JP2003510065A - 分析物検出のためのレセプターを有する粒子構造体 - Google Patents

分析物検出のためのレセプターを有する粒子構造体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、レセプター分子が結合し得る新規な粒子構造体を含んでいる。その構造体は、問題の分子を含有する複合溶液中の分析物のラマン分光分析に有効である。本発明のある実施態様においては、分析物分子内に有するラマンシグナル生成部分がレセプター分子は欠けているものであるので、分析物のレセプターへの結合によりラマンシグナル生成部分と配列する。これらの方法を用いて検出し得る分析物としては、核酸、タンパク質、又は配列に特異的に結合し得る他の分子が含まれる。表面現象と共鳴現象によって分析物により生成されるラマンシグナルを増強する粒子構造体が開示される。新規な方法は、粒子構造体を製造し、その粒子構造体の共鳴増強の領域にレセプター分子を結合し、よって生物分子の非常に特異的な感受性のある分析に使用し得るラマンシグナルを生成する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、分析物(analyte)の検出用粒子構造体の製法に関する。具体的には
、本発明は、粒子構造体内の共鳴ドメインに付着したレセプタ分子を含む、該粒
子構造体の製造に関する。より詳しくは、本発明は、ラマン分光法を利用した、
分析物検出のための、レセプタ分子を含む粒子構造体の利用に関するものである
。
【０００２】
【背景技術】
少量の分析物と、多数のおよび多量の他の物質を含む、複雑な混合物中の、分
子または「分析物」の検出および定量は、完全に解決されることのない課題となっ
ている。より多くの興味が、生理学および疾患過程における生物学的分子の役割
に集められているので、核酸およびタンパク質等の生物学的分子の、迅速かつ正
確な検出が、より重要となっている。1. 分析物の検出 分析物または「リガンド」分子の検出は、最近の生物学、生物工学、化学および
環境工業の重要な局面となっている。リガンドの検出は、クロマトグラフィーの
化学的方法、マススペクトル法、核酸ハイブリッド化法および免疫学的方法を包
含する、多くの異なる方法を利用して達成できる。ハイブリッド化法および免疫
学的方法は、検出器または「レセプタ」分子に対する、リガンドの特異的結合に基
づいている。これら方法の特異性に関する基礎は、レセプタ分子によって与えら
れ、該分子は特有の様式で該リガンド分子に結合し、結果として結合した複合体
を生成することができる。未結合リガンドの除去を促進する条件下で、この複合
体を処理した際には、該結合リガンドを、アッセイすることができる。
【０００３】 この結合の特異性、結合および未結合リガンドおよびレセプタ分離の完全性、お
よび該リガンドの検出感度が、この検出装置の選択性をもたらす。例えば、生物
学的および生物工学的工業において、デオキシリボ核酸(DNA)およびメッセンジ
ャーリボ核酸(mRNA)等の分析物は、特定の遺伝的、生理的または病理的な状態に
関する、重要な指標である。DNAは、生物の遺伝的な組み立てに関する重要な情
報を含むことができ、またmRNAは、該当遺伝子が、特定の生理的または病理的な
条件下で活性であるか否か、および如何なるタンパク質が、遺伝子活性化の結果
として生成できるかに関する重要な指標であり得る。また、タンパク質の直接的
な検出は、ある個体の生理的または病理的な状態を理解する上で重要であり得る
。
【０００４】 DNAは、2本のストランドからなる二重螺旋で作られており、該ストランド各々
はヌクレオチド塩基の一組または「配列」である。DNA中に見出される塩基は、ア
デニン、チミン、シトシンおよびグアニンである。該二重螺旋の１本のストラン
ドは、mRNAに転写することのできるヌクレオチド配列を有し、ここでは「読み取
りストランド」と呼ばれ、また他方のストランドは、塩基の1配列を含み、該塩基
各々は、該読み取りストランド内の対応する位置における塩基に対して、相補的
なものである。該読み取りストランド内の各アデニンに対して、該他方のストラ
ンド中にはチミンが存在する。同様に、該読み取りストランド内の各シトシンに
対して、該他方のストランド中にはグアニンが存在する。該読み取りストランド
内の各グアニンおよびアデニンに対して、該他方のストランド中には、夫々シト
シンおよびチミンが見出される。従って、これら2本のストランドが、夫々他方
に関して適性に配列された場合には、各ストランドの相補的塩基が、水素結合を
形成し、結果としてこれら2つのストランドを、ワトソン-クリックのモデルに従
う複合体または「ハイブリッド」状態に維持する。従って、これら2つのストラン
ドは、ここでは相互に「相補的」であると考えられる。リボ核酸はDNAと同様な構
造をもつ。但し、チミンは典型的に塩基であるウラシルによって置き換えられる
。しかし、ウラシルはアデニンに対して相補的であり、従ってRNAのDNAとのハイ
ブリッド化が起こり得る。核酸の情報内容は、この核酸を構成する単位の配列内
に、有意に存在するので、ヌクレオチド塩基の存在のみを検出できる、純粋に化
学的な方法は、その有用性において制限される。即ち、特定のDNAまたはRNAの存
在を検出する方法は、該当する核酸の塩基配列のキャラクタリゼーションに基づ
いている。
【０００５】 A. 核酸のハイブリッド化法による検出 多くの異なる方法が、核酸およびタンパク質の検出のために、一般的に利用さ
れているが、これら方法は時間がかかり、経費がかかり、あるいは再現性に乏し
い可能性がある。例えば、DNAまたはRNA分子における特定の核酸配列の検出は、
ハイブリッド化反応を利用して行うことができ、ここでは、分析物のDNAまたはR
NA分子を、DNAの相補配列に結合することができる。相補的DNA分子を、支持マト
リックスに付着させることができ、この結合したDNAおよびマトリックスを、こ
こでは「基質」と呼ぶことにする。分析物としての核酸を、相補的基質DNAに暴露
することにより、相対的に安定なハイブリッドを形成することができる。この二
重螺旋DNAハイブリッドの検出は、標識を付したDNA分析物を検出できる方法を利
用して、特徴的に行われる。この標識は、典型的に放射性、スピン共鳴、発色団
またはその他の標識を使用して行われる。かくして、該標識された分析物が、該
基質に付着した場合、未結合の分析物は、除去することができ、また該結合した
または特異的な分析物は、検出し、かつ定量することができる。
【０００６】 例えば、通常の方法を利用して、特定の配列を持つmRNA分子を検出するために
は、天然に産する、即ち「天然の」mRNAは、典型的に、「逆転写酵素」と呼ばれる酵
素を用いて、相補的DNA(cDNA)内に標識ヌクレオチドを組み込む条件下で、該cDN
Aに転化される。この標識されたcDNAと該ハイブリッド化基質との結合の際に、
該結合したリガンドは、放射分析技術、例えばシンチレーションカウンティング
法、蛍光法またはスピン共鳴法を、使用した標識の型に応じて利用して、検出す
ることができる。 核酸およびタンパク質の検出のために、通常利用できる方法は、望ましからぬ
特性をもつ。これら方法は、時間を要し、高価な装置および試薬を必要とし、熟
練した手作業を必要とし、また該試薬は環境上の観点から有害である可能性があ
る。更に、mRNAをアッセイするために、これらの方法は、また逆転写の忠実性に
おける欠陥に敏感である可能性がある。逆転写中に形成されたcDNAが、そのmRNA
に対して正確に相補的ではない場合、該分析物は、該天然のmRNAと同一の配列を
持たず、誤った結果が得られる可能性がある。
【０００７】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸配列の増幅は、検出できる核酸分子(相
補DNA、即ちcDNA)の数を増大するのに利用されている。PCR法は、該cDNAを増幅
するための、DNAポリメラーセ酵素を必要とする。幾つかのDNAポリメラーセは、
新たに合成されるcDNAの成長中のストランド内に不正確な塩基を挿入する恐れが
ある。PCRのために使用されるDNAポリメラーセおよびプライマーによるセラチン
(ceratin) cDNAの認識は、増幅すべき該サンプル中の、DNAの特異的配列に依存
して変動する可能性がある。この変動は、異なるcDNA分子の非-比例的な増幅を
もたらす恐れがある。正確でない配列を持つストランドの、後の増幅は、同一サ
ンプル中に、幾つかの異なるcDNA配列の存在をもたらす恐れがある。従って、PC
Rを利用したcDNA分析の精度および感度は、低下する可能性がある。 更に、医学的な診断または討論の目的に関連して、迅速に入手できることは、
テスト結果にとって極めて重要であり得る。特定の核酸配列を検出するための一
般に利用される方法は、医学的な診断または討論の目的にとって、余りに遅すぎ
る可能性がある。かくして、核酸配列の迅速かつ正確な測定に対する、需要があ
る。
【０００８】 II. ラマン分光法 ラマン分光法は、分析物分子中にシグナルを発生するための、電磁波の利用を
含む。ラマン分光法は、極最近、必要な感度の達成が可能な点にまで、発展して
いる。ラマン分光法および該ラマン分光法の感度を高めるための、幾つかの方法
を、以下に説明する。 A. ラマン散乱 ラマン散乱の理論によれば、近赤外、可視または紫外範囲の波長を持つ入射フ
ォトンが、ある分子を照射した場合、この入射光のフォトンは、該分子によって
散乱され、結果として該分子の振動状態は、より高いまたはより低いレベルに変
更される。分子の振動状態は、該分子の結合のある型の伸縮、曲げまたは屈曲に
よって特徴付けられる。次いで、該分子は、一時的にその元の振動状態に戻るこ
とができる。この分子がその元の振動状態に戻る際に、該分子は、該入射フォト
ンと同一の波長を持つ、特徴的なフォトンを放出することができる。このフォト
ンは、該分子に関して任意の方向に放出され得る。この現象は、「レイリー(Rale
igh)の光散乱」と言われる。
【０００９】 変更された振動状態を持つ分子は、フォトンの放出後に、元の状態とは異なる
振動状態に戻ることも可能である。ある分子が、元の状態とは異なる状態に戻る
場合、該放出されたフォトンは、該入射光の波長とは異なる波長を持つことがで
きる。この型の発光は、この効果の発見者である、C.V.ラマン(Raman)にちなん
で、「ラマン散乱」として知られている。ある分子が、その元の振動状態よりも高
い振動レベルに戻った場合、該放出されたフォトンのエネルギーは、該入射光の
波長よりも低い(即ち、長い波長)であろう。この型のラマン散乱は、「ストーク
ス-シフト(Stokes-shifted)ラマン散乱」と呼ばれる。逆に、ある分子が、その元
の振動状態に戻った際に、より高い振動状態にある場合、この放出されたフォト
ンは、より低いエネルギーをもつ(即ち、より短い波長を持つ)。この型のラマン
散乱は、「アンチストークス-シフトラマン散乱」と言われる。より高い振動状態
にある分子よりも、元の状態にある分子のほうが多いので、典型的には該ストー
クス-シフトラマン散乱が、該アンチストークス-シフトラマン散乱よりも支配的
であろう。結果として、ラマン分光法において観測される、波長の典型的なシフ
トは、長波長側へのシフトである。ストークスおよびアンチストークス両シフト
は、ラマン分光光度計を使用して定量化できる。
【００１０】 B. 共鳴ラマン散乱 該入射光の波長が、該分子の最大吸収に関わる振動数またはその近傍にある場
合、フォトンの吸収は、該分子の電気的および振動的状態両者を高める可能性が
ある。これら波長のラマン散乱効率は、該吸収の最大値に関わる波長とは実質的
に異なる波長における効率の約108倍程度に高めることができる。従って、基底
の電気的状態への復帰に伴って、該フォトンを放出した際には、該ラマン散乱の
強度を、同等なファクターだけ高めることができる。 C. 表面増強 (Surface Enhanced) ラマン散乱 ラマン活性分子を、幾つかの型の金属表面近傍にまで励起した場合、該ラマン
散乱強度における有意な増加が、観測される。これら波長において観測された、
この高いラマン散乱は、ここでは「表面増強ラマン散乱」と命名される。ラマン強
度において最大の増加を示す該金属表面は、典型的には微小な金属粒子で被覆さ
れた、微小なまたはナノサイズの粗い表面を含む。例えば、金属コロイド等のナ
ノサイズの粒子は、ラマン散乱強度を、金属粒子の不在下でのラマン散乱よりも
、約106倍またはそれ以上まで高める可能性がある。このラマン散乱強度を高め
る作用を、「表面増強ラマン散乱」と言う。
【００１１】 この表面増強ラマン散乱のメカニズムは、正確には分かっていないが、一つの
ファクタがこの増強に影響をもつものと考えられる。電子は、典型的に振動運動
を示し、ここではこれを「プラズモン(plasmon)」振動と命名する。該入射光の波
長に対して約1/10倍の径を持つ粒子が、この作用に寄与する可能性がある。入射
フォトンは、該粒子を横切る電場を誘発し、結果として該金属内の移動性電子の
運動を変更することができる。該入射光は、その波長を通して循環するので、電
子の誘発される運動は、該光の循環に追随し、結果として該金属表面内で、該入
射光と同一の周波数をもつ、該電子の振動を生じる。これら電子の運動は、該金
属粒子内に移動性の電気双極子を生成し得る。該金属粒子が、ある形状を持つ場
合、入射光は、整合された様式で表面電子群を振動させることができ、結果とし
てこのようにして生成した電場の、積極的な妨害を生じ、本明細書において「共
鳴ドメイン(resonance domain)」と呼ぶ領域を生成する。従って、このような共
鳴ドメインによって増強された電場は、ラマン散乱の強度を高めることができ、
かくしてラマン分光光度計で検出されるシグナルの強度を、高めることが可能と
なる。
【００１２】 ラマン散乱に及ぼされる、表面増強および共鳴の協働効果は、「表面増強共鳴
ラマン散乱」と命名される。この表面増強共鳴ラマン散乱の協働効果は、該ラマ
ン散乱の強度を、約1014またはそれ以上高めることができる。増強ラマン散乱に
関する上記の理論が、この効果を説明する唯一の理論ではないことに注意すべき
である。他の理論も、これら条件下における、この高いラマン散乱強度を説明す
ることができる。 D. 核酸およびタンパク質を検出するためのラマン法 核酸およびタンパク質を検出するために利用される幾つかの方法がある。典型
的に、分析物分子は、これに付加されて、分析的方法の該分子を検出する能力を
高める、リポーター基を持つことができる。リポーター基は、放射性、蛍光性、
スピン標識であり得、また合成中に該分析物中に組み込むことができる。例えば
、リポーター基は、対象とする該リポーター基を含むプリカーサから、そのDNA
を合成することによって、mRNAから作られるcDNA内に組み込むことができる。付
随的に、他の型の標識、例えばローダミンまたはエチジウムブロミドを、該アッ
セイ中に、結合した核酸のストランド間に挿入することができ、またこれは、ハ
イブリッド化核酸オリゴマーのリポーター基として機能し得る。
【００１３】 上記方法に加えて、幾つかの方法が、ラマン分光法を利用した、核酸の検出の
ために用いられている。Vo-Dinhの米国特許第5,814,516号、同第5,783,389号、
同第5,721,102号および同第5,306,403号参照。これら特許の内容全体を、本発明
の参考とする。最近、ラマン分光法は、タンパク質を検出するために利用されて
いる。Tarcha等の米国特許第5,266,489号および同第5,567,628号両者は、テスト
混合物中で、ラマン活性標識および未標識分析物を使用して、標識された分析物
を提供するものであり、これら特許の内容全体を、本発明の参考とする。上記方
法は、該分析物分子への、ラマン活性標識または「リポーター」基の導入に基づく
ものである。該リポーター基は、該分析物の存在を検出し、かつ定量するのに利
用される、ラマンシグナルを与えるように選択される。 該分析物内への、リポーター基の導入を要求することによって、付随的な段階
および時間が必要となる。更に、上記方法では、このアッセイの選択性および感
度を得るために、該結合および未結合のラマン標識された分析物の、十分な洗浄
を必要とする可能性がある。その上、特別なラマン標識を、使用するアッセイの
各型に対して、準備する必要があることから、該分析物の諸特性を、該アッセイ
に先立って、決定する必要がある。
【００１４】
【発明の内容】
従って、本発明の一つの目的は、分析物分子の標識化に頼らない分光学的方法
を開発することである。 本発明の他の目的は、蛍光、SERS及びSERRSを含む光学検出方法のための粒子
構造体の製造方法の開発及びその製造である。 これらの、及びその他の目的は、ラマン及び／又はその他の電磁放射を含むシ
グナルの直接検出に有用な組成物及び方法の設計、及び製造によって達成される
。一般に、本発明の分析物の検出に有用な組成物には、ラマンシグナルを含む電
磁シグナルを増強するように設計された粒子構造体を使用することができる。粒
子構造体は、フラクタル、ランダム又は規則正しく並んだものであってもよい。
本発明のある特定の実施態様において、粒子構造体は、リンカーを用いる化学的
方法を用いて製造してもよい。このように結合した粒子構造体は、増強したラマ
ンシグナルの発生を与えて種々の分析物を敏感よく検出を可能にする入射電磁放
射の波長の選択及びその他のものを含む所望の性質を有するように設計し、製造
することができる。
【００１５】 本発明のある特定の実施態様において、ラマン及びその他の電磁シグナルは、
分析物分子内に電磁的活性標識を組み込むことを必要としないで、分析物を検出
することができる。ラマン分光方法で使用されるこれらの実施態様の方法は、本
明細書において「逆ラマン分光」又は「RRS」と呼ばれる。レセプターへの分析
物の結合及び結合しない分析物の除去により、分析物は、検出及び／又は定量化
及び／又は同定のための検出可能なラマンシグナルを提供できる。このように、
核酸配列を検出するために、同定されるべき特異的配列と相補的な配列を有する
が、分析分子の一般的な成分のないオリゴヌクレオチドレセプター分子を形成す
ることができる。実施例として、アデニンは、レセプター分子の分析物のチミン
残基の結合に悪影響を与えることなしに、2,6-ジ-アミノプリン（「2,6AP」）に
よって置換できる。同様に、5-メチルウリジン又は5(1-プロピニル)ウリジンは
、分析物のアデニンの結合に悪影響を与えることなしに、相補的な核酸配列のチ
ミンを置換できる。さらに、本発明の他の実施態様において、重水素（D2O）を
使用してある特定のレセプターのある特定の合成でH2Oを置換することができる
。本発明のさらに別の実施態様において、ペプチド核酸（本明細書において「PN
A」と呼ぶ）は、燐酸及び糖含有核酸に代えて使用することができる。
【００１６】 上記のラマンシステムを用いて、固有のラマンシグナルを有する天然分子の結
合を検出でき、その結果容易に定量化及び分析できる。従って、これらの新規な
方法は、生理活性分子の検出のスピード、信頼性及び精度の実質的な改善を提供
する。 本発明の他の実施態様において、SERSの表面増強効果を促進する表面を生成す
る。他の実施態様において、共鳴領域に、局所的に、レセプターに組み込まれる
ラマン増強表面を生成し、その結果ラマン分光検出の感度を増大する。 本発明のさらに別の実施態様において、粒子構造体、レセプター及び分析物を
入射電磁放出にさし、複合物のラマンスペクトルを使用して分析物の存在量を検
出及び／又は定量化する、生物学的に重要な部分の分析システムを提供する。
【００１７】 幾つかの実施態様において、レセプターは、共鳴領域に付着又はその付近に配
置でき、その結果多くのシグナルを集中させ、分析物の検出の感度を増大させる
。 ある特定の実施態様は、共鳴領域へのレセプターの選択的な付着を提供し、そ
の結果他の場所での分析物-レセプター複合体の効果を減少させる。 本発明のさらに別の実施態様において、フラクタル粒子構造体を使用して分析
物の存在下で発生するラマンシグナルを増強することができ、その結果増大した
感度を有するシグナルの検出方法を提供する。 実施態様の多くは、分析物のラマン分光検出について説明されているが、本発
明の原理は、蛍光法を含む電磁放射の共鳴に関連する任意の検出方法で使用でき
る。 本発明は、その特定の実施態様に関して記載される。本発明のその他の目的、
構成及び利点は、本明細書及び図面を参照して明らかになるであろう。
【００１８】 （発明の詳細な説明） （定義） 下記の単語及び用語が本願明細書において使用される。 本願明細書において使用される用語「分析物」は、それらの存在及び／又は量
が決定されるべき分子、粒子又は他の物質を意味する。分析物の例は、デオキシ
リボ核酸("DNA")、リボ核酸("RNA")、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、糖質、
脂質、糖タンパク質、細胞、細胞レベル下オルガネラ、細胞凝集物、及びその他
の生物学的に関心のある物質を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１９】 本願明細書において使用される用語「フラクタル」とは、構成要素で構成され
る構造体であって、観察スケール及び構成要素数の間の相関関係、すなわちスケ
ール不変量を有するものを意味する。単なる例証のために、連続線分は、一次元
オブジェクトである。平面は二次元オブジェクトであり、体積は三次元オブジェ
クトである。しかし、線分がその中にギャップを有しかつ連続線分でないならば
、この次元(dimension)は１未満である。例えば、線分の1/2が失われているなら
ば、そのフラクタル次元は1/2である。同様に、平面上の点が失われているなら
ば、その平面のフラクタル次元は1と2の間である。平面の点の1/2が失われてい
るならば、そのフラクタル次元は1.5である。更に立体(solid)の点の1/2が失わ
れているならば、そのフラクタル次元は2.5である。スケール不変量構造におい
て、オブジェクトの構造は、観察された面積のサイズにかかわらず、類似してい
るように見える。従って、フラクタル構造は、規則正しくないランダム構造とは
区別される、規則正しい構造の一種である。 本願明細書において使用される用語「フラクタル会合体(fractal associate)
」とは、互いに連結された少なくとも約100個の個別の粒子を含む、限定された
サイズの構造体を意味し、かつこれはフラクタル会合体を構成する個々の粒子サ
イズの下限、及びフラクタル会合体のサイズの上限で制限された観察領域内のス
ケール不変量を示している。
【００２０】 本願明細書で使用される用語「フラクタル次元（寸法）」は、下記式のエクス
ポーネントDを意味する： N=RD (ここで、Rは観察面積であり、Nは粒子数であり、かつDはフラクタル次元である
。)。従って、非フラクタル固体において、観察半径が2倍に増加するならば、観
察される粒子数は同じ体積で23増加する。しかし対応するフラクタルにおいては
、観察半径が2倍に増加するならば、観察される粒子数は23未満の増加である。
【００２１】 本願明細書において使用される用語「フラクタル粒子会合体」は、単位体積(
従属変数)当たり又は単位面積当たりの粒子数が観察スケール(独立変数)により
非線形に変化するように配列された膨大な数の粒子を意味する。 本願明細書において使用される用語「標識」は、標識がその一部であるような
分析物の存在及び／又は量を決定することができるような、他の部分とは異なる
物理化学的特徴を有する部分を意味する。標識の例は、蛍光、スピン共鳴、放射
性部分を含むが、これらに限定されるものではない。レポーター基としても公知
である。 本願明細書において使用される用語「リンカー」は、表面に結合することが可
能である2種以上の化学基を有しかつ粒子を一緒に結合し粒子群の形成をもたら
すような、原子、分子、部分又は分子複合体を意味する。最も単純なリンカーは
、2個の粒子を連結する。分枝したリンカーは、より多数の粒子を一緒に結合す
ることができる。
【００２２】 本願明細書において使用される用語「規則的構造」は、無秩序でない構造を意
味する。 本願明細書において使用される用語「粒子構造体」とは、電磁放射線投射に反
応した電場の増強を可能にするような様式で互いに会合している個々の粒子の群
を意味する。粒子の例は、金属、金属被覆したポリマー及びフラーレンを含む。
更に用語「粒子構造体」の意味には、誘電性表面上のもしくは誘電性物質内に埋
め込まれた粒子を含むフィルム又は複合体も含まれる。 本願明細書において使用される用語「パーコレーション(percolation)ポイン
ト」は、媒体内の表面伝導度又はバルク伝導度のいずれかにより測定されるよう
な、伝導度の増加を表面が示す場合の、導電性表面又は媒体上のある時点を意味
する。表面又は「シート」伝導度を測定する一法は、表面に当てた電気探針によ
るものである。
【００２３】 本願明細書において使用される用語「ラマンアレイリーダー」は、光源及び光
検出器を備えた装置を意味する。 本願明細書において使用される用語「ラマンシグナル」は、ラマンスペクトル
又はラマンスペクトルの一部を意味する。 本願明細書において使用される用語「ラマンスペクトル特性」は、検出条件下
の分析物について作成されたラマンスペクトルの分析の結果得られる値を意味す
る。ラマンスペクトル特性は、ラマンバンド振動数、ラマンバンド強度、ラマン
バンド幅、バンド幅の比、バンド強度の比、及び／又はこれらの組合せを含むが
、これらに限定されるものではない。 本願明細書において使用される用語「ラマン分光法」は、電磁放射線の振動数
の関数としての、散乱された電磁放射線の強度間の関係を決定する方法を意味す
る。 本願明細書において使用される用語「ラマンスペクトル」は、電磁放射線の振
動数の関数としての、散乱された電磁放射線の強度間の関係を意味する。
【００２４】 本願明細書において使用される用語「ランダム構造」は、規則的でもフラクタ
ルでもない構造を意味する。ランダム構造は、観察点及び観察スケールとは関わ
りなく、均一(uniform)であるように見え、ここで観察スケールは少なくとも数
個の粒子を包含している。 本願明細書において使用される用語「レセプター」は、検出条件下で、分析物
に結合することができるか又はこれを保持することができるような部分を意味す
る。
【００２５】 本願明細書において使用される用語「共鳴」は、入射、散乱及び／又は放出さ
れた電磁放射線と、その電磁放射線により励起され、かつその電磁放射線の電場
強度を増加するような電子を有する表面の相互作用を意味する。 本願明細書において使用される用語「共鳴ドメイン」は、入射電磁放射線の電
場における増加が生じるような粒子構造内の又はそれに近接する領域を意味する
。 本願明細書において使用される用語「レポーター基」は標識を意味する。 本願明細書において使用される用語「逆ラマン分光法("RRS")」は、分析物の
レセプターにおいて又は分析が行われる媒体においては認められないようなラマ
ンスペクトル特徴の存在により、分析物が識別されるようなラマン分光法の適用
を意味する。
【００２６】 本願明細書において使用される用語「スケーリング直径」は、粒子のサイズと
は関わりなく、同じ粒子直径の比(スケーリング比)を示すような、入れ子式構造
の粒子間の関係を意味する。 本願明細書において使用される用語「表面増強ラマン分光法("SERS")は、ラマ
ン散乱の強度が増強表面の存在下において増強されるような、ラマン分光法の適
用を意味する。 本願明細書において使用される用語「表面増強共鳴ラマン分光法("SERRS")」
は、分析物のラマンシグナルが増強表面の存在下で増強され(SERS参照)、かつ分
析物の吸収バンドが入射電磁放射線の波長と重なるような、ラマン分光法の適用
を意味する。
【００２７】 （発明の実施態様） 本発明の方法及び組成物は、分析物分子の検出及び定量のための分光法に関す
る現存の方法に勝る改善点を示している。特に、この組成物及び方法は、赤外分
光法、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴法、ラマン分光法、質量分析法、又は電
磁放射線による分析物の励起を利用する他の方法との併用が望ましい。 本発明のある実施態様は、表面増強ラマン分光法("SERS")、表面増強共鳴ラマ
ン分光法("SERRS")、及び逆ラマン分光法("RRS")を基にしている。本発明は、ラ
マン活性構造に結合した特異的分析物レセプター分子を有するようなラマン活性
構造を形成する方法を含む。本発明は更に、ラマン分光法、逆ラマン分光法、逆
ラマン分光法に有用な組成物、並びにラマン分光法を具体化するアレイ及び試験
キットを用い分析物を検出する方法も含む。 本発明の方法において使用するのが望ましい構造は、サブセットとしてフラク
タル会合体を含むような、本願明細書において粒子構造体と称される、構造内に
小粒子がある構造を含む。粒子構造体は、入射及び出射電磁放射線と共鳴するよ
うに電子を振動することが可能である物理的及び化学的構造を有することで特徴
付けることができる。
【００２８】 1.粒子構造体の製造 本発明において使用するのに望ましいラマン活性構造は、ラマンシグナルが増
幅され得るような構造のいずれかを含むことができる。金属フラクタル構造に関
する下記の考察は、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、単に
説明を目的としている。 A.金属粒子の製造 本発明のいくつかの実施態様におけるレセプターのナノスケールアレイ用の金
属粒子を製造するために、本発明者らは、一般に当該技術分野において公知のTa
rchaらの米国特許第5,567,628号の方法を使用し、これは本願明細書に参照とし
て組入れられている。金属コロイドを、貴金属、特に元素金又は銀、銅、プラチ
ナ、パラジウム、及びその他の表面増強を提供することがわかっている金属で構
成することができる。一般に、金属コロイドを形成するためには、金属塩を含有
する希釈溶液を、還元剤と化学的に反応する。還元剤は、アスコルビン酸エステ
ル、クエン酸エステル、水素化ホウ素、水素ガスなどであることができる。金属
塩の化学還元は、溶液中に元素金属を生成し、これは一緒になり比較的球形の金
属粒子を含むコロイド溶液を形成することができる。
【００２９】 実施例１：金コロイド及びフラクタル構造の製造 本発明のひとつの実施態様において、金核(gold nuclei)溶液を、水を溶媒と
するNaAuCl4の0.01％溶液を激しく攪拌しながら調製することにより作成した。1
％クエン酸ナトリウム溶液1mlを添加した。1分間混合した後、0.075％NaBH4及び
1％クエン酸ナトリウムを含有する溶液1mlを、激しく攪拌しながら添加した。こ
の反応を5分間進行させ、平均直径約2nmを有する金核を調製した。この金核含有
溶液を、必要となるまで4℃で冷蔵した。この溶液は、そのままで、もしくは金
核含有溶液30μl及び1％クエン酸ナトリウム溶液0.4mlを、H2O 100ml中に希釈し
た1％HAuCl4・3H2Oの溶液に激しく攪拌しながら迅速に添加することにより、よ
り大きいサイズの粒子(例えば直径約50nmまで)を製造するために使用することが
できる。この混合液を15分間煮沸し、その後室温まで冷やした。冷却時に、溶液
中の粒子はフラクタル構造を形成することができる。得られるコロイド及び／又
はフラクタル粒子構造は、褐色瓶に入れて貯蔵することができる。
【００３０】 ガラスを含む誘電性表面への増強粒子の付着により、電磁シグナルを増強する
ことができるフィルムを作成することができる。このようなフィルムは、約10nm
と薄い。特にこのようなフィルムの表面への電界増強物質の分布はむらとなるこ
とがある。このような領域は共鳴ドメインである。このような領域は、分析物の
結合及び検出のためのレセプターの配置にとって特に有用であることができる。
誘電性物質が埋め込まれたフィルム又は粒子構造について、増強構造を製造する
一法は、「パーコレーションポイント」が出現するまで表面を処理することであ
る。シート抵抗及び体抵抗の測定法は、当該技術分野において周知である。
【００３１】 実施例２：レーザーアブレーションを用いる金属粒子及びフラクタル構造体の製
造 金属粒子を製造するために、前述の液相合成に加え、レーザーアブレーション
を使用した。金属箔片を、低濃度のヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン又は
クリプトンのような希ガスを含むチャンバー内に置いた。箔のレーザー光又は他
の熱源への曝露は、金属原子の蒸発を生じ、これはランダム拡散の結果、チャン
バー内の懸濁液中に、自発的に凝集し、フラクタル又は他の粒子構造を形成する
。これらの方法は当該技術分野において周知である。 B.粒子含有フィルムの製造 本発明のひとつの実施態様である金属コロイド粒子を含有する基板を製造する
ために、コロイド金属粒子を、実施例1又は2に記されたように、石英スライド上
に付着することができる。同様の方法で、ランダム構造又は非-フラクタル規則
的構造を組込む別のフィルムを製造することができる。
【００３２】 実施例３：金フラクタル構造体を含む石英スライドの製造 石英スライド（２．５ｃｍ×０．８ｃｍ×０．１ｃｍ）を、ＨＣｌ：ＨＮＯ3
（３：１）の混合物中において数時間清浄した。スライドを、その後、約１８Ｍ
Ωの抵抗性まで脱イオンＨ2Ｏ（Millipore Corporation）で洗浄し、次いで、Ｃ
Ｈ3ＯＨで洗浄した。スライドを、その後、ＣＨ3ＯＨ中において１：５希釈され
たアミノプロピルトリメトキシシランの溶液中において１８時間浸漬させた。ス
ライドを、その後、上記コロイド金溶液への浸漬前に、ＣＨ3ＯＨ（分光光度的
グレード）及び脱イオンＨ2Ｏで広範に洗浄した。スライドを、その後、上記金
コロイド溶液に浸漬させた。この間、金コロイド粒子が、石英スライドの表面へ
堆積し、結合した。２４時間後、コロイド誘導体化を終了した。一旦結合すると
、コロイド金ナノコンポジットの石英表面への結合は強力で、本質的には不可逆
的である。この手順の間、そのように誘導されたスライドの紫外線及び／又は可
視光吸光スペクトルを使用して、誘導体化手段の質及び再現性を評価した。その
製造方法を、電子顕微鏡を用いてモニターして、コロイドコーティングの密度、
表面上における金コロイド粒子の分配、及び金コロイド粒子のサイズを評価した
。
【００３３】 Ｃ．粒子構造体を形成するための粒子の凝集 本発明の他の態様に従えば、数種の方法を使用して、粒子構造体を形成するこ
とができる。金属コロイドが表面上に堆積し得ることが知られており、凝集する
と、約１．８のフラクタル寸法(fractal dimension)を有するフラクタル構造体
を形成する。Safonovら, Spectral Dependence of Selective Photomodificatio
n in Fractal Aggregates of Colloidal Particles, Physical Review Letters 80(5) : 1102-1105 (1998)、これは文献として本件明細書に十分に組み込まれる
ものとする。図１は、本発明の方法における使用に適する粒子構造体を示す。粒
子は、スケール−不変様式(scale-invariant fashion)で配列され、それにより
、レーザー光線によるイルミネーション上における共鳴ドメイン(resonance dom
ain)の形成が促進される。 フラクタル構造体の他に、規則的(ordered)な非フラクタル構造体及びランダ
ム構造体が発生し得る。これらの異なるタイプの構造体は、電磁放射線を用いる
分析物検出に関連するシグナルを強化するのに望ましい特性を有しているかもし
れない。 規則的な非フラクタル構造体を作り出すためには、例えば、以下により詳細に
記載するような異なる長さを有する化学リンカーを使用することができる。また
、同一サイズのリンカーを用いて、規則的な構造体を発生させることができ、そ
れは、ある用途に有用である。
【００３４】 本発明のある態様においては、粒子が共に結合して、共鳴特性を有する構造体
を形成し得る。一般に、球状、楕円状又は棒状の粒子を有するのが望ましい。楕
円状粒子について、その粒子が、長軸（ｘ）、他軸（ｙ）及び第３軸（ｚ）を有
するのが望ましい。一般には、使用される入射電磁放射線の波長（λ）の約０．
０５〜約１倍であるｘを有するのが望ましい。棒(rod)状について、ｘが、約４
λ未満、あるいは約３λ未満、あるいは約２λ未満、他の態様では約１λ未満、
及び更に他の態様では約１／２λ未満であるのが好ましい。棒の末端は、フラッ
ト、テーパー、オブロングのいずれかであってもよく、又は共鳴を促進し得る他
の型を有していてもよい。 ２種の粒子構造体について、粒子対は、ｘ寸法が、約４λ未満、あるいは約３
λ未満、あるいは約２λ未満、他の態様では約１λ未満、及び更に他の態様では
約１／２λ未満であるのが望ましい。 ２次元構造体について、粒子対、棒、棒＋粒子を一緒に使用することができる
。これらの要素の配列は、ランダムに分配されたものであってもよく、又は非線
状様式において観察スケールに依存する分配密度を有していてもよい。
【００３５】 他の態様においては、棒が一緒に末端ごとに結合して、強化された共鳴特性を
提供し得る長構造体を形成していてもよい。 ３次元構造体について、標準ネスト粒子(regular nested particle)、又はフ
ラクタル構造体における又は規則的なネスト配列における化学リンカーのいずれ
かにより結合された、粒子の化学的配列を使用することができる。 ３次元構造体の更に他の態様においては、粒子の懸濁液が望ましい。これらの
態様の幾つかにおいては、懸濁粒子が、約１／２λから約１ミリメートル（ｍｍ
）の範囲の寸法を有していてもよい。 本発明の方法を用いて、研究者又は開発者は、以下のものを選択すること含む
がこれらに制限される訳ではない多くの必要性を満足させることができる：粒子
素子による電磁放射線の吸光度、選択される表面の性質、共鳴ドメインの数、共
鳴特性、共鳴強化を示す電磁放射線の波長、粒子構造体の多孔度、及び構造体の
フラクタル寸法を含むがこれに制限される訳ではない粒子構造体の全体的構造体
。
【００３６】 １．光凝集(photoaggregation) 光凝集を使用して、ラマン分光学において使用するのに望ましい特性を有する
粒子構造体を製造することができる。 ある閾値より高いエネルギーでのレーザーパルスによるフラクタル金属ナノコ
ンポジットの照射により、レーザー波長に近い吸収スペクトルにおいて、“二色
ホール(dichroic hole)”の形成が生じ得る方法、選択的な光変性(photomodific
ation)が導かれる(Safonovら, Physical Review Letters 80(5): 1102-1105 (19
98), これは文献として本件明細書に十分に組み込まれるものとする)。幾何学的
構造体の選択的光変性は、銀及び金の両コロイド、金属凝集物でドープされたポ
リマー、及び金属標的のレーザー蒸発により製造されるフィルムについて観察さ
れ得る。 選択的光変性の形成についての１つの理論は、フラクタル構造体における光隆
起の局在化がランダムナノコンポジット中に普及しているというものである。こ
の理論によれば、フラクタルにおける選択的光改質の局在化が、高極性粒子（モ
ノマー）のスケール−不変分配のために生じ得る。従って、異なる局在構成を有
する粒子の小さな群は、他のものと関係なく入射光と相互作用し得、また、異な
る周波数で共鳴し得、異なるドメインを発生させ、本件明細書においては、“光
学モード”と称する。同一の理論によれば、フラクタルにおけるモノマー間の相
互作用により形成される光学モードは、入射光の光波長より短くてもよく、また
、コロイドにおける粒子のクラスターのサイズより短くてもよいドメインにおい
て局在化される。光学モードの周波数は、表面でプラズモン共鳴と関連するモノ
マーの吸収バンド幅より広範なスペクトル域に及ぶ。しかしながら、他の理論が
、フラクタル構造体の光変性の効果について説明しており、本発明は、実施可能
性について特定の理論に制限されない。
【００３７】 銀フラクタル凝集物の光変性は、約２４×２４×４８ｎｍ3程度の小さなドメ
イン内に生じ得る(Safonovら, Physical Review Letters 80(5): 1102-1105 (19
98), これは文献として本件明細書に十分に組み込まれるものとする)。フラクタ
ル媒体により吸収されるエネルギーは、レーザー波長が上昇したときに、モノマ
ー数について進行的に小さな部分において局在化し得る。共鳴ドメインに吸収さ
れるエネルギーが上昇すると、その位置の温度が上昇する。１１ｍＪ／ｃｍ2の
力で、５５０ｎｍの波長を有する光は、約６００Ｋの温度を生じ得る(Safonovら
, Physical Review Letters 80(5): 1102-1105 (1998), これは文献として本件
明細書に十分に組み込まれるものとする)。銀の融解温度の略半分であるこの温
度で、コロイドの燒結が生じ得(Safonovら, Id, これは文献として本件明細書に
十分に組み込まれるものとする)、これにより、安定なフラクタルナノコンポジ
ットが形成される。 本発明に使用されるような光凝集は、約４００〜約２０００ｎｍの範囲の波長
を有する入射光のパルスに表面上における金属コロイドを付することにより達成
することができる。別の態様においては、波長は、約４５０〜約１０７９ｎｍの
範囲内にあってもよい。入射光の強度は、約５〜約２０ｍＪ／ｃｍ2の範囲にあ
ってもよい。他の態様においては、入射光は、１１ｍＪ／ｃｍ2の強度で１０７
９ｎｍの波長を有していてもよい。
【００３８】 本発明に特に有用なフラクタル凝集物は、約１０〜約１００ｎｍ直径の範囲、
及び他の態様においては約５０ｎｍ直径の寸法を有する金属粒子から製造するこ
とができる。本発明の典型的なフラクタル構造体は、約１０００個までの粒子か
ら構成され、典型的に大スケールの配列に使用される凝集物の領域は、約１００
μｍ×１００μｍのサイズを有していてもよい。 図２は、光凝集されており、かつ、本発明の方法に使用するのに適する粒子構
造体を示す。金属粒子の融合局部を観察することができる（サークル）。
【００３９】 ２．粒子構造体の化学的直接合成 本発明の或種の実施態様では、粒子構造体は化学的方法を使用して造ることが
出来る。第一に、金属粒子は上述の方法によって造る事も出来るし、さもなけれ
ば、化学品供給業者（(Nano Gram Inc., Fremont, California)から購入する事
も出来る。第二に、この粒子は、一緒に結合されて一次構造体、例えば、粒子対
を形成することが出来る。次いで、この一次構造体は、一緒に結合されて二次構
造体、例えば、粒子対の対を形成することが出来る。最後に、三次フラクタル(f
ractal)構造体は、二次構造体を一緒に結合する事によって造ることが出来る。 本発明の別の実施態様では、金属粒子のフラクタル配列の形成は、化学的方法
を使用して行うことが出来る。金属コロイド粒子が一旦製造されると、それぞれ
の粒子はチオールを介して或いはその他のタイプの適当な化学的結合を介してリ
ンカー分子に結合することが出来る。次いで、リンカー分子は、近接のコロイド
粒子と一緒に結合する為に互いに結合することが出来る。粒子間の距離は、リン
カー分子の全長の関数である。粒子対リンカー分子の化学量論比を選択すること
が望ましい。使用されるリンカー分子が少な過ぎると、粒子の配列は一層ルーズ
に成るか、全く形成されないかも知れない。反対に、リンカー分子対粒子の比が
大き過ぎると、配列は密着し過ぎて、ランダムではない結晶構造を形成すること
になり、従って、表面の高められたラマン効果を促進することにはならない。
【００４０】 一般に、結合手順を順番に行うことが望ましく、その第一工程は、粒子同士の
架橋を許さない条件下でリンカー分子を個々の粒子に添加する事を含む。例えば
、その様なリンカーは、一端のみに反応性基を有するオリゴヌクレオチドを含む
。この第一工程中に、オリゴヌクレオチドの反応性末端が金属粒子と結合する事
ができ、それによってリンカーの自由末端を有する第一の粒子−リンカー種を形
成する。リンカー分子対粒子の比は、粒子に結合されるべきリンカー分子の数に
よって選択する事が出来る。第二のリンカーは、別の反応室において粒子のその
他の基に結合する事ができ、それによって再度自由末端を有するリンカーを持つ
第二のリンカー−粒子種が得られる。 これらの反応が進行した後に、別々のリンカー−粒子種が一緒に混合され、リ
ンカーが共に結合して、リンカー分子によって結合された「粒子対」を形成する
事が出来る。
【００４１】 例えば、図３ａ〜３ｃは本発明のフラクタル構造体の製造方法を例示するもの
である。図３ａにおいて、金属粒子１０は前述の方法を使用して形成される。シ
ョートリンカー２０は、金属粒子１０に結合する事のできる化学的活性末端を有
する。例えば、リンカー２０はリンカー２０のそれぞれの末端にスルフヒドリル
（「ＳＨ」）基を有する。一緒にされると、金属粒子１０はリンカー２０のＳＨ
末端と結合して粒子対３０を形成する。 図３ｂは、粒子対のクラスターを形成する為に使用することのできる工程を例
示する。粒子対３０は中間長さのリンカー４０と反応してクラスター５０を形成
する。 図３ｃは、本発明のナノスケールのフラクタル構造体を形成する為に使用する
事のできる工程を例示する。クラスター５０は、長いリンカー６０と反応してナ
ノスケールのフラクタル構造７０を形成する。
【００４２】 その他の実施態様では、相補的配列を含む核酸とハイブリッドを形成するＤＮ
Ａの能力に基づいて、核酸がリンカーとして使用出来る。ＤＮＡリガーゼ又はそ
の他のメカニズムは、リンカーを一緒にして金属粒子間に完全なリンカーを形成
させるのに使用することが出来る。 図４は、一般に、結合領域を有するリンカーを使用して粒子対を形成する為の
金属粒子の結合を示す。図４ａは、二つの金属粒子（Ｍ）を示し、それぞれは所
望の長さを有するリンカー分子（Ｌ１又はＬ２）を有し、リンカー間結合領域（
ＢＤ１とＢＤ２）を含む。リンカー間結合領域は解放されている。図４ｂは、図
４ａで示された粒子のリンカー間結合領域の結合後の粒子対の形成を示す。リン
カーが核酸である実施態様においては、この結合領域は、ヌクレオチド残基が互
いに安定な雑種複合体を形成する事ができ、それによって対として一緒に金属粒
子を結合させる様な相補的配列を有する事が出来る。或る実施態様では、ＢＤ１
の配列はポリ［アデニン］、例えば、Ａ10である事が出来る。ＢＤ２の配列は、
ポリ［チミジン］、例えば、Ｔ10である事が出来る。従って、Ａ10 はＴ10 にハ
イブリダイズする事が出来、それによって、安定なハイブリッドを形成する。そ
の他の実施態様では、結合領域の長さは、安定なハイブリッドの形成を許すのに
都合の良い長さである事が出来る。
【００４３】 その他の実施態様では、図４ｃで例示されている様に、ＢＤ１とＢＤ２は、二
つの配列を含み、一つはＢＤ１に対して相補的であり、今一つはＢＤ２に対して
相補的である第三の核酸（ここでは、「ブリッジ核酸」又は「ＢＮＡ」と名づけ
られる）に対して相補的である様に選択する事が出来る。ＢＮＡがＢＤ１と接触
状態に置かれると、ＢＤ１に対して相補的なＢＮＡの部分は、第一の金属粒子Ｍ
１とＬ１とそれに結合したＢＮＡの安定なハイブリッドを形成する事ができる。
然しながら、Ｌ２のＢＤ２に対して相補的であるＢＮＡの部分はＢＤ２に対して
自由にハイブリダイズする事ができる。Ｍ１−Ｌ１−ＢＮＡコンプレックスをＭ
２−Ｌ２に暴露すると、ＢＤ２はＢＤ２に対して相補的なＢＮＡの部分に結合し
て安定な粒子対を形成する。 図４ｄは、インター結合分子(inter-linking molecule)がその末端で結合され
る選択的粒子対を示す。これは、例えば、図４ｃで示される粒子対をＤＮＡリガ
ーゼで処理してＬ１とＬ２との間に共有結合を形成し、次いで、ブリッジ核酸を
消化する事によって達成する事ができる。
【００４４】 粒子の対が形成された後に、追加のリンカーがこの粒子対に結合でき、この方
法は、「粒子対の対」を形成する為に繰り返す事が出来る。引き続き、この方法
は、３次以上の粒子構造体が形成されるまで繰り返す事が出来る。これらの条件
下で、所望の空隙率を持つ構造体を造る事が出来る。一般に、ナノスケールの構
造体のサイズは約２０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均寸法を有するべきである
。別の実施態様では、この寸法は、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲である事が
でき、その他の実施態様では、約１００〜約２００ｎｍの範囲、尚その他の実施
態様では、約１５０ｎｍである事が出来る。 本発明のその他の実施態様では、結合はアリールジチオール又はジイソニトリ
ル分子を使用して行う事が出来る。図５は、それぞれの末端にチオール（ＳＨ）
基を有するリンカー類の構造を示す。代わりに、リンカーを金属粒子に結合する
のに使用する事のできる活性部分を使用する事も出来る。上記タイプの核酸を伴
うアリールリンカー又はその他のタイプのリンカー分子を使用する事が望ましい
。リンカーは、エチルベンゼン部分（ｎ＝１〜約１０，０００の数）を有する中
央領域を有する事が出来る
【００４５】 一般に、リンカーのそれぞれの順次対に対する長さの比は約２〜約２０の範囲
である。或いは、リンカーの順次対の長さの比は、約３〜約１０の範囲、その他
の実施態様では約５である事が出来る。別の実施態様では、順番にあるリンカー
長の比を不規則にする事が出来、従って、順番に非フラクタル構造を造る事が出
来る。 例えば、三次の製造方法では、Ｌ１：Ｌ２：Ｌ３の比は約１：２：４の範囲で
ある事が望ましい。或いは、この比は約１：５：２５である事が出来、尚その他
の実施態様では、この比は、約１：２０：４００である事が出来る。その他の実
施態様では、Ｌ１とＬ２及びＬ２からＬ３との間の比は同じである必要はない。
従って、或る実施態様では、Ｌ１：Ｌ２：Ｌ３の比は１：３：２０、又は１：２
０：４０である事が出来る。
【００４６】 ３．フラクタル粒子会合体の懸濁物の製造 本発明のある他の態様において、フラクタル粒子会合体(フラクタル会合体:fr
actal associates)の懸濁液は、例えば、本発明の方法を使用した検出用の分析
物を結合又は保持し得る、溶液中の構造体を提供するために使用できる。フラク
タル粒子会合体の大きさは、数百nmからmmの寸法範囲にあり得る。フラクタル会
合体は、化学的リンカーによって配列された多数の粒子を含み得る。フラクタル
会合体に対する粒子の数は、わずか約１００粒子であり、又は、これとは別に、
数千がフラクタル会合体を形成するのに使用され得る。フラクタル会合体におけ
る粒子の数が増加すると、ボイドの大きさの増加が大きな割合で増加する。
【００４７】 ４．ネスト化フラクタル構造体 本発明の他のシリーズの態様において、ネスト化したフラクタル構造体を提供
する。ネスト化フラクタル構造体は、例えば、大きな粒子のコアを有し、小さな
粒子「ハロ」に囲まれ、及びこの小さな粒子は、更に小さな粒子「ハロ」によっ
て囲まれている(実施例６参照)。ネスト化フラクタル構造体は、増強した分析物
の検出のために実質的に均一なフラクタル表面の産生に特に有用である。各逐次
工程において、大きな粒子に対して非常に過多の小さな粒子を含むことが望まし
い。例えば、大きな粒子の数に対して、約１０〜約１０００倍の小さな粒子を過
剰に有することが望ましい。これとは別に、大きな粒子の数に対して１０〜１０
０倍の小さな粒子を過剰に有することが望ましく、及び、他の態様として、大き
な粒子の数に対して約１０倍過剰な小さな粒子を有することが望ましい。
【００４８】 ５．粒子構造体のリソグラフ的製造(lithographic manufacture) 本発明の他の態様において、粒子構造体は、半導体製造技術において知られて
いるリソグラフ的方法を使用して製造され得る。粒子構造体を製造するために、
製造する粒子構造体のイメージを作り、コンピュータのメモリーに保存する。粒
子構造を決める各点は、メモリー内にある単一の位置によって表現される。メモ
リー装置は、その後、電磁放射線、電子、又は、他の粒子のビームの投射を、好
適な表面上に局所的に当てることができる。このビームを表面上の部位に与えて
、次いで金属粒子を望ましい位置に形成することができる。 例として、そのような方法は、Xioaら、Hunting for the Active Sites of Su
rface-Enhanced Raman Scattering: A New Strategy Based on Single Silver P
articles, J. Physical Chemistry B 101: 632-638頁、(1997年)に開示されてお
り、これは、ここで、参考として取り入れる。図６は、本発明の粒子構造体のリ
ソグラフ的製造におけるいくつかの工程を示す。図６ａは、ナノ粒子の所望の分
布のイメージ600を示す。このイメージをコンピュータのメモリーに保存し、各
粒子を２つの基準座標、つまり、各点に対する１つのｘと１つのｙによって表現
する。図６ｂは、ナノ粒子構造体がその上で製造されるヘキサデカンチオールフ
ィルム620を有する金基材615を含有するナノ粒子構造体610に対する基材を示す
。図６ｃは、金基材615の上方で、コンピュータメモリーに保存された点におけ
る、走査トンネル顕微鏡(STM)の先端部635の位置を示す。STMの先端部635から放
射された電子は、ヘキサデカンチオールのフィルム620と相互作用してパッチ637
を形成し、続いて、シアン化物でエッチングすると(図６ｄ)、基礎の金基材615
の表面にある一連のパッチ637を曝露し得る。従って、コンピュータのメモリー
に保存された粒子位置のパターンは、基材の表面上に物理的に表現され得る。次
いで、銀又は他の金属は、ヘキサデカンチオールフィルム620が除去されたこれ
らの位置645においてのみ電気化学的に堆積され、ナノ粒子構造体650を形成する
(図６ｅ)。 これとは別に、従来の半導体マスクは、基材上のナノ粒子構造体の位置に向け
るために使用され得る。使用した方法に関係なく、得られた結果は、構造体の共
鳴特性を与える。
【００４９】 II. レセプター誘導体化粒子構造体の製造 一度、金属粒子の粒子構造体が製造されると、レセプターが結合し、それによ
って、分光学的な検出及び定量分析に有用なレセプター誘導体化構造体を形成す
る。 Ａ．レセプターの選択 本発明の粒子構造体に結合するように選択されたレセプターは、所望の分析物
の結合特性に依存する。例えば、核酸配列を検出しかつ定量するために、オリゴ
ヌクレオチドレセプターを使用することが望ましい。オリゴヌクレオチドレセプ
ターは、分析物ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、結合リガンドを生産する
。これとは別に、望ましいときは、ヌクレオチド配列に対する抗体を使用して核
酸を結合し得る。他の態様としては、ＤＮＡ結合タンパク質を使用し得る。例え
ば、遺伝子のあるプロモーター領域を検出するために、特定のプロモーター結合
タンパク質をレセプターとして使用できる。さらに、ペプチド核酸を使用して天
然核酸を結合することができる。 同様に、タンパク質分析物、抗体及びその他を検出するために、特定のタンパ
ク質結合分子を使用し得る。一度、分析物のタイプが選択されると、特定のレセ
プター分子及びフラクタル配列に対するその結合の条件が決定される。加えて、
低分子量の分析物に対する抗体を基材に結合することができる。 例えば、核酸レセプターを大規模なマトリックス配列で使用して、大量の分析
物配列を同時に測定することができる。
【００５０】 実施例４：核酸オリゴマーのレセプターの合成 チオール誘導体化ＤＮＡオリゴマーは、Caruthers Gene Synthesis Machines:
DNA Chemistry and Its Uses, Science 230; 281-285頁(1995年)（これはここ
で参考として取り入れる）の方法に従う基本的ホスホラミダイトケミストリーに
よって合成される。このようなオリゴマーは、Dr. Keith McKenneyのThe Instit
ute for Genomic Research (TIGR), Rockville, Marylandから得られ、及びPete
rlinzら、Observation of Hybridization and Dehybridization of Thiol-Tethe
red DNA Using Two-Color Surface Plasmon Resonance Spectroscoly, Journal
American Chemical Society 119; 3401-3402頁, (1997年)(これはここで参考と
して取り入れる)の方法によって調製される。 このＤＮＡオリゴマーは、長さ基準で約１０〜５０の範囲になるように選択さ
れるが、より長い配列も使用され得る。他の態様において、ＤＮＡオリゴマーは
、長さ基準で約１５〜３０の範囲にあり、これとは別の態様において、ＤＮＡオ
リゴマーは、長さ基準で約２５である。このオリゴマーが長すぎる場合、分析物
分子は、金属表面にはほど遠く、表面のラマン共鳴増強は望ましくないほど低い
。オリゴマーが短すぎる場合、ハイブリダイゼーションの特異性は、非常に低く
なり得る。従って、オリゴマーの長さは、配列の特異性及び分析物の共鳴増強を
最適化するために選択される。配列の特異性が共鳴増強よりも重要でない状況に
おいては、より短いオリゴマーが望ましい。逆に、高度の配列特異性が望ましい
状況においては、より長いオリゴマーが望ましく使用される。 ２セットの相補的ヌクレオチドオリゴマーを合成し、１セットは、ラマン活性
成分を欠く部分を使用して生産した。ある態様において、ＤＮＡオリゴマーが、
2,6 ジアミノプリンをアデニンの代わりに使用して合成される。
【００５１】 本発明の他の態様において、ペプチド核酸(ＰＮＡ)レセプターを使用する。ペ
プチド核酸は、ＤＮＡの親和性と互換可能な程度のＲＮＡとＤＮＡに対する親和
性を有する（Griffin (1998年); Kygerら(1998年); Igloi (1998年); Ratilaine
nら(1998年)、各文献はここで参考として取り入れられる）。従って、ｍＲＮＡ
とハイブリダイゼーションペアを形成し得る。ＰＮＡとＤＮＡの化学的構造の違
いは、表明されたこれらのラマンスペクトルの違いになり得る。特に、核酸リン
酸ジエステル主鎖結合に対応するバンドは、基材に結合したＰＮＡなしに、ＰＮ
ＡをＤＮＡ又はｍＲＮＡリガンドにハイブリダイゼーションによって結合する場
合、出現する(Guan(1996年))。ＰＮＡフラグメントは、Atom Sciences(Oak Ridg
e, Tennessee)から得られる。
【００５２】Ｂ．レセプターの金属コロイドへの付着 一般的に、Herne, Characterization of DNA Probes Immobilized on Gold Su
rfaces, Journal American Chemical Society 119:8916-8920 (1997)（参照する
ことによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法にしたがって、オ
リゴマーを、一本鎖ＤＮＡオリゴマーの５’位に共有結合的に連結したアルカン
チオールを介して、金属表面へ付着させることができる。付着は不可逆的なもの
であることができ、これにより表面上におけるハイブリダイゼーション及び脱ハ
イブリダイゼーションを許容することができる（Peterlinzら, Observation of
Hybridization and Dehybridization of Thiol-Derivatized DNA Using Two Col
or Surface Plasmon Resonance Spectroscopy. Journal American Chemical Soc
iety 119:3401-3402 (1997)（参照することによりその全体が本明細書に組み込
まれる））。しかしながら、レセプター分子の金属表面への付着を起こし、かつ
、レセプターがリガンドに対する特異的結合に必要な物理的特性を維持すること
を許容する全ての方法を使用することができる。
【００５３】実施例５：ＤＮＡのコロイド状金への連結 実施例３のコロイド状金で被覆した石英スライドを、分析物である核酸のハイ
ブリダイゼーション検出に使用するＤＮＡを結合するためのマトリックス又は基
材として使用することができる。 金コロイド誘導体化スライドを、１．０μＭ チオール誘導体化ＤＮＡ含有１
．０Ｍ ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ３．８）中に、ＤＮＡのチオール束縛（thiol-
tethering）を達成するのに十分な時間置く。次いでＤＮＡ束縛スライドを１．
０ｍＭ メルカプトヘキサノール（ＨＳ（ＣＨ2）6ＯＨ）に１時間暴露すること
により、表面を被膜で保護する。この処理は、ポリヌクレオチドの非特異的結合
を除去する。脱イオン化水を用いた徹底的な洗浄が、ハイブリダイゼーション分
析の前に要求される。
【００５４】Ｃ．レセプターの共鳴ドメインへの付着 本発明のその他の態様では、レセプターを、粒子構造体内の共鳴ドメインに局
在化させることができる。粒子構造体に照射したとき、共鳴ドメインは加熱され
、その加熱は金属粒子の部分的融解を引き起こすことができる。典型的には、共
鳴ドメインの次元（dimension）は、入射光線の波長よりも小さい。入射光の特
定波長において生成する共鳴ドメインの大きさは、当該共鳴ドメインの生成に使
用する光の波長の１／２５程度であることができる。しかしながら、光の波長が
長くなるにつれて、共鳴ドメインの大きさは小さくなることができる。共鳴ドメ
インとは、強い共鳴を示すことができ、かつ、凝集していない金属又は金属コロ
イド基材において可能なラマンシグナルの増幅よりも大きいラマンシグナル増幅
を生じさせることができる領域である。したがって、本発明に特に有用な共鳴ド
メインは、入射光を使用して作成することができ、この方法により、約４〜約１
０のモノマー粒子からなる共鳴ドメインを生じさせることができる。 本発明の特定の態様では、局所的に加熱される粒子構造体の性質を、レセプタ
ー粒子を当該加熱される位置へ局在化させるために有利に使用することができる
。局在化した共鳴ドメイン特異的レセプターを有する粒子構造体を製造するため
に、粒子構造体を含む表面を前記のようにして調製する。レセプター分子含有溶
液を表面上に置き、粒子構造体と接触させる。レーザー光パルスを使用して表面
を照射して、その位置に共鳴ドメインを作成する。反応混合物の局所的温度は、
粒子構造体とレセプターとの間の分子間結合の形成に対する閾値に到達すること
ができる。これにより、レセプターは粒子構造体に付着することができる。一般
的に、レセプターを基材へ連結するための全ての温度感受性化学を使用すること
ができる。 一般的に、レセプター分子の誘導体化を開始するのに必要なパワーは、光凝集
に必要なパワーよりも小さい。共鳴ドメインにおいて約０℃〜約５００℃、代替
として約２０℃〜約３００℃、別の態様では約５０℃〜約１８０℃の範囲の温度
を提供することが望ましくあることができる。更に別の態様では、温度は約７０
℃〜約１００℃の範囲であることができる。
【００５５】 必要とされる温度は、レセプターの金属表面への連結を開始させるのに必要な
閾値温度によって変化するだろう。特定の態様では、共鳴ドメインに局所的な温
度は、レセプターと金属表面との間の結合の切断及び反転（reversal）が起こる
温度よりも低いままであることが望ましい。 本発明の別の態様では、光化学反応性試薬を使用して、レセプターを特定の位
置で粒子構造体に連結することができる。そのような多数の試薬は、Pierce Pro
ducts Inc.（ロックフォード、イリノイ）より入手することができる。異なる光
化学連結剤を使用することにより、異なるタイプのレセプターを同一基材へ連結
することができる。例えば、ＤＮＡ及びタンパク質を同一基材へ付着させること
ができる。 基材の特定部位へのレセプター分子付着を制限することが、望ましくあること
ができる。これは、光の比較的短い波長、例えば約１０００ｎｍ未満、その他の
態様では約６００ｎｍ未満、更に別の態様では約４００ｎｍ未満の波長を使用す
ることにより達成することができる。更に、付着部位を高電界領域に局在化させ
る状況においては、レーザー光が望ましくあることができる。この場合、二重−
又は三重−光子プロセス（photon process）を使用することが好ましい。前記の
プロセスにおいて、長波長を有する複数の光子は、レセプター及び粒子構造体の
光化学反応性部分に到達し、連結反応を起こすのに十分なエネルギーを提供する
ことができる。これは、単一光子のエネルギーが光化学反応の開始に不十分であ
る場合でさえも生じることができる。 製造後、フラクタルアレイの共鳴ドメインに局在化したレセプター分子は、続
く入射光暴露の間、当該位置にとどまることができる。
【００５６】 本発明のその他の態様では、共鳴ドメインにおけるレセプター付着を、キャピ
ラリーチップ及び光学的フィードバックを有する走査原子間力顕微鏡を使用して
実行することができる（Hansenら, "A Technique for Positioning Nanoparticl
es Using an Atomic Force Microscope", Nanotechnology 9:337-342 (1998)を
参照のこと。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。これら
の態様において、キャピラリーは、表面へ堆積させることができる誘導体化レセ
プターを含んでいる。堆積過程では、表面を、レーザーにより生成した入射電磁
放射線により照射することができる。共鳴ドメインにおいて、共鳴は、放射され
る放射線強度を増加させ、これによりシグナルを光学的フィードバック装置へ提
供し、当該位置におけるレセプターの堆積を開始させる。これは、レーザーによ
り提供される外部照射に応答して表面から放射される電磁放射線の強度に依存す
る。 図７ａ及び７ｂは、レセプター分子が粒子構造体の共鳴ドメインへ付着してい
る本発明の態様を示している。図７ａは、レセプター分子が未変性のアデニン（
「Ａ」）含有オリゴヌクレオチドである粒子構造体の領域を示している。図７ｂ
は、図７ａに示される粒子構造体と類似するが、２，６−ジアミノプリン（「Ａ
Ｐ」）により置換されたアデニン部分を有している粒子構造体を示している。 図８ａは、未変性の相補的オリゴヌクレオチド分析物の、図７ｂに示す２，６
−ジアミノプリン（ＡＰ）により置換されたアデニンを有するレセプターを含む
粒子構造体への結合を示している。アデニン（Ａ）を含有する分析物分子は、ア
デニン残基がレセプター分子の２，６−ジアミノプリン残基に結合する態様での
オリゴヌクレオチドレセプターへのハイブリダイズとして示される。
【００５７】III．マトリックスアレイの設計及び製造 金属コロイド凝集物の誘導体化についての前述の方法を、異なる多数のレセプ
ターを有するマトリックスアレイの製造へ拡張することができる。そのようなア
レイには、特定のタイプのレセプターが金属コロイド凝集物に結合している個々
の定義された領域又は「セル」が多数存在することができる。各セルの大きさは
、約１００μｍ×１００μｍ程度であることができる。各セル中に、単一タイプ
のレセプター−フラクタル凝集物を製造することができる。したがって、１０ｃ
ｍ×１０ｃｍのマトリックスアレイにおいて、約１０6までの異なるセルが存在
することができ、各セルは異なるフラクタル凝集物レセプタータイプを有するこ
とができる。 図８ｂは、多数のセル又は定義された領域を含むアレイを示している。多数の
セル又は定義された領域の各々は、当該各定義された領域に結合する複数のレセ
プターを含み、かつ、所望の分析物に対して特異的である粒子構造体を有してい
る。示されている大規模アレイは、１０×１０のマトリックスであり、当該大規
模アレイ内に位置的に位置付けられている個々のセルを有している。その他のア
レイ配置は、望ましくあることができ、かつ、レセプター分子とは異なる識別子
（identifier）部分を有するアレイを含んでいる。識別子部分を使用して、特定
の定義された領域の位置及び／又は当該領域のレセプター分子特性のタイプを定
義することができる。そのような識別子部分は、定義された配列の核酸又は当該
技術分野において既知のコンビナトリアル化学法により生成した識別子を含むこ
とができる。
【００５８】 単なる例示として、フラクタル凝集物を含む大規模アレイを、第一のレセプタ
ータイプに暴露し、高度に収束された入射光ビームを、１つ又は幾つかの特定の
セルへ選択的に照射し、これにより、第一のレセプタータイプを有する凝集物が
望まれるセル中でのみ第一のレセプターを基材へ連結させることができる。必要
な次元を有する高度に収束されたレーザー光ビームは、半導体製造に使用する写
真平板法を使用してルーチン的に生成することができる。引き続いて、基材を洗
浄して非結合性の第一レセプタータイプを除去し、次いで第二のレセプタータイ
プを基材へ適用することができる。レーザー光を異なるセルへ照射して、第二の
レセプタータイプをフラクタル凝集物へ連結し、第二のレセプタータイプを有す
るフラクタル凝集物を形成することができる。マトリックスアレイ中の異なるセ
ルへ所望の数の異なるレセプタータイプを連続的に適用する方法は、同一の連結
についての化学を使用して行うことができる。、所望により、異なるタイプの化
学的連結を使用することができる。前記の方法は完全に自動化することができ、
そのため、フラクタル凝集物の製造の再現性は極めて高いものであることができ
る。 この方法の結果、多数の位置的に同定可能なセルを含むマトリックスアレイを
製造することができる。そのようなアレイを使用し、例えば、米国特許第５，９
２５，５２５号明細書（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる
）に記載される戦略を用いて、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの配列を検出しかつ決定する
ことができる。
【００５９】 IV．分析物の検出 本発明の方法に従う分析物の検出は、ラマンリーダー及びマトリックスアレイ
の使用を含む。粒子構造体を基質の頂上に有する予め製造した基質を使用して検
出を行うことができる。基質はその上に、単一型のレセプターを有する細胞又は
規定した領域を有することができる。分析物を含む試料をこのようなマトリック
スに適用すると、十分な親和性を有するレセプターに結合するか又はレセプター
に保持されることが可能である。次いでマトリックスを洗浄して未結合の分析物
を除去し、分析物が結合しているレセプターに対して十分な親和性を有する分析
物のみを残すことができる。次いでリーダーを使用してマトリックスアレイを分
析し、又はアレイに焦点を当てた光源を一時に１個ずつの細胞に当てて実行する
ことができる。光を細胞に照射し、反射光、散乱光又は再放出光を集めて光検出
器に送ることができる。集めた光をラマンスペクトルの特徴について分析するこ
とができ、この特徴を既知の物質から得られたラマンスペクトルの特徴と比較す
ることができる。このような既知のスペクトルを外部のデータベースから導入す
ることができ、このデータベースは特定の分析物の生物学的特徴に関する情報を
含むことができる。情報の分析をコンピュータを使用して行うことができ、該コ
ンピュータはスペクトル分析を実行するプログラムを保存するメモリ装置を伴う
ことができる。さらに、出力装置、例えばスクリーンディスプレー又はプリンタ
ーはユーザーに情報を提供することができる。このような比較を、マトリックス
アレイ上の細胞における分析物の量を決定するための基礎とすることができる。
さらに、測定条件による分析物における変化を決定することができ、全ての人工
生産物、例えば導入された非特異的な結合物を発見することができる。
【００６０】 他の態様において、分析物の分子中の電子遷移による共鳴が生じない条件下で
、検出を行うことができる。ある理論によると、入射光の周波数が分析物の吸収
帯と重ならない場合に、このような状態が生じ得る。このような状態では、粒子
を頂上に有する基質とレセプター分析物複合体の懸濁物を添加することが望まし
いであろう。ラマン信号を強化して、高感度の検出を提供するのに十分であると
することができる。 他の態様では、粒子構造体が提供する強化と共鳴条件の組み合わせが高感度を
提供するのに十分であろう。 さらに他の態様では、マトリックスアレイに結合した分析物を検出しそれを定
量するために、ラマンリーダーを使用することができる。アレイの各細胞におけ
るラマンスペクトルの特徴を取得し、かつ該スペクトルの特徴を既知のスペクト
ルの特徴と比較することによって、並行した、急速かつ高感度の分析物の検出に
ラマンリーダーを使用することができる。このようにして、分析物の存在、特定
及び量を決定することができる。
【００６１】 ある態様では、異なる波長の光を同時に提供する光源を使用することが望まし
いことがある。これらの光源は安価であることができ、かつ波長が相互に十分に
異なっていれば、特定のラマンスペクトルを取得する場合の干渉を最小限にする
ことができる。 本発明のある態様に従う分析物の検出は、天然の分析物を使用して実施すると
有利である。このような検出を実施するために、ラマン信号の原因となる分析物
の構造上の特徴を欠くレセプター分子を使用することが望ましいであろう。この
ような戦略を本明細書では“逆ラマン分光法”又は“ＲＲＳ”と名付ける。一般
に、ＲＲＳを使用して核酸を有利に検出することができる。この戦略のいくつか
の例を以下に示す。
【００６２】 Ａ．変性核酸レセプター ＲＲＳを使用する核酸の検出は、天然の核酸塩基を欠くレセプター分子の使用
を典型的に含む。ヌクレオチド塩基のシトシン、ウラシル、チミン、グアニン及
びアデニンはそれぞれ、約６１０cm-1〜約８００cm-1の範囲の波数にラマンバン
ドを示す。この帯域にラマンバンドを有さないいくつかのヌクレオチド類似物を
、本発明の方法及び組成物に好適に使用することができる。
【００６３】 １．アデニンの置換 ヌクレオチドのアデニンは、７３３cm-1に特徴的なラマン散乱バンドを有する
プリン環構造を含む（クロカワ他, Surface-Enhanced Raman Spectroscopic Det
ection of CO2, SO3, and Nucleic Acid Bases Using Polyvinyl Alcohol Film
Doped with Ag Fine Particles. Analytic Biochemistry 209: 247-250 (1993)
、全てを参考として本明細書に取り込む）。ワトソン−クリックによる塩基ペア
リングに従ってチミン残基と対になる塩基としてアデニンをレセプター分子が取
り込む場合、分析物がレセプターに全く吸着されなくても７３３cm-1に大きなラ
マンバンドが見出され、従って、アデニンを含む核酸分析物の決定を困難にする
。関心のある核酸の多くがアデニンを含むために、レセプターにおける天然アデ
ニンの存在は問題を有している。
【００６４】 この問題を解決するため、レセプター核酸配列にアデニンに代わってアデニン
類似体を取り込むことができる。(1) 特徴的なラマンバンドを欠き、かつ(2) ワ
トソン−クリックによる塩基ペアリングに従って相補的な塩基に結合することが
できる、いずれのアデニン類似体も使用可能である。例として挙げるだけである
が、核酸配列にアデニンの代わりに２，６−ジ−アミノプリン（“２，６ＡＰ”
）のアデニン類似物を取り込み、次いでこの配列をフラクタルアレイレセプター
凝集物に取り込むと、バックグラウンドのラマンスペクトルは７３３cm-1におけ
る特徴的なバンドを全く有さない。しかしながら、２，６ＡＰはチミンとのペア
リングに実質的に全く干渉しない（Hacia他, Enhanced High Density Oligonucl
eotide Array-Based Sequence Analysis Using Modified Nucleoside Triphosph
ates Nucleic Acids Research 26: 4975-4982 (1998)、全てを参考として本明細
書に取り込む）。アデニンを含む天然の核酸を引き続き結合させることにより、
７３３cm-1におけるラマンバンドが出現し、従って、ハイブリダイゼーション信
号はレセプターに結合する天然のヌクレオチド配列に特異的である。
【００６５】 図９ａ−９ｂは、アデニンを含むオリゴ核酸のラマン分光法による検出におい
てアデニンを有さないオリゴヌクレオチドレセプターの使用の原理を示す図であ
る。図９ａは、アデニン残基又は７３３cm-1にラマンバンドを有する他の残基を
有さない核酸のラマンスペクトルの部分を示す。図９ｂは、アデニンを含むオリ
ゴヌクレオチドが図９ａに示すようなアデニンを有さないレセプター分子に結合
して得られたもののラマンスペクトルを示し、７３３cm-1にラマンバンドの存在
を示している。
【００６６】 ２．チミンの置換 アデニンについて上記したのと同様の方法で、特徴的なラマンバンドを欠き、
かつワトソン−クリックによる塩基ペアリングに従って核酸と相補的な塩基ペア
リングを形成することができるいずれかの類似体でチミンを置き換えたレセプタ
ーを使用してＲＲＳを実施することができる。例として挙げるだけであるが、相
補的な塩基とハイブリダイズする能力を失うことなく、マトリックスに結合した
ＤＮＡオリゴマーにおいて、チミジンを５−メチルウリジンで置き換えることが
できる（Hacia他, Nucleic Acids Research 26: 4975-4982 (1998)、全てを参考
として本明細書に取り込む）。チミンを５−(１−プロピニル)ウリジンと置き換
えることもできる。
【００６７】 ３．グアニンの置換 グアニンは８位に水素原子を有しており、これを本質的に完全に重水素で置き
換えることができる（約９７％まで）。この重水素置換を、マノー他の方法に従
って９０℃でＤ2Ｏ中の核酸のインキュベーションにより行うことができる（An
Isotope Edited Classical Raman Difference Spectoscopic Study of the Inte
ractions of Guanine Nucleotides with Elongation Factor Tu and H-Ras p21,
Biochemistry 30: 10914-10920 (1991) 、全てを参考として本明細書に取り込
む）。グアニンを重水素化するとラマンバンドが約１４８６cm-1から約１４６３
cm-1（マノー他、Biochemistry 30: 10914-10920 (1991) 、全てを参考として本
明細書に取り込む）にシフトする。
【００６８】 水素を重水素で置換することにより、天然のグアニンに欠けているＲＲＳレセ
プターオリゴヌクレオチドの製造が可能となる。従って、重水素化したグアニン
レセプターにハイブリダイズすると、天然グアニンは、レセプターオリゴヌクレ
オチドに結合した分析物の存在を示す特徴的なラマンバンドを提供する。 図９ｃは、１０ M ＫＯＨ中に５００mg／mlのグアニンを含む試料に観察され
たラマン散乱の強度（任意の単位）及びcm-1で示した波数の図を示す。励起は１
ワットのレーザーパワーによる５１４nmにおいてであり、スペクトルは電荷結合
素子（ＣＣＤ）を使用して３秒以内に得られた。強度のピークは約９８０cm-1、
約１２２０cm-1、約１２４０cm-1、約１２８０cm-1、１３４５cm-1、約１３９０
cm-1、約１４７０cm-1及び約１５５５cm-1で観察された。ピークのこのパターン
は以前に出版されたパターンと類似している。強化することなく、本システムは
約２０mg／mlの濃度のグアニンを検出することができる。
【００６９】 ４．ペプチド核酸 オリゴ核酸レセプター中のアデニン、チミンおよびグアニンについての置換に
ついて上述したように、ペプチド核酸中のこれらの塩基の置換も天然の核酸の特
徴的ラマンバンドを欠損したレセプターを製造する結果となる。天然の分析対象
物が結合すると、特徴的なラマンバンドを検出および定量することができる。
【００７０】 Ｂ．改変タンパク質レセプター 改変核酸レセプターについて上述したのと同様なやり方で、本発明の方法に従
い、天然のタンパク質に見られる特徴的なシグナルを欠損するタンパク質レセプ
ターを合成することができる。単なる例示であるが、抗体の合成に際して抗体中
のアミノ酸、トリプトファン(Trp)をz7Trpに置換することができる。z7TrpはCor
nishら、Site-Specific Incorporation of Biophysical probes Into Proteins,
Proceedings of the National Academy of Science (USA):91:2910-2914 (1994
)(引用により本明細書に完全に取り込まれるものとする)に開示されている。あ
るいは、インシュリンまたは他のシステイン含有タンパク質およびペプチドに対
する抗体を、システインをセレノシステインまたはホモシステインに置換して、
システイン無しに調製することができる。システインまたはシスチンと関連した
ラマンスペクトル特性値はそのような抗体レセプターの存在下で明瞭に検出する
ことができる。更に、他の人工的アミノ酸をタンパク質中の本来のアミノ酸を置
換するために使用ことができる。特徴的なラマンシグナルを欠損し、実質的に二
次、三次または四次構造を破壊しないどんな人工的アミノ酸もRSSに好都合に利
用することができる。従って、RSSを用いて、置換レセプターに対する天然のタ
ンパク質結合をタンパク質解析物の検出に使用することができる。同様に重水素
(D)によりある種のタンパク質の水素を置換することもできる。
【００７１】 Ｃ．未改変レセプターを用いた検出 本発明のある別の実施態様においては、レセプター分子への特徴的なラマンバ
ンドを欠損する類似物で置換する必要が無い。相補的なオリゴ核酸のハイブリダ
イゼーションは、ラマンスペクトルをシフトさせることができる。しかしながら
、ハイブリダイゼーションによって生じるシフトの大きさはかなり小さく、従っ
て、シグナルを増強するために特異的なラマン特性値を増強することが望ましい
。
【００７２】 Ｄ．リガンド−レセプター結合の特異性 本発明のアッセイの特異性の程度はそのアッセイの目的に依存する。たとえば
、アッセイの目的が関連する一連のヌクレオチド配列（本明細書において「相同
体(homologues)」と称する）のいずれかの検出である場合、ハイブリダイゼーシ
ョン反応の忠実度は、単一ヌクレオチド多型(SNP)を検出および同定するアッセ
イほど高い必要は無い。本発明の方法および組成物はマトリックスアレイの特定
のセル内のラマンバンドの存在または非存在を検出するために非常に適している
。さらに、特徴的なラマンバンドの強度は結合した分析対象物の数が増加するに
従って増加するため、本発明の方法はアッセイ中の分析対象物の量を定量するた
めに使用することができる。
【００７３】 一般には、ヌクレオチド−ヌクレオチドハイブリダイゼーション反応は、ハイ
ブリダイゼーションの条件（本明細書では「ストリンジェンシー」という）に依
存し得る。ハイブリダイゼーションの条件は、Sambrookら、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989
)（引用により本明細書に完全に取り込まれるものとする）に記載されている。
ここでも用いるように、一般に、「高ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイ
ゼーション温度が二重鎖の融解温度よりも約５℃〜約10℃低い条件を言う。オリ
ゴヌクレオチド二重鎖の融解温度Tmは以下のように見積もることができる： Tm＝81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(C+G 含量)−(600/N) （式中、[Na+]はナトリウム濃度、 C+Gはヌクレオチド塩基の総数に対する割合
としてのシトシン(C)とグアニン(G)の量、Nは鎖の長さである。）。高ストリン
ジェンシーには、非相補的配列のハイブリダイゼーションに適しない条件下にお
けるリガンドとレセプターヌクレオチドのインキュベーションまたは洗浄が含ま
れる。そのような条件には、高い温度、低い塩濃度および、高い界面活性剤濃度
の使用が含まれる。高ストリンジェンシーを使用すると、ただ一つの非相補的塩
基（１個の「ミスマッチ」）を有する配列の検出を行うことができる。反対に、
低ストリンジェンシー条件には、より低い温度、より高い塩濃度およびより低い
界面活性剤濃度の使用が含まれる。低ストリンジェンシー条件は、アッセイの目
的が、塩基対ミスマッチが存在する相同体の検出である場合に特に望ましいこと
があり得る。
【００７４】 更に、本発明のある実施態様においては、漸次的にストリンジェンシーが高く
なる条件下で、同一セルのラマン分光測定を繰り返し行うことにより、塩基対ミ
スマッチの数に関する定性的な情報を得ることができる。たとえば、分析対象物
が比較的大きな数のミスマッチを有し、従って検出可能なラマンシグナルが低ス
トリンジェンシー洗浄後にのみ存在する場合、同じセルを高ストリンジェンシー
条件で続いて洗浄するとそのセルから分析対象物を除去することができる。この
ストリンジェンシーを本明細書では「ストリンジェンシー閾値」と呼ぶ。ミスマ
ッチの数をストリンジェンシー閾値と比較することにより、実際の配列を決定す
ることなく、核酸配列の相同性の相対的な程度を決定することができる。 分析対象物の結合の特異性はしばしば完全ではなく、特に抗体が使用される場
合にはしばしば完全ではない。抗体はその直接の標的に加えて他の分析対象物に
非特異的に結合することがある。そのような状況において、ラマンスペクトルの
スペクトル分析により非特異的結合の存在下であっても所望の分析対象物の識別
と定量が可能である。
【００７５】 Ｅ．ラマンスペクトル分光測定による分析対象物の検出 １．分析対象物のラマン分光測定 本発明の方法による分析を行うために使用する装置には、分析に必要な波長の
レーザー光を発生することのできるどんな装置も含まれる。たとえば、T64000ラ
マン分光測定器(The Ultimate Raman Spectrometer Instruments S.A. Ltd.(UK)
)を使用することができる。適切な装置の望ましい特徴には、サンプル隔室をを
位置決めしてスペクトルの感度を調製することができること、低振動数測定がで
きること、充分なスペクトル解像度を備えていること、および、液体窒素冷却荷
電結合素子(CCD)検出器を備えていることが含まれる。分光器は連続波、振動数
倍加(frequency doubled)アルゴンレーザーを含むレーザー光源を備えているこ
とが適切である。ヌクレオチドのプリン環およびピリミジン環構造は紫外線領域
に特徴的な最大吸収を有するため、紫外線領域に放射波長を有するレーザー光を
供給することが望ましい。適切なレーザーはInova 300FReDであり、Coherent In
c., Santa Clara, Californiaから入手できるものである。本発明のある実施態
様についてレーザー出力は257nmにて約５ミリワット、または244nm、229nmおよ
び238nmにおいて１ミリワットに維持することができる。
【００７６】 他の応用については、より長い波長、たとえば、約830nm領域の波長を使用す
ることが望ましいことがあり得る。そのような光源は連続波チタニウム：サファ
イアレーザーである。他の応用については、可視領域の光が適切であることもあ
る。 単一セル中の分析対象物を検出するため、隣接するセルからの交差性読み取り
を避けるために充分に狭い領域を覆うラマン分光測定を準備するのが望ましいで
あろう。一辺100μmｘ100μmを有するマトリックスアレイについては、細い、集
束ビームの入射光を与えるのが望ましい。
【００７７】 IV. データの解析 セルが結合した分析対象物を有しているかどうかを決定するために必要なこと
は、分析対象物の混合物に曝露する前の特徴的ラマンバンドの強度を、分析対象
物に曝露した後の同じセルの同じラマンバンドの強度に比較するだけである。あ
るいは、レセプターが全て特徴的な置換基（たとえば2,6 AP）を有する場合、対
照セルとして分析対象物に曝露する前の任意のセルを使用することができる。 対照セルは典型的には不変分子に対応するいくつかのバンドをもったラマンス
ペクトルを示し得る。それは結合した分析対象物を有するセルの比較のための内
部標準となり得る。さらに、所望であれば、各セルに分析対象サンプル中には存
在しない既知の対照ラマン標識を入れることができる。従って、分析条件下でセ
ルを光に曝露すると、非特異的ラマン散乱による光透過または吸収におけるいか
なる変化もin situで評価することができる。
【００７８】 分析物-レセプター結合が存在するかを求める場合には、ラマンスペクトル性
能の強度の閾値増大を選択することができる。分析物-レセプター結合の定量化
を必要とせずに測定する場合には、この閾値を便利に高レベル、例えば、最大シ
グナルの約25％に設定することができる。ラマンシグナルの強度を注意深く評価
すべきである代替的実施態様の場合には、閾値を低い値、例えば、最大ラマンシ
グナルの2〜5％に設定することが望ましい。 分析物の存在及び/又は量を求めるとすぐに、追加の情報を得るために続いて
の操作を行うことができる。例えば、その分析が所望の配列をもつオリゴヌクレ
オチドの存在を求めるものである場合には、関連細胞からのラマンシグナルの強
度を比較することができる。一連の細胞が、例えば、米国特許第5,925,525号に
記載される重複オリゴヌクレオチド配列をもつレセプターを含んでいる場合には
、関連細胞における分析物の存在により、問題の具体的な分析物の配列と全体の
サイズに関する情報を得ることができる。その明細書の記載は本願明細書に含ま
れるものとする。
【００７９】 実施例６: ネストされた粒子会合体の製造 一例として、直径がそれぞれ10 nm、40 nm及び240 nmである均一なサイズの金
属金粒子のコロイド溶液を選ぶことによりネストされた粒子会合体を製造するこ
とができる。図10a〜図10cは、そのような粒子から製造されたネスト粒子構造体
の製造を示す図である。 図10aは、DNAリンカー1012が結合した10 nm金粒子1004を示す図である。40 nm
粒子1008は、粒子1008に結合する、DNAリンカー1012に相補的であるDNAリンカー
1016を有する。粒子1004と1008の混合物は、溶液中に置かれ、各DNAリンカーと
相互作用して図10bに示されるように一次ネスト構造1020を形成する。 図10cは、図10a及び図10bに示される粒子1004と1008を有し、一次ネスト粒子1
020で囲まれた、直径が240 nmである大きな粒子1024と共に二次ネスト粒子1028
を形成している二次ネスト粒子構造体を示す図である。一次又は二次混合物を約
100℃未満の温度に加熱し、次に混合物を冷却すると、良好な順序のネスト粒子
が生じ得る。
【００８０】 実施例７: 非ランダム粒子構造をもつ表面の製造 図11a〜図11gは、フラクタル粒子構造をもつ表面の代替的実施態様を示す図で
ある。図11aは、上面1108をもつ基体1104を示す図である。図11bは、活性化され
た後の図11aに示された表面1008を示す図であり、表面1108に結合したチオール
基1112が生じる。 図11cは、複数の粒子1004が中間粒子1008より小さいことを示す図である。図1
1dは、小粒子1004から製造された一次ネスト粒子構造体1020、中間粒子1008及び
大きい粒子1024から製造された二次ネスト粒子構造体1028を示す図である。 図11eは、小粒子1004と中間粒子1008から製造された化学結合粒子構造体1132
を示す図である。 図11fは、基体1104の上にネスト粒子構造体1028がある電磁シグナルエンハン
サー1132を示す図である。 図11gは、図11eに示される結合粒子構造体1132が上にある基体1104を含んでい
る代替的電磁シグナルエンハンサー1040を示す図である。
【００８１】 実施例８: 分析物レセプターとフラクタル粒子構造体をもつバイオチップの製造 図12a〜図12dは、分析物レセプターとエンハンサーを有するバイオチップの製
造を示す図である。図12aは、2つの棒状粒子1204を示す図である。図12bは、図1
2aに示された棒状粒子と、コネクタ1212を含む分析物レセプター1208を示す図で
ある。分析物レセプター1208の一部は、レセプター-棒複合体1216を形成するコ
ネクタ1212によって棒1024に結合して示されている。 図12cは、リンカー1224を含む基体1220から構成され、それに結合したレセプ
ター-棒複合体1216を有するバイオチップ1226を示す図である。 図12dは、図12cに示されたバイオチップ1216と同様であるが、図11eに示され
る結合した粒子構造体1132を更に含んでいる代替的バイオチップ1228を示す図で
ある。
【００８２】 実施例９: 非ネスト粒子から製造されたバイオチップ 図13a及び図13bは、更に、レセプター-棒複合体と非ネスト粒子を有する本発
明の実施態様1324を示す2つの図である。 図13aは、2種類の構造を有するバイオチップを示す平面図である。図13aの右
側の構造1324は、図12bに示されるレセプター1212が結合した棒1204が直線的に
配列している。棒1204は、トレンチ1308内に存在するように示されている。ある
棒1204は相互に平行して示され、ある棒は端と端をつないで示されているが、他
の構造も本発明の範囲内である。図13bの右側は、図13aの右側に示した実施態様
1324を線A-A' に沿って切った断面図である。トレンチ1308は、その中にレセプ
ター-棒複合体1216がある。トレンチ1308は、図示されているように平行であり
得るし、非平行でもあり得る。 図13aの左側は、実施態様1324に示されるバイオチップを含んでいるが、更に
基体1304上に分布した粒子1320とレセプター-棒複合体を有する代替的バイオチ
ップを示す図である。粒子1320は、例えば、レーザアブレーションによって製造
され得る。 図13bの左側は、図13aによって示される実施態様1328の線A-A' に沿って切っ
た断面図である。基体1304は、その中にレセプター-棒複合体1216があるトレン
チ1308を有し、基体1304とレセプター-棒複合体1216の上には粒子1320がある。
【００８３】 産業上の利用性 本発明の粒子構造体は、多くの異なる種類の分子を含有する複合溶液において
分析物を検出するために化学及びバイオテクノロジーの分野に使用され得る。更
に、本発明の方法は、ラマン分光法、蛍光分光法、免疫生物学又は質量分析法を
含む分光法を用いて分析物の検出や定量化に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】分光法で使用される本発明の粒子構造体を表す図である。
【図２】光凝集（photoaggregation）にさらされている本発明の粒子構造体
を表す。
【図３】化学的に結合した粒子が本発明の粒子構造体を形成する本発明のス
トラテジーを表す。
【図４】リンカー分子を用いて2つの粒子を一緒に結合する本発明のストラ
テジー及び本発明の粒子構造体の製造を表す。
【図５】リンカー基がアリールジイソニトリル基を含む本発明の他の実施態
様を表す。
【図６】本発明の粒子構造体を製造する写真平板方法の説明である。
【図７】さらにレセプターを有する図２の本発明の粒子構造体を表す。図７
ａは、共鳴領域に付着したアデニン残基（「Ａ」）を含むオリゴヌクレオチドレ
セプター分子を有する本発明の2つの粒子構造体を表す。図７ｂは、図７ａと同
様、アデニン残基と置換した2,6-ジアミノプリン（「AP」）を含むオリゴヌクレ
オチドレセプター分子を有する本発明の2つの粒子構造体を表す。
【図８】分析物分子のチミン残基（「T」）との結合を示すAP置換オリゴヌ
クレオチドレセプターを有する本発明の粒子構造体の一部を表す。分析分子は、
検出のためのラマン又はその他の電磁シグナルを与えるアデニン残基（「A」）
を有する。 図８ｂは本発明のマトリックスを表し、各領域内に粒子構造体を有する所定の
領域を有する。
【図９】図９ａ及びｂは、アデニンを含むオリゴヌクレオ酸（oligonucleic
acids）のラマン分光検出における、アデニンを有さないオリゴヌクレオチドレ
セプターの使用に関する本発明の原理を説明するグラフである。 図９ｃはグアニンのラマンスペクトルを示すグラフである。
【図１０】本発明の多重構造（nested）の粒子構造体の製造方法を表す。図
１０ａは、配列し、お互いに結びついて粒子を固定する相補的なオリゴヌクレオ
酸配列を有する2つの粒子を表す。図１０ｂは、本発明の一次多重構造粒子構造
体を表す。図１０ｃは、本発明の二次多重構造粒子構造体を表す。
【図１１】本発明のバイオチップの製造方法を表す。 図１１ａは、粒子構造体の次の付着で使用される基体を表す。図１１ｂはチオ
ール基を有する図１１ａの基体を表す。 図１１ｃは、本発明の粒子構造体の製造に使用される種々の大きさの粒子を表
す。 図１１ｄは、本発明の多重構造粒子構造体の群を表す。 図１１ｅは、本発明の化学的に結合した粒子構造体の群を表す。 図１１ｆは、基体に付着した図１１ｄの多重構造粒子構造体を有する本発明の
バイオチップの一部を表す。 図１１ｇは、基体に付着した図１１ｅの化学的に結合した粒子構造体を有する
本発明のバイオチップの一部を表す。
【図１２】化学的に結合した粒子構造体及び／又は棒を有する本発明の実施
態様を表す。 図１２ａは、電磁シグナルの増強に有用な2つの棒を表す。 図１２ｂは、分析物レセプターを有する図１２ａに示される棒を表す。 図１２ｃは、基体に堆積した分析物レセプターを有する棒を有する本発明のバ
イオチップの一部を表す。 図１２ｄは、基体に堆積したレセプターを有する棒及び本発明の化学的に結合
した粒子構造体を有する本発明のバイオチップの一部を表す。
【図１３】本発明の別の実施態様を表す。図１３ａは、端と端が接するよう
に、基材の刻まれた溝に配列した棒／レセプターを有し、粒子を有する、及び粒
子を有さない本発明のバイオチップの一部の平面図を表す。図１３ｂは、図１３
ａに記載される本発明のバイオチップの一部の断面図を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/22 １２１ Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ ４Ｂ０６３ 33/483 33/53 Ｄ 33/53 Ｍ 33/543 ５９５ 33/543 ５９５ 33/553 33/553 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆ (31)優先権主張番号 ６０／１５６，４７１ (32)優先日 平成11年９月27日(1999．9．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 イェヴィン オレグ エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94596 ウォールナット クリーク クリ ークサイド ドライヴ 1364 アパートメ ント ４ (72)発明者 ニュファート トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94596 ウォールナット クリーク エフ オーク ロード 2633 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD19 CB03 DA10 FB05 HA02 2G043 AA01 BA16 CA07 CA09 DA01 EA03 GA07 GB05 KA01 KA02 KA03 KA09 LA03 NA06 2G045 AA35 DA13 FA11 FB02 FB15 4B024 AA11 CA01 CA09 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB15 BB20 CC03 CC08 FA15 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ20 QQ42 QQ53 QR32 QR38 QR55 QR82 QS20 QS34 QX01

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フラクタル構造体及びそれに結合したレセプターを含有する
    粒子構造体。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つの共鳴ドメイン及び該共鳴ドメインの近くに
    分析物レセプターを含有する粒子構造体。
  3. 【請求項３】 共鳴ドメインを有する複数の粒子及び該共鳴ドメインの近く
    に優先的に結合した複数の分析物レセプターを含有する粒子構造体。
  4. 【請求項４】 少なくとも１つの共鳴ドメイン及び該分析物の少なくとも１
    つのラマン分光特性が欠けている分析物レセプターを含有する、分析物に結合す
    るための粒子構造体。
  5. 【請求項５】 さらに複数の共鳴ドメインを有する複数の粒子及び該共鳴ド
    メインの充分近くに優先的に局在化している複数の分析物レセプターであって、
    該分析物レセプターに会合している分析物によって生成するシグナルを増強する
    分析物レセプターを含有する請求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  6. 【請求項６】 液体及び複数のフラクタル会合体を含有するフラクタル会合
    体の懸濁物。
  7. 【請求項７】 表面に分散したフラクタル会合体。
  8. 【請求項８】 さらにケミカルリンカーを含有する請求項１〜４のいずれか
    １項記載の粒子構造体。
  9. 【請求項９】 該粒子の少なくとも２つが化学的に会合している請求項１〜
    ４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  10. 【請求項１０】 該粒子の少なくとも２つが配位結合により会合している請
    求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  11. 【請求項１１】 該粒子の少なくとも２つが共有結合により会合している請
    求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  12. 【請求項１２】 該粒子の少なくとも２つがイオン相互作用により会合して
    いる請求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  13. 【請求項１３】 該アレイに該粒子を保持するリンカーをさらに含有する請
    求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１つのリンカーがポリマーを含有する請求項１
    ３記載の粒子構造体。
  15. 【請求項１５】 該ポリマーがオリゴヌクレオチドである請求項１４記載の
    粒子構造体。
  16. 【請求項１６】 該オリゴヌクレオチドがデオキシリボ核酸を含有する請求
    項１５記載の粒子構造体。
  17. 【請求項１７】 該粒子が電磁気共鳴を与えることが知られている金属を含
    有する請求項１〜４のいずれか１項記載の粒子構造体。
  18. 【請求項１８】 該粒子が電磁気共鳴を与えることが知られている金属を含
    有する請求項１記載のフラクタル構造体。
  19. 【請求項１９】 該金属が金、白金、銀、銅及びパラジウムからなる群から
    選ばれる請求項１〜１８のいずれか１項記載の粒子構造体。
  20. 【請求項２０】 該金属が金、白金、銀、銅及びパラジウムからなる群から
    選ばれる請求項１８記載の粒子構造体。
  21. 【請求項２１】 約１.１〜約２.９のフラクタル寸法を有する請求項１〜２
    ０のいずれか１項記載のフラクタル構造体。
  22. 【請求項２２】 該粒子が約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均直径を有する
    モノマーを含有する請求項１〜２１のいずれか１項記載の粒子構造体。
  23. 【請求項２３】 該粒子が約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの平均直径を有する
    モノマーを含有する請求項１項記載のフラクタル構造体。
  24. 【請求項２４】 その上に少なくとも１つの所定の領域を有する基体、複数
    の共鳴ドメインを有する複数の粒子構造体を含有し、該所定の領域が共鳴ドメイ
    ンの近傍に優先的に局在化している複数の分析物レセプターを有するバイオチッ
    プ。
  25. 【請求項２５】 該粒子構造体がフラクタル構造体である請求項２４項記載
    のバイオチップ。
  26. 【請求項２６】 基体、該基体上の複数の共鳴ドメインを有する複数の粒子
    構造体、及び該共鳴ドメインの近傍に優先的に局在化している複数の分析物レセ
    プターを含有し、該粒子構造体が該分析物レセプターと会合した分析物によって
    生成するシグナルを増強する、バイオチップ。
  27. 【請求項２７】 該基体が珪素、二酸化珪素、ガラス及びプラスチックから
    なる群から選ばれる請求項２４〜２６のいずれか１項記載のバイオチップ。
  28. 【請求項２８】 該分析物レセプターが該共鳴ドメインの近傍に優先的に局
    在化している請求項２４〜２７のいずれか１項記載のバイオチップ。
  29. 【請求項２９】 該所定の領域のそれぞれに会合している複数の分析物レセ
    プターのそれぞれが、別の所定の領域に会合している分析物レセプターの結合親
    和力とは異なった優先的分析物結合親和力を有する請求項２６〜２８のいずれか
    １項記載のバイオチップ。
  30. 【請求項３０】 さらに該異なった領域のそれぞれを同定する手段を含む請
    求項２９項記載のバイオチップ。
  31. 【請求項３１】 該所定の領域が検出器によって少なくとも部分的に観測で
    きるようになっている請求項２４〜２９のいずれか１項記載のバイオチップ。
  32. 【請求項３２】 その上に複数の所定の領域を有する基体であって、該領域
    のそれぞれが、複数の共鳴ドメインを有する複数の粒子構造体及び該共鳴ドメイ
    ンの近傍に優先的に局在化している複数の分析物レセプターを有し、ここで、所
    定の領域のそれぞれに会合している複数の分析物レセプターのそれぞれが、別の
    所定の領域に会合している分析物レセプターの結合親和力とは異なった優先的分
    析物結合親和力を有し；該異なった領域のそれぞれの同定器；及び該基体上の所
    定の領域と会合している検出器を含有する分析物検出用システム。
  33. 【請求項３３】 該粒子構造体がフラクタル構造体である請求項３２記載の
    システム。
  34. 【請求項３４】 少なくとも１つの共鳴ドメインを有する粒子構造体を用意
    すること、該共鳴ドメインの近傍に分析物レセプターを設けること、該分析物を
    該レセプターに暴露して、分析物レセプター複合体を形成すること、及び該分析
    物レセプター複合体と会合したスペクトル特性を検出することを含む分析物検出
    方法。
  35. 【請求項３５】 さらに該基体から未結合分析物を除く工程を含む請求項３
    ４記載の方法。
  36. 【請求項３６】 さらに該スペクトル特性を解析し、そして該スペクトル特
    性を既知の参照スペクトル特性と比較する工程を含む請求項３４又は３５記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】 さらに該スペクトル特性に関連するアウトプットを与える
    工程を含む請求項３４〜３６のいずれか１項記載の方法。
  38. 【請求項３８】 複数の粒子を用意すること、該粒子に第１のリンカー長を
    有する第１のケミカルリンカーをリンクさせて、第１列の粒子構造体を形成する
    こと、及び該第１列の粒子構造体に第２のリンカー長を有する第２のケミカルリ
    ンカーをリンクさせて、共鳴ドメインを有する第２列の粒子構造体を形成するこ
    とを含む粒子構造体の製造方法。
  39. 【請求項３９】 さらに該第２列の粒子構造体に第３のリンカー長を有する
    第３のケミカルリンカーをリンクさせて、共鳴ドメインを有する第３列の粒子構
    造体を形成する工程を含む請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 該ケミカルリンカーが核酸、ポリエチルベンゼン、ポリア
    リール、チオレート化ポリマー及びジイソニトリルポリマーなどからなる群から
    選ばれるポリマーを含有する請求項３８又は３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 連続的に加えたリンカーの長さの比が約２〜約２０である
    請求項３８〜４０のいずれか１項記載の方法。
  42. 【請求項４２】 連続的に加えたリンカーの長さの比が約２〜約２０である
    請求項３８〜４１のいずれか１項記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該リンカーがチオール及びジイソニトリル基などからなる
    群から選ばれる結合基を有する請求項３８〜４２のいずれか１項記載の方法。
  44. 【請求項４４】 (a)各プールが複数の粒子を含む第１及び第２のプールの
    粒子を用意すること、(b)複数の第１の核酸リンカーを用意すること、ここで該
    リンカーのそれぞれが近位の末端に結合基を有し、遠位の末端に第１の長さのヌ
    クレオチド配列を有する、(c)粒子の第１のプールの実質的な数の粒子のそれぞ
    れに約２つの第１核酸リンカーを結合させること、(d) 複数の第２の核酸リンカ
    ーを用意すること、ここで該リンカーのそれぞれが近位の末端に結合基を有し、
    遠位の末端にヌクレオチド配列を有し、一部分が第１核酸リンカーの遠位の末端
    の配列の少なくとも一部に相補的であり、ここで、相補的ストランドの配向が逆
    平衡である、(e) 粒子の第２のプールの実質的な数の粒子のそれぞれに約２つの
    第２核酸リンカーを結合させること、(f) 粒子の第１のプールと第２のプールを
    一緒に混ぜて、第１と第２のヌクレオチドリンカ−の相補的部分をお互いに会合
    させること、(g)該相補的核酸配列を共有結合させて、粒子対を形成させること
    、(h)該粒子対のプールを第３と第４のプールに分割すること、(i)複数の第３の
    核酸リンカーを用意すること、ここで、該リンカーのそれぞれが近位の末端に結
    合基を有し、遠位の末端に第３の長さのヌクレオチド配列を有する、(j)第３の
    プールの実質的な数の粒子対のそれぞれに約２つの第３核酸リンカーを結合させ
    ること、(k) 複数の第４の核酸リンカーを用意すること、ここで、該リンカーの
    それぞれが近位の末端に結合基を有し、遠位の末端にヌクレオチド配列を有し、
    一部分が第３核酸リンカーの遠位の末端の配列の少なくとも一部に相補的であり
    、ここで、相補的ストランドの配向が逆平衡である、(l) 第４のプールの実質的
    な数のナノ粒子対のそれぞれに約２つの第４核酸リンカーを結合させること、(m
    ) 第３のプールと第４のプールを一緒に混ぜて、第３と第４のヌクレオチドリン
    カ−の相補的部分をお互いに会合させること、及び(n)該相補的な第３と第４の
    核酸配列を一緒に共有結合させること、を含む化学結合粒子構造体の製造方法。
  45. 【請求項４５】 該ケミカルリンカーが核酸、ポリエチルベンゼン、ポリア
    リール、チオレート化ポリマー及びジイソニトリルポリマーなどからなる群から
    選ばれるポリマーを含有する請求項８記載の粒子構造体。
  46. 【請求項４６】 連続的に加えたリンカーの長さの比が約２〜約２０である
    請求項８〜２３及び４５のいずれか１項記載の粒子構造体。
  47. 【請求項４７】 モノマーが、連続的に加えたリンカーの長さの比が約２〜
    約２０のケミカルリンカーにより会合している請求項１８、２１及び２３のいず
    れか１項記載のフラクタル構造体。
  48. 【請求項４８】 該リンカーがチオール及びジイソニトリル基などからなる
    群から選ばれる結合基を有する請求項１８、２１及び４７のいずれか１項記載の
    フラクタル構造体。
  49. 【請求項４９】 その上に少なくとも１つの所定の領域を有する基体を用意
    すること、複数の共鳴ドメインを有する複数の粒子構造体を用意することを含み
    、ここで、該所定の領域が該共鳴ドメインの近傍に優先的に局在化している複数
    の分析物レセプターを有する、バイオチップの製造方法。
  50. 【請求項５０】 該粒子構造体がフラクタル構造体である請求項４９項記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 基体を用意すること、該基体上に複数の共鳴ドメインを有
    する複数の粒子構造体を設けること、及び該共鳴ドメインの近傍に優先的に局在
    化している複数の分析物レセプターを設けることを含み、該粒子構造体が該分析
    物レセプターと会合した分析物によって生成するシグナルを増強する、バイオチ
    ップの製造方法。
  52. 【請求項５２】 該基体が珪素、二酸化珪素、ガラス及びプラスチックから
    なる群から選ばれる請求項４９〜５１のいずれか１項記載の方法。
  53. 【請求項５３】 該分析物レセプターが該共鳴ドメインの近傍に優先的に局
    在化している請求項４９〜５２のいずれか１項記載の方法。
  54. 【請求項５４】 該所定の領域のそれぞれに会合している複数の分析物レセ
    プターのそれぞれが、別の所定の領域に会合している分析物レセプターの結合親
    和力とは異なった優先的分析物結合親和力を有する請求項４９〜５３のいずれか
    １項記載の方法。
  55. 【請求項５５】 さらに該異なった領域のそれぞれを同定する手段を含む請
    求項４９〜５４のいずれか１項記載の方法。
  56. 【請求項５６】 該所定の領域が検出器によって少なくとも部分的に観測で
    きるようになっている請求項４９〜５５のいずれか１項記載の方法。
  57. 【請求項５７】 光源、その上に粒子構造体を有するマトリックスアレイ、
    該光源に対する関係で該マトリックスアレイを位置付けるホルダー、及び光検出
    器を含有するラマンリーダー。
  58. 【請求項５８】 光検出器が散乱光を検出する請求項５７のリーダー。
  59. 【請求項５９】 光検出器が散乱光の少なくとも１つのスペクトル特性を検
    出する請求項５７のリーダー。
  60. 【請求項６０】 さらに検出した光を既知の成分の既知のスペクトル特性と
    比較するコンピューターを含む請求項５７〜５９のいずれか１項記載のリーダー
    。
  61. 【請求項６１】 さらに該スペクトル特性分析用プログラムを保存するメモ
    リーデバイスを含む請求項５７〜６０のいずれか１項記載のリーダー。
  62. 【請求項６２】 さらに外部データーベースから情報を得るためのデバイス
    を含む請求項５７〜６１のいずれか１項記載のリーダー。
  63. 【請求項６３】 その上に少なくとも１つの分析物レセプター及び同定器を
    有する所定の領域をその上に少なくとも１つ有するバイオチップを用意すること
    、ラマンリーダーを用意すること、該バイオチップを分析物を含む溶液に曝すこ
    と、該分析物を該レセプターに保持させて分析物レセプター複合体を形成するこ
    と、該所定の領域を入射光線に曝すこと、所定の領域から発した光を集めること
    、及び該所定の領域の位置を決定することを含むバイオチップ上の分析物を検出
    する方法。
  64. 【請求項６４】 該所定の領域がさらに該レセプターと会合した共鳴ドメイ
    ンを含む請求項６３記載の方法。
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