JP2010517026A - 光学的測定方法及び電気的測定方法の両方を用いたアナライトの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】感度及び選択性が改善され、迅速に、安価に、そして簡単に実施するアナライトの検出方法の提供。
【解決手段】１又は複数のアナライトが、前記アナライトに関係付け可能である１以上の標識で標識化されており、（ａ）前記１又は複数の標識化アナライトに対して光学的検出法を行い、前記１以上の標識から光学的データを得る工程と、（ｂ）前記１又は複数の標識化アナライトに対して電気的検出法を行い、前記１以上の標識から電気的データを得る工程と、（ｃ）前記光学的データ及び電気的データの両方に基づき前記１又は複数のアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含む１又は複数のアナライトの検出方法の提供。
【選択図】図３

Description

本発明は、１又は複数のアナライトの検出方法に関し、特にタンパク質又はＤＮＡの検出方法に関する。特に本発明は、標識化アナライトの光学的検出及び標識化アナライトの電気的検出の両方からなるアナライトの検出方法に関する。

アナライトの検出方法は生化学分析の分野ではよく知られている。従来の方法においては通常、アナライトを同定するために、蛍光検出などによって検出可能な蛍光標識を用いてアナライトを標識化する。

ここ数年間、ＤＮＡ検出分野においては、ナノ粒子を標識として使用している。これらの標識は、標識化可能で結合を伴う如何なるシステムに対しても機能するものと考えられることから、タンパク質及び核酸と同様に生細胞システムに対しても有用となり得る。ナノ粒子の使用によって、コスト、使い易さ、感度、選択性など、蛍光標識の使用の際における多数の問題点が克服されることが見出されている（非特許文献１参照）。ナノ粒子は、光学的検出、電気的検出、電気化学的検出、及び重力検出を含む多種多様なＤＮＡ検出に使用されている（非特許文献１参照）。コロイド状金タグの電気化学的ストリッピング検出に基づくＤＮＡハイブリダイゼーションの検出において、金ナノ粒子の使用が成功している（非特許文献２参照）。ＤＮＡハイブリダイゼーションの研究のための蛍光標識として、半導体ナノ結晶（量子ドットともいう）及び金ナノ粒子の使用も成功している（非特許文献３参照）。

従来の蛍光標識に代えて、ナノ粒子をＤＮＡ検出法に使用することにより種々の利点が得られるにも拘わらず、これら検出法の感度及び選択性については依然として改良する必要がある。各検出法がある程度の感度及び選択性を有するものの、それぞれが種々の問題点を有すると共に不正確でもある。

アナライトの検出方法において、感度及び選択性の改善が必要であることに加えて、特にＤＮＡを対象とした、迅速で、安価で、そして簡単な検出方法に対する必要性が高まっている。

Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ， "Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ"， Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３年， １４巻， Ｒ６３−Ｒ７３ Ｗａｎｇ Ｊ， Ｘｕ Ｄ， Ｋａｗｄｅ Ａ， Ｐｏｓｌｋｙ Ｒ， "Ｍｅｔａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ"， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００１年， ７３巻， ｐｐ．５５７６−５５８１ Ｗｅｓｔ Ｊ， Ｈａｌａｓ Ｎ， "Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｓｅｎｓｉｎｇ， Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００３年， ５巻， ｐｐ．２８５−２９２

本発明の目的は、前記の従来技術が抱える問題点を克服することにある。特に、本発明の目的は、感度及び選択性が改善されると共に、迅速に、安価に、そして簡単に実施できるアナライトの検出方法を提供することにある。

従って、本発明は、アナライトを検出する方法であって、前記アナライトが、前記アナライトに関係付け可能である（ｒｅｌａｔａｂｌｅ）１以上の標識で標識化されており、（ａ）標識化アナライトに対して光学的検出法を行い、前記１以上の標識から光学的データを得る工程と、（ｂ）前記標識化アナライトに対して電気的検出法を行い、前記１以上の標識から電気的データを得る工程と、（ｃ）前記光学的データ及び電気的データの両方に基づきアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とするアナライトの検出方法を提供する。

本発明はまた、複数のアナライトを検出する方法であって、それぞれ異なる前記アナライトが、前記アナライトに関係付け可能である１以上の異なる標識で標識化されており、（ａ）複数の標識化アナライトに対して光学的検出法を行い、前記標識から光学的データを得る工程と、（ｂ）前記複数の標識化アナライトに対して電気化学的検出法を行い、前記標識から電気的データを得る工程と、（ｃ）前記光学的データ及び電気的データの両方に基づき前記複数のアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする複数のアナライトの検出方法を提供する。

本発明は、光学的検出法及び電気的検出法の両方を１又は複数の標識化アナライトに対して実施するという点で優れている。驚くべきことに本発明者らは、光学的検出の実施後に電気的方法を行えば、１又は複数の標識化アナライトに対して光学的検出法及び電気的検出法の両方を実施することができることを見出した。

また、本発明者らは驚くべきことに、その好ましい実施形態において、光学的検出及び電気的検出に適切な標識を使用することにより、光学的検出後の標識化アナライトを電気的検出において成功裏に使用可能な状態とすることができることを見出した。

本発明の方法の利点は、測定結果の感度及び選択性を改善することである。複数の異なるアナライトを検出する場合には、本発明の方法は検出されるアナライトの個数を増加させ及びその正確度を向上させる。これらの利点は、光学的検出法からの光学的データと電気的検出法からの電気的データの両方を使用して、１又は複数のアナライトを同定及び／又は定量することよりもたらされる。

当技術分野においては、アナライトに対して光学的検出法及び電気的検出法を別々に使用することは知られているが、１又は複数の標識化アナライトに対して両方の方法を使用することは、これまで一切教示も示唆さえもされていない。

本発明の好ましい態様においては、１以上の標識が光学的検出及び電気的検出に適切であって、工程（ａ）において使用される１以上の標識は、本方法の工程（ｂ）において使用される１以上の標識と同一である。これにより、光学的方法及び電気的方法の両方から得たデータを使用して行う、１サンプル中の１又は複数のアナライトの同定及び／又は定量がより容易となる。

本発明の他の態様においては、工程（ａ）における１以上の標識が光学的検出に適切であり、工程（ｂ）における１以上の標識も電気的検出に適切であり、工程（ａ）における前記１以上の標識が、工程（ｂ）における前記１以上の標識と異なる。これは、光学的検出と電気的検出を別々の標識に対して実施する場合に、より多くのデータが得られるので有利である。

光学的検出法及び電気的検出法のいずれかを実施する場合と比べて、本発明の方法の感度と選択性は著しく改善される。

本発明の方法は迅速に、安価に、そして簡単に実施される。

添付の図面を参照して本発明を更に詳細に説明する。

図１は、本発明の方法を説明する概略図である。この方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡなど任意のアナライトの検出に使用することができる。 図２は、工程（ａ）と工程（ｂ）とで異なる標識を用いて、アナライトを標識化するための各種経路のフロー図である。 図３は、工程（ａ）と工程（ｂ）とで異なる標識を用いて、アナライトである核酸を標識化する方法を説明する概略図である。 図４は、プローブのみを有する電極（黒丸）、１００ｎＭの相補性標的とハイブリダイズしたプローブを有する電極（黒三角）、及び標的除去後のプローブを有する電極（白三角）のＮｙｑｕｉｓｔプロットを示した図である。 図５は、プローブのみを有する電極（黒丸）、及び１００ｎＭの非相補性標的とハイブリダイズさせた後のプローブを有する電極（黒三角）のＮｙｑｕｉｓｔプロットを示した図である。 図６は、相補性標的とハイブリダイズさせた電極又は非相補性標的とハイブリダイズさせた電極から測定された蛍光を示した図である。エラーバーは電極を横切るピクセル強度の標準偏差を示す。

本発明の方法において検出されるアナライトは、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、ＤＮＡ、及びＲＮＡから選択される１以上の化合物であることが好ましい。特に、本発明の方法は、ＤＮＡの検出とＲＮＡの検出とに有用である。

本発明の方法は、１又は異なる複数のアナライトを検出するために使用することができる。異なる複数のアナライトを検出するために本発明の方法を使用する場合には、それぞれ異なるアナライトを、該アナライトに関係付け可能な異なる１以上の標識で標識化してもよい。また、例えば、複数のアナライトに対するプローブのセットを表面上に配列させることにより、複数のアナライトを空間的に分離させて検出してもよい。異なる複数のアナライトの検出は、多重検出としても知られている。

（標識）
本発明の好ましい実施形態においては、１以上の標識は、ナノ粒子、単一分子、特定のヌクレオチドやアミノ酸などの標的に内在する要素、及び化学発光酵素から選択される。適切な化学発光酵素としては、ＨＲＰやアルカリホスファターゼを挙げることができる。

本発明の方法の工程（ａ）において使用される１又は複数の標識が、工程（ｂ）において使用される１又は複数の標識と異なる本発明の実施形態においては、工程（ａ）で使用される標識を、例えば、蛍光色素分子とし、工程（ｂ）で使用される標識を、ナノ粒子、単一分子、及び化学発光酵素とすることができる

前記標識は、ナノ粒子であることが好ましい。ナノ粒子は、光学的検出法と電気的検出法いずれにおいても良好に機能することから、工程（ａ）において使用される（１以上の）標識と工程（ｂ）において使用される（１以上の）標識が同一である本発明の実施形態において特に有利である。ナノ粒子が表面に近接しているかどうかは特段重要ではないため、ナノ粒子を用いたアッセイはより柔軟性が高い。好ましい実施形態においてナノ粒子は分子の集合物である。これは、単一分子を使用した場合に比べて光学的検出法と電気的検出法においてより強いシグナルが得られるからである。

前記ナノ粒子は、金属、金属ナノシェル、二元金属化合物、及び量子ドットから選択されることが好ましい。好ましい金属又は他の元素の例としては、金、銀、銅、カドミウム、セレン、パラジウム、白金が挙げられる。好ましい二元金属化合物及び他の化合物の例としては、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、ＩｎＧａＮが挙げられる。

前記金属ナノシェルは、薄い金属シェルで覆われたコアナノ粒子を含む球形ナノ粒子である。金属ナノシェルの例としては、薄い金シェルで覆われた硫化金コア又はシリカコアなどを挙げることができる。

量子ドットは、半導体ナノ結晶であって高光吸収性を有する発光性ナノ粒子である（Ｗｅｓｔ Ｊ， Ｈａｌａｓ Ｎ， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｓｅｎｓｉｎｇ， Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ” Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２００３ 年， ５巻： ｐ． ２８５−２９２））。量子ドットの例としては、ＣｄＳｅやＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、ＩｎＧａＮなどの各ナノ結晶を挙げることができる。

前記標識はいずれも抗体に結合させることができる。例えば、ナノ粒子で標識化された抗ビオチン抗体を示す図１を参照されたい。

標識のサイズは、直径で２００ｎｍ未満が好ましく、１００ｎｍ未満がより好ましく、２ｎｍ〜５０ｎｍが更に好ましく、５ｎｍ〜５０ｎｍが更により好ましく、１０ｎｍ〜３０ｎｍが特に好ましく、１５ｎｍ〜２５ｎｍが最も好ましい。

本発明の方法を複数のアナライトの検出に用いる場合には、それぞれ異なるアナライトを、該アナライトに関係付け可能な異なる１以上の標識で標識化する。本発明のこの態様において標識は、その組成及び／又は種類が異なっていてもよい。例えば、標識がナノ粒子である場合には、これらを異なる金属ナノ粒子とすることができる。ナノ粒子が金属ナノシェルである場合には、コアとシェル層の寸法を様々に変化させることで異なる標識を作製してもよい。これに代えて又はこれに加えて、サイズ、形状、表面粗度などの物理的性質が異なる標識としてもよい。一の実施形態においては、組成及び／又は種類が同一で物理的特性が異なる各標識を用いることができる。

異なるアナライトに対する各標識は、光学的検出法及び電気的検出法において相互に識別可能であることが好ましい。例えばこれらの標識は、発光周波数、散乱信号、及び酸化電位が異なっていてもよい。

（アナライトの標識化）
本発明の好ましい実施形態においては、本発明の方法は、工程（ａ）の前に、１以上の標識を用いてアナライトを標識化する工程を更に含み、標識化アナライトを形成する。

アナライトを標識化するための手段は特に限定されず、多くの好適な方法が当技術分野においてよく知られている。例えば、アナライトがＤＮＡ又はＲＮＡである場合には、標識が結合されたプライマーの酵素的伸長；リガンド又は反応性部位における、ハイブリダイゼーション後の標識化；未標識化標的と標識‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートプローブとの「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションによって、アナライトを標識化することができる（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ， “Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３年， １４巻， Ｒ６３−Ｒ７３）。

オリゴヌクレオチドをナノ粒子にコンジュゲートさせるため各種の方法が当技術分野において多数知られている。例えば、チオール修飾オリゴヌクレオチド及びジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子の表面、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）製のホスフィン修飾ナノ粒子由来のオリゴヌクレオチドコンジュゲート、オリゴチオール−ナノ粒子コンジュゲート、ジ−及びトリ−スルフィド修飾コンジュゲートと自発的に結合する（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ， “Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３年， １４巻， Ｒ６３−Ｒ７３の図２参照のこと）。

図１は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に一体化されているビオチンを示す。相補性プローブとの結合が生じると、二本鎖は、光学的検出及び電気的検出に適切なナノ粒子をタグとして付された抗ビオチン抗体で標識化される。

一の実施形態においては、ＤＮＡストランドとＲＮＡストランドとの両方をビオチン化することができる。ビオチン化標的ストランドは、オリゴヌクレオチドプローブで被覆した磁性ビーズにハイブリダイズさせることができる。続いて、ストレプトアビジン被覆金ナノ粒子が、捕捉された標的ストランドに結合する（Ｗａｎｇ Ｊ， Ｘｕ Ｄ， Ｋａｗｄｅ Ａ， Ｐｏｓｌｋｙ Ｒ， “Ｍｅｔａｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００１年， ７３巻， ｐ．５５７６−５５８１）。磁性ビーズは、ハイブリダイゼーションしていないＤＮＡの磁気的除去を可能にする。

工程（ａ）において使用される１以上の標識が、工程（ｂ）において使用される１以上の標識と異なる本発明の実施形態においては、アナライトは、例えば、工程（ａ）用標識として蛍光色素分子を用いて、工程（ｂ）用標識としてナノ粒子を用いて標識化することができる。蛍光色素分子は工程（ａ）での光学的検出に好適であり、ナノ粒子は工程（ｂ）での電気的検出に好適である。アナライトは、２種の異なる標識で同時に標識してもよいし、２個のアリコートに分けて別々に標識してもよい。光学的及び電気的データの測定値は、１個のチップ上又は別個のチップ上で得られる。異なる標識でアナライトを標識化する工程を図３のフロー図に示す。同図において、アナライトは核酸であり、工程（ａ）での光学的検出用に蛍光色素分子を使用し、工程（ｂ）での検出用には金／銀ナノ粒子を使用している。

この実施形態において、アナライトである核酸を異なる標識で標識化する特に好ましい方法を図３に示す。この方法は、電気的検出に適切な標識で標識化されるプライマーを使用する。このプライマーは、標的とする核酸配列に結合し、適切な酵素（ＲＮＡの場合には逆転写酵素；ＤＮＡの場合にはＤＮＡポリメラーゼ）により伸長される。プライマー伸長のために使用される１以上のヌクレオシドは、蛍光色素分子など、光学的検出用の１以上の標識で標識化される。従って伸長工程により、オリゴヌクレオチドに１以上の光学的標識が導入される。前記伸長工程の最終生成物は２種の異なる標識を含む。

（光学的検出法）
光学的検出法は、発光検出法、吸光検出法、光散乱検出法、スペクトルシフト検出法、表面プラズモン共鳴イメージング法、及び吸着染料由来の表面増強ラマン散乱法からなる群から選択されるのが好ましい。

好ましい実施形態においては、光学的検出法は発光検出法であって、標識化アナライトを該標識の励起が可能な光に曝露する工程と、前記標識からの光放射の周波数及び強度を検出する工程とを含む。周波数及び／又は強度の光学的データを、本発明の方法の工程（ｃ）において使用して、存在するアナライトの同定及び／又は定量に関する情報を得ることができる。

この好ましい実施形態において、複数の異なる標識で異なるアナライトを標識化する場合には、各標識が異なる発光周波数を有するものであることが好ましい。標識の種類、組成、サイズ、形状、及び粗度によって、標識からの発光の共鳴周波数が決まる。従って、標識のこれら性質のいずれかを変えることにより、発光の周波数を所望の周波数に「合わせる（ｔｕｎｅ）」ことができる。このように、材料の種類は同一であるが寸法が異なる（又は寸法は同一であるが材料の種類が異なる）標識を、多重検出法に使用することができる。

本発明において光学的検出法で使用される光は、１以上の標識を十分に励起できれば、特に限定されない。組み込まれた標識化アナライトを曝露する光は通常、レーザー光である。光の周波数も特に限定されず、紫外線、可視光、又は赤外光を使用することができる。

好ましい実施形態においては、標識が金属ナノ粒子又は金属ナノシェルである場合には、使用される光は白色光である。

別の好ましい実施形態においては、標識が単一分子又は量子ドットである場合には、使用される光はレーザー光である。

吸光検出法、光散乱検出法、スペクトルシフト検出法、表面プラズモン共鳴イメージング法、及び吸着染料由来の表面増強ラマン散乱法などの他の光学的検出法を実施する方法が当技術分野においてよく知られている（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ， “Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００３年， １４巻， Ｒ６３−Ｒ７３）。

好ましい実施形態においては、前記光学的検出法はチップ上で行われる。

（電気的検出法）
電気的検出法は、電気抵抗検出及び電気化学検出から選択されることが好ましい。

電気抵抗検出法は、当技術分野においてよく知られている（Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ Ｗ， Ｔａｔｏｎ Ｔ Ａ， “Ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｌａｂｅｌｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ， ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００３年， １４巻， Ｒ６３−Ｒ７３）。

電気的検出法は電気化学検出であることが好ましい。一の実施形態においては電気化学検出法は、
（ｉ）標識化アナライトを、２個の電極を含む溶液中に投入して、１以上の標識を前記溶液に溶解させる工程と、
（ｉｉ）前記電極に析出電位を印加して、前記１以上の標識を前記電極の内の１個に析出させる工程と、
（ｉｉｉ）電極からの電気化学信号を検出する工程とを含む。

工程（ｉ）における前記溶液は、１以上の標識を溶解させるのに適切であれば、特に限定されない。前記溶液としては、１以上の標識を溶解させる酸を含むことが好ましい。この工程により、前記アナライト及び前記標識は通常破壊される。従って、前記光学的検出法は、前記電気化学検出法の前に行う必要がある。

工程（ｉｉ）においては、電位を印加して電極に標識を析出させる。析出時間は特に限定されず、１秒間を超える時間が好ましく、３０秒間を超える時間がより好ましく、１分間を超える時間が更により好ましく、２分間を超える時間が最も好ましい。

通常、析出工程は緩慢な工程であり、溶解した標識が溶液中を拡散し酸化還元析出反応が生じる電極表面に接触するのに比較的長い時間を要する。この工程は進行が緩慢なので、得られる信号は比較的弱く測定には適切でない可能性がある。従って、好ましい実施形態においては、工程（ｉｉ）は、電極に析出した標識の第２の酸化還元反応を生じさせるために、電極に第２の電位を印加する工程を更に含む。これによって信号が発生する。第２の酸化還元反応は、析出した標識を酸化させるものであってもよい。この第２の酸化還元反応は、もはや拡散過程によって律速されないのでより迅速である。これにより、遥かに強い信号、即ちより高い感度がもたらされる。

標識が金などの金属ナノ粒子である一の実施形態においては、第２の酸化還元反応は析出金属の酸化である。

複数の異なる標識を用いて異なるアナライトを標識化する場合には、各標識は、電気化学検出法のための異なる酸化電位を有し、これにより、得られた各データにおける信号ピークが異なることが好ましい。例えば、金属ナノ粒子を異なるアナライトの標識として使用する場合、異なる酸化電位を有する異なる金属を各アナライトに使用することができる。

前記電気化学検出法を行う工程（ｉｉ）において析出電位は、−０．１Ｖ〜−１．０Ｖが好ましく、−０．５Ｖ〜−０．８Ｖがより好ましい。

第２の電位を電極に印加して、析出した標識の酸化還元反応を生じさせる工程を、工程（ｉｉ）が更に含む場合の工程（ｉｉ）の好ましい実施形態においては、該第２の電位は、＋１．０Ｖ〜＋２．０Ｖであり、＋１．２Ｖ〜＋１．８Ｖが好ましい。

本発明の好ましい電気化学検出法においては、標識は、物質種の集合物であるナノ粒子であることが好ましい。これにより、正確で且つ感度の良い検出を行うのに十分に強い信号が電気化学検出において確実に生成される。単一分子ナノ粒子を用いる場合には、電流は非常に低くなり、従って検出感度が低下する。

好ましい実施形態においては、電気的検出法はチップ上で行う。これは、光学的検出法に使用したチップと同一のチップであってもよいし、異なるチップであってもよい。光学的検出を行う工程（ａ）で使用する標識と、電気的検出を行う工程（ｂ）で使用する標識とが異なる本発明の実施形態において、前記異なるアナライトがこれら異なる標識で同時に標識化されている場合には、光学的検出及び電気的検出は１個のチップ上で行うことができる（図２参照）。また、２個のアリコートに分けられたアナライトが別々に標識化されている場合には、標識化後のアナライトを合一して１個のチップ上で光学的検出及び電気的検出を行ってもよいし、または別々の２個のチップ上で光学的検出及び電気的検出を行ってもよい（図２参照）。

アナライトが核酸であり、標識化プライマーを用いて標識化ヌクレオシドを使用するプライマー伸長により標識化工程を行う本発明の実施形態においては（図３参照）、標識化伸長プライマーを、光学的検出及び電気的検出のためのプローブにハイブリダイズさせることができる（図３参照）。これは、図３に示すように、電気的検出用標識を検出用電極に近接させて配置することができるため特に有利である。

（光学的データ及び電気的データの両方に基づくアナライトの同定及び／又は定量）
本発明の方法の工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた光学的データ及び電気的データの両方に基づき、１又は複数のアナライトの同定及び／又は定量を行う。

例えば、光学的検出法として発光検出法を用いる場合には、標識由来の発光強度に基づいて存在するアナライトの同定及び／又は定量に関する情報を得ることができる。

例えば、電気的検出法として電気化学検出法を用いる場合には、存在する標識をボルタンメトリーによって定量することができる。定量データは、信号ピークから積分によって得ることができる。即ち、生成される各信号ピークのグラフ下面積を測定することによって得ることができる。

（ナノ粒子を用いたＤＮＡアナライトの標識化）
ＲＮＡは従来の技術に従い逆転写させて、ナノ粒子で標識化されたヌクレオチドを取り込ませる。

（光学的検出及び電気化学的検出）
従来の方法に従って、標識を所定波長の光で励起して、その発光を所定波長で検出する。

続いて、光学的検出法が実施された後の標識化アナライトに対して電気化学検出法を行う。標識化アナライトを酸性溶液に溶解させる。電極を溶液中に挿入し、−０．８Ｖの析出電位を印加する。２分間の析出の後、＋１．２Ｖの第２の電位を印加し析出ナノ粒子を酸化する。電気化学信号が検出される。

以下、発明を更に説明するがこれはほんの一例に過ぎない。

（実施例１：プロトコール）
＜金電極の清浄＞
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、電気化学パルス法を１．４Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して）で用いて、金電極を３０秒間清浄した。次いで、電極を超純水で室温にて５分間洗浄した。続いて、電極を窒素気流下室温にて１分間乾燥させた。

＜７５量体チオール修飾一本鎖ＤＮＡ（ＨＣＶプローブ）の固定化＞
固定化に先立ち、５ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）のＰＢＳ溶液で３０分間処理し、チオエート化オリゴヌクレオチドからジスルフィド保護基を脱離させ、続いてＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ‐２５カラムを用いて精製した。オリゴヌクレオチド（ＨＣＶプローブ＝５’−ＧＧＣ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＴＡ ＣＴＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＣＡ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＡＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＡＧＧ ＧＧＧ ＧＧ−３’［５’］＝ＳＨ）（１０μＭ ７５量体チオール修飾一本鎖ＤＮＡ）を、ＰＢＳ（１０ｍＭ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中、清浄した金電極上において３０℃で１６時間インキュベートした。電極に対し、ＰＢＳによる洗浄、ＮａＣｌ（１Ｍ）による洗浄、次にＰＢＳによる洗浄の一連の洗浄を３回（それぞれ１０分間）行った。次いで、窒素気流下で室温にて１分間電極を乾燥させた。使用前は、２×ＳＳＣ緩衝液中に４℃で電極を保管した。

＜電気化学的及び光学的特性の測定＞
電気化学インピーダンス分光法は、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）_６］^{３−／４−}を含有する２×ＳＳＣ緩衝液（電気化学緩衝液（ＥＢ））中で、周波数窓１００ｋＨｚ〜１００ｍＨｚにおけるＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対し、０．２４Ｖの直流電圧を重畳した交流電圧１０ｍＶを用いて実施した。次に、室温にて１分間電極を水洗し、窒素気流下で１分間乾燥させた。ＨＣＶ標的とハイブリダイズさせるために、１００ｎＭの標的ＤＮＡ（Ａ又はＢ）と電極とを、２×ＳＳＣ緩衝液中、５５℃で２時間インキュベートした。

Ａ：相補性ＨＣＶ標的＝５’−ＣＣＣ ＣＣＣ ＣＴＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＣＡ ＴＡＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＧＣＧ ＧＡＡ ＣＣＧ Ｇ−３’［５’］＝Ｃｙ３
Ｂ：非相補性ＨＣＶ標的＝５’−ＡＧＴ ＧＴＴ ＧＡＧ ＧＧＣ ＣＧＴ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＴＣ ＧＴＣ ＣＣＡ ＣＧＧ ＴＡＴ ＴＴＧ−３’，［５］＝Ｃｙ３

ハイブリダイゼーション後、電極を２×ＳＳＣ緩衝液で洗浄して、続いて０．２×ＳＳＣ緩衝液によって１０分間室温にて洗浄した。励起波長を５３４ｎｍとし発光波長を５７０ｎｍとして（以下参照）、マイクロアレイスキャナー（Ｔｅｃａｎ ＬＳ Ｒｅｌｏａｄｅｄ（商標））にて蛍光を測定した。標的の電極からのストリッピングは、水中にて３分間９０℃で洗浄することにより行った。

＜結果＞
１回のハイブリダイゼーション実験の電気化学的検出及び光学的検出の結果を評価するために、電子移動抵抗（Ｒｅｔ）の検出は電気化学インピーダンス分光法によって行い（図１参照）、蛍光強度の測定はＴｅｃａｎ ＬＳ ｒｅｌｏａｄｅｄマイクロアレイスキャナーを用いて行った（図２参照）。相補性標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション後に、蛍光強度とＲｅｔの増加（１０ｋΩ）が明らかに認められた（電極１参照）。プローブのみを有する電極の蛍光強度の値は２７±５７ａ．ｕ．の範囲である。非相補性標的とのインキュベーションでは信号の変化量が明らかに減少するので（電極２参照）、相補性標的によりもたらされるイベントと明確に区別することができる。なお、各標的の結合作用の評価は、クロスコンタミネーションを排除するため異なる電極を用いて行った。

Claims (37)

1. アナライトを検出する方法であって、
   前記アナライトが、前記アナライトに関係付け可能である（ｒｅｌａｔａｂｌｅ）１以上の標識で標識化されており、
   （ａ）標識化アナライトに対して光学的検出法を行い、前記１以上の標識から光学的データを得る工程と、
   （ｂ）前記標識化アナライトに対して電気的検出法を行い、前記１以上の標識から電気的データを得る工程と、
   （ｃ）前記光学的データ及び電気的データの両方に基づきアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とするアナライトの検出方法。
2. １以上の標識が光学的検出及び電気的検出に適切であり、かつ工程（ａ）における１以上の標識が、工程（ｂ）における１以上の標識と同一である請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）の前に、１以上の標識を用いてアナライトを標識化する工程を更に含み、標識化アナライトを形成する請求項２に記載の方法。
4. 工程（ａ）における１以上の標識が光学的検出に適切であり、工程（ｂ）における１以上の標識が電気的検出に適切であり、前記工程（ａ）における前記１以上の標識が前記工程（ｂ）における前記１以上の標識と異なる請求項１に記載の方法。
5. 工程（ａ）の前に、前記工程（ａ）における１以上の標識を用いてアナライトを標識化する工程、及び工程（ｂ）における１以上の標識を用いてアナライトを標識化する工程を更に含み、同時又は別々に標識化アナライトを形成する請求項４に記載の方法。
6. 複数のアナライトを検出する方法であって、
   それぞれ異なる前記アナライトが、前記アナライトに関係付け可能である１以上の異なる標識で標識化されており、
   （ａ）複数の標識化アナライトに対して光学的検出法を行い、前記標識から光学的データを得る工程と、
   （ｂ）前記複数の標識化アナライトに対して電気化学的検出法を行い、前記標識から電気的データを得る工程と、
   （ｃ）前記光学的データ及び電気的データの両方に基づき前記複数のアナライトの同定及び定量の少なくともいずれかを行う工程とを含むことを特徴とする複数のアナライトの検出方法。
7. １以上の標識が光学的検出及び電気的検出に適切であり、工程（ａ）における各アナライトの１以上の標識が工程（ｂ）における各アナライトの１以上の標識と同一である請求項６に記載の方法。
8. 工程（ａ）の前に、１以上の標識を用いて複数のアナライトを標識化する工程を更に含み、標識化アナライトを形成する請求項７に記載の方法。
9. 工程（ａ）における１以上の標識が光学的検出に適切であり、工程（ｂ）における１以上の標識が電気的検出に適切であり、工程（ａ）における各アナライトの１以上の標識が工程（ｂ）における各アナライトの１以上の標識と異なる請求項６に記載の方法。
10. 工程（ａ）の前に、前記工程（ａ）における１以上の標識を用いて複数のアナライトを標識化する工程、及び工程（ｂ）における１以上の標識を用いて複数のアナライトを標識化する工程を更に含み、同時又は別々に標識化アナライトを形成する請求項９に記載の方法。
11. 標識がナノ粒子、単一分子、化学発光酵素、及び蛍光色素分子から選択される請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 標識が分子及び原子の少なくともいずれかの集合物を含むナノ粒子である請求項１１に記載の方法。
13. ナノ粒子が金属、金属ナノシェル、二元金属化合物、及び量子ドットから選択される請求項１２に記載の方法。
14. ナノ粒子がＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＨｇＩ、ＺｎＴｅ、ＧａＡｓ、ＨｇＳ、ＣｄＡｓ、ＣｄＰ、ＺｎＰ、ＡｇＳ、ＩｎＰ、ＧａＰ、ＧａＩｎＰ、及びＩｎＧａＮから選択される金属化合物である請求項１３に記載の方法。
15. ナノ粒子が金、銀、銅、カドミウム、セレン、パラジウム、及び白金から選択される請求項１３に記載の方法。
16. ナノ粒子の直径が１００ｎｍ未満である請求項１１から１５のいずれかに記載の方法。
17. ナノ粒子の直径が５ｎｍ〜５０ｎｍである請求項１６に記載の方法。
18. ナノ粒子の直径が１０ｎｍ〜３０ｎｍである請求項１７に記載の方法。
19. それぞれ異なるアナライトにおける１以上の標識が、異なる物理的性質を有する請求項６から１８のいずれかに記載の方法。
20. 物理的性質がサイズ、形状、及び表面粗度の１以上の性質から選択される請求項１９に記載の方法。
21. それぞれ異なるアナライトの標識が、異なる組成を有する請求項６から２０のいずれかに記載の方法。
22. それぞれ異なるアナライトの標識が、異なる種類である請求項６から２１のいずれかに記載の方法。
23. 光学的検出法が発光検出法、吸光検出法、光散乱検出法、スペクトルシフト検出法、表面プラズモン共鳴イメージング法、及び吸着染料由来の表面増強ラマン散乱法から選択される請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
24. 光学的検出法が発光検出法であって、標識の励起が可能な光に標識化アナライトを曝露する工程と、前記標識からの光放射の周波数及び強度を検出する工程とを含む請求項２３に記載の方法。
25. 光がレーザー光である請求項２４に記載の方法。
26. 光が赤外光、可視光、及び紫外光から選択される請求項２４から２５のいずれかに記載の方法。
27. 光が白色光である請求項２６に記載の方法。
28. 電気的検出法が電気抵抗検出法及び電気化学検出法から選択される請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
29. 電気的検出法が電気化学検出であり、
    （ｉ）標識化アナライトを、２個の電極を含む溶液中に投入して、１以上の標識を前記溶液に溶解させる工程と、
    （ｉｉ）前記電極に析出電位を印加して、前記１以上の標識を前記電極の内の１個に析出させる工程と、
    （ｉｉｉ）電極からの電気化学信号を検出する工程とを含む請求項２８に記載の方法。
30. 析出電位が−０．１Ｖから−１．０Ｖである請求項２９に記載の方法。
31. 電位が直流電圧に重畳された交流電圧である請求項３０に記載の方法。
32. 交流電圧が、約０．２４Ｖの直流電圧に重畳された約１０ｍＶの交流電圧である請求項３１に記載の方法。
33. 工程（ｉｉ）が、電極に第２の電位を印加する工程を更に含み、析出した標識の酸化還元反応を生じさせる請求項２９から３２のいずれかに記載の方法。
34. 第２の電位が＋１．０Ｖ〜＋２．０Ｖの範囲にある請求項３３に記載の方法。
35. 酸化還元反応が、析出した標識の酸化である請求項３３から３４のいずれかに記載の方法。
36. アナライトが細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、ＤＮＡ、及びＲＮＡから選択される１以上の化合物を含む請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
37. アナライトがＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかであり、工程（ａ）における１以上の標識及び工程（ｂ）における１以上の標識で前記１又は複数のアナライトを標識化する工程が、
    （ｉ）工程（ｂ）における電気的検出に適切な１以上の標識で標識化されたプライマーをＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかに結合させる工程と、
    （ｉｉ）前記プライマーを、工程（ａ）における光学的検出に適切な１以上の標識で標識化した１以上のヌクレオシドを用いて酵素的に伸長させる工程と、を含む請求項５及び請求項１０から３６のいずれかに記載の方法。

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