JP4580875B2 - 核酸検出法のためのプライマーの設計方法 - Google Patents
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Description
本発明は標的核酸の検出方法に関連し、具体的には、標的核酸を増幅するためのプライマーの設計方法、及び該プライマーを用いた検出方法に関する。
特定の核酸配列を持った核酸鎖を検出するためには、検出対象に相補的な核酸プライマーを用いて増幅し、増幅の有無を電気泳動で確認する方法や、その増幅産物中の検出対象となる配列に相補的なプローブを用いて検出する方法が一般的に知られている。このプローブを用いた検出方法は、増幅産物の特異性を改めて確認することができるといった利点がある。
遺伝子の増幅技術としては、PCR(Polymerase Chain Reaction)法が一般的に知られているが（例えば非特許文献１）、複雑な温度制御装置が必要であること、数塩基違いの鋳型に対して特異的な増幅反応が難しいことなどの問題点が指摘されている。
このような複雑な温度制御を必要としない遺伝子増幅法としてLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法が開発された（特許文献１参照）。LAMP法は、60〜65℃の等温条件下で特定の遺伝子領域を増幅する技術である。LAMP法は、インナープライマーペア、アウタープライマーペア、さらに任意にループプライマーペア（特許文献２）を加えた複数のプライマーと鎖置換型のポリメラーゼ、及び基質であるヌクレオチドを用いて特定の遺伝子領域を増幅する。LAMP法はPCRと比較して、最終産物量が多いだけでなく、操作が簡便、迅速、安価であることから、今後、幅広い分野で応用されることが期待されている。
PCR産物をプローブ核酸で検出する場合、PCR産物の構造が2本鎖の状態であるため、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低下するという問題があった。この問題を解決する方法として、標的核酸鎖のプローブと相補的な配列部位を除く部分に結合する核酸を添加し、検出すべき核酸のセルフハイブリダイゼーションを防止する方法が発明されているが（例えば特許文献３）、十分な感度が得られているとはいえない。また、2本鎖の検出核酸のうち相補鎖側を分解または分離するといった方法が開発されているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残っていた。
一方、LAMP産物は、産物中に1本鎖ループ領域があることから、この領域がプローブと結合するように設計すれば、検出すべき核酸を1本鎖にするという工程を経ずに、プローブと効率よくハイブリダイズさせることができる。この1本鎖ループ領域を利用しLAMP増幅産物を検出する方法として、1本鎖ループ領域にハイブリダイズするプローブを蛍光標識し、蛍光偏光度を測定する方法（特許文献４）、1本鎖ループ領域にハイブリダイズするプライマーの5’末端を固定化担体に固定化し、凝集反応を観察する方法（特許文献５）、1本鎖ループ領域にハイブリダイズするプローブを固相に固定化し、プローブとLAMP増幅産物とのハイブリを蛍光または電気化学的な原理により検出する方法（特許文献６）がある。
特許第3313358号明細書
国際公開第02/024902号パンフレット
特開平6-70799号公報
特開2002-272475号公報
特開2002-345499号公報
特開2005-143492号公報
Science, 230, p.1350-1354, 1985
LAMP増幅産物を検出する手法として、その１本鎖領域にプローブをハイブリダイズさせて検出する技術が開示されていることは上述の通りである（例えば、特許文献４、５参照）。しかしながらこのハイブリダイゼーション反応を利用した検出技術については、複雑な構造上の問題も含め不明確な点が多く、LAMP法で増幅した目的遺伝子産物をプローブにより検出する技術の確立が切望されているのが実情である。本発明は、かかる実情に鑑み開発されたものであり、LAMP増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーション効率を改善し、より精度よく検出することができるLAMP増幅産物を得るための、LAMPプライマーの設計方法を提供することを目的とする。
本発明者等が前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、LAMP産物の増幅に用いるプライマーがハイブリダイゼーション反応を阻害し、反応効率を低下させる一因であることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明により、標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させた増幅産物を、プローブ核酸とハイブリダイズさせることによって検出する方法に用いられる前記プライマーの設計方法であって、前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域、及び３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、且つ、前記ＦＰ領域と前記ＬＦ領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記ＬＢｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、各領域を規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法が提供される。
前記プローブ核酸が、前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、且つ、前記ＦＰ領域と前記ＬＦ領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記ＬＢｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、各領域を規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法が提供される。
また、本発明の他の側面から、一塩基変異を含む標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させ、該増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることによって該一塩基変異を検出する方法に用いられる、前記プライマーの設計方法であって、前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域、及び３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記一塩基変異を含むＦＰ領域を前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分において、及び／又は、前記一塩基変異を含むＢＰｃ領域を前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分において有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、且つ、前記ＬＦ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法が提供される。
前記プローブ核酸が、前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、且つ、前記ＬＦ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法が提供される。
また、本発明の他の側面から、上記設計方法に従って設計されたプライマーを用いたLAMP増幅産物を、プローブ核酸とハイブリダイズさせて検出することによって、標的核酸又はその一塩基変異を検出する方法が提供される。さらに、本発明の他の側面から、上記に従って設計されたプライマーを用いて標的核酸を増幅するためのアッセイキットが提供される。
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の高いLAMP増幅産物を得ることができ、精度良くLAMP増幅核酸を検出することが可能である。これにより、簡便且つ高精度で標的核酸を検出することが可能である。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書においては、検出されるべき核酸を標的核酸と称し、その塩基配列を標的配列と称する。また、本発明の検出方法に供され、この標的核酸を含み得る溶液を試料溶液と称する。
また、本発明はLAMP法による増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることによって検出するが、プローブ核酸とのハイブリダイズに用いられる該増幅産物中の配列を検出配列と称することとする。従って、プローブ核酸は該検出配列と相補的な配列を有する。
LAMP法とは、試料中に存在する標的核酸を複数のプライマーと鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する方法である。増幅産物の検出方法には種々の方法があるが、本発明は上記のとおりプローブ核酸を用いて検出する方法に関するものである。以下、LAMP法の概要を説明する。
図１に示すように、LAMP法においては標的核酸に対して、その５’末端側から順に、Ｆ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を規定し、且つ、その３’末端側から順に、Ｂ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を規定する。増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせて検出する本発明の方法では、さらに図２に示すように、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＦＰ領域を規定し、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＢＰｃ領域を規定する。このＦＰ領域、ＢＰｃ領域、並びにその相補鎖となる領域がプローブ核酸とハイブリダイズするための検出領域であり、その塩基配列が検出配列である。プローブ核酸とのハイブリダイゼーションによる検出に用いる配列は、ＦＰ領域の配列、ＢＰｃ領域の配列、並びにそれらの相補的な配列のうち何れか一つのみを使用してもよいが、二以上を同時に使用してもよい。従って、プローブ核酸の配列は、上記配列のうち検出に用いる配列と相補的な配列を有するように準備する。
なお、ここでＦ３領域、Ｆ２領域、及びＦ１領域は、それぞれその相補鎖においては、Ｆ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、及びＦ１ｃ領域と称する。また、Ｂ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域、及びＢ１ｃ領域は、それぞれその相補鎖においては、Ｂ３領域、Ｂ２領域、及びＢ１領域と称する。同様に、ＦＰ領域及びＢＰｃ領域は、その相補鎖においてはＦＰｃ領域及びＢＰ領域と称される。本明細書では便宜的に、Ｆ３領域などを有する相補鎖をプラス鎖と称し、Ｆ３ｃなどを有する相補鎖をマイナス鎖と称することにする。
LAMP法において核酸を増幅するために使用されるプライマーは、４種のプライマーが基本となり、これらは（１）３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し、且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー；（２）前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー；（３）３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し、且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー；及び、（４）前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマーである。一般に、FIPプライマー及びBIPプライマーはインナープライマーと呼ばれ、Ｆ３プライマー及びＢ３プライマーはアウタープライマーと呼ばれる。
LAMP法ではさらに、ループプライマーと呼ばれるさらなるプライマーを任意に用いることによって、増幅時間を短縮させることができる。この場合、図３に示すように標的核酸において、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を規定し、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を規定する。これらはループプライマー領域と称する。そして、上記の４種のプライマーに加えて、ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ、及び上記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃを用いる。詳細には、WO2002/024902を参照されたい。これらのループプライマーＬＦｃ及びＬＢｃは、同時に用いてもよいが、何れか一方のみを用いてもよい。
図４は、LAMP法における増幅の中間産物を示す模式図である。LAMP法においては、まず標的核酸から図に示すようなダンベル型の中間産物が生成され、これが増幅サイクルの起点となる。起点構造体の生成及びその後の増幅過程は既に周知であり、詳細には特許第3313358号明細書を参照されたい。図４に示すように、中間産物は、その両端部分に相補的な配列を持つため自己アニールしループを形成する。
図４に示すように、FIPプライマー及びBIPプライマーは中間産物にアニールして合成起点を与え、3’末端側から合成反応が進行する。ループ構造を有する中間産物は、連続的にFIP及びBIPプライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。また、ループプライマーは、図に示すように、FIP及びBIPプライマーがアニールするループとは別のループにアニールし、さらなる合成起点を与えることによって増幅を促進させる。
本発明のようにLAMP増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせて検出する場合、一本鎖であるループ部分を反応に用いることが有利であるために、検出領域はこのループ部分に規定される。
図５は、LAMP増幅産物中に形成される4種類の1本鎖ループ領域部分を模式的に示した図である。それぞれ検出領域として、ＦＰ領域又はＢＰｃ領域、又はそれらの相補的な領域を有しており、該検出配列とハイブリダイズするプローブ核酸も併せて示してある。なお、図５に示したように、増幅産物の検出に４種のプローブ核酸を用いることもできるが、１種又は２種のプローブ核酸のみを適宜選択して用いてもよい。
ここで、本発明の第一の態様において、前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域は、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように規定される。同様に、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域は、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように規定される。好ましくは、重複部分は０〜１０塩基であり、より好ましくは０〜５塩基である。これらの領域がこの条件を満たすように規定されるに伴って、他の領域も適切に規定され、プライマーはこれらの規定に従って設計される。
このような条件に従ってプライマーを設計すること、即ち、各領域が上記条件を満たすように規定することは、増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を上昇させるために重要である。その理由を、図６を参照して以下に詳述する。
図６は、ＦＰ領域とＦ２領域が大きく重複している例を模式的に示した図である。図６（ａ）は、ループ部分にＦＰ領域がある場合、即ちプラス鎖の場合を表す。このときプローブ核酸は、ＦＰ領域と相補的な配列（即ち、ＦＰc領域の配列）を有している。ところで反応溶液中には、未反応のFIPプライマーが存在しており、この未反応のFIPプライマーはＦ２領域と同じ配列を有している。従って、図６（ａ）に示すように、未反応FIPプライマーとプローブ核酸は、ＦＰ領域とＦ２領域との重複部分の配列によってハイブリダイズしてしまう。即ち、未反応FIPプライマーが増幅産物の競合物質となり、増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション効率を低下させる要因となる。また、標的核酸の増幅が達成されない場合においても、未反応のプライマーがプローブ核酸とハイブリダイズすることによって、擬陽性の信号を検出してしまう可能性がある。
また、図６（ｂ）は、ループ部分にＦＰc領域がある場合、即ちマイナス鎖の場合を表す。この核酸鎖には、図２で示したようにＦ２領域と相補的なＦ２ｃ領域が存在する。このＦ２ｃ領域はFIPプライマーのＦ２領域と相補的であるため、未反応FIPプライマーがＦ２ｃ領域とアニールして2本鎖を形成し、増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害する要因となる。この影響は、リアルタイムに増幅産物を検出する場合や、高感度、高精度に検出する場合には特に致命的である。
以上に述べたハイブリダイゼーション阻害要因をまとめると、次の２つに分類することができる。即ち（Ｉ）未反応プライマーとプローブ核酸の反応、及び（II）未反応プライマーと増幅産物の反応；である。これらの阻害要因のため、ハイブリダイゼーションの反応効率が低下し、検出精度が悪化するという問題が生じると考えられる。
次に、本発明の第二の態様として、ループプライマーを用いる場合を説明する。この場合、前記ＦＰ領域とＬＦ領域は、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように規定される。同様に、前記ＢＰｃ領域と該ＬＢｃ領域は、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように規定される。これらの領域がこの条件を満たすように規定されるに伴って、他の領域も適切に規定され、プライマーはこれらの規定に従って設計される。
本第二の態様においても、ＦＰ領域とループプライマー領域とが大きく重複することによって、上記第一の態様と同様にハイブリダイゼーション効率の阻害が生じ得る。例えば図７（ａ）に示すように、プラス鎖の場合は、未反応のループプライマーＬＦｃが増幅産物中のＬＦ領域とアニールして２本鎖を形成し、プローブ核酸ＦＰｃとのハイブリダイゼーションを阻害する。即ち、上記阻害要因（ＩＩ）の影響を受ける。また、図７（ｂ）に示すようにマイナス鎖の場合は、未反応のループプライマーＬＦｃがプローブ核酸ＦＰとハイブリダイズしてしまい、増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションを阻害する。また、標的核酸の増幅が達成されない場合においても未反応のループプライマーとプローブ核酸とがハイブリダイズしてしまい、擬陽性の信号を検出してしまう可能性がある。即ち、上記阻害要因（Ｉ）の影響を受ける。
なお、図７においては、Ｆ２領域、ＦＰ領域、ＬＦ領域の順に配置した例を用いたが、Ｆ２領域、ＬＦ領域、ＦＰ領域の順に配置してもよい。
図８に、上記阻害要因をまとめた一覧を示した。図８（ａ）には、未反応プライマーがプローブ核酸に対して擬陽性を示す場合（阻害要因Ｉ）の相関関係を網掛けで表した。増幅産物中の標的核酸配列とインナープライマー（即ち、FIP及びBIPプライマー）中の配列、又はループプライマー（即ち、ＬＦｃ及びＬＢｃプライマー）の配列が同一鎖（即ち、プラス鎖同士又はマイナス鎖同士）の場合に阻害要因（Ｉ）が生じる。見方を変えると、プローブ核酸の配列とインナープライマーの配列、またはループプライマーの配列が逆鎖の場合である。
図８（ｂ）には、未反応プライマーがプローブ核酸と競合する場合（阻害要因II）の相関関係を網掛けで表した。増幅産物中の標的核酸の配列とインナープライマー中の配列、又はループプライマーの配列が逆鎖の場合に阻害要因（ＩＩ）が生じる。見方を変えると、プローブ核酸の配列とインナープライマー中の配列、またはループプライマーの配列が同一鎖の場合である。
以上記載したように、ＦＰ、Ｆ２、及びＬＦ領域、並びに、ＢＰ、Ｂ２、及びＬＢｃ領域が、何れかにおいて重複したとき、その重複部分が大きすぎるとハイブリダイゼーションを阻害する影響、又は効率を低下させる影響が生じる。本発明者らはこのような問題を見出し、鋭意研究の結果、下記の実施例に示すように、重複部分を１０塩基以下とすることによってこれらの影響が排除されるか又は許容範囲内とされることを見出した。
なお、重複部分が１０塩基以下であっても、残りの非重複部分の塩基数が少なすぎると影響を受けやすくなるため、非重複部分が１０塩基以上あることが望ましい。この非重複部分は、一本鎖ループ構造部分内に収まる限り何塩基であってもよく、標的核酸の配列、各プライマーと検出配列との関係に依存して適宜決定することができる。
図９に、標的核酸鎖のプラス鎖及びマイナス鎖のそれぞれについて、検出配列領域(ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）、インナープライマー配列領域(Ｆ１c+F2、B1c+B2）、ループプライマー配列領域(ＬＦｃ、ＬＢｃ）の設計パターンについて示した。（1）及び（2）は、Ｆ領域側に検出配列とループプライマーの両方を設計した場合である。（1）の場合、ＦＰ領域と、Ｆ２領域またはＬＦ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように設計する。
ＦＰ領域とＦ２領域またはＬＦ領域の重複部分を１０塩基以下とする理由は上述した通りである。例えば、検出配列がプラス鎖（ＦＰ）の場合、Ｆ２により阻害要因Ｉが生じ、ＬＦｃにより阻害要因ＩＩが生じ得る。検出配列がマイナス鎖（ＦＰｃ）の場合、ＬＦｃにより阻害要因Ｉが生じ、Ｆ２により阻害要因ＩＩが生じ得る。
なお、ＬＦ領域とＦ１領域の重複部分は、20塩基以下、より好ましくは10塩基以下とする。ＬＦ領域とＦ１領域の重なる塩基数が多いと、ループプライマーＬＦｃは、2本鎖になったＦ１-Ｆ１ｃ領域にアニールしなければならず、増幅効率が低くなるためである。
図９（2）の場合、ＦＰ領域とＬＦ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように設計する。ＦＰ領域とＬＦ領域の重複部分を１０塩基以下とする理由は上述した内容の通りである。例えば、検出配列がプラス鎖（ＦＰ）の場合、ＬＦｃにより阻害要因ＩＩが生じる。検出配列がマイナス鎖（ＦＰc）の場合、ＬＦｃにより阻害要因Ｉが生じる。
なお、ＦＰ領域とＦ１領域の重なる塩基数は15塩基未満、より好ましくは0塩基とする。ＦＰ領域とＦ１領域が15塩基以上重複する場合、マイナス鎖（ＦＰc）を検出する場合にはＦ１ｃにより阻害要因Ｉが生じる。また、2本鎖になったＦ１-Ｆ１ｃ領域にプローブ核酸がハイブリダイズしなくてはならず、ハイブリ効率が低下するためである。
また、Ｆ２領域とＬＦ領域の重なる塩基数は20塩基以下、より好ましくは10塩基以下とする。Ｆ２領域とＬＦ領域が20塩基を超えて重複すると、Ｆ２配列を含むFIPプライマーとループプライマーＬＦｃが該重複部分の配列において相補的であるため、プライマー同士で相互作用してしまう。その結果、本来アニールすべき増幅産物と反応しにくくなり増幅効率が低下するためである。
図９（３）は、Ｆ領域側にループプライマーを設計していない場合について示した。（
１）、（２）の場合と同様の理由により、ＦＰ領域とＦ２領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように設計される。また、ＦＰ領域とＦ１領域の重複部分が15塩基未満、より好ましく0塩基となるように設計する。
１）、（２）の場合と同様の理由により、ＦＰ領域とＦ２領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように設計される。また、ＦＰ領域とＦ１領域の重複部分が15塩基未満、より好ましく0塩基となるように設計する。
図９（４）は、Ｆ領域側に検出配列を設計していない場合について示した。（４）の場合は、Ｂ領域に検出配列を設計している（６）〜（８）と組み合わせることができる。（１）及び（２）の場合と同様の理由により、Ｆ２、ＬＦ、及びＦ１は、重複部分が20塩基以下、より好ましくは10塩基以下とする。
図９（５）は、Ｆ領域側にループプライマー及び検出配列を設計していない場合について示した。（５）の場合は、Ｂ領域に検出配列を設計している（６）〜（８）と組み合わせることができる。Ｆ２領域とＦ１領域は自己アニール効率を高めるために5塩基以上離れていることが好ましい。
Ｂ領域について示した図９（６）〜（１０）についても、Ｆ領域側の場合と同様である。検出配列を設計していない（９）及び（１０）については、Ｆ領域側に検出配列を設計している（１）〜（３）と組み合わせることができる。
標的核酸の配列によっては、図９の（１）、（２）、（６）及び（７）のように、検出配列領域とループプライマー配列領域を同一ループ内に設計すると、1本鎖ループ部分が長鎖になることで自己アニール効率が低下するため、増幅効率が低下する場合がある。この場合は、検出配列を含む側のループ部分にはループプライマーを設計せず、もう一方の側のループ部分にループプライマーを設計する方法が有効である。
さらに本発明の第三の態様として、LAMP法を用いて一塩基変異(一塩基多型)を検出する方法に関するプライマーの設計方法が提供される。LAMP法による増幅方法及びプローブ核酸を用いた検出方法は上記第一及び第二の態様と同様であるが、一塩基変異を検出する場合には、標的核酸の一塩基変異を示す部位がＦＰ及びＢＰの何れかの領域に含まれるよう設計する。即ち、標的核酸に対して、その５’末端側から順に、Ｆ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を規定し、且つ、その３’末端側から順に、Ｂ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を規定し、さらに、一塩基変異を含むＦＰ領域を、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分において規定する。或いは、一塩基変異を含むＢＰｃ領域を、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分において規定する。
本態様で用いられるプライマーは、上記第一の態様と同様である。ここで、第三の態様では、前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定する。或いは、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定する。これらの領域がこの条件を満たすように規定されるに伴って、他の領域も適切に規定され、プライマーはこれらの規定に従って設計される。
一塩基変異を検出する場合には、増幅が飽和に達した増幅産物を用いてプローブ核酸とハイブリダイズさせればよい。このとき、増幅産物中の一塩基変異部位における塩基によって、プローブ核酸とのハイブリダイズの有無が決定される。このように1塩基の相違に伴う相対的な信号の違いを見分ければ良いため、プライマー設計における制限は緩和される。
しかしながら、一塩基変異部位またはその相補鎖となる部位にインナープライマーまたは、ループプライマーを設計してしまうと、インナープライマーまたは、ループプライマーに含まれた型のゲノムが優先的に増幅してしまい、標的核酸本来の遺伝子型を反映した増幅産物ができない。
そこで、標的核酸中の一塩基変異(一塩基多型)部位には、インナープライマーまたはループプライマー配列領域が重複しないよう設計することが重要となる。よって、上記のような規定に従って領域が規定され、プライマーが設計される。
また、本発明の第四の態様として、上記第二の態様のようにループプライマーを用いて一塩基変異を検出する方法に関するプライマーの設計方法が提供される。
即ち、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を規定し、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を規定する。前記プライマーに加えて、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃを用いる。ここで、本発明の第四の態様では、前記ＬＦｃ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定する。また、該ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定する。これらの領域がこの条件を満たすように規定されるに伴って、他の領域も適切に規定され、プライマーはこれらの規定に従って設計される。
図１０に一塩基変異を検出する場合の、標的核酸のプラス鎖又はマイナス鎖における各領域の設計パターンを示した。図１０（１）及び（２）は、Ｆ領域側に検出配列とループプライマー領域配列の両方を設計した場合である。図１０（１）の場合、ＦＰまたはＦＰｃ領域に含まれる一塩基変異部位、またはその相補鎖部位にはＦ２領域又はとＬＦ領域が重複しないように設計する。即ち、Ｆ２領域は変異部位に隣接する塩基まではＦＰ領域と重なってもよい。同様に、ＬＦ領域は変異部位に隣接する塩基まではＦＰｃ領域と重なってもよい。
ＬＦ領域とＦ１領域は、20塩基以下の重複部分を有することが好ましく、10塩基以下の重複部分を有することがより好ましい。ＬＦ領域とＦ１領域の重複塩基数が多いと、ループプライマーＬＦｃが2本鎖になったＦ１-Ｆ１ｃ領域にアニールしなければならず、増幅効率が低くなるため上記の範囲が好ましい。
図１０（２）の場合は、ＦＰ領域に含まれる一塩基変異部位がＬＦ領域と重ならないように設計する。逆にいうと、ＬＦ領域は変異部位に隣接する塩基までＦＰ領域と重なってもよい。ＦＰ領域と、Ｆ１領域の重複部分は、15塩基未満であることが好ましく、0塩基であることがより好ましい。ＦＰ領域とＦ１領域の重複塩基数が多いほど、プローブが2本鎖になったF1-F1c領域にハイブリダイズしなければならず、ハイブリ効率が低下するため前記の範囲が好ましい。
Ｆ２領域とＬＦ領域の重複塩基数は、20塩基以下、より好ましくは10塩基以下とする。Ｆ２領域とＬＦ領域の重複塩基数が多いほど、インナープライマー内のＦ２配列とループプライマーＦＰｃ配列が互いに相補的となる配列部分が多くなり、プライマー同士で相互作用してしまう。その結果、本来アニールすべき標的核酸と反応しにくくなり増幅効率が低下するため前記の範囲が好ましい。
図１０（３）は、Ｆ領域側にループプライマーを設計していない場合である。図１０（１）及び（２）と同様に、Ｆ２領域は変異部位の手前までＦＰと重なってもよく、ＦＰ領域と、Ｆ１領域の重複塩基数については、15塩基未満、より好ましくは0塩基とする。
図１０（４）は、Ｆ領域側に検出配列を設計していない場合である。図１０（４）の場合は、Ｂ領域に検出配列を設計している図１０（６）〜（８）と組み合わせることができる。図１０（１）及び（２）の場合と同様に、Ｆ２とＬＦ、ＬＦとＦ１の重複塩基数は20塩基以下、より好ましくは10塩基以下とする。
図１０（５）は、Ｆ領域側にループプライマー及び検出配列を設計していない場合である。図１０（５）の場合は、Ｂ領域に検出配列を設計している図１０（６）〜（８）と組み合わせることができる。Ｆ２領域とＦ１領域は自己アニール効率を高めるために5塩基以上離れていることが好ましい。
図１０（６）〜（１０）は、Ｂ領域について示したものであり、Ｆ領域側の場合と同様である。検出配列を設計していない図１０（９）及び（１０）は、Ｆ領域側に検出配列を設計している図１０（１）〜（３）と組み合わせることができる。
一塩基変異を検出する場合にも、標的核酸の配列によっては、検出配列領域またはその相補鎖となる配列領域とループプライマー配列領域を同一ループ内に設計すると、1本鎖ループ部分が長鎖になり自己アニール効率が低下するため、増幅効率が低下することがある。この場合、検出配列を含むループ側には、ループプライマーを設計せずにループ部分を短くし、もう一方の検出配列を含まないループ側にループプライマーを設計する方法が有効である。
さらに、本発明の第五の態様において、標的核酸をLAMP法によって増幅し、プローブ核酸によって検出する方法が提供される。或いは、一塩基変異を含む標的核酸をLAMP法によって増幅し、プローブ核酸によって検出することによって、一塩基変異を検出する方法が提供される。この第五の態様においては、上記第一から第四の態様において設計されたプライマーを用いたLAMP法によって標的核酸を増幅し、その増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせて検出する。
ここで用いられるプローブ核酸は、上記の通り、検出配列（FP、FPc、BP、BPc）と相補的な配列を有する。プローブ核酸は、検出配列の何れか一つに対して用意されてもよいが、複数の検出配列に対して用意されてもよい。プローブ核酸は、溶液中に浮遊した状態であってもよいが、凝集担体などに固定されてもよく、或いは固相基体に固定されてもよい。
プローブ核酸は、未標識のものであってもよいが、検出方法に応じてCy5、Cy3、FITC、ローダミン等の蛍光物質で標識したものであってもよく、ルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル誘導体などの発光物質で標識したもの、ハプテンや酵素を標識したものであってもよい。また、基体にプローブ核酸を固定化させるためにアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、アビジン、ビオチン等の物質で修飾したものであってもよい。
プローブ核酸を固定する基体としては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、マイクロタイタープレート、ガラス、電極、磁石、ビーズ、プラスチック、ラテックス、合成樹脂、天然樹脂、光ファイバーなどが挙げられる。
さらに、プローブ核酸によってDNAチップを構成してもよい。DNAチップとは、ガラスやシリコンの基板上に高密度にプローブ核酸を固定化したもので、一度に多くの遺伝子の配列情報を調べることができるデバイスである。現在主流の方式である蛍光検出方式は、蛍光で標識したサンプル遺伝子をチップ上のプローブと反応させ、高感度な蛍光解析装置を使って検出する方式である。また別の検出方法として、電流検出方式のDNAチップも開発されている。これは、電極上に固定化したプローブ核酸と標的核酸をハイブリダイゼーションした後、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する挿入剤を添加し、挿入剤から得られる電気化学的な信号を測定する方法である。電気化学的なＤＮＡチップは標識が不要で検出に高価な装置が必要ないことから第二世代のＤＮＡチップとして期待されている（例えば、特開平5−199898号公報参照）。
二種以上のプローブ核酸を用いる場合には、検出方法に応じて、未標識のプローブと標識されたプローブ、固相に固定化されているプローブと固定化されていないプローブを同時に使用してもよい。例えば、捕獲用のプローブ核酸と検出用の標識プローブ核酸を使用するサンドイッチハイブリダイゼーションなどでは、標識プローブ核酸は溶液中に浮遊し検出配列とハイブリダイズするが、捕獲用のプローブ核酸は、溶液中に浮遊し検出配列とハイブリダイズした後に基体に固定化されるか、または、あらかじめ基体に固定化されていてもよい。
＜ハイブリダイゼーション反応条件＞
増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、プローブ核酸の種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
増幅産物とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、プローブ核酸の種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加しても良い。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めても良い。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
＜検出方法＞
プローブ核酸にハイブリダイズした増幅産物を検出する方法には、任意の方法を用いることができる。その具体例を以下に述べる。
プローブ核酸にハイブリダイズした増幅産物を検出する方法には、任意の方法を用いることができる。その具体例を以下に述べる。
第一の検出方法としては、核酸の2本鎖に結合する挿入剤を用いる方法を用いることができる。この方法では、プローブ核酸をアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基、ハプテン、アビジン、ビオチン等の物質で修飾し、固相に固定化させる。増幅産物と固相上に固定化されたプローブ核酸とをハイブリダイゼーションさせ、その後洗浄する。プローブ核酸と増幅産物とがハイブリダイズしたか否かは、2本鎖に結合した挿入剤の信号によって検出する。
挿入剤としては、光化学的な活性または電気化学的な活性があれば特に限定されない。例えば、エチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチシン、アクチノマイシンＤ、ドーノマイシン、マイトマイシンＣ、ヘキスト33342、ヘキスト33258、アクラルビシン、ＤＡＰＩ、アドリアマイシン、エピルビシン、アクラシノマイシン等を用いることができる。また、その他の使用可能な挿入剤としては、特開昭62-282599 号公報に記載されたものが挙げられる。
また、電極を用いて電気化学的変化を検出する場合には、上述の挿入剤自身が酸化還元反応に対して可逆的である物質の他に、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質を中心金属として含有する金属錯体、すなわちメタロインターカレーターを用いることができる。このようなメタロインターカレーターとしては、例えばトリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニュウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、タ−ピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニュウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニュウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体を挙げることができる。
さらに、電極を用いて遺伝子の検出を行なう場合には、電気化学発光を生じる挿入剤を利用することもできる。このような挿入剤は特に限定されるものではなく、例えば、ルミノ−ル、ルシゲニン、ピレン、ジフェニルアントラセンおよびルブレンを挙げることがで
きる。これらの挿入剤による電気化学発光は、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノ−ル、クロロフェノ−ルのようなフェノ−ル類もしくはナフト−ル類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
きる。これらの挿入剤による電気化学発光は、ホタルルシフェリン、デヒドロルシフェリンのようなルシフェリン誘導体、フェニルフェノ−ル、クロロフェノ−ルのようなフェノ−ル類もしくはナフト−ル類のようなエンハンサ−を用いることにより増強することが可能である。
光学的に活性な挿入剤の場合には、挿入剤単独の場合と、2本鎖に結合した場合との信号の差を吸光度、蛍光、発光、消光、蛍光偏光、円偏光二色性などの光学的な情報に基づく検出方法、あるいは、2本鎖に結合した挿入剤の吸収波長、蛍光波長、発光波長、消光波長の変化を検出する。電気化学的に活性な挿入剤の場合には、中心金属または挿入剤自身の酸化還元電流を測定することにより検出する。
第二の検出方法としては、捕獲用のプローブ核酸と標識した検出用のプローブ核酸をサンドイッチハイブリダイズさせる方法を用いることができる。捕獲用のプローブ核酸は、第一の検出方法に記載した方法により、固相上に固定化させる。検出核酸を標識する物質はその後に行われる検出方法に応じて決めることができる。例えば電極活物質、蛍光物質、発光物質、電気化学発光物質、酵素、酵素基質、ハプテン、抗原、抗体、放射性同位元素などで標識することができる。上記ハプテンのように直接信号を検出できないような物質は、酵素結合アビジンのような酵素結合抗ハプテン抗体を利用して酵素反応による物質の濁度、吸光度、蛍光、発光、消光、蛍光偏光、円偏光二色性のような光学的な情報により測定するか、もしくは電気活性を測定することにより間接的に遺伝子の検出を行う。
また、プローブ核酸がDNAチップを構成している場合は、蛍光検出方式と電流検出方式などにより検出することができる。
電流検出方式の場合には、一般的に第一の検出方法に従い、核酸の2本鎖に結合する挿入剤を用いて検出を行うガラスやシリコンの基板上に電極を配置し、その電極上にプローブ核酸を固定化する。電極の数および配置パターンは、当業者が必要に応じて適宜設計することができる。また、他の一般的な電気化学検出法と同じように対極や参照極を使用してもよい。
ここで使用される電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物を用いる事ができる。
続いて、標的核酸を電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせ、その後、電気化学的に活性な挿入剤を添加する。標的核酸と基板上のプローブ核酸とのハイブリダイゼーションは、挿入剤の電気化学的な信号から検出する。
電気化学的な測定は、例えば挿入剤が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、挿入剤に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。
2本鎖に入り込む挿入剤は電気化学的に活性な物質、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドーノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。
蛍光検出方式の場合には、第二の検出方法に従い、プローブ核酸をCy5、Cy3、FITC、ローダミン等の蛍光色素で標識し、標的核酸をサンドイッチハイブリさせる方法、および蛍光色素で標識したプライマーまたはｄNTPなどを用いることにより標的核酸を標識し、その後、固相に固定化したプローブ核酸とハイブリダイズする方法などがある。標的核酸と固相上のプローブ核酸との結合は、標識の種類に応じた適宜の検出装置を用いて行う。
＜検体試料＞
本発明が対象とする検体は特に限定される物ではなく、例えば、個体から採取した血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等を用いることができる。個体とは、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物であってもよい。これら検体試料から核酸成分の抽出を行い、標的核酸の検出試験に供される試料溶液を調製する。抽出方法は特に限定されないが、例えば、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
本発明が対象とする検体は特に限定される物ではなく、例えば、個体から採取した血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等を用いることができる。個体とは、ヒト、ヒト以外の動物及び植物、並びにウィルス、細菌、バクテリア、酵母およびマイコプラズマなどの微生物であってもよい。これら検体試料から核酸成分の抽出を行い、標的核酸の検出試験に供される試料溶液を調製する。抽出方法は特に限定されないが、例えば、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属社製）等を利用することも可能である。
＜プライマー＞
LAMP反応では、インナープライマーからの核酸合成の方が、アウタープライマーからの合成より前に開始される必要があるため、インナープライマーとアウタープライマーの融解温度(Tm)、量比については、それぞれインナープライマーの方が、アウタープライマーと比較して融解温度(Tm)を高く、量比を高く設定することにより、効率的に反応を行うことができる。融解温度(Tm)について詳しくは、(F3‐F3c間の及びB3‐B3c間の融解温度)≦(F2‐F2c間の及びB2‐B2c間の融解温度)≦(F1‐F1c間の及びB1‐B1c間の融解温度)と表すことができる。(F2‐F2c間の及びB2‐B2c間の融解温度)≦(F1‐F1c間の及びB1‐B1c間の融解温度)としたのは、Ｆ２またはR2がループ部分にアニールするよりも先にF1‐F1c間の及びB1‐B1c間の分子内アニールを優先的に行わせるためである。量比について詳しくは、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも2〜50倍、好ましくは4〜25倍に設定することができる。
LAMP反応では、インナープライマーからの核酸合成の方が、アウタープライマーからの合成より前に開始される必要があるため、インナープライマーとアウタープライマーの融解温度(Tm)、量比については、それぞれインナープライマーの方が、アウタープライマーと比較して融解温度(Tm)を高く、量比を高く設定することにより、効率的に反応を行うことができる。融解温度(Tm)について詳しくは、(F3‐F3c間の及びB3‐B3c間の融解温度)≦(F2‐F2c間の及びB2‐B2c間の融解温度)≦(F1‐F1c間の及びB1‐B1c間の融解温度)と表すことができる。(F2‐F2c間の及びB2‐B2c間の融解温度)≦(F1‐F1c間の及びB1‐B1c間の融解温度)としたのは、Ｆ２またはR2がループ部分にアニールするよりも先にF1‐F1c間の及びB1‐B1c間の分子内アニールを優先的に行わせるためである。量比について詳しくは、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも2〜50倍、好ましくは4〜25倍に設定することができる。
＜プライマー長＞
LAMP反応で使用される6種のプライマーの鎖長は、10〜100塩基が好ましい。インナープライマーは、2つの領域を結合したプライマーであるが、ここでは各領域の鎖長を示している。10塩基以上とは、プライマーが特異性を維持しながら鋳型にアニールするために必要な長さである。また、あまりにも長い塩基を化学合成で製造するのは困難であることから前記のような鎖長が望ましい。
LAMP反応で使用される6種のプライマーの鎖長は、10〜100塩基が好ましい。インナープライマーは、2つの領域を結合したプライマーであるが、ここでは各領域の鎖長を示している。10塩基以上とは、プライマーが特異性を維持しながら鋳型にアニールするために必要な長さである。また、あまりにも長い塩基を化学合成で製造するのは困難であることから前記のような鎖長が望ましい。
1本鎖ループ部分となるＦ２ｃ領域からＦ１ｃ領域までの距離、およびB2c領域からB1c領域までの塩基数は、0〜120塩基より望ましくは、5〜70塩基であることが好ましい。この数値には、Ｆ２ｃ、Ｂ２ｃ領域は含まれていない。1本鎖ループ部分が極端に近すぎるまたは遠すぎると自己アニールが効率的に行われないため、前記のような鎖長が望ましい。
Ｆ１−B1間(Ｆ１、Ｂ１領域を含まない)の塩基数は0塩基でもよいが、10塩基以上間隔をあけるほうがより好ましい。F1-B1間が狭い場合、増幅が不安定化する場合がある。
F2-B2間(Ｆ２、B2領域を含む)の塩基数は、鎖置換型ポリメラーゼの活性にもよるが、700塩基以下、好ましくは500塩基以下であることが好ましい。
＜DNAポリメラーゼ＞
鎖置換型DNAポリメラーゼには、Bst DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(exo-)DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent(exo-) DNAポリメラーゼ、などがあげられるが、これ以外にも特許第3313358に記載のDNAポリメラーゼが使用できる。
鎖置換型DNAポリメラーゼには、Bst DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(exo-)DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent(exo-) DNAポリメラーゼ、などがあげられるが、これ以外にも特許第3313358に記載のDNAポリメラーゼが使用できる。
＜LAMP反応条件＞
LAMP反応条件について、温度、pHは使用するDNAポリメラーゼ酵素に従い、その活性が好適となる条件に設定する。また、酵素活性、核酸の融解温度(Tm)調整のために塩類が適宜添加される。例えば、KCl、NaCl、(NH4)2SO4などが挙げられる。さらに、融解温度(Tm)の調整剤としてベタインやDMSOなどが、酵素を保護する成分として、ウシ血清アルブミンや糖類が使用される。詳しくは、特許第3313358を参照されたい。
LAMP反応条件について、温度、pHは使用するDNAポリメラーゼ酵素に従い、その活性が好適となる条件に設定する。また、酵素活性、核酸の融解温度(Tm)調整のために塩類が適宜添加される。例えば、KCl、NaCl、(NH4)2SO4などが挙げられる。さらに、融解温度(Tm)の調整剤としてベタインやDMSOなどが、酵素を保護する成分として、ウシ血清アルブミンや糖類が使用される。詳しくは、特許第3313358を参照されたい。
以下、実施例を用いて本発明を具体的に説明する。
［実施例1］インナープライマーによる擬陽性信号の検出
＜検出配列＞
本実施例では、サンプル用核酸としてヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、且つ、検出配列をFIPプライマーのＦ２配列と（i）まったく重ならない設計、（ii）5塩基重なる設計、（iii）10塩基重なる設計、（iv）15塩基重なる設計、の計4種の検出配列を設計した（図11）。
［実施例1］インナープライマーによる擬陽性信号の検出
＜検出配列＞
本実施例では、サンプル用核酸としてヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、且つ、検出配列をFIPプライマーのＦ２配列と（i）まったく重ならない設計、（ii）5塩基重なる設計、（iii）10塩基重なる設計、（iv）15塩基重なる設計、の計4種の検出配列を設計した（図11）。
（i）AGGAGCTGACCAGTGAAGAAAGTG
（ii）GGGGGAGGAGCTGACCAG
（iii）ATGTGGGGGGAGGAGCTG
（iv）TGAAGATGTGGGGGGAGG
＜プライマー＞
本実施例で用いた合成ヌクレオチドプライマーを以下に示した。また図11に、ヒトMTHFR遺伝子における各プライマーの配列部分を示した。ここで、FIPプライマーはF1c部分とF2部分とを含み、BIPプライマーはB1c部分とB2部分とを含む。それらの間は任意の配列を挿入してもよいし、挿入しなくてもよい。なお図11においては、Ｆ領域ではcが付加された部分（即ちF1c）は図11に示した配列の逆鎖を用い、反対にＢ領域ではcが付加されない部分（即ちB2及びB3）が図11に示した配列の逆鎖を用いることを意味する。
（ii）GGGGGAGGAGCTGACCAG
（iii）ATGTGGGGGGAGGAGCTG
（iv）TGAAGATGTGGGGGGAGG
＜プライマー＞
本実施例で用いた合成ヌクレオチドプライマーを以下に示した。また図11に、ヒトMTHFR遺伝子における各プライマーの配列部分を示した。ここで、FIPプライマーはF1c部分とF2部分とを含み、BIPプライマーはB1c部分とB2部分とを含む。それらの間は任意の配列を挿入してもよいし、挿入しなくてもよい。なお図11においては、Ｆ領域ではcが付加された部分（即ちF1c）は図11に示した配列の逆鎖を用い、反対にＢ領域ではcが付加されない部分（即ちB2及びB3）が図11に示した配列の逆鎖を用いることを意味する。
MTHFR F3プライマー GCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC
MTHFR FIPプライマー CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG（F1c）-GCTGCTGAAGATGTGGGGGG(F2)
MTHFR B3プライマー GCACAGGATGGGGAAGTC
MTHFR BIPプライマー GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)-AGCTGGGGTCAGGCC(B2)
MTHFR FIPプライマー CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG（F1c）-GCTGCTGAAGATGTGGGGGG(F2)
MTHFR B3プライマー GCACAGGATGGGGAAGTC
MTHFR BIPプライマー GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)-AGCTGGGGTCAGGCC(B2)
＜LAMP反応液＞
以下に示す条件により調製したヒトゲノム又はマウスゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を、電流検出方式を用いて検出した。
以下に示す条件により調製したヒトゲノム又はマウスゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を、電流検出方式を用いて検出した。
LAMP反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純粋 5.5μL
Bst DNA ポリメラーゼ 1μL
バッファー 12.5μL
Tris・HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
Tween20 0.2%
Betaine 1.6M
DNTP 2.8mM
F3-プライマー(10μM) 0.5μL
B3-プライマー(10μM) 0.5μL
FIP-プライマー(20μM) 2μL
BIP-プライマー(20μM) 2μL
30 ng/μl 鋳型 (精製ヒトゲノム又は精製マウスゲノム) 1μL
総量 25μL
Bst DNA ポリメラーゼ 1μL
バッファー 12.5μL
Tris・HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
Tween20 0.2%
Betaine 1.6M
DNTP 2.8mM
F3-プライマー(10μM) 0.5μL
B3-プライマー(10μM) 0.5μL
FIP-プライマー(20μM) 2μL
BIP-プライマー(20μM) 2μL
30 ng/μl 鋳型 (精製ヒトゲノム又は精製マウスゲノム) 1μL
総量 25μL
＜LAMP法による増幅反応＞
ヒトゲノム、マウスゲノムの2種類の鋳型と、コントロールとしてゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したものを用い、上記で示した組成のLAMP反応液で63℃、120分反応させた。増幅産物について、アガロース電気泳動で確認したところ、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、増幅に伴うバンドが確認できたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については増幅バンドが得られなかった。増幅後の溶液についても、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、白色沈殿がみられたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については白色沈殿が見られなかった。白色沈殿とは、LAMP増幅が達成されると、増幅の過程で生成される副産物、ピロリン酸マグネシウムにより溶液中に見られる現象である。
ヒトゲノム、マウスゲノムの2種類の鋳型と、コントロールとしてゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したものを用い、上記で示した組成のLAMP反応液で63℃、120分反応させた。増幅産物について、アガロース電気泳動で確認したところ、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、増幅に伴うバンドが確認できたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については増幅バンドが得られなかった。増幅後の溶液についても、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、白色沈殿がみられたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については白色沈殿が見られなかった。白色沈殿とは、LAMP増幅が達成されると、増幅の過程で生成される副産物、ピロリン酸マグネシウムにより溶液中に見られる現象である。
これらの結果より、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については特異的な増幅反応が行われていること、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については、増幅反応は行われていないことが確認された。
＜プローブ核酸固定化電極の作製＞
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
ネガティブ プローブ GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA
ポジティブ プローブ（i）CACTTTCTTCACTGGTCAGCTCCT
ポジティブ プローブ（ii）CTGGTCAGCTCCTCCCCC
ポジティブ プローブ（iii）CAGCTCCTCCCCCCACAT
ポジティブ プローブ（iv）CCTCCCCCCACATCTTCA
ポジティブ プローブ（i）（ii）（iii）（iv）は、5’SH修飾のマイナス鎖プローブを用いた。ネガティブ プローブは、MTHFR遺伝子配列とは無関係な配列を示す5’SH修飾のプローブを使用した。
ポジティブ プローブ（i）CACTTTCTTCACTGGTCAGCTCCT
ポジティブ プローブ（ii）CTGGTCAGCTCCTCCCCC
ポジティブ プローブ（iii）CAGCTCCTCCCCCCACAT
ポジティブ プローブ（iv）CCTCCCCCCACATCTTCA
ポジティブ プローブ（i）（ii）（iii）（iv）は、5’SH修飾のマイナス鎖プローブを用いた。ネガティブ プローブは、MTHFR遺伝子配列とは無関係な配列を示す5’SH修飾のプローブを使用した。
プローブの金電極への固定化は、チオールと金との強い化学結合性を利用して行った。末端をチオール修飾したプローブ溶液を金電極上にスポットし、25℃で１時間静置後、1mMメルカプトヘキサノール溶液に浸し、0.2×SSC溶液で洗浄した。スポットは、同一プローブについて、3電極ずつ割り当てた。洗浄後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極基板とした。
＜電極配置＞
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ（i）
7−9電極 ポジティブ プローブ（ii）
10-12電極 ポジティブ プローブ（iii）
13-15電極 ポジティブ プローブ（iv）
＜LAMP反応溶液の調製およびハイブリダイゼーション＞
反応液は、上記の組成で調整したヒトゲノムを鋳型に増幅した産物、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物、計3種類に終濃度2×SSCの塩を添加した。また、コントロールとして終濃度2×SSCのみの溶液も調製した。これらの溶液を上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上にスポットし、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に、この電極を15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ（i）
7−9電極 ポジティブ プローブ（ii）
10-12電極 ポジティブ プローブ（iii）
13-15電極 ポジティブ プローブ（iv）
＜LAMP反応溶液の調製およびハイブリダイゼーション＞
反応液は、上記の組成で調整したヒトゲノムを鋳型に増幅した産物、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物、計3種類に終濃度2×SSCの塩を添加した。また、コントロールとして終濃度2×SSCのみの溶液も調製した。これらの溶液を上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上にスポットし、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に、この電極を15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
＜結果＞
図12に示すように、コントロールである2×SSC溶液からは、ネガティブプローブ（NP）を固定化した電極からの電流値と比較し、ポジティブプローブ(i)〜(iv)を固定化した電極からの信号増加は見られなかった。一方、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物からは、ポジティブプローブ(i)〜(iv)の全てからハイブリダイズに伴う信号が検出された。
図12に示すように、コントロールである2×SSC溶液からは、ネガティブプローブ（NP）を固定化した電極からの電流値と比較し、ポジティブプローブ(i)〜(iv)を固定化した電極からの信号増加は見られなかった。一方、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物からは、ポジティブプローブ(i)〜(iv)の全てからハイブリダイズに伴う信号が検出された。
マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物からは、増幅反応は起きていないにもかかわらず、Ｆ２領域と15塩基重なるポジティブプローブ（iv）から擬陽性の信号が検出された。また、10塩基重なるポジティブプローブ（iii）、5塩基重なるポジティブプローブ（ii）、0塩基重なるポジティブプローブ（i）と重なる部分を少なくなるにつれて擬陽性の信号は消失した。
これらの結果から、1本鎖ループ上における検出配列とインナープライマーの配列が重複することによって、偽陽性の信号が検出されることが示された。これは、検出配列と相補的な配列を示すプローブ核酸が溶液中のインナープライマーとハイブリダイズすることによるものと考えられる。重複部分が１５塩基であると、偽陽性の信号が明確に検出され、正確な検出結果が得られないことが明らかになった。
［実施例2］ループプライマーによる擬陽性信号の検出
＜検出配列＞
本実施例では、実施例1と同じくサンプル用核酸としてヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計した。検出配列は、ループプライマーＬＦｃの配列と(v)まったく重ならない設計、(vi)5塩基重なる設計、(vii)10塩基重なる設計、(viii)15塩基重なる設計、計4種の検出配列を設計した（図13）。
＜検出配列＞
本実施例では、実施例1と同じくサンプル用核酸としてヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計した。検出配列は、ループプライマーＬＦｃの配列と(v)まったく重ならない設計、(vi)5塩基重なる設計、(vii)10塩基重なる設計、(viii)15塩基重なる設計、計4種の検出配列を設計した（図13）。
(v)TTTCTTCACTGGTCAGCTCCT
(vi)GACACTTTCTTCACTGGTCAG
(vii)TCAAAGACACTTTCTTCACTG
(viii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT
1）＜プライマー＞
本実施例で用いた合成ヌクレオチドプライマーを以下に示した。また図13に、ヒトMTHFR遺伝子における各プライマーの配列部分を示した。ここで、FIPプライマーはF1c部分とF2部分とからなり、BIPプライマーはB1c部分とB2部分とからなる。配列部分の表記方法は実施例１と同様である。
(vi)GACACTTTCTTCACTGGTCAG
(vii)TCAAAGACACTTTCTTCACTG
(viii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT
1）＜プライマー＞
本実施例で用いた合成ヌクレオチドプライマーを以下に示した。また図13に、ヒトMTHFR遺伝子における各プライマーの配列部分を示した。ここで、FIPプライマーはF1c部分とF2部分とからなり、BIPプライマーはB1c部分とB2部分とからなる。配列部分の表記方法は実施例１と同様である。
MTHFR F3プライマー GCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC
MTHFR FIPプライマー CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG（F1c）-GCTGCTGAAGATGTGGGGGG(F2)
MTHFR B3プライマー GCACAGGATGGGGAAGTC
MTHFR BIPプライマー GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)--AGCTGGGGTCAGGCC(B2)
MTHFR LFcプライマー GTAAAGAACAAAGACTTCAAAGACAC
MTHFR LBcプライマー CCCTGGTTCATCCCCTG
MTHFR FIPプライマー CGGTTTGGTTCTCCCGAGAG（F1c）-GCTGCTGAAGATGTGGGGGG(F2)
MTHFR B3プライマー GCACAGGATGGGGAAGTC
MTHFR BIPプライマー GTGAGTGATGCTGGAGTGGG(B1c)--AGCTGGGGTCAGGCC(B2)
MTHFR LFcプライマー GTAAAGAACAAAGACTTCAAAGACAC
MTHFR LBcプライマー CCCTGGTTCATCCCCTG
＜LAMP反応液＞
以下に示す条件により調製したヒトゲノムまたはマウスゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。
以下に示す条件により調製したヒトゲノムまたはマウスゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。
LAMP反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純粋 1.5μL
Bst DNA ポリメラーゼ 1μL
バッファー 12.5μL
Tris・HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
Tween20 0.2%
Betaine 1.6M
DNTP 2.8mM
F3-プライマー(10μM) 0.5μL
B3-プライマー(10μM) 0.5μL
FIP-プライマー(20μM) 2μL
BIP-プライマー(20μM) 2μL
ＬＦｃプライマー (10μM) 2μL
ＬＢｃプライマー (10μM) 2μL
30ng/μl 鋳型 (purified ヒトゲノム or purified マウスゲノム) 1μL
総量 25μL
Bst DNA ポリメラーゼ 1μL
バッファー 12.5μL
Tris・HCl pH8.0 40mM
KCl 20mM
MgSO4 16mM
(NH4)2SO4 20mM
Tween20 0.2%
Betaine 1.6M
DNTP 2.8mM
F3-プライマー(10μM) 0.5μL
B3-プライマー(10μM) 0.5μL
FIP-プライマー(20μM) 2μL
BIP-プライマー(20μM) 2μL
ＬＦｃプライマー (10μM) 2μL
ＬＢｃプライマー (10μM) 2μL
30ng/μl 鋳型 (purified ヒトゲノム or purified マウスゲノム) 1μL
総量 25μL
＜LAMP法による増幅反応＞
ヒトゲノム、マウスゲノムの2種類の鋳型と、増幅のコントロールとしてゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したものを用いた。図14（Ａ）は、４種の基本的なプライマー（F3-プライマー、B3-プライマー、FIP-プライマー、BIP-プライマー）に加えて２種のループプライマー（ＬＦｃプライマー、ＬＢｃプライマー）を2)に記載の組成の通りに用いた。図１４（Ｂ）は、6種類のプライマーからＬＦｃプライマーのみを除いた5種類のプライマーを上記に記載の組成の通りに添加し、ＬＦｃプライマーの変わりに滅菌水を添加した。図１４（Ｃ）は、6種類のプライマーからＬＦｃプライマー及びＬＢｃプライマーを除いた4種類のプライマーを上記に記載の組成の通りに添加し、ＬＦｃプライマー及びＬＢｃプライマーの変わりに滅菌水を添加した。
ヒトゲノム、マウスゲノムの2種類の鋳型と、増幅のコントロールとしてゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したものを用いた。図14（Ａ）は、４種の基本的なプライマー（F3-プライマー、B3-プライマー、FIP-プライマー、BIP-プライマー）に加えて２種のループプライマー（ＬＦｃプライマー、ＬＢｃプライマー）を2)に記載の組成の通りに用いた。図１４（Ｂ）は、6種類のプライマーからＬＦｃプライマーのみを除いた5種類のプライマーを上記に記載の組成の通りに添加し、ＬＦｃプライマーの変わりに滅菌水を添加した。図１４（Ｃ）は、6種類のプライマーからＬＦｃプライマー及びＬＢｃプライマーを除いた4種類のプライマーを上記に記載の組成の通りに添加し、ＬＦｃプライマー及びＬＢｃプライマーの変わりに滅菌水を添加した。
LAMP反応は、63℃で30分、60分、90分、120分反応させた。実施例1と同様に、増幅産物について、アガロース電気泳動で確認したところ、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、3種類のプライマーセット全てで増幅に伴うバンドが確認できたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については3種類のプライマーセット全てで増幅バンドが得られなかった。増幅後の溶液についても、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については、白色沈殿がみられたが、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については白色沈殿が見られなかった。これらの結果より、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物については特異的な増幅反応が行われていること、マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物については、増幅反応は行われていないことが確認された。
＜プローブ核酸固定化電極の作製＞
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
ネガティブ プローブ GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA
ポジティブ プローブ(v)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAA
ポジティブ プローブ(vi)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC
ポジティブ プローブ(vii)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA
ポジティブ プローブ(viii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT
ポジティブプローブ(v)〜(viii)は、5’SH修飾のプラス鎖プローブを用いた。ネガティブプローブについては、MTHFR遺伝子配列とは無関係な配列を示す5’SH修飾のプローブを使用した。プローブの金電極への固定化は、実施例1と同様の方法で行った。
ポジティブ プローブ(v)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAA
ポジティブ プローブ(vi)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC
ポジティブ プローブ(vii)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA
ポジティブ プローブ(viii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT
ポジティブプローブ(v)〜(viii)は、5’SH修飾のプラス鎖プローブを用いた。ネガティブプローブについては、MTHFR遺伝子配列とは無関係な配列を示す5’SH修飾のプローブを使用した。プローブの金電極への固定化は、実施例1と同様の方法で行った。
＜電極配置＞
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ(v)
7−9電極 ポジティブ プローブ(vi)
10-12電極 ポジティブ プローブ(vii)
13-15電極 ポジティブ プローブ(viii)
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ(v)
7−9電極 ポジティブ プローブ(vi)
10-12電極 ポジティブ プローブ(vii)
13-15電極 ポジティブ プローブ(viii)
＜LAMP反応溶液の調製およびハイブリダイゼーション＞
反応液は、鋳型としてヒトゲノム、マウスゲノム、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したもの3種類それぞれに対して上記に示したＡ、Ｂ及びＣの3種類のプライマーセットを用いて63℃で120分増幅した。増幅後、それぞれの反応液に終濃度2×SSCの塩を添加した。また、コントロールとして2×SSCの塩のみの溶液も調製した。これらの溶液を上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上にスポットし、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、電気化学測定は実施例1と同様の方法で行った。
反応液は、鋳型としてヒトゲノム、マウスゲノム、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加したもの3種類それぞれに対して上記に示したＡ、Ｂ及びＣの3種類のプライマーセットを用いて63℃で120分増幅した。増幅後、それぞれの反応液に終濃度2×SSCの塩を添加した。また、コントロールとして2×SSCの塩のみの溶液も調製した。これらの溶液を上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上にスポットし、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、電気化学測定は実施例1と同様の方法で行った。
＜結果＞
図14に示すように、コントロールである2×SSC溶液からは、ネガティブプローブを固定化した電極からの電流値と比較した、ポジティブプローブ(v)(vi)(vii)(viii)を固定化した電極からの信号増加は見られなかった。一方、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物からは、ポジティブプローブ(v)(vi)(vii)(viii)からハイブリに伴う信号が検出された。
図14に示すように、コントロールである2×SSC溶液からは、ネガティブプローブを固定化した電極からの電流値と比較した、ポジティブプローブ(v)(vi)(vii)(viii)を固定化した電極からの信号増加は見られなかった。一方、ヒトゲノムを鋳型に増幅した産物からは、ポジティブプローブ(v)(vi)(vii)(viii)からハイブリに伴う信号が検出された。
マウスゲノムを鋳型に増幅した産物、ゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した産物からは、増幅反応は起きていないにもかかわらず、検出配列がループプライマーＬＦｃの配列と15塩基重なるポジティブプローブ(viii)から擬陽性の信号が検出された。さらに、10塩基重なるポジティブプローブ(vii)、5塩基重なるポジティブプローブ(vi)、0塩基重なるポジティブプローブ(v)と、重複部分が少なくなるにつれ、擬陽性の信号は減少した。
これらの結果より、1本鎖ループ上に存在する検出配列とループプライマーの配列が重複すると、検出配列と相補的な配列を示すプローブ核酸と溶液中のループプライマーがハイブリダイズし、擬陽性の信号が検出されることが明らかになった。
また、図15に示すように、本実施例でＦ領域側に設計した検出配列と重複部分を持つループプライマーＬＦｃを含む6種類のプライマーで増幅したＡでは、上記に示すように擬陽性のシグナルが検出された。また、両ループプライマーＬＦｃ及びＬＢｃを添加せずに4種類のプライマーで増幅したＣでは、増幅効率が低く、飽和増幅に120分もの時間を要した。
一方で、検出配列を設計しなかったＢ領域のみにループプライマーＬＢｃプライマーを添加し、5種類のプライマーで増幅したＢでは、擬陽性は検出されず、60分で飽和増幅された。このことから、検出配列または検出配列の相補鎖となる配列とループプライマーを同一ループ内に設計できない場合は、検出配列または検出配列の相補鎖となる配列を含むループとは別方向のループにループプライマーを設計するという方法が、LAMP増幅効率の点、増幅産物検出の点から有効であることが示された。
［実施例3］ループプライマーによるプローブ核酸と検出配列のハイブリ反応阻害
＜検出配列＞
本実施例では、実施例2と同じくサンプル用核酸として、ヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、且つ、検出配列の相補鎖となる配列がループプライマーＬＦｃ配列と(ix)まったく重ならない設計、(x)5塩基重なる設計、(xi)10塩基重なる設計、(xii)15塩基重なる設計、の計4種の検出配列を設計した(図13)。実施例3で使用する検出配列は実施例2の場合とは、逆鎖（即ち、相補的な配列で向きが逆）の関係となる。
＜検出配列＞
本実施例では、実施例2と同じくサンプル用核酸として、ヒトMTHFR遺伝子を用いた。検出配列は、MTHFR LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、且つ、検出配列の相補鎖となる配列がループプライマーＬＦｃ配列と(ix)まったく重ならない設計、(x)5塩基重なる設計、(xi)10塩基重なる設計、(xii)15塩基重なる設計、の計4種の検出配列を設計した(図13)。実施例3で使用する検出配列は実施例2の場合とは、逆鎖（即ち、相補的な配列で向きが逆）の関係となる。
(ix)AGGAGCTGACCAGTGAAGAAA
(x)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC
(xi)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA
(xii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT
(x)CTGACCAGTGAAGAAAGTGTC
(xi)CAGTGAAGAAAGTGTCTTTGA
(xii)AAGAAAGTGTCTTTGAAGTCT
＜プライマー＞
実施例2で使用したものと同様のプライマーを用いた。
実施例2で使用したものと同様のプライマーを用いた。
＜LAMP反応液＞
以下に示す条件により調製したヒトゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。LAMP反応溶液は実施例2の反応液と同様の組成にした。
以下に示す条件により調製したヒトゲノムを鋳型とするLAMP反応液を、金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。その後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。LAMP反応溶液は実施例2の反応液と同様の組成にした。
＜LAMP法による増幅反応＞
ヒトゲノムを鋳型とし、Ａ．6種のプライマーを添加したLAMP反応液と、Ｂ．ＬＦｃプライマーのみ添加せず、残りの5種のプライマーを添加したLAMP反応液、Ｃ．ＬＦｃ及びＬＢｃプライマーを添加せず残りの4種のプライマーを添加したLAMP反応液とした。これらを63℃の反応液中で30分、60分、90分、120分反応させた。増幅産物については、アガロース電気泳動で確認した。さらに、LAMP反応液調製時にゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した溶液についても同時に電気泳動し、コンタミネーションが起きていないかを確認した。
ヒトゲノムを鋳型とし、Ａ．6種のプライマーを添加したLAMP反応液と、Ｂ．ＬＦｃプライマーのみ添加せず、残りの5種のプライマーを添加したLAMP反応液、Ｃ．ＬＦｃ及びＬＢｃプライマーを添加せず残りの4種のプライマーを添加したLAMP反応液とした。これらを63℃の反応液中で30分、60分、90分、120分反応させた。増幅産物については、アガロース電気泳動で確認した。さらに、LAMP反応液調製時にゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した溶液についても同時に電気泳動し、コンタミネーションが起きていないかを確認した。
＜プローブ核酸固定化電極の作製＞
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
ネガティブ プローブ GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA
ポジティブ プローブ(ix)TTTCTTCACTGGTCAGCTCCT
ポジティブ プローブ(x)GACACTTTCTTCACTGGTCAG
ポジティブ プローブ(xi)TCAAAGACACTTTCTTCACTG
ポジティブ プローブ(xii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT
ポジティブ プローブについては、3’SH修飾のマイナス鎖プローブを用いた。
ポジティブ プローブ(ix)TTTCTTCACTGGTCAGCTCCT
ポジティブ プローブ(x)GACACTTTCTTCACTGGTCAG
ポジティブ プローブ(xi)TCAAAGACACTTTCTTCACTG
ポジティブ プローブ(xii)AGACTTCAAAGACACTTTCTT
ポジティブ プローブについては、3’SH修飾のマイナス鎖プローブを用いた。
ネガティブ プローブ については、MTHFR遺伝子配列とは無関係な配列3’SH修飾のプローブを使用した。プローブの金電極への固定化は、実施例1と同様の方法で行った。スポットも同様に、同一プローブについて、3電極ずつ割り当てた。
＜電極配置＞
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ(ix)
7−9電極 ポジティブ プローブ(x)
10-12電極 ポジティブ プローブ(xi)
13-15電極 ポジティブ プローブ(xii)
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ プローブ(ix)
7−9電極 ポジティブ プローブ(x)
10-12電極 ポジティブ プローブ(xi)
13-15電極 ポジティブ プローブ(xii)
＜LAMP増幅産物の希釈およびハイブリダイゼーション＞
反応液は、ヒトゲノムを鋳型とし、上記に示したＡ及びＢのプライマーセットで63℃で30分及び60分増幅反応させた。この増幅産物について電気泳動したところ、30分増幅させた産物についてはＡ及びＢのプライマーセットは何れも、60分増幅させた産物と比較して増幅バンドが薄かった。この結果より、30分増幅させた産物については、飽和増幅に達していないことが確認された。
反応液は、ヒトゲノムを鋳型とし、上記に示したＡ及びＢのプライマーセットで63℃で30分及び60分増幅反応させた。この増幅産物について電気泳動したところ、30分増幅させた産物についてはＡ及びＢのプライマーセットは何れも、60分増幅させた産物と比較して増幅バンドが薄かった。この結果より、30分増幅させた産物については、飽和増幅に達していないことが確認された。
60分反応させたＡ及びＢの増幅産物、及び30分反応させたＡの増幅産物について、LAMP バッファーで段階希釈した。その後、30分反応させたＢの増幅産物と並べて電気泳動を行い、それぞれ同程度となる希釈率の溶液を選択し、これらの増幅産物の濃度を同程度に成るようにした。
その後、30分反応させたＢの増幅産物、およびLAMP バッファーで希釈した60分反応のＡ及びＢの増幅産物、30分反応させたＡの増幅産物のそれぞれに、終濃度2×SSCの塩を添加した。また、コントロールとして2×SSCのみの溶液も調製した。これらの溶液を、上記で作製したプローブ核酸固定化電極基板上にスポットし、35℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
＜結果＞
図16に示すように、60分反応と30分反応のＢの増幅産物については、ポジティブ プローブ(ix)(x)(xi)(xii)を固定化した電極よりほぼ同程度の信号増加が認められた。一方、60分反応と30分反応のAの増幅産物について、検出配列がループプライマーＬＦｃの配列と15塩基重なるポジティブ プローブ(xii)の信号増加は、60分反応のものと比較して30分反応のものが低かった。さらに、10塩基重なるポジティブ プローブ(xi)、5塩基重なるポジティブ プローブ(x)、0塩基重なるポジティブ プローブ(ix)と重複部分を少なくすることにより60分反応の信号増加と30分反応の信号増加はほぼ同程度となった。
図16に示すように、60分反応と30分反応のＢの増幅産物については、ポジティブ プローブ(ix)(x)(xi)(xii)を固定化した電極よりほぼ同程度の信号増加が認められた。一方、60分反応と30分反応のAの増幅産物について、検出配列がループプライマーＬＦｃの配列と15塩基重なるポジティブ プローブ(xii)の信号増加は、60分反応のものと比較して30分反応のものが低かった。さらに、10塩基重なるポジティブ プローブ(xi)、5塩基重なるポジティブ プローブ(x)、0塩基重なるポジティブ プローブ(ix)と重複部分を少なくすることにより60分反応の信号増加と30分反応の信号増加はほぼ同程度となった。
30分反応のＡの増幅産物は、60分反応のＡの増幅産物と比較して増幅反応が中途であり、未反応のＬＦｃプライマーがより多く残存している。これにより、未反応のＬＦｃプライマーが多く残存する溶液中では、固相上のプローブより溶液中のＬＦｃプライマーが優先的に1本鎖の検出配列にアニールしてしまい、プローブと検出配列のハイブリ効率が低下することが明らかとなった。
このように、検出配列の相補鎖となる配列と、1本鎖ループにアニールするプライマーの配列が重なると、溶液中に残存するプライマーがプローブ核酸と検出配列とのハイブリ反応を阻害してしまうため、正確な判定結果が得られないことが示された。また、このような影響は、本実施例で示したループプライマーだけでなく、1本鎖ループに結合するインナープライマーについても同様の結果となることが安易に予測される。
さらに、図17に示すように、本実施例でＦ領域側に設計した検出配列の相補鎖となる配列領域と重なる部分を持つループプライマーＬＦｃを含む6種類のプライマーで増幅したＡでは、上記に示すようにプローブ核酸と標的核酸のハイブリ阻害が認められた。また、両ループプライマーＬＦｃ及びＬＢｃを添加せずに4種類のプライマーで増幅したＣでは、増幅効率が低く、飽和増幅に120分もの時間を要した。
一方で、検出配列を設計しなかったＢ領域のみにループプライマーＬＢｃを添加し、5種類のプライマーで増幅したＢでは、ハイブリ阻害は起こらず60分で飽和増幅された。このことから、検出配列または検出配列の相補鎖となる配列とループプライマーを同一ループ内に設計できない場合は、検出配列または検出配列の相補鎖となる配列を含むループとは別方向のループにループプライマーを設計するという方法が、LAMP増幅効率の点、増幅産物検出の点から有効であることが示された。
［実施例4］1塩基変異部位にプライマーを設計した場合のLAMP増幅について
本実施例では、サンプル用核酸として、ヒト遺伝子N-アセチルトランスフェラーゼ2 (NAT2)を用い、NAT2遺伝子内に存在する857G/A一塩基変異を検出した(図18)。ヒトゲノムの鋳型は、シークエンスの結果より857G/Gホモ型、857A/Aホモ型、857G/Aヘテロ型とそれぞれ判明しているものを用いた。一塩基変異を含む検出配列は、NAT2 LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、以下に示す条件によりLAMP増幅させた産物を金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。洗浄を行った後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。
本実施例では、サンプル用核酸として、ヒト遺伝子N-アセチルトランスフェラーゼ2 (NAT2)を用い、NAT2遺伝子内に存在する857G/A一塩基変異を検出した(図18)。ヒトゲノムの鋳型は、シークエンスの結果より857G/Gホモ型、857A/Aホモ型、857G/Aヘテロ型とそれぞれ判明しているものを用いた。一塩基変異を含む検出配列は、NAT2 LAMP産物中の1本鎖ループ部分に設計し、以下に示す条件によりLAMP増幅させた産物を金電極上に固定化したプローブ核酸とハイブリダイゼーションさせた。洗浄を行った後、該LAMP増幅産物中に存在する検出配列を電流検出方式を用いて検出した。
＜検出配列＞
(xiii)ATAGTAAGGGATCCATCACCAGG
(xiv)AAATAGTAAGGGATTCATCACCAGGT
(xiii)ATAGTAAGGGATCCATCACCAGG
(xiv)AAATAGTAAGGGATTCATCACCAGGT
＜合成ヌクレオチドプライマー＞
NAT2 F3プライマー GTGGGCTTCATCCTCAC
NAT2 FIPプライマー AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC（F1c）-TAAAGACAATACAGATCTGGTCG(F2)
NAT2 B3プライマー TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
NAT2 BIPプライマー GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA(B1c)−GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC(B2)
NAT2 LFcプライマー AGTGAGAGTTTTAAACTCGACC
NAT2 LBc Ｇプライマー CTGGTGATGGATCCCTTAC
NAT2 LBc Ａプライマー CCTGGTGATGAATCCCTTAC
一塩基変異部位にループプライマーを設計したLBGプライマーとLBAプライマーについては、Tm値が同程度となるように鎖長を調整した。
NAT2 F3プライマー GTGGGCTTCATCCTCAC
NAT2 FIPプライマー AGCACTTCTTCAACCTCTTCCTC（F1c）-TAAAGACAATACAGATCTGGTCG(F2)
NAT2 B3プライマー TGATAATTAGTGAGTTGGGTGAT
NAT2 BIPプライマー GGGGAGAAATCTCGTGCCCAA(B1c)−GGGTTTATTTTGTTCCTTATTC(B2)
NAT2 LFcプライマー AGTGAGAGTTTTAAACTCGACC
NAT2 LBc Ｇプライマー CTGGTGATGGATCCCTTAC
NAT2 LBc Ａプライマー CCTGGTGATGAATCCCTTAC
一塩基変異部位にループプライマーを設計したLBGプライマーとLBAプライマーについては、Tm値が同程度となるように鎖長を調整した。
＜LAMP反応液＞
実施例2と同様の組成で行った。LBcプライマーについて、LBc ＧプライマーとLBc Ａプライマーの両プライマーを使用する場合は、LBc ＧプライマーとLBc Ａプライマーの濃度を各々半分にした。
実施例2と同様の組成で行った。LBcプライマーについて、LBc ＧプライマーとLBc Ａプライマーの両プライマーを使用する場合は、LBc ＧプライマーとLBc Ａプライマーの濃度を各々半分にした。
＜LAMP法による増幅反応＞
（Ｄ）857G/Gホモ型、（Ｅ）857A/Aホモ型を鋳型として、３種のループプライマーを除いた４種のプライマーを添加した反応液を調製した。
また、ヒトゲノム857G/Aヘテロ型を鋳型として、次の（Ｆ）〜（Ｉ）の反応液を調製した。（Ｆ）全てのループプライマーを含む7種のプライマーを添加、（Ｇ）LBc Ａプライマーを除く6種のプライマーを添加、（Ｈ）LcB ＧプライマーとLBc Ａプライマーを除く5種のプライマーを添加、（Ｉ）３種のループプライマー（LFc、LBc Ｇ、LBc Ａプライマー）を除く4種のプライマーを添加。それぞれの反応液を63℃の反応液中で30分、60分、90分、120分反応させた。
（Ｄ）857G/Gホモ型、（Ｅ）857A/Aホモ型を鋳型として、３種のループプライマーを除いた４種のプライマーを添加した反応液を調製した。
また、ヒトゲノム857G/Aヘテロ型を鋳型として、次の（Ｆ）〜（Ｉ）の反応液を調製した。（Ｆ）全てのループプライマーを含む7種のプライマーを添加、（Ｇ）LBc Ａプライマーを除く6種のプライマーを添加、（Ｈ）LcB ＧプライマーとLBc Ａプライマーを除く5種のプライマーを添加、（Ｉ）３種のループプライマー（LFc、LBc Ｇ、LBc Ａプライマー）を除く4種のプライマーを添加。それぞれの反応液を63℃の反応液中で30分、60分、90分、120分反応させた。
増幅産物については、アガロース電気泳動で確認した。さらに、LAMP反応液調製時にゲノムの代わりに滅菌超純粋を添加した溶液についても同時に電気泳動し、コンタミネーションが起きていないかを確認した。
＜プローブ核酸固定化電極の作製＞
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
プローブ核酸の塩基配列を以下に示す。
ネガティブ プローブ GACTATAAACATGCTTTCCGTGGCA
(xiii)ポジティブ G プローブ CCTGGTGATGGATCCCTTACTAT
(xiv)ポジティブ A プローブ ACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTT
ポジティブプローブについては、3’SH修飾のプラス鎖プローブを用いた。ネガティブプローブについては、NAT2遺伝子配列とは無関係な配列3’SH修飾のプローブを使用した。プローブの金電極への固定化は、実施例1と同様の方法で行った。スポットも同様に、同一プローブについて、3電極ずつ割り当てた。
(xiii)ポジティブ G プローブ CCTGGTGATGGATCCCTTACTAT
(xiv)ポジティブ A プローブ ACCTGGTGATGAATCCCTTACTATTT
ポジティブプローブについては、3’SH修飾のプラス鎖プローブを用いた。ネガティブプローブについては、NAT2遺伝子配列とは無関係な配列3’SH修飾のプローブを使用した。プローブの金電極への固定化は、実施例1と同様の方法で行った。スポットも同様に、同一プローブについて、3電極ずつ割り当てた。
＜電極配置＞
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ G プローブ
7−9電極 ポジティブ A プローブ
1−3電極 ネガティブ プローブ
4−6電極 ポジティブ G プローブ
7−9電極 ポジティブ A プローブ
＜LAMP反応溶液の調製およびハイブリダイゼーション＞
63℃で60分反応させた増幅産物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび、増幅産物ＤとＥを半量ずつ混合したものＤ＋Ｅに、終濃度2×SSCの塩を添加した。またコントールとして2×SSCのみの溶液も調整した。これらの溶液を、金電極上に固定化したプローブ核酸と55℃で20分ハイブリダイゼーションさせた。その後、0.2×SSCのバッファーで45℃、20分洗浄し、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
63℃で60分反応させた増幅産物Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび、増幅産物ＤとＥを半量ずつ混合したものＤ＋Ｅに、終濃度2×SSCの塩を添加した。またコントールとして2×SSCのみの溶液も調整した。これらの溶液を、金電極上に固定化したプローブ核酸と55℃で20分ハイブリダイゼーションさせた。その後、0.2×SSCのバッファーで45℃、20分洗浄し、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μＭ含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。
＜結果＞
図19に示すように、Ｄ．857G/Gホモ型、Ｅ．857A/Aホモ型を鋳型とし、ループプライマーを用いなかったLAMP産物は、それぞれＧプローブまたはＡプローブからの信号増加が認められた。また、DとEを混合し、人工的にヘテロ様の産物を作製したD+E産物については、Ｇプローブ、Ａプローブ両方からほぼ同程度の信号増加が認められた。
図19に示すように、Ｄ．857G/Gホモ型、Ｅ．857A/Aホモ型を鋳型とし、ループプライマーを用いなかったLAMP産物は、それぞれＧプローブまたはＡプローブからの信号増加が認められた。また、DとEを混合し、人工的にヘテロ様の産物を作製したD+E産物については、Ｇプローブ、Ａプローブ両方からほぼ同程度の信号増加が認められた。
857G/Aヘテロ型を鋳型として、LBc Ａプライマー、LBc Ｇプライマーを含む7種のプライマーを添加したＦは、LBc Ａプライマー、LBc ＧプライマーのTm値をほぼ同一にしたが、A型の信号が高く出た。このことから、G型、A型のプライマーの反応効率を均等にするのは困難であることが明らかになった。
また、LBc Ａプライマーを除き、LBc Ｇプライマーを含む6種のプライマーを添加したLAMP反応液Ｇは、ループプライマーの型を反映したG型の信号が検出され、A型の信号は殆ど検出されなかった。このことから、Ｇの増幅産物は、鋳型の型は殆ど反映されておらず、ループプライマーに導入した型の産物が優先して増幅されることが明らかになった。
一方、変異部位に重複するプライマーを用いなかったＨおよびＩについては、鋳型の型を正確に反映した信号を得ることができた。これらの結果より、鋳型の型を正確に反映した増幅産物を得るためには、多型(変異)部位にプライマーを設計してはならないことが示唆された。
また、図20に示すように、添加したプライマーと飽和増幅時間の関係について注目してみると、一塩基変異部位に重複せずに設計されたＦ領域側にアニールするループプライマーＬＢｃを添加したＨは、30分で飽和増幅に達した。一方、ループプライマーを添加しなかったＩは、飽和増幅に60分もの時間を要した。このことから、一塩基変異(一塩基変異)部位またはその相補鎖となる部位を含むループ内にループプライマーを設計できない場合は、一塩基変異(一塩基変異)部位またはその相補鎖となる部位を含むループとは別方向のループにループプライマーを設計するという方法が、LAMP増幅効率の点、増幅産物検出の点から有効であることが示された。
Claims (10)
- 標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させた増幅産物を、プローブ核酸とハイブリダイズさせることによって検出する方法に用いられる前記プライマーの設計方法であって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域、及び３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、且つ、前記ＦＰ領域と前記ＬＦ領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記ＬＢｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように、各領域を規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法。 - 標的核酸を複数種のプライマーを用いて増幅させ増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることにより前記標的核酸を検出する工程とを具備する標的核酸の検出方法であって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を有し、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であり、且つ、前記ＦＰ領域と前記ＬＦ領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記ＬＢｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であることを特徴とする、標的核酸の検出方法。 - 前記プローブ核酸が固相基体に固定されたことを特徴とする、請求項２に記載の検出方法。
- 前記固相基体がＤＮＡチップであることを特徴とする、請求項３に記載の検出方法。
- 一塩基変異を含む標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させ、該増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることによって該一塩基変異を検出する方法に用いられる、前記プライマーの設計方法であって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域、及び３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記一塩基変異を含むＦＰ領域を前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分において、及び／又は、前記一塩基変異を含むＢＰｃ領域を前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分において有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、且つ、前記ＬＦ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定してプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法。 - 一塩基変異を含む標的核酸を複数種のプライマーを用いて増幅させ増幅産物を得る工程と、
前記増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることにより前記標的核酸の一塩基変異を検出する工程とを具備する一塩基変異の検出方法であって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を有し、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分において一塩基変異を含むＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分において一塩基変異を含むＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないこと、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないこと、且つ、前記ＬＦ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないこと、及び／又は、前記ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないことを特徴とする、一塩基変異の検出方法。 - 前記プローブ核酸が固相基体に固定されたことを特徴とする、請求項６に記載の一塩基変異の検出方法。
- 前記固相基体がＤＮＡチップであることを特徴とする、請求項７に記載の一塩基変異の検出方法。
- 標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させた増幅産物を、プローブ核酸とハイブリダイズさせることによって検出する検出方法に用いられるアッセイキットであって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を有し、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記ＦＰ領域と前記Ｆ２領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記Ｂ２ｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように各領域を規定し、且つ、前記ＦＰ領域と前記ＬＦ領域、及び／又は、前記ＢＰｃ領域と前記ＬＢｃ領域が、少なくとも１０塩基以上の非重複部分を有し且つ重複部分が１０塩基以下であるように各領域を規定して設計された各プライマー、バッファー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、及びdNTPを具備するアッセイキット。 - 一塩基変異を含む標的核酸を複数のプライマーを用いて増幅させ、該増幅産物をプローブ核酸とハイブリダイズさせることによって該一塩基変異を検出する方法に用いられる、アッセイキットであって、
前記標的核酸が、５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域及びＦ１領域を有し、３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域及びＢ１ｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分において一塩基変異を含むＦＰ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分において一塩基変異を含むＢＰｃ領域を有し、さらに、前記Ｆ２領域からＦ１領域にかけての部分においてＬＦ領域を、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域からＢ１ｃ領域にかけての部分においてＬＢｃ領域を有し、
前記プローブ核酸が、
前記ＦＰ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＢＰｃ領域の配列と同じ塩基配列を有するプローブ核酸、
前記ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列を有し、且つ、該ＦＰ領域の配列と同じ塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｆ１領域の配列と同じ配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、及び、
前記ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ、該ＢＰｃ領域の配列に対して相補的な塩基配列に連続する配列中に含まれる前記Ｂ１ｃ領域の配列と相補的な配列が１０塩基以下であるプローブ核酸、
からなる群から選択される一種以上のプローブ核酸であり、
前記複数のプライマーが、３’末端側に前記Ｆ２領域と同じ配列を有し且つ５’末端側に前記Ｆ１領域と相補的な配列を有するFIPプライマー、前記Ｆ３領域と同じ配列から成るＦ３プライマー、３’末端側に前記Ｂ２ｃ領域と相補的な配列を有し且つ５’末端側に前記Ｂ１ｃ領域と同じ配列を有するBIPプライマー、及び、前記Ｂ３ｃ領域と相補的な配列から成るＢ３プライマー、並びに、前記ＬＦ領域と相補的な配列から成るループプライマーＬＦｃ及び／又は前記ＬＢｃ領域と同じ配列から成るループプライマーＬＢｃである場合に、
前記Ｆ２領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記Ｂ２ｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、且つ、前記ＬＦ領域が前記ＦＰ領域中の一塩基変異と重複しないように規定し、及び／又は、前記ＬＢｃ領域が前記ＢＰｃ領域中の一塩基変異と重複しないように規定して設計された各プライマー、バッファー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、及びdNTPを具備するアッセイキット。
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