CN113151408A - 一种等温环介导扩增方法及其应用 - Google Patents

一种等温环介导扩增方法及其应用 Download PDF

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雷洋
曾晓昕
史江伟
白佳委
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汪大明
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Abstract

本发明公开了一种等温环介导扩增方法及其应用，该等温环介导扩增方法，通过设计特异性引物：FIP引物、BIP引物、F3P引物、B3P引物增加扩增靶点，从而使核酸等温扩增过程中产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构，提高扩增效率，缩短反应时间，提高灵敏度。本发明提供的等温环介导扩增方法可以运用于多种病原微生物(例如甲流和新冠)的POCT快速检测，检测简单、快速，灵敏性高。

Description

一种等温环介导扩增方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种等温环介导扩增方法及其应用。
背景技术
环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术，可以在等温条件下一步完成，该方法于2000年由Notomi等建立，现已被广泛应用于病原微生物、胚胎性别鉴定、转基因相关检测等方面。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由Notomi开发的一种新颖的核酸扩增技术。该方法是在等温条件下(60-65℃)，分别利用一种链置换DNA聚合酶和识别靶基因6个区域的4条特异性引物，在几十分钟内快速、高效、特异地完成对靶DNA序列的扩增。2002年，Nagamine等在F1-F2和B1-B2之间引入二条环引物LoopF(简称LF)和Loop B(简称LB)，大大加速了整个链置换反应过程，提高了反应检测的敏感度，缩短了LAMP反应的时间，使得整个扩增反应在30分钟内即可完成。
如图1所示，LAMP技术中，针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和F1c区以及5’端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物，该四种引物为FIP引物、F3引物、BIP引物及B3引物。其中，FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的F1c区域序列相同。F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer)，由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c域与靶基因5’端的B1c区域序列相同。B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
如图2和图3所示，LAMP技术的扩增反应包括起始阶段和循环扩增阶段，其中，参照图2所示，起始阶段：内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成，合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新的双链DNA。以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链，并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构；
参照图3所示，在循环扩增阶段，在哑铃状结构中BstDNA聚合酶以3’末端的F1区域为起点，以自身作为扩增模板，进行DNA延伸合成；同时，内引物FIP的F2区域与环上单链F2c区域配对杂交，启动新一轮的链置换反应。同样，解离出来的单链DNA也会形成环状结构，内引物BIP的B2区与其B2c区配对结合，启动新一轮扩增。如此循环，茎环个数逐渐增加，最后的扩增产物是一系列大小不一的茎环结构和多环花椰菜结构的DNA片段混合物。
上述常规的等温环介导扩增方法存在扩增效率、反应速度及检测灵敏度有待进一步改善的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种扩增效率高、反应速度快且检测灵敏度更高的新型等温环介导扩增方法及其应用。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种等温环介导扩增方法，包括步骤：针对靶基因的6个不同区域设计特异性引物，所述特异性引物可以在恒温条件下顺利与靶基因模板结合，发生链置换扩增反应；其中：
所述特异性引物包括4条混合式引物，所述4条混合式引物如下:
FIP引物：由F1c区域和F2区域组成，F2区域与靶基因端的F2c区域互补，F1c区域与靶基因的F1c区域序列相同；
BIP引物：由B1c区域和B2区域组成，B2区域与靶基因的B2c区域互补，B1c区域与靶基因的B1c区域序列相同；
F3P引物：由F1c区域和F3区域组成，F3区域与靶基因的F3c区域互补，F1c区域与靶基因的Flc区域序列相同；
B3P引物：由B3区域和B1C区域组成，B3区域与靶基因的B3c区域互补，B1C区域与靶基因的B1c区域序列相同。
进一步地，所述特异性引物还包括2条非混合式引物，所述2条非混合式引物为环引物LF及环引物LB。
进一步地，所述特异性引物组合时的摩尔比为：FIP:B3P:LF＝4:1:1。
本发明的另一目的在于提供上述等温环介导扩增方法在非疾病诊断目的的病原微生物检测中的应用。
进一步地，所述病原微生物为H1N1流感病毒，所述特异性引物的序列为：
H1N1-F3P：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGTGGTCGAAACGTACGTTCTT；
H1N1-B3P：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTAGTCTACGCTGCAGTCCTC；
H1N1-FIP：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT-CTATCATCCCGTCAGGCC；
H1N1-BIP：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTA-GAGCGTGAACACAAATCCT；
H1N1-LF：CTCCCTTCTTGATCCC；
H1N1-LB：AGTGGTACCGAGATATGCA。
进一步地，应用于非疾病诊断目的的H1N1病毒的检测时，检测方法包括以下步骤：
S1、设计并合成如权利要求5所述的引物，配制引物混合液；
S2、配制LAMP反应体系，利用步骤S1得到的引物混合液将待测样本中的DNA模板进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化或者进行实时荧光检测。
进一步地，所述反应体系还包括：Bst DNA聚合酶和酚红指示剂。
进一步地，步骤S1中，引物混合液中，各引物的浓度为：H1N1-F3P：4μMol/L，H1N1-B3P：4μMol/L，H1N1-FIP：16μMol/L，H1N1-BIP：16μMol/L，H1N1-LF：4μMol/L，H1N1-LB：4μMol/L。
本发明的又一目的在于提供一种用于检测H1N1流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物的组合。
进一步的，该试剂盒还包含缓冲液和颜色指示剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：
1、本发明提供的等温环介导扩增方法，通过设计引物F3P和B3P增加扩增靶点，从而使扩增过程中产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构，提高扩增效率，缩短反应时间，提高灵敏度。
2、本发明提供的等温环介导扩增方法可以运用于多种病原微生物(例如甲流和新冠)的POCT快速检测，检测简单、快速，具有高灵敏性。
3、本发明提供的等温环介导扩增方法应用于甲流H1N1的检测时，最低检测限可达102copy/μL。
附图说明
图1：现有技术中常规环介导等温扩增方法中的LAMP反应引物与对应模板区域示意图；
图2：现有技术中常规环介导等温扩增方法中，哑铃状结构形成过程示意图；
图3：现有技术中环介导等温扩增反应的循环扩增阶段原理示意图；
图4：本发明提供的环介导等温扩增方法起始阶段的示意图；
图5：实施例1对照组与试验组的可视化检测结果示意图；
图6：实施例2对照组与试验组扩增效率的荧光实时监测示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种扩增效率高、反应速度快、检测灵敏度高的等温环介导扩增方法及其应用。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。
本发明提供了一种新型的等温环介导扩增方法，本发明针对靶基因片段的六个碱基区域(F3、F2、F1、B1c、B2c、B3c)设计特异性引物，所述特异性引物包括4条混合式引物，所述4条混合式引物如下:
FIP引物：由F1c区域和F2区域组成，F2区域与靶基因端的F2c区域互补，F1c区域与靶基因的F1c区域序列相同；
BIP引物：由B1c区域和B2区域组成，B2区域与靶基因的B2c区域互补，B1c区域与靶基因的B1c区域序列相同；
F3P引物：由F1c区域和F3区域组成，F3区域与靶基因的F3c区域互补，F1c区域与靶基因的Flc区域序列相同；
B3P引物：由B3区域和B1c区域组成，B3区域与靶基因的B3c区域互补，B1c区域与靶基因的B1c区域序列相同。
参照图1-图4所示，本发明LAMP反应的起始阶段原理与现有技术类似，但是由于引物的不同设计，背景技术中描述的常规等温环介导扩增方法在初始阶段只能产生一个茎环结构(哑铃状结构)，而本发明在扩增过程中会产生多倍数的能自我配对继而引发循环扩增的特殊核苷酸结构，具体的，参照图4，本发明可产生4个茎环结构，并且该种茎环结构的大量产生富集，使得随后的循环扩增引发几率显著增加(本方案的茎环结构，比常规LAMP提供更多引物结合位点)，继而使得扩增效率增加，反应速度加快，检测灵敏度提升。
进一步地，本发明的特异性引物还可以包括2条非混合式引物，所述2条非混合式引物为环引物LF及环引物LB，从而进一步加快LAMP反应速度。
进一步地，上述特异性引物组合时的摩尔比为：FIP:B3P:LF＝4:1:1。
本发明提供的等温环介导扩增方法可以用于在非疾病诊断目的的病原微生物检测，并进一步可制成检测相应的检测试剂盒等，该检测试剂盒可以包含引物组合物、BstDNA聚合酶、显色剂及缓冲液等。
实施例1：
本实施例提供了上述的等温环介导扩增方法应用于非疾病诊断目的的H1N1流感病毒检测上。
首先，本实施例利用H1N1的流感病毒的M基因，通过LAMP引物设计工具网站(https://lamp.neb.com/#！/)，具体地为，下载NCBI的Influenza A virus物种库上的H1N1流感病毒的M基因，通过MEGA等软件比对序列找到保守的区域，通过LAMP引物设计工具网站(https://lamp.neb.com/#！/)，最终设计筛选得到的用于实施本发明LAMP方法(试验组)的引物序列见表1。本实施例同时还以现有技术中常规LAMP方法作对照组试验，该对照试验的引物序列见表2。
表1实施例1中用于实施本发明方法的引物序列表
Figure BDA0003080696560000071
表2实施例1中用于对照试验的引物序列表
Figure BDA0003080696560000072
Figure BDA0003080696560000081
然后，人工合成表1和表2中的引物，备用。
再次，配制引物混合液，试验组引物混合液LAMP Primer Mix(10X)中，各引物的浓度为：H1N1-F3P：4μMol/L，H1N1-B3P：4μMol/L，H1N1-FIP：16μMol/L，H1N1-BIP：16μMol/L，H1N1-LF：4μMol/L，H1N1-LB：4μMol/L；
对照组引物混合液LAMP Primer Mix(10X)中，各引物的浓度为：H1N1-F3：2μMol/L，H1N1-B3：2μMol/L，H1N1-FIP：16μMol/L，H1N1-BIP：16μMol/L，H1N1-LF：4μMol/L，H1N1-LB：4μMol/L。
接着，配制反应体系，进行LAMP反应。反应体系为10X BST DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL，10mM dNTPs 3.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL,耐热逆转录酶0.5μL，LAMP Primer Mix(10X)2.5μL，酚红改良染料(生产供应商sigma)1μL，待测样本DNA模板1-9μL(本实施例选取1μL)，用dH2O补齐至25μL。将配好的反应体系放置金属浴中，恒温加热65℃。加热20分钟后，观察颜色变化。本检测终点可视化，反应前后颜色变化为：粉红色(反应前)变为黄色(反应后)。本实施例的试验组和对照组还分别进行了空白/阴性对比实验，也即反应体系中不包含待测样本模板(反应结果对应图5中的NTC组)。
本实验进行梯度试验，反应体系中Target DNA的质粒浓度依次为0(反应结果对应图5中的NTC组)，102copy/μL，103copy/μL，每个浓度同时进行两个平行(两个反应管)。图5示出了试验组(本发明提供的LAMP法)与对照组(现有常规LAMP法)的实验结果。由图5可以看出，对于HIN1病毒，对照组(现有常规LAMP法)的检测下限是质粒浓度103copy/μL,而试验组(本发明提供的LAMP法)在质粒浓度102copy/μL即发生变色，所以本发明提供的LAMP法可以提高检测下限(灵敏度)。
实施例2:
本实施例与实施例1的区别在于，如同实施例1相同的方案配制好引物混合物后，配制反应体系进行LAMP反应。
本实施例采用如下反应体系进行LAMP反应；10X BST DNA聚合酶反应缓冲液2.5μL，10mM dNTPs 3.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL,耐热逆转录酶0.5μL，LAMP Primer Mix(10X)2.5μL，，SYTO9染料(生产供应商themo)0.5μL，待测样本DNA模板1-9μL(本实施例具体选用的为1μL)，用dH2O补齐至25μL。本实施例目的在于采用荧光染料方法，实时监控不同的LAMP方法扩增效率，考察本发明提供的LAMP方法的扩增效率和反应时间。
本实施例进行LAMP反应的条件是：将配好的反应体系放置RT-PCR仪(型号SLAN-96S，生产供应商上海宏石公司)中，恒温加热65℃，设定扩增程序65℃(荧光采集)25s65cycle。。
图6示出了试验组(本发明提供的LAMP法)与对照组(现有常规LAMP法)的对比扩增曲线。两组实验(试验组和对照组)的Target DNA质粒浓度均为102copy/μL，由图6可知，在相同条件下，试验组(本发明提供的LAMP法)比对照组(现有常规LAMP法)更早起峰，说明了扩增效率更快；且试验组的CT值约为28.5，本实施例中一个循环为25秒，则试验组扩增反应时间共为11.8分钟，对照组CT值约为40.5，本实施例中一个循环为25秒，则对照组扩增反应时间共为16.9分钟。
本发明提供了一种新型的等温环介导扩增方法，该方法只需要恒温控制设备，在等温条件和工程酶BST酶作用下即可实现对RNA/DNA病原在一个反应管中一个步骤完成(即工程酶BST酶具有反转录酶，聚合酶，置换酶活性)。检测的结果判定可通过观察显色剂观察颜色变化、荧光标记等简单措施实现。本发明相对于现有的常规LAMP法，具有更高的灵敏度(从而对微量样本更有意义)和扩增速度(适用于POCT检测)。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
序列表
<110> 厦门健康工程与创新研究院
<120> 一种等温环介导扩增方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctgcaaag acactttcca gtggtcgaaa cgtacgttct t 41
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaggctctc atggaatggc tagtctacgc tgcagtcctc 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcctgcaaag acactttcca gtctatcatc ccgtcaggcc 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaggctctc atggaatggc tagagcgtga acacaaatcc t 41
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctcccttct tgatccc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagtggtacc gagatatgca 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtcgaaacg tacgttctt 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtctacgctg cagtcctc 18
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcctgcaaag acactttcca gtctatcatc ccgtcaggcc 40
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgaggctctc atggaatggc tagagcgtga acacaaatcc t 41
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tctcccttct tgatccc 17
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tagtggtacc gagatatgca 20

Claims (10)

1.一种等温环介导扩增方法，包括步骤：针对靶基因的6个不同区域设计特异性引物，所述特异性引物可以在恒温条件下顺利与靶基因模板结合，发生链置换扩增反应；其特征在于：
所述特异性引物包括4条混合式引物，所述4条混合式引物如下:
FIP引物：由F1c区域和F2区域组成，F2区域与靶基因端的F2c区域互补，F1c区域与靶基因的F1c区域序列相同；
BIP引物：由B1c区域和B2区域组成，B2区域与靶基因的B2c区域互补，B1c区域与靶基因的B1c区域序列相同；
F3P引物：由F1c区域和F3区域组成，F3区域与靶基因的F3c区域互补，F1c区域与靶基因的Flc区域序列相同；
B3P引物：由B3区域和B1C区域组成，B3区域与靶基因的B3c区域互补，B1C区域与靶基因的B1c区域序列相同。
2.如权利要求1所述的等温环介导扩增方法，其特征在于：所述特异性引物还包括2条非混合式引物，所述2条非混合式引物为环引物LF及环引物LB。
3.如权利要求1所述的等温环介导扩增方法，其特征在于：所述特异性引物组合时的摩尔比为：FIP:B3P:LF＝4:1:1。
4.一种如权利要求1或2或3所述的等温环介导扩增方法在非疾病诊断目的的病原微生物检测中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述病原微生物为H1N1流感病毒，所述特异性引物的序列为：
H1N1-F3P：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGTGGTCGAAACGTACGTTCTT；
H1N1-B3P：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTAGTCTACGCTGCAGTCCTC；
H1N1-FIP：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT-CTATCATCCCGTCAGGCC；
H1N1-BIP：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTA-GAGCGTGAACACAAATCCT；
H1N1-LF：CTCCCTTCTTGATCCC；
H1N1-LB：AGTGGTACCGAGATATGCA。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：应用于非疾病诊断目的的H1N1病毒的检测时，检测方法包括以下步骤：
S1、设计并合成如权利要求5所述的引物，配制引物混合液；
S2、配制LAMP反应体系，利用步骤S1得到的引物混合液将待测样本中的DNA模板进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化或者进行实时荧光检测。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述反应体系还包括：Bst DNA聚合酶和酚红指示剂。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤S1中，引物混合液中，各引物的浓度为：H1N1-F3P：4μMol/L，H1N1-B3P：4μMol/L，H1N1-FIP：16μMol/L，H1N1-BIP：16μMol/L，H1N1-LF：4μMol/L，H1N1-LB：4μMol/L。
9.一种用于检测H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如权利要求5所述的引物的组合。
10.根据权利要求9所述用于检测H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于：还包含缓冲液和颜色指示剂。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090117544A1 (en) * 2006-01-20 2009-05-07 Naoko Nakamura Method of designing primers for use in method of detecting target nucleic acid and assay kit
CN101962691A (zh) * 2010-11-01 2011-02-02 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 针对m基因检测甲型h1n1流感病毒2009变异株的核苷酸序列和试剂盒
CN103328629A (zh) * 2010-11-02 2013-09-25 因姆诺莱夫公司 针对大流行性甲型流感病毒h1n1的新型疫苗
CN104388581A (zh) * 2013-08-23 2015-03-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 新型等温多自配引发扩增技术(imsa)
CN105349526A (zh) * 2015-11-22 2016-02-24 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用
US20170107549A1 (en) * 2015-07-16 2017-04-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Accelerated isothermal amplification of dna
WO2018070659A1 (ko) * 2016-10-11 2018-04-19 주식회사 엠모니터 표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 lamp 기반의 단일염기 변화 검출 방법

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090117544A1 (en) * 2006-01-20 2009-05-07 Naoko Nakamura Method of designing primers for use in method of detecting target nucleic acid and assay kit
CN101962691A (zh) * 2010-11-01 2011-02-02 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 针对m基因检测甲型h1n1流感病毒2009变异株的核苷酸序列和试剂盒
CN103328629A (zh) * 2010-11-02 2013-09-25 因姆诺莱夫公司 针对大流行性甲型流感病毒h1n1的新型疫苗
CN104388581A (zh) * 2013-08-23 2015-03-04 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 新型等温多自配引发扩增技术(imsa)
US20170107549A1 (en) * 2015-07-16 2017-04-20 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Accelerated isothermal amplification of dna
CN105349526A (zh) * 2015-11-22 2016-02-24 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用
WO2018070659A1 (ko) * 2016-10-11 2018-04-19 주식회사 엠모니터 표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 lamp 기반의 단일염기 변화 검출 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈琳等: "环介导恒温扩增技术及其在病原检测中的应用", 《中国病原生物学杂志》 *

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