である(非特許文献1〜4を参照のこと)。高密度遺伝子チップによって、数千の遺伝子の発現レベルを同時に調べることが可能となっている。低密度チップによって、1サンプル中の多くの考えられる生物学的有害物質(バイオハザード)を実験室および臨床現場のいずれにおいても同定できる見込みが示されてきている。容認され使用されている主要な標識技術は、現在は分子蛍光マーカーに基づくものであるが、近年のナノ粒子技術の進展によって、従来の蛍光に基づく手法よりも感度および選択性が著しく高く、おそらくは一層簡単かつ多用途の読み取り用ハードウェアを備えたシステムが示されてきている(非特許文献5〜17を参照のこと)。生物学的診断に関する研究のための次世代標識技術としてのナノ粒子に関する、精力的な議論がなされている。
の複合体は、固体支持体上に捕捉され、銀処理によりSERS効果を生じる。あるいはこの複合体を、固体支持体である基材と直接的または間接的に結合済みの分析物質と、直接的または間接的に複合体形成させることが可能である。本発明では、SERS効果は、その測定時間付近で生じる。この試薬は好都合なことに、多用途のための莫大な数の試薬に索引を付ける方法として、特定の特異的結合要素を備えた特定の粒子担体を識別する方法として粒子担体に結合した多数の異なるラマン色素を含むことが可能である。
することが可能である。支持体上の複合体中のラマン標識を、銀、金または銅などの染色物質で処理して、レーザーによる照射時にSERS効果を活性化させる。代替例として、分析物質を固体支持体基材上に直接的または間接的に捕捉し、検出用試薬と直接的または間接的に反応させてから染色およびSERS測定を実施することも可能である。2種以上の異なるラマン標識を、多用途のために粒子上で使用することも可能である。
したがって、本発明のこの実施形態の1態様では、サンプル中の1つまたは複数の、少なくとも2つの結合部位を有する標的分析物質の有無を検出するための方法を提供する。この方法は:
支持体であって、標的分析物質を直接的または間接的に同支持体上に固定するための1種類または複数種類の第1の特異的結合相補物または捕捉プローブが結合した支持体を提供する工程と、
1種類または複数種類の検出用プローブを提供する工程であって、それぞれの種類の検出用プローブが(a)1つまたは複数のラマン活性標識、および(b)特異的標的分析物質と直接的または間接的に結合するための第2の特異的結合相補物、が結合した粒子を含んでなり、(i)それぞれの種類の粒子に結合したラマン活性標識が異なっていて特異的標的分析物質の識別子の役割を果たし、(ii)それぞれの種類の粒子と結合した第2の特異的結合相補物が異なっていて特異的標的分析物質を標的としており、かつ(iii)ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなる、ことを特徴とする工程と、
サンプル中に1つまたは複数の標的分析物質が存在する場合に粒子と複合体形成した試験支持体が形成されるように、粒子、サンプル、および支持体を、標的分析物質と第1および第2の特異的結合相補物の間の特異的結合相互作用に有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の1つまたは複数の標的分析物質の存在の指標として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる。支持体と結合した第1の特異的結合相補物は、直接的または間接的に標的分析物質を支持体に固定する捕捉プローブである。この捕捉プローブを支持体上の個別領域に配置して、サンプル中の1以上の標的分析物質、または標的分析物質の複数の部分を検出可能とすることができる。さらに、検出用プローブを、標的分析物質と検出用プローブの間の特異的結合相互作用を可能にするのに有効な条件下で標的分析物質と最初に接触させてから、支持体上の捕捉プローブと接触させることが可能である。代替例として、標的分析物質を、捕捉プローブと分析物質の間の特異的結合相互作用を可能にするのに有効な条件下で支持体上の捕捉プローブと最初に接触させてから、検出用プローブと接触させることが可能である。あるいは検出用プローブ、標的分析物質および捕捉プローブを同時に接触させることも可能である。
核酸の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した支持体を提供する工程と、
オリゴヌクレオチドが結合しており、かつ該オリゴヌクレオチドの一部分と結合したラマン活性標識を含んでなる1種類または複数種類の粒子を提供する工程であって、(i)それぞれの種類の粒子と結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、特異的標的核酸の配列の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)それぞれの種類の粒子と結合したラマン標識が異なっていて特異的標的核酸の識別子の役割を果たし、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなる、ことを特徴とする工程と、
1つまたは複数の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に1つまたは複数の粒子複合体が結合した試験支持体が形成されるように、粒子、支持体、およびサンプルを、支持体に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第1の部分とのハイブリダイゼーション、および粒子に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第2の部分とのハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の1つまたは複数の標的核酸の存在の指標として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程とからなる。
核酸の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した支持体を提供する工程と、
オリゴヌクレオチドが結合しており、かつ該オリゴヌクレオチドの一部分と結合したラマン活性標識を含んでなる粒子を提供する工程であって、(i)該粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかが、核酸の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)粒子と結合したラマン活性標識が標的核酸の識別子として働き、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなる、ことを特徴とする工程と、
前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に粒子複合体が結合した試験支持体が形成されるように、粒子、支持体、およびサンプルを、支持体に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第1の部分とのハイブリダイゼーション、および粒子に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第2の部分とのハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の標的核酸の存在の指標として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる。
核酸の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した支持体を提供する工程と、
オリゴヌクレオチドが結合しており、該オリゴヌクレオチドの一部分と結合したラマン活性標識を含んでなる1種類または複数種類の粒子を提供する工程であって、(i)それぞれの種類の粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、核酸の配
列の第2の部分と相補的であると考えられる配列を有し、前記核酸の配列の第2の部分は、同核酸の野生型配列と比較すると1ヌクレオチドの置換を有する疑いがあることと、(ii)それぞれの種類の粒子に結合したラマン活性標識が異なっていて、1ヌクレオチドの置換を有する特異的配列の識別子としての役割を果たし、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることと、を特徴とする工程と、
粒子、支持体、およびサンプルを、支持体に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第1の部分とのハイブリダイゼーション、および粒子に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第2の部分とのハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させて、1つまたは複数の粒子複合体が結合した試験支持体を形成する工程と、
厳密な(ストリンジェントな)洗浄を支持体に施して、非特異的に結合した全ての粒子、および核酸配列の第2の部分と相補的ではないオリゴヌクレオチドを有する全ての粒子複合体を十分に除去する工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の前記核酸の一塩基多型の存在の指標として前記検出用支持体上の粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる。
本発明のさらに別の実施形態では、検出用プローブまたは試薬を提供する。該試薬は、特定の標的分析物質に結合するための特異的結合相補物、およびそれと結合した少なくとも1種類のラマン活性標識を含んでなり、(i)ラマン活性標識が、特異的標的分析物質の識別子としての役割を果たすことと、(ii)ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることとを特徴とする。本発明の他の実施形態では、検出用プローブは、粒子、特定の標的分析物質に結合するための特異的結合相補物、および少なくとも1種類のラマン活性標識を含んでなり、(i)ラマン活性標識が、特異的標的分析物質の識別子としての役割を果たすことと、(ii)ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることとを特徴とする。ラマン標識は、粒子に直接結合させても間接的に結合させてもよい。別例として、ラマン標識を特定の標的分析物質と結合させることも可能であり、次いでその結合体を粒子に結合させる。
粒子と、該粒子に結合したオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に結合したラマン標識とを含んでなる1つまたは複数の種類の結合体であって、(i)それぞれの種類の粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、特異的標的核酸の配列の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)それぞれの種類の粒子に結合したラマン活性標識が異なっていて特異的標的核酸の識別子としての役割を果たし、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含むことを特徴とする結合体と、
標的核酸の配列の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した任意選択の支持体と、
表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な支持体表面を作製するための、任意選択の染色用試薬と
からなる。
オリゴヌクレオチドが結合しており、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に結合したラマン標識を含んでなる粒子であって、(i)該粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、標的核酸の配列の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)該粒子に結合したラマン活性標識が標的核酸の識別子としての役割を果たし、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることを特徴とする粒子、および
標的核酸の配列の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した任意選択の支持体
からなる。
ラマン活性標識が結合したオリゴヌクレオチドの入った第1の容器と、該オリゴヌクレオチドのラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることと、
粒子および該粒子に結合したオリゴヌクレオチドを含んでなる結合体の入った第2の容器と、それぞれの種類の粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、ラマン活性標識を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分と相補的な配列を有することと、
標的核酸の配列の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した任意選択の支持体と、
表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な支持体表面を作製するための、任意選択の染色用試薬と
からなる。
1つまたは複数の種類のラマン活性標識が結合したオリゴヌクレオチドの入った1つまたは複数の容器と、ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子を含んでなることと、
粒子および該粒子に結合したオリゴヌクレオチドを含んでなる結合体の入った第2の容器と、それぞれの種類の粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、ラマン活性標識を有するオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分と相補的な配列を有することと、
標的核酸の配列の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した任意選択の支持体および任意選択の染色物質である試薬と
からなる。
1つまたは複数の特定の受容体が結合した支持体を提供する工程と、
粒子、該粒子に結合した特異的結合物質、特異的結合物質の一部分に結合したラマン活性標識、および特異的結合物質の一部分と結合した前記サンプル由来の分子を含む試薬を提供する工程であって、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線を照射さ
れると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性化分子を含んでなることを特徴とする工程と、
分子が特定の受容体のリガンドである場合に粒子と複合体形成した試験支持体が形成されるように、粒子、サンプル、および支持体を、粒子に結合した分子と支持体に結合した特定の受容体との間の特異的結合相互作用に有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、特定の受容体に対するリガンドの確証として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる。
本発明のこれらの実施形態、および他の実施形態は、以下の詳細な説明に照らせば明らかであろう。
本明細書で使用する「分析物質」、または「標的分析物質」は、本発明を使用して、試験サンプル中で定量化または検出される物質である。分析物質は任意の物質であってよく、該物質としては天然に存在する特異的結合要素(例えば抗体、ポリペプチド、DNA、RNA、細胞、ウイルスなど)があり、あるいは該物質として特異的結合要素を作製することも可能であり、また分析物質はアッセイにおいて1つまたは複数の特異的結合要素に結合可能である。「分析物質」には、任意の抗原物質、ハプテン、抗体、およびこれらの組合せも含まれる。分析物質には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与された薬剤および不法な目的で投与された薬剤などの薬剤、細菌、ウイルス、ならびに任意の前記物質の代謝産物または任意の前記物質に対する抗体が含まれうる。本発明に従い検出または定量化することが可能な分析物質の他の例には、多糖、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、および核酸がある。特異的分析物質には、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン(例えばインシュリン、ゴナドトロピン、ソマトロピン)、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、その他のサイトカイン、腫瘍特異的エピトープ(例えば腫瘍特異的タンパク質上でのみ見られるエピトープ)を含むペプチド、細胞(例えば赤血球細胞)、細胞表面分子(例えばCD抗原、インテグリン、細胞受容体)、微生物(ウイルス、細菌、寄生虫、カビおよび真菌)、微生物の断片、一部分、成分または生産物、小有機分子(例えばジゴキシン、ヘロイン、コカイン、モルフィン、メサリン、リセルグ酸、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、ステロイド、ペンタミンジン(pentamindine)、およびビオチン)などがある。検出または定量化可能な核酸およびオリゴヌクレオチドには、遺伝子(例えば、特定の疾患と関連がある遺伝子)、ウイルスRNAおよびDNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA(例えばヒトDNA)、cDNA、mRNA、RNA断片およびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸などがある。本質的にあらゆる分析物質を、その分析物質に特異的な抗体を使用して検出または定量化することが可能である。さらに、分析物質と特異的に結合する任意の分子を使用することが可能であり、多くのこのような分子が当分野で知られている。例えば、核酸を、分析物質である該核酸の少なくとも一部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを使用して、検出または定量化することが可能である。さらに、レクチンを使用して、多糖およびグリコシル化タンパク質を検出または定量化することが可能である。他の例として、受容体を使用してそのリガンドを検出することが可能であり、その逆も然りである。
本明細書で使用する「捕捉試薬」または「捕捉プローブ」は、分析物質または指標試薬との結合能を有し、実質的に固体の材料に直接的または間接的に結合させることが可能な特異的結合要素である。固相の捕捉試薬複合体を使用して、アッセイの結合成分と非結合成分を分離することが可能である。
本明細書で使用する「指標試薬」は、特異的結合要素または金属表面に直接的または間接的に結合した検出可能な標識を含んでなる。
本明細書で使用する「粒子」は、液体中に分散させることが可能であり、表面増強ラマン光散乱(SERS)または表面増強共鳴ラマン光散乱(SERRS)の現象を支持する任意の物質である。粒子の例には、金または銀、Pt、Cu、Ag/Au、Pt/Au、
Cu/Auのコロイド、コア・シェル粒子または合金粒子、すなわち金、銀、銅、または伝導帯電子を示す他の物質の粒子、中空粒子、または薄片があるが、これらに限定はされない。粒子表面がSERSおよびSERRS効果に関与するので、伝導帯電子を示す物質で予めコーティングされた、伝導帯電子を示さない物質の薄片または粒子も、適切な粒子状物質になる。粒子には、金属ナノ粒子などのナノ粒子がある。
本明細書で使用する「特異的結合要素」とは、特異的結合対、すなわち分子の一方が化学的または物理的手段によって第2の分子と特異的に結合するような2つの異なる分子、のうちの1要素である。抗原と抗体の特異的結合対以外に、他の特異的結合対には、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列(標的核酸配列を検出するためにDNAハイブリダイゼーション・アッセイで使用されるプローブおよび捕捉核酸配列など)、相補的ペプチド配列、エフェクター分子と受容体分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、細胞、ウイルスなどがある。さらに、特異的結合対には、本来の特異的結合要素の類似体である要素が含まれうる。例えば、分析物質の誘導体または断片、すなわち分析物質類似体は、それが分析物質と共通の少なくとも1つのエピトープを有する限り、使用することが可能である。免疫反応性の特異的結合要素には、抗原、ハプテン、抗体、およびこれらの複合体があり、組換えDNA法またはペプチド合成により作製されたものも含まれる。
本発明は、検出アッセイで使用するのに好適なラマン標識および特異的結合物質が結合した任意の適切な粒子の使用を企図している。しかしながら、本発明を実施する際には、ナノ粒子が好ましい。粒子の大きさ、形状および化学的組成は、DNAバーコードなどの得られるプローブの性質に貢献する。これらの性質には、光学的性質、光電子工学的性質、電気化学的性質、電子工学的性質、さまざまな溶液中での安定性、孔およびチャンネルの大きさの違い、フィルタとして作用しながら生物活性のある分子を分離する能力などがある。異なる大きさ、形状および/または化学的組成を有する粒子の混合物の使用も、均一な大きさ、形状および化学的組成を有するナノ粒子の使用も企図される。適切な粒子の例には、非制限的に、ナノおよびミクロンの大きさのコア粒子、凝集粒子、等方性粒子(球状粒子など)および反等方性粒子(棒状、四面体状、角柱状など非球状の粒子)、ならびに、その全容を本願明細書に援用する2002年12月28日に出願された米国特許出願第10/034,451号および2002年12月28日に出願された国際特許出願第PCT/US01/50825号に記載されたコア・シェル粒子などの粒子がある。
Chem.)第143巻、p.113、1988年;ヘングレイン(Henglein)、ケミカル・レビューズ誌(Chem. Rev.)第89巻、p.1861、1989年;ブラス(Brus)、アプライド・フィジックス・エイ誌(Appl. Phys. A.)第53巻、p.465、1991年;バーンクマン(Bahncmann )「太陽エネルギーの光化学変換と貯蔵(Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy)」、ペリツェッティ(Pelizetti )およびスキ
アヴェロ(Schiavello)編、1991年、p.251;ワン(Wang)およびヘロン(Herron)、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌(J. Phys. Chem.)第95巻、p.525、1991年;オルシャフスキー(Olshavsky )ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌(J. Am. Chem. Soc. )第112巻、p.9438、1990年;ウシダ(Ushida)ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌(J. Phys. Chem.)第95巻、p.5382、1992年を参照のこと。
粒子、特異的結合要素、またはこの両方を官能化して、特異的結合要素を粒子に結合させて検出用プローブを作製することが可能である。このような方法は、当分野ではよく知られている。例えば、アルカンチオールでその3’末端または5’末端を官能化したオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に結合する。ホワイトサイズ(Whitesides)、米国テキサス州ヒューストンにおけるロバート エイ.ウェルチ基金(Robert A. Welch Foundation)第39回ケミカル・リサーチ・ナノフェイズ・ケミストリー会議(Conference On Chemical Research Nanophase Chemistry )会報、p.109〜121、1995年を参照のこと。マキック(Mucic )ら、ケミカル・コミュニケーションズ誌(Chem. Commun. )p.555〜557、1996年も参照されたい(この文献には3’チオールDNAを平らな金表面に結合させる方法が記載されている;この方法を使用して、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させることが可能である)。アルカンチオール法を使用して、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイド、ならびに前に列挙した他のナノ粒子に結合させることも可能である。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基(例えば、オリゴヌクレオチド‐ホスホロチオエートの金表面への結合については米国特許第5,472,881号を参照のこと)、置換アルキルシロキサン(例えば、オリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面への結合についてはバーウェル(Burwell )、ケミカル・テクノロジー誌(Chemical Technology )第4巻、p.370〜377、1974年およびマットイッチ(Matteuicci)およびカルサース(Caruthers )、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌(J. Am. Chem. Soc. )第103巻、p.3185〜3191、1981年、ならびにアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合についてはグラバー(Grabar)ら、アナリティカル・ケミストリー誌(Anal. Chem. )、第67巻、p.735〜743を参照のこと)がある。末端が5’チオヌクレオシドまたは3
’チオヌクレオシドで終わるオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるために使用することが可能である。以下の参照文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるのに使用可能な他の方法を記載するものである:ヌッツォ(Nuzzo )ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌(J. Am. Chem. Soc. )第109巻、p.2358、1987年(金上のジスルフィド);アラーラ(Allara)およびヌッツォ(Nuzzo )、ラングミュア誌(Langmuir)第1巻、p.45、1985年(アルミニウム上のカルボン酸);アラーラ(Allara)およびトンプキンス(Tompkins)、ジャーナル・オブ・コロイド・アンド・インターフェイス・ソサイエティ誌(J. Colloid Interface Sci. )第49巻、p.410〜421、1974年(銅上のカルボン酸);アイラー(Iler)「シリカの化学(The Chemistry Of Silica )」、第6章、ワイリー(Wiley )社、1979年(シリカ上のカルボン酸);ティモンズ(Timmons )およびジスマン(Z isman)、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌(J. Phys. Chem.)第69巻、p.984〜990、1965年(白金上のカルボン酸);ソリアガ
(Soriaga )およびハッバード(Hubbard )、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌(J. Am. Chem. Soc. )第104巻、p.3937、1982年(白金上の芳香環化合物);ハッバード(Hubbard )、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ誌(Acc. Chem. Res. )第13巻、p.177、1980年(白金上のスルフォラン、スルホキシド、および他の官能性溶媒);ヒックマン(Hickman )ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌(J. Am. Chem. Soc. )第111巻、p.7271、1989年(白金上のイソニトリル);マオズ(Maoz)およびサギブ(Sagiv )、ラングミュア誌(Langmuir)第3巻、p.1045、1987年(シリカ上のシラン);マオズ(Maoz)およびサギブ(Sagiv )、ラングミュア誌、第3巻、p.1034、1987年(シリカ上のシラン);ヴァッサーマン(Wasserman )ら、ラングミュア誌、第5巻、p.1074、1989年(シリカ上のシラン);エルテコーヴァ(Eltekova)およびエルテコフ(Eltekov )、ラングミュア誌、第3巻、p.951、1987年(二酸化チタンおよびシリカ上の、芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基);レック(Lec )ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌(J.
Phys. Chem.)第92巻、p.2597、1988年(金属上の剛性(rigid )リン酸)。
検出可能な変化の観察が可能な任意の支持体を使用することが可能である。適切な支持体には、透明な固体表面(例えばガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー)、不透明な固体表面(例えば、TLCシリカ・プレート、濾紙、ガラス・ファイバー製フィルタ、硝酸セルロース膜、ナイロン膜、PDVF膜などの白い固体表面)、および伝導性固体表面(例えば、インジウム‐スズ酸化物(ITO))がある。支持体は任意の形状または厚さであってよいが、一般には平らで薄い。好ましいのは、ガラス(例えばスライドグ
ラスまたはガラス・ビーズ)またはプラスチック(例えば、マイクロタイター・プレートのウエル)などの、透明な支持体である。
捕捉プローブを支持体に結合させるために、任意の適切な方法を使用することが可能である。例えば、核酸標的と相補的なオリゴヌクレオチドを含む捕捉プローブを、例えばクリセイ(Chrisey )ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌(Nucleic Acids Res.)、第24巻、p.3031〜3039、1996年;クリセイ(Chrisey )ら,ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌、第24巻、p.3040〜3047、1996年;マキック(Mucic )ら、ケミカル・コミュニケーションズ誌(Chem. Commun. )p.555、1996年;ツィマーマンおよびコックス(Zimmermann and Cox)、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌、第22巻、p.492、1994年;ボトムレイ(Bottomley )ら、ザ・ジャーナル・オブ・バキューム・サイエンス・テクノロジー・エイ誌(J. Vac. Sci. Technol. A )、第10巻、p.591、1992年;およびヘグナー(Hegner)ら、エフイービーエス・レターズ誌(FEBS Lett.)、第336巻、p.452、1993年に記載されているようにして支持体に結合させることが可能である。
ラマン標識は、示差的なラマン散乱スペクトルを有する多くの分子のうちの任意のものであってよい。酵素イムノアッセイで使用される酵素とは異なり、これらの標識種は、安定、単純、安価な、必要に応じて化学的に修飾することが可能な分子でありうる。以下の属性が、この用途における標識の有効性を高める:(a)レーザー励起波長付近に強い吸収バンドがあること(吸光係数104付近);(b)官能基が特異的結合要素と共有結合することが可能と思われること;(c)光安定性であること;(d)充分な表面および共鳴増強によりナノグラム未満の範囲の分析物質の検出が可能であること;(e)標識され
た特異的結合要素と標識されていない特異的結合要素との間の結合相互作用における干渉が最小限であること;(f)使用する励起波長における強烈な蛍光発光が最小限であること;(g)数箇所の強いピークを有する、比較的単純な散乱パターンであること;および/または(h)標識が互いに干渉しない散乱パターンを有するため、いくつかの指標分子を同時に分析可能であること。
ラマン1‐ラマン2‐ラマン3‐(特異的結合リガンド)
のように想定することが可能である。
好ましい実施形態では、レーザーが励起源の役割を果たす。レーザーは、ヘリウム‐ネオンまたはダイオード・レーザーなどの、安価な種類のものであってよい。このようなレーザーの操作寿命は、50,000時間を超える可能性がある。
(H)ラマン標識プローブ
異なる特異性を有する特異的結合要素から、示差的な散乱パターンを有する異なるラマン活性標識をそれぞれ備えたいくつかの異なる種類の結合体を作製することが可能であろう。アッセイにおいてこれらの結合体を混合することによって、同じサンプル中のいくつ
かの異なる分析物質を同時に分析することが可能になると思われる。本発明の他の態様では、結合体に2つ以上の異なるラマン標識を含めることが可能である。
最初は、ラマン標識プローブは検出可能なSERS活性をほとんど、あるいは全く有していない。銀染色物質などの染色物質によって強力なSERSの増強がもたらされる。支持体を使用すると検出可能な変化を生み出すことが可能であり、銀染色によってさらに増強することも可能である。銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子を用いて、銀染色を実施することが可能である。貴金属(例えば金および銀)で作製されたナノ粒子が好ましい。バセル(Bassell )ら、ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー誌(J. Cell Biol. )、第126巻、p.863〜876、1994年;ブラウン‐ホーランド(Braun-Howland )ら、バイオテクニクス誌(Biotechniques )、第13巻、p.928〜93
1、1992年を参照のこと。核酸の検出用に使用するナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合は、銀イオンを核酸と複合体形成させて還元を触媒することが可能である。ブラウン(Braun )ら、ネイチャー誌(Nature)、第391巻、p.775、1998年を参照のこと。さらに、核酸上のリン酸基と反応することが可能な銀染色物質が知られている。
いくつかの方法が、ラマン散乱を検出するために利用可能である。これらは一般に、様々な種類の分光計と共に使用することが可能である。SERSにおいては、その主な測定は、特定の波長での光の散乱強度の測定である。SERSでは、励起ビーム由来の強烈なバックグラウンドの存在下で、波長シフトした散乱強度を測定する必要がある。大きなストークスシフトを有するラマン活性物質を使用することによって、この測定が簡単になる。
本発明は、自動分析装置としての使用に適合可能である。装置は個々のストークスシフトしたスペクトル線をモニタすることになると思われるので、複雑な単色光分光器システムに関する必要性はない。ホログラフィー光学要素などの、当分野の現況の光学技術における近年の進展によって、価格および複雑性が研究室レベルの装置より低い適切な分光計の設計が可能である。
市販のアレイ作製装置(GMS 417 arrayer、ゲノティックマイクロシステムズ・インコーポレイテッド(Genotic MicroSystems, Inc.))を使用して5’‐ヘキシルチオール・キャップ構造のオリゴヌクレオチド(0.15M NaCl、pH6.5
リン酸バッファ(PBS、10mM リン酸)中に1mM)をスポットすることにより、オリゴヌクレオチド捕捉鎖をSMPB‐(スクシンイミジル4‐(マレミドフェニル)‐ブチレート)官能化スライドグラスに固定化した。チップに捕捉オリゴヌクレオチドをスポットした後(約200μmスポット)、SMPBとヘキシルチオール‐キャップ構造オリゴヌクレオチドとのカップリング反応をすすめるためにチップを恒湿器内に12時間置いた。次いで該チップをナノピュア(Nanopure:登録商標)水で十分に洗浄した。チップをヘキシルチオール‐キャップ構造ポリアデニン(A15)溶液(0.1mM)に4時間浸した後、3‐メルカプト‐プロパンスルホン酸ナトリウム塩溶液(0.2M)に30分浸して残りのSMPB部位を処理することにより、オリゴヌクレオチドスポットの周囲のチップ領域を不動態化した。最後に、チップをナノピュア純水で洗浄し、マイクロアレイ遠心機で乾燥させた(2000g)。
この実施例では、ラマン標識が結合したオリゴヌクレオチド、すなわち:(3’HS‐‐Cy3‐A10‐AAT CTC AAC GTA CCT(図19aの配列番号1)、3’HS‐Cy3‐A10‐CTC‐CCT‐AAT‐AAC‐AAT)(図1の配列番号25)の合成について説明する。
この実施例では、ラマン標識が結合した3種類のオリゴヌクレオチド、すなわち:3’HS‐‐TMR‐A10‐AAC CGA AAG TCA ATA[図19aの配列番号2];3’HS‐‐Cy3.5‐A10‐CCT CAT TTA CAA CCT[図19aの配列番号3];および3’HS‐‐Cy5‐A10‐CTC CCT AAT
AAC AAT[図19bの配列番号4]の合成について説明する。色素は標準的な切断試薬(アンモニア)に対して感受性なので、非常に穏やかな条件下で脱保護反応を実施できるように、ここでは非常に弱い塩基モノマー(グレンリサーチ(Glen Rsearch)由来)、すなわちフェノキシアセチル(Pac)保護dA、4‐イソプロピル‐フェノキシアセチル(iPr‐Pac)保護dG、およびアセチル(Ac)保護dCを使用した。TAMRA‐dT(TMR‐dT、5’‐ジメトキシトリチルオキシ‐5‐[N‐((テトラメチルローダミニル)‐アミノヘキシル)‐3‐アクリルイミド]‐2’‐デオキシウリジン‐3’‐[2‐シアノエチル]‐(N,N‐ジイソプロピル)]‐ホスホロアミダイト]、Cy3.5‐CEホスホロアミダイト(インドジカルボシアニン 3.5,1’‐O‐(4‐モノメトキシトリチル)‐1‐O‐(2‐シアノエチル)‐(N,N‐ジイソプロピル)‐ホスホロアミダイト)およびCy5‐CEホスホロアミダイト(インドジカルボシアニン5,1’‐O‐(4‐モノメトキシトリチル)‐1‐O‐(2‐シアノエチル)‐(N,N‐ジイソプロピル)‐ホスホロアミダイト)を、それぞれオリゴヌクレオチドを標識するために使用した。オリゴヌクレオチドの合成後、合成用カラムの内容物を2mLの反応バイアルに移し、無水メタノールに溶解した1mLの0.05M 炭酸カリウム液で処理した(4時間、室温)。その後、支持体から上清をピペッティングで回収し、1.5mLの2M トリエチル酢酸アンモニウムで中和した。Cys3標識オリゴヌク
レオチドの合成について前述したように、さらなる精製を行った。HPLCの保持時間はそれぞれ、28分(TMR標識プロピルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド)、32分(Cy3.5標識プロピルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド)、30分(Cy5標識プロピルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド)である。
この実施例では、ラマン標識が結合した2種類のオリゴヌクレオチド、すなわち:3’HS‐‐Rd‐A10‐TCA ACA TTG CCT TCT[図19bの配列番号5]および3’HS‐‐TR‐A10‐TCT TCT ATA AAC CTT ATT[図19aの配列番号6]の合成について説明する。図24を参照されたい。これらのオリゴヌクレオチドはいずれも2工程合成で作製した。第1工程ではアミノ修飾オリゴヌクレオチド(3’‐S‐S‐‐(NH2)‐A10‐TCA ACA TTG CCA TCTおよび3’‐S‐S‐‐(NH2)‐A10‐TCT TCT ATA AAC CTT ATT)を文献の手順5にしたがって合成した。amino‐modifier
C6 dT(5’‐ジメトキシトリチル‐5‐[N‐(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)‐3‐アクリルイミド]‐2’‐デオキシウリジン,3’‐[(2‐シアノエチル)‐(N,N‐ジイソプロピル)]‐ホスホロアミダイト)をDNA合成機(Expedite)のポジション5にセットし、従来の自動合成によってアミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの切断、脱保護および精製は、Cy3修飾オリゴヌクレオチドの合成について説明した手順(上記)にしたがって行った(保持時間=26分)。第2工程ではスクシンイミドエステル修飾Rhod6G(5‐カルボキシル‐ローダミン6G、スクシンイミジルエステル)およびテキサス・レッド(Texas Red‐X‐スクシンイミジルエステル)をそれぞれ、アミノ修飾オリゴヌクレオチドに結合させた。標準的な実験では、アミノ修飾されたアルキルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド(0.15μmol)をホウ酸ナトリウムバッファ(0.1M、pH=8.5、0.5ml)に溶かし、2.5mgのスクシンイミドエステル修飾Rhod6G(もしくはテキサス・レッド)を含むDMSO溶液(150μl)をオリゴヌクレオチドのバッファ溶液に添加した(図24)。溶液を室温で12時間かき混ぜた後、Rhod6G(もしくはテキサス・レッド)標識オリゴヌクレオチドをエタノール沈殿(3回)および前述の条件のHPLCをさらに行うことにより精製した。
標準的なDNA検出の実験では、3成分サンドイッチ・アッセイをマイクロアレイ方式で使用する(図1)。特定の標的DNA鎖の存在をモニタするために、Cy3修飾アルキルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド鎖で修飾した金ナノ粒子(直径13±2nm)をプローブとして使用した。これらのナノ粒子結合体は、本願明細書に全体を援用する2003年1月14日発行の米国特許第6,506,564号(ナノスフェアー インコーポレイテッド(Nanosphere, Inc.)、譲受人)に記載のエイジング法(a ging process )に従って調製した。平均して110個のオリゴヌクレオチド鎖が13nmの各金ナ
ノ粒子上に結合している。ラマン散乱断面積が大きいことからCy3基をラマン標識として選択した23。適切な15merの捕捉鎖をスポットしたチップを、室温の恒湿器中で、30merの標的配列(100pM)を含む0.6M NaCl‐PBSバッファ溶液(10mM リン酸、pH7)でコーティングした。4時間後、チップを0.6M NaCl‐PBSバッファ溶液で4回洗浄して非特異的に結合した標的を除去した。次に、標的配列の突出している領域とハイブリダイズさせるために、ナノ粒子プローブの0.6M
NaCl‐PBSバッファ溶液(2nM)でチップを1.5時間処理した(図1)。次いで0.6M 硝酸‐PBSバッファ溶液でチップを洗浄して、塩素イオンおよび非特異
的に結合したナノ粒子プローブを除去した。チップを直ちに銀増強溶液(テッドペラ・インコーポレイテッド(Ted Pella, Inc)社)で8分間処理し、続いてナノピュア水でリンスし、マイクロアレイ遠心機で乾燥させた(2000g)。チップには肉眼でも観察可能なグレー・スポットが現れるが、文献の手順8により平台スキャナ(Expression 1600、エプソン)を用いて画像化が可能である(図2AおよびB)。グレー・スポットを0.3M NaCl‐PBSバッファ溶液中でラマン分光法により画像化することも可能である(Solution Raman 633分光計、ディテクション・リミット・インコーポレイテッド(Detection Limit Inc.)社、30mW He‐Neレーザー)(図2C)。チップを0.65 N.A.アダプタ(25μmレーザー・スポット)を備えた光ファイバープローブでスキャンしたところ、各スポットは1192cm−1で一貫した強いラマン応答を示している(図2D)。
一般的な実験においては、適切な捕捉鎖をスポットしたチップ(図3A)を、鎖長30merの標的配列(20fM)を含む0.75M NaCl‐PBSバッファ溶液(10mM リン酸、pH7)で、恒湿器中で室温にてコーティングした。8時間後、チップを0.75M NaCl‐PBSバッファ溶液で洗浄して非特異的に結合した標的を除去した。次に、標的配列の突出している領域にハイブリダイズさせるために、ナノ粒子プローブの0.75M NaCl‐PBSバッファ溶液(500pM)でチップを3時間処理した(図3A)。塩素イオンおよび非特異的に結合したナノ粒子プローブを除去するために、0.75M 硝酸‐PBSバッファ溶液でチップを洗浄した。該チップを直ちに銀増強溶液(テッドペラ・インコーポレイテッド社)で15分間処理し、続いてナノピュア水でリンスしてからマイクロアレイ遠心機で乾燥させた(2000g)。チップ上のスポットは、乾燥状態で平台スキャナで画像化してもよいし(図3B)、湿潤状態(0.3M NaCl、pH7、PBSバッファ溶液)でラマン分光法によって画像化することも可能である(図3Cおよび3D)。この技法を用いた現時点での最適化されていない検出限界は10fMである。
この実施例では、複数のラマン標識プローブを使用した多数のオリゴヌクレオチドの検
出について説明する。個別かつ測定可能なSERSシグナルを備えた多数のプローブを作製するために、実施例5で記述した方法とCy3以外の色素で官能化したナノ粒子プローブとを使用することができる。この方法によって、多数のオリゴヌクレオチド標的を同時に多重検出することが可能になる。この点を実証するために、標準的なDNA自動合成でオリゴヌクレオチドに導入可能な、ラマン・スペクトルの異なる6種類の市販の色素を選択した。ラマン標識しオリゴヌクレオチド修飾した6種類の金ナノ粒子プローブを作製したが、それらは、以下の統計的に固有な30〜36merの配列、すなわち:A)A型肝炎ウイルスVall7ポリプロテイン遺伝子(HVA)、(B)B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子(HVB)、(C)HIV、(D)エボラ・ウイルス(EV)、(E)痘瘡ウイルス(天然痘、VV)および(F)炭疽菌(BA)防御抗原遺伝子、に相補的な配列を備えるものとした(図4)32。これらのプローブを使って、6種類の標的分析物質に対する新しいラマン走査技術の多重検出能力を示すことが可能である。
この実施例では、一塩基多型(SNP)を識別するための検出システムにおける、ラマン標識を有するオリゴヌクレオチドの利用について記述するが、遺伝子発現の研究の場合、単一スポットのシグナルに限定可能なRNA検出方法が望まれる。よく知られていることだが、オリゴヌクレオチドで十分に官能化されたナノ粒子プローブは非常に鋭い熱誘発性変性遷移を示し、その結果DNA検出における従来のフルオロフォア分子プローブよりも実質的に高い選択性がもたらされる5、8、9。しかしながらRNA検出との関連においてはこれらのプローブの挙動については何もわかっていない。ラマン分光に基づくこのシステムの選択性およびSNP標的の同定能力をさらに評価するために、同じ捕捉DNA
鎖に結合し得るが、プローブ結合領域に1塩基変異を有する2種類のRNA標的(標的1:T1、正常;標的2:T2、1塩基の差異あり、図6)を選択した。従って、これらの2種類のRNA標的鎖を識別するために、配列とラマン標識が異なる2種類のDNA官能化プローブ(プローブ1:P1、プローブ2:P2)が必要である(図6)。2種類の標的(T1、T2)をいかに識別し得るかということだけでなく、2種類の標的の混合物をいかに半定量的な方法で分析し得るのかを実証するために7種の個別テストを行った。
ナル(I1:1650cm−1(プローブ1)、I2:1588cm−1(プローブ2))が検出されたが、シグナル強度の比率は個々の実験における2種類の標的の比率に比例する(図9Bの挿入図)。
このラマン検出方式は、タンパク質‐小分子間およびタンパク質‐タンパク質間の相互作用に関するタンパク質マイクロアレイへの応用においても使用可能である。タンパク質‐小分子間の相互作用を検出するために、無関係の3種類の小分子であって、その特異的な受容体タンパク質が入手可能な小分子、すなわち:ビオチンおよび抗ビオチンマウスモノクローナル抗体;DIG(ステロイド・ジゴキシゲニン)および抗DIGマウスモノクローナル抗体;DNP(ジニトロフェニル)および抗DNPマウスモノクローナル抗体を選択した。この3種類の小分子を、ラマン色素で官能化した金粒子で標識した(金ナノ粒子(直径13nm)は、小分子キャップ構造の、ラマン色素およびアルキルチオールで官能化したポリアデニン(A20)で修飾した(図11A))。標準的な検出実験では、3組すべてのタンパク質を、市販のアレイ作製装置を使用してタンパク質溶液(200μg/ml、5%グリセロール)をスポットすることにより、アルデヒドで官能化したスライドグラス上に3連で固定化した(図11A)33、34。恒湿器中で4時間インキュベートした後に、該タンパク質チップを、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSバッファ(0.173M NaCl、0.027M KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、pH=7.4)で洗浄し、タンパク質チップ上の無反応アルデヒドを不動態化するために同溶液中に4時間浸漬した。PBS溶液(0.173M NaCl、0.027M KCl、4.3mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、pH=7.4)で洗浄後、ラマン標識した小分子プローブで該タンパク質チップを処理した(4℃、2時間)。バッファ溶液(0.2M NaNO3、5mMリン酸、pH7.4)で洗浄後、金粒子で官能化されたタンパク質チップを銀増強溶液で8分間処理し、ナノピュア水で洗浄した。ラマン測定の前に、銀染色されたチップを2×PBS溶液に10分間浸漬した。
タンパク質‐タンパク質の相互作用のスクリーニング研究用に3対のタンパク質、すなわちマウス免疫グロブリンG(IgG)とその抗体、ユビキチンとその抗体、ヒト・プロテインCとその抗体を選択した。マウスIgG、ユビキチン、およびヒト・プロテインCを、それぞれアルデヒド・スライド上に4連でスポッティングした。金ナノ粒子をはじめに抗体で、次にラマン色素標識オリゴヌクレオチドで官能化させた。図12に標識手順を示す。抗体(10μg、pH=9.2)を金粒子溶液(13nm、10nM、1mL、pH9.2)に添加し、20分間後にラマン色素キャップ構造のアルキルチオール官能化ポ
リアデニン(A10、0.2=OD260)を該溶液に添加した。12時間後に、金粒子の表面をさらに不動態化するために同溶液に10%BSA溶液(0.3ml)を添加し、10分間静置した。ラマン色素キャップ構造の金粒子‐抗体コンジュゲートを、遠心分離(14000rpm)により粒子を沈殿させて精製した。過剰のオリゴヌクレオチド、BSAおよび抗体を含む上清を静かに移して粒子から取り除くことが可能である。その後粒子プローブをPBSバッファに再分散させる。次いでプローブ(金ナノ粒子濃度は2nM、抗体濃度は約2μg/mL)をタンパク質チップの現像に使用した。タンパク質‐タンパク質間相互作用のスクリーニング・プロトコールは、(前述の)タンパク質‐小分子間相互作用の場合と同様である。
上述のラマン標識は全て1色素系、すなわち単一の担体とラマン色素である。2つ以上のラマン色素をナノ・サイズのナノ粒子担体に搭載することが可能である。標識成分間の比率調整によって、大規模にコード化されたラマン標識を作製することが可能である(図14および15)。2色素系では、同一の塩基配列を有するがラマン標識の異なる(Cy3およびTMR)2種類のアルキルチオール・キャップ構造オリゴヌクレオチド鎖を用いて直径13nmの金ナノ粒子を同時に修飾し、複合ラマン標識を作成した。この2色素標識ナノ粒子プローブは1色素標識ナノ粒子プローブと類似の熱力学的・反応速度論的性質を有する(すなわち同一の鎖についての同一のハイブリダイゼーション速度論と融解温度)。標準的なDNA検出実験(標的濃度は100pM、図1)では、銀染色スポット由来のラマン・スペクトルは、Cy3およびTMRの両方から発生するラマン線の特徴をはっきりと示している(図16、左)。Cy3とTMRの比率を変えることによって、異なる複合ラマン・スペクトルが得られた(図16、右)。これらのラマン・スペクトルは、測定される領域内の主たる帯域の相対強度の差によって識別可能である。参照手段を複数と
することにより異なるラマン標識の同定の精度が高まり、この2色素ラマン標識方法が実用可能となる。2色素系以外に、Cy3、TMR、およびCy3.5の間の量的比率を変えた3色素標識の2例を図17に示す。
数多くの並行標識技術が、マイクロビーズを用いる生物学的検出法において特に重要である。マイクロビーズ技術は、遺伝子発現のモニタリング、SNP遺伝子型決定、プロテオミクス・スクリーニング、創薬のための重要な生物学的分析方式として浮上しつつある1、13。マイクロアレイ技法と比較して、マイクロビーズ検出は、ハイブリダイゼーションを用いる手法における適応性が高く、分析物質の拡散が速く、また、作製が簡単で安価である。しかしながら、マイクロアレイのような位置的コード化を伴わないマイクロビーズ検出は、粒子プローブについてある種のバーコード化を施す方法に頼らざるを得ない。現在の蛍光色素を用いるコード化手法における主要な問題は、発光スペクトルが広いことと有機色素間でエネルギーが伝達されることが原因で識別可能な標識の数が限定されるということである11。これに対し、ラマン標識はこれらの問題を克服可能である。
これまでに述べたラマン検出の実験はすべて、ガラスチップもしくはガラス・ビーズの表面上で行われた。しかしながら、支持体の選択も非常に適応性が広い。ポリマー(例えばニトロセルロース、PVDF)の支持体もラマン検出実験によく適しており、一般にサザン・ブロッティング、ノーザンブロッティングおよびウェスタン・ブロッティング実験で使用されるポリマー支持体については、同支持体由来の大きなバックグラウンドはみられない(図25)。従って、本実施例で述べるラマン標識技法はサザン、ノーザン、およびウェスタン・ブロッティング実験においても適用可能である。
液(レディング(Redding)所在のテッドペラ・インコーポレイテッド(Ted Pella, Inc. )製)で8分間処理すると、金ナノ粒子プローブを含む領域は銀染色によってダーク・グレー色を示した(図27B)。ラマン測定の前に、銀染色された膜を2×PBS溶液に10分間浸漬した。膜上のダーク・グレー領域から発生する標準的なラマン・スペクトルは、ラマン線がほとんどCy3.5からのものであり、ニトロセルロース膜、タンパク質分子および実験に用いた他の化学物質から発生しているものではないことを示す(図27C)。これらの結果は、本明細書に記述されたラマン標識が、ブロッティング実験に応用可能なことを実証している。
Claims (89)
- 少なくとも1つのラマン標識および特異的結合要素が結合した粒子からなり、該ラマン標識を活性化してSERS効果を生じさせることが可能である試薬。
- 前記粒子が2つ以上の異なるラマン標識を有する、請求項1に記載の試薬。
- 前記特異的結合要素がDNA、RNA、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、任意の前記物質の代謝産物または任意の前記物質に対する抗体である、請求項1に記載の試薬。
- 核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスRNAおよびウイルスDNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA、cDNA、mRNA、RNA断片およびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸からなる、請求項3に記載の試薬。
- 前記粒子が金、Ag、Cu、Pt、Ag/Au、Pt/Au、Cu/Auコア・シェル粒子および合金粒子である、請求項1に記載の試薬。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項1に記載の試薬。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項1に記載の試薬。
- 前記粒子が金ナノ粒子である、請求項1に記載の試薬。
- 前記ラマン標識が前記粒子に直接結合している、請求項1に記載の試薬。
- 前記ラマン標識が前記粒子に間接的に結合している、請求項9に記載の試薬。
- 少なくともいくつかの前記ラマン標識が、前記特異的結合対要素に結合している、請求項1に記載の試薬。
- 前記結合体が前記粒子に共有結合している、請求項11に記載の試薬。
- 前記特異的結合対要素が、官能基によって前記粒子に共有結合している、請求項1に記載の試薬。
- 前記ラマン標識が染色物質によって活性化される、請求項1に記載の試薬。
- 前記染色物質が銀、金または銅染色物質からなる、請求項1に記載の試薬。
- 2つ以上の異なるラマン標識が結合した特異的結合要素からなる試薬。
- 前記特異的結合要素が、抗原と抗体の特異的結合対、ビオチンとアビジンの結合対、炭
水化物とレクチンの結合対、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子と受容体分子、酵素補因子と酵素、および酵素阻害剤と酵素からなる群から選択される特異的結合対の要素からなる、請求項16に記載の試薬。 - 前記特異的結合要素がDNA、RNA、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、任意の前記物質の代謝産物または任意の前記物質に対する抗体である、請求項16に記載の試薬。
- 核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスRNAおよびウイルスDNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA、cDNA、mRNA、RNA断片およびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸からなる、請求項18に記載の試薬。
- 前記特異的結合要素が、DNA、RNA、抗体、抗原、ポリペプチド、または炭水化物である、請求項16に記載の試薬。
- (a)請求項1に記載の試薬と分析物質との複合体を形成する工程と、
(b)該複合体を支持体に結合させる工程と、
(c)該支持体上の該複合体を染色して、前記ラマン標識のSERS効果を活性化する工程と、
(d)該SERS効果を測定する工程と
からなる分析物質を検出するための方法。 - 前記複合体が、1つまたは複数の特異的結合物質によって前記支持体に結合される、請求項21に記載の方法。
- (a)分析物質を支持体に結合させる工程と、
(b)請求項1に記載の試薬と該支持体上の分析物質とを複合体形成させる工程と、
(c)該支持体上の該複合体を染色して、ラマン標識のSERS効果を活性化する工程と、
(d)該SERS効果を測定する工程と
からなる分析物質を検出するための方法。 - 前記試薬を、1つまたは複数の特異的結合物質によって、前記支持体上の前記分析物質に間接的に結合させる、請求項23に記載の方法。
- 前記標的分析物質が、抗体、抗原、ハプテン、受容体、リガンド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、膜または膜分画、脂質、膜‐タンパク質複合体、炭水化物、ウイルス、細胞またはマクロ分子もしくは分子複合体からなる、請求項21または23に記載の方法。
- 前記特異的結合要素が、抗体、抗原、受容体、リガンド、タンパク質、ポリペプチド、小分子または核酸からなる、請求項21または23に記載の方法。
- 前記特異的結合要素が、抗原と抗体の特異的結合対、ビオチンとアビジンの結合対、炭水化物とレクチンの結合対、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子と受容体分子、酵素補因子と酵素、および酵素阻害剤と酵素からなる群から選択される特異的結合対の要素からなる、請求項21または23に記載の方法。
- 前記特異的結合要素がDNA、RNA、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、任意の前記物質の代謝産物または任意の前記物質に対する抗体である、請求項27に記載の方法。
- 核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスRNAおよびウイルスDNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA、cDNA、mRNA、RNA断片およびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸からなる、請求項28に記載の方法。
- 多数の種類の標的分析物質の検出を可能とするために、前記支持体に複数の異なる第1の特異的結合要素がアレイ状に結合している、請求項21または23に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項21または23に記載の方法。
- サンプル中の、少なくとも2つの結合部位を有する1つまたは複数の標的分析物質の有無を検出するための方法であって、
該標的分析物質を支持体上に固定するための、1種類または複数種類の第1の特異的結合要素が結合した支持体を提供する工程と、
1種類または複数種類の粒子を提供する工程であって、それぞれの種類の粒子に(a)1つまたは複数のラマン標識、および(b)特異的標的分析物質に結合するための第2の特異的結合要素が結合しており、(i)それぞれの種類の粒子に結合した該ラマン活性標識が異なっていて特異的標的分析物質の識別子としての役割を果たし、かつ(ii)それぞれの種類の粒子に結合した第2の特異的結合要素が異なっていて特異的標的分析物質を標的としていることを特徴とする工程と、
サンプル中に1つまたは複数の標的分析物質の存在する場合に粒子と複合体形成した試験支持体が形成されるように、粒子、サンプル、および支持体を、標的分析物質と第1および第2の特異的結合要素との間の特異的結合相互作用に有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の1つまたは複数の標的分析物質の存在の指標として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる方法。 - 多数の種類の標的分析物質の検出を可能とするために、前記支持体に複数の異なる第1の特異的結合要素がアレイ状に結合している、請求項32に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項32に記載の方法。
- 前記ラマン標識の少なくとも一部分が、前記特異的結合要素に結合している、請求項32に記載の方法。
- 前記ラマン標識がオリゴヌクレオチドに結合している、請求項32に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ポリアデノシンまたはポリチミジンである、請求項33に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、いかなる標的核酸とも相補的ではない、請求項32に記載の方法。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項32に記載の方法。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項32に記載の方法。
- 前記ラマン標識が前記特異的結合対要素に結合している、請求項32に記載の方法。
- 前記結合体が前記粒子と共有結合している、請求項41に記載の方法。
- 前記特異的結合要素がDNA、RNA、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖、脂質、リポ多糖、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドホルモンおよびタンパク質ホルモン、非ペプチドホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、腫瘍特異的エピトープからなるペプチド、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、一部分、成分または生成物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、任意の前記物質の代謝産物または任意の前記物質に対する抗体である、請求項32に記載の方法。
- 核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスRNAおよびウイルスDNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA(例えばヒトDNA)、cDNA、mRNA、RNA断片およびDNA断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸からなる、請求項43に記載の方法。
- 前記特異的結合要素が、抗原と抗体の特異的結合対、ビオチンとアビジンの結合対、炭水化物とレクチンの結合対、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター分子と受容体分子、酵素補因子と酵素、および酵素阻害剤と酵素からなる群から選択される特異的結合対の要素からなる、請求項32に記載の試薬。
- サンプル中の、配列が少なくとも2つの部分を有する1つまたは複数の標的核酸の有無を検出するための方法であって、
特異的核酸標的の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した支持体を提供する工程と、
1種類または複数種類の粒子を提供する工程であって、それぞれの種類の粒子にはオリゴヌクレオチドおよび少なくとも1以上のラマン活性標識が結合しており、(i)それぞれの種類の粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが、特異的標的
核酸の配列の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)それぞれの種類の粒子に結合したラマン標識が異なっていて特異的標的核酸の識別子としての役割を果たし、前記ラマン標識が少なくとも1つのラマン標識からなることを特徴とする工程と、
1つまたは複数の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に1つまたは複数の粒子複合体が結合した試験支持体が形成されるように、粒子、支持体、およびサンプルを、支持体に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第1の部分のハイブリダイゼーション、および粒子に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第2の部分のハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、サンプル中の1つまたは複数の標的核酸の存在の指標として前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる方法。 - 前記ラマン標識が、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に結合している、請求項46に記載の方法。
- 多数の種類の標的分析物質の検出を可能にするために、前記支持体に複数の異なる第1の特異的結合要素がアレイ状に結合している、請求項46に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項46に記載の方法。
- 前記ラマン標識の少なくとも一部分が、前記特異的結合対要素に結合している、請求項46に記載の方法。
- 前記ラマン標識がオリゴヌクレオチドに結合している、請求項46に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、ポリアデノシンまたはポリチミジンである、請求項51に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、いかなる標的核酸とも相補的ではない、請求項51に記載の方法。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項46に記載の試薬。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項46に記載の試薬。
- 前記ラマン標識が前記特異的結合対要素に結合している、請求項46に記載の試薬。
- 前記結合体が前記粒子と共有結合している、請求項Xに記載の試薬。
- サンプル中の、配列が少なくとも2つの部分を有する1つまたは複数の標的核酸の有無を検出するための方法であって、
該核酸の第1の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した支持体を提供する工程と、
それぞれオリゴヌクレオチドが結合しており、かつ該オリゴヌクレオチドの一部分と結合したラマン活性標識をそれぞれ含んでなる1種類または複数種類の粒子を提供する工程であって、(i)該粒子に結合したオリゴヌクレオチドのうち少なくともいくつかが該核酸の第2の部分と相補的な配列を有し、かつ(ii)それぞれの種類の粒子と結合したラ
マン標識が特異的標的核酸の識別子としての役割を果たし、前記ラマン標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線により照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン標識からなることを特徴とする工程と、
前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に粒子複合体が結合した試験支持体が形成されるように、粒子、支持体、およびサンプルを、支持体に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第1の部分のハイブリダイゼーション、および粒子に結合したオリゴヌクレオチドと核酸の第2の部分のハイブリダイゼーションに有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、該サンプル中の該標的核酸の存在の指標として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる方法。 - 前記ラマン標識が、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分と結合している、請求項58に記載の方法。
- 多数の種類の標的核酸または標的核酸の一部分の検出を可能にするために、該支持体に複数の異なるオリゴヌクレオチドがアレイ状に結合している、請求項58に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項58に記載の方法。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項58に記載の方法。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項58に記載の方法。
- 前記粒子が金ナノ粒子である、請求項63に記載の方法。
- 1つまたは複数の分子をスクリーニングして、該分子が1つまたは複数の特定の受容体のリガンドであるかどうか、該分子がサンプル中に存在するかどうかを判定するための方法であって、
1つまたは複数の特定の受容体が結合した支持体を提供する工程と、
1種類または複数種類の結合体を提供する工程であって、該結合体が、粒子、該粒子に結合したオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドの一部分に結合したラマン活性標識、および特定の種類の結合体のオリゴヌクレオチドの一部分と結合した前記サンプル由来の分子からなり、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線により照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子からなることを特徴とする工程と、
該分子が特定の受容体のリガンドである場合に粒子と複合体形成した試験支持体が形成されるように、粒子、サンプル、および支持体を、粒子に結合した分子と支持体に結合した特定の受容体との間の特異的結合相互作用に有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、特定の受容体に対するリガンドの確証として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる方法。 - 多数の種類の分子の検出を可能にするために、該支持体に複数の異なる受容体がアレイ状に結合している、請求項65に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項65に記載の方法。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項65に記載の方法。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項65に記載の方法。
- 前記粒子が金ナノ粒子である、請求項69に記載の方法。
- 1つまたは複数の分子をスクリーニングして、該分子が1つまたは複数の特定の受容体のリガンドであるかどうか、該分子がサンプル中に存在するかどうかを判定するための方法であって、
1つまたは複数の特定の受容体が結合した支持体を提供する工程と、
特異的結合対の第1の要素で修飾した分子を提供する工程と、
1種類または複数種類の結合体を提供する工程であって、該結合体が、粒子、該粒子に結合した1つまたは複数のラマン活性標識、および該粒子に結合した特異的結合対の第2の要素からなり、前記ラマン活性標識が、ラマン散乱を誘導可能な放射線により照射されると検出可能または測定可能なラマン散乱シグナルを生じる少なくとも1つのラマン活性分子からなることを特徴とする工程と、
該分子が特定の受容体のリガンドである場合に粒子と複合体形成した試験支持体が形成されるように、粒子、サンプル、および支持体を、分子と支持体に結合した特定の受容体との間、特異的結合対の第1の要素と第2の要素との間の特異的結合相互作用に有効な条件下で接触させる工程と、
該試験支持体と染色物質を接触させて、表面増強ラマン散乱(SERS)を発生可能な表面を有する検出用支持体を生成させる工程と、
SERSスペクトルを得て分析することによって、特定の受容体のリガンドの確証として、前記検出用支持体上の前記粒子複合体の存在を判定する工程と
からなる方法。 - 多数の種類の分子の検出を可能にするために、該支持体に複数の異なる受容体がアレイ状に結合している、請求項70に記載の方法。
- 前記支持体が、スライドグラス、マイクロプレート・ウエル、ビーズ、ポリマー製の膜、または光ファイバーからなる、請求項70に記載の方法。
- 前記粒子が金、Ag、Cu、Pt、Ag/Au、Pt/Au、Cu/Auコア・シェル粒子および合金粒子である、請求項70に記載の方法。
- 前記粒子がナノ粒子である、請求項70に記載の方法。
- 前記粒子が金属ナノ粒子である、請求項70に記載の方法。
- 前記粒子が金ナノ粒子である、請求項75に記載の方法。
- 前記ラマン標識が前記粒子に直接結合している、請求項70に記載の方法。
- 前記ラマン標識が前記粒子に間接的に結合している、請求項70に記載の方法。
- 前記ラマン標識が染色物質によって活性化される、請求項70に記載の方法。
- 前記染色物質が銀、金または銅染色物質を含んでなる、請求項80に記載の方法。
- 1つの容器に入った請求項1に記載の試薬、および別の容器に入ったラマン増強用染色物質からなる、試験用キット。
- 1つの容器に入った請求項1に記載の試薬、および別の容器に入った銀、金または銅染色ラマン増強剤からなる、試験用キット。
- 1つの容器に入った請求項16に記載の試薬、および別の容器に入ったラマン増強用染色物質からなる、試験用キット。
- 1つの容器に入った請求項16に記載の試薬、および別の容器に入った銀、金または銅染色ラマン増強剤からなる、試験用キット。
- 光ファイバー束を備えてなる光ファイバー製検出装置であって、該光ファイバー束の終端は光ファイバーの端部となっており、複数の光ファイバーの端部に請求項1に記載の試薬が配置されていることを特徴とする検出装置。
- 光ファイバーの端部の2つ以上の請求項1に記載の試薬が、異なる特異的結合要素および異なるラマン標識を有する、請求項86に記載の光ファイバー製検出装置。
- 光ファイバー束を備えてなる光ファイバー製検出装置であって、該光ファイバー束の終端は光ファイバーの端部となっており、複数の光ファイバーの端部に請求項16に記載の試薬が配置されていることを特徴とする検出装置。
- 光ファイバーの端部の2つ以上の請求項16に記載の試薬が、異なる特異的結合要素および異なるラマン標識を有する、請求項86に記載の光ファイバー製検出装置。
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