JP2010516284A

JP2010516284A - マイクロｒｎａの検出のための方法、組成物及びキット

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Publication number: JP2010516284A
Application number: JP2009547422A
Authority: JP
Inventors: ジョゼフゾルゲ、; レベッカマリナックス、
Original assignee: Stratagene California
Current assignee: Stratagene California
Priority date: 2007-01-26
Filing date: 2008-01-24
Publication date: 2010-05-20
Also published as: US20080182239A1; EP2106444A2; US8314220B2; WO2008092016A2; WO2008092016A3

Abstract

本発明は、試料中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出するための方法、核酸、組成物およびキットを提供する。該方法は、ｍＲＮＡ特異的プライマーを設計するステップと、ポリＡテールをｍｉＲＮＡに付加するステップと、逆転写および増幅を用いてｍｉＲＮＡを検出するステップとを含む。通常、該核酸、組成物およびキットは本発明の方法を実施するのに必要な成分の一部またはすべてを含む。

Description

本発明は、分子生物学分野に関する。更に詳細には、本発明は、ホモポリマーテーリング、逆転写及び増幅を用いたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子の検出に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、分裂酵母から高等生物に至る真核生物に内因性に発現する非タンパク質コード小ＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡは全遺伝子の最大３０％の発現を調節し、細胞分化、増殖、アポトーシス、抗ウイルス防御及び癌において役割を果たす。ｍｉＲＮＡは組織特異的かつ発達特異的発現パターンを有する。従って、これらの小ＲＮＡ分子は、生物学的プロセス、病状及び成長の解明において非常に興味深い。

ｍｉＲＮＡはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと称される比較的長いＲＮＡ分子としてｐｏｌＩＩ転写物として発現する。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは他のＲＮＡ転写物のように５’キャップ及びポリＡテールを有する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは核内にてヘアピンループ構造を形成し、次に、ヘアピン構造はヌクレアーゼであるＲＮＡＩＩＩＤｒｏｓｈａによってステムの基部において切断され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと称される二本鎖分子を形成する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはエクスポーチン５によって細胞質に輸送され、そこでＤｉｃｅｒによる切断によって短い（１７〜２５ヌクレオチド）二本鎖ＲＮＡ分子にプロセシングされる。次に、５’末端安定性が低いｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ鎖はＲＮＡ干渉サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合することができ、ｍｉＲＮＡとの相同性を有するｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）において結合することにより、または体部（ｂｏｄｉｅｓ）へのｍＲＮＡの輸送を導くことにより、ｍＲＮＡの調節を行うことができる。結合は、ｍｉＲＮＡと標的ＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）との間に１００％の相補性がある場合、標的ｍＲＮＡの切断を生じさせ、またはｍｉＲＮＡと標的ＲＮＡとの間に１００％未満の相補性がある場合、標的ｍＲＮＡに結合して翻訳を阻止し、若しくはｍｉＲＮＡに誘導された迅速な脱アデニル化によって開始されるｍＲＮＡ崩壊を導くことにより、（切断なしに）発現のダウンレギュレーションを生じさせる。ｍｉＲＮＡの有用な情報資源が、ｈｔｔｐ：／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／においてｍｉＲＮＡの登録を維持するＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅから得られる。ｍｉＲＢａｓｅＳｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅは、種々の情報源由来の公開ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列及びアノテーションを含む。ｍｉＲＢａｓｅＲｅｇｉｓｔｒｙは公開前に新規ｍｉＲＮＡ遺伝子に新規ｍｉＲＮＡの従来の命名法に従う独自の名称を付与する。ｍｉＲＢａｓｅＴａｒｇｅｔｓは動物における予測ｍｉＲＮＡ標的のための情報源である。データベースは頻繁に更新され、従って、有用なｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の包括的な情報源を提供する。

ｍｉＲＮＡはゲノム内のコード及び非コード配列に見出されている。ｍｉＲＮＡはそれらが位置する特定の遺伝子に関し、センスまたはアンチセンス方向に配向されていることも見出されている。加えて、ｍｉＲＮＡは２つ以上のｍｉＲＮＡが単一のｍＲＮＡ転写物に存在するポリシストロン性でもありうる。種々の細胞におけるｍｉＲＮＡの発現は１０００コピー未満から５０００００コピー超であると推定されている。

ｍｉＲＮＡファミリー遺伝子発現は空間的および時間的に調節される。この調節の理解に役立つように、多くの研究において急速に進化するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）ｍｉＲＮＡ遺伝子について検討してきた。これらのｍｉＲＮＡ遺伝子は、タンパク質遺伝子ファミリーの進化を促進するプロセスに類似したプロセスにて、ゲノムワイドな重複、縦列重複、分節重複、その後の分散及び多様化のプロセスから生じた。ｍｉＲＮＡファミリーの異なるメンバーの転写パターンについて研究するため、多数の発現データセットを検討した。空間的および時間的発現パターンの変化は重複ｍｉＲＮＡ遺伝子の配列多様化を伴い、進化するに従って重複コピーが新たな機能性を獲得することを示唆する（Ｍａｈｅｒ，Ｃ．，Ｌ．Ｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｗａｒｅ．２００６．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｍｉｃｒｏＲＮＡｆａｍｉｌｉｅｓｔｈｒｏｕｇｈｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｖｅｎｔｓ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１６：５１０−５１９）。

エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）における更なる研究では、異なるｍｉＲＮＡファミリーメンバーは異なる生理的機能に関与しうることを示し（Ａｂｂｏｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｅ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｅ．Ａ．Ｍｉｓｋａ，Ｎ．Ｃ．Ｌａｕ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｖ．Ａｍｂｒｏｓ．２００５．Ｔｈｅｌｅｔ−７ＭｉｃｒｏＲＮＡｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｍｉｒ−４８，ｍｉｒ−８４，ａｎｄｍｉｒ−２４１ｆｕｎｃｔｉｏｎｔｏｇｅｔｈｅｒｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｔｉｍｉｎｇｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ９：４０３−４１４及びＬｅａｍａｎ，Ｄ．，Ｐ．Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｆａｋ，Ａ．Ｙａｌｃｉｎ，Ｍ．Ｐｅａｒｃｅ，Ｕ．Ｕｎｎｅｒｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｓ．Ｍａｒｋｓ，Ｃ．Ｓａｎｄｅｒ，Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｕ．Ｇａｕｌ．２００５．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｐｌｅｔｉｏｎｒｅｖｅａｌｓｅｓｓｅｎｔｉａｌａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ１２１：１０９７−１１０８）、関連ｍｉＲＮＡファミリーメンバー間を識別する重要性を更に際立たせる。

系統的評価により、ｉｎｖｉｖｏでの機能的ｍｉＲＮＡ−標的二本鎖の最小必要条件が決定された（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ，Ｊ．，Ａ．Ｓｔａｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．Ｃｏｈｅｎ．２００５．ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ＰｌｏＳＢｉｏｌ．３（３）：ｅ８５）。この研究では、標的部位は２つの広義のカテゴリーに分類された。１つのカテゴリーでは、ｍＲＮＡ結合部位はｍｉＲＮＡ３’末端への対合からの支援がほとんどまたは全くなく機能するのに十分なｍｉＲＮＡ５’末端との相補性を有する。第二のカテゴリーでは、不十分な５’末端対合により、強い３’末端対合が機能に必要である。両部位は生物学的に関連する遺伝子に存在する。加えて、平均的ｍｉＲＮＡが約１００個の標的部位を有するという証拠が提示され、ｍｉＲＮＡが大部分のタンパク質コード遺伝子を調節し、かつｍｉＲＮＡ３’末端がｍｉＲＮＡファミリー内の標的特異性の主要な決定因子であることを示す。従って、異なるｍｉＲＮＡファミリーメンバー間のヌクレオチド配列の相違は、それらの生物学的機能に極めて重要であり得、高相同性の植物、哺乳動物及び蠕虫ｍｉＲＮＡ間を識別する能力は、これらのｍｉＲＮＡによって調節される生物学的プロセスの正確な理解に極めて重要でありうる。

複数の研究では、差別的ｍｉＲＮＡ発現が癌及び非癌組織に生じることが示されている。ｍｉＲＮＡは哺乳動物ゲノムの１％を表すが、５０％超のｍｉＲＮＡ遺伝子は、癌において増幅、欠失及び転位置と関連する領域内に位置する。ゲノムＤＮＡが欠失または増幅した領域に存在するｍｉＲＮＡは、それぞれ、発現せず、または標準レベルより高度に発現すると思われる。転位される領域に存在するｍｉＲＮＡの発現は、ヌクレオチド配列が由来する領域よりも、該配列が転位された領域におけるヌクレオチド配列に制御される。

種々の固形腫瘍における癌細胞及び正常細胞におけるｍｉＲＮＡの差別的発現は十分に確立している（ＬｕＪ．，Ｇ．Ｇｅｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｍｉｓｋａ，Ｅ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｓａａｖｅｄｒａ，Ｊ．Ｌａｍｂ，Ｄ．Ｐｅｃｋ，Ａ．Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｂ．Ｌ．Ｅｂｅｒｔ，Ｒ．Ｈ．Ｍａｋ，Ａ．Ａ．Ｆｅｒｒａｎｄｏ，Ｊ．Ｒ．Ｄｏｗｎｉｎｇ，Ｔ．Ｊａｃｋｓ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｒｖｉｔｚ，Ｔ．Ｒ．Ｇｏｌｕｂ．２００５．ＭｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｃｌａｓｓｉｆｙｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ４３５：８３４−８３８及びＶｏｌｉｎｉａ，Ｓ．，Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ，Ｃ−Ｇ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ａｍｂｓ，Ａ．Ｃｉｍｍｉｎｏ，Ｆ．Ｐｅｔｒｏｃｃａ，Ｒ．Ｖｉｓｏｎｅ，Ｍ．Ｉｏｒｉｏ，Ｃ．Ｒｏｌｄｏ，Ｍ．Ｆｅｒｒａｃｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｐｒｕｅｉｔｔ，Ｎ．Ｙａｎａｉｈａｒａ，Ｇ．Ｌａｎｚａ，Ａ．Ｓｃａｒｐａ，Ａ．Ｖｅｃｃｈｉｏｎｅ，Ｍ．Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｃ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｍ．Ｃｒｏｃｅ．２００６．ＡｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｇｎａｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓｄｅｆｉｎｅｓｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｔａｒｇｅｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３；２２５７−２２６１）。従って、ｍｉＲＮＡ発現の検出は癌病状の診断を含む診断法に有用となりうる。加えて、ｍｉＲＮＡ発現は癌の予後及び腫瘍の転移可能性の判定に有用となり得、これにより、好適なアジュバント処置を特定するのに役立ちうる。

高相同性ＲＮＡの一例として、高配列相同性に基づき、多くのｍｉＲＮＡはファミリーに分類される。特に、５’末端から２〜７ヌクレオチド位置は概して１００％相同である（Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｉ−Ｈ．Ｓｈｉｈ，Ｍ．Ｗ．Ｊｏｎｅｓ−Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，Ｃ．Ｂ．Ｂｕｒｇｅ，２００３．ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＭａｍｍａｌｉａｎＭｉｃｒｏＲＮＡＴａｒｇｅｔｓ．Ｃｅｌｌ．１１５：７８７−７９８）。残りのヌクレオチドはわずか単一ヌクレオチドだけ異なりうる。このヌクレオチドの相違はｍｉＲＮＡにおける他の任意の位置において生じうる。

ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーは、同じ生物学的機能を有することもあれば有さないこともある高相同性のヌクレオチド配列を有する、異なる９つのメンバーを有する。それらが常に同じ生物学的機能を有するのであれば、それらを識別することが可能なアッセイを有することは重要ではない可能性がある。ｍｉＲＮＡの生物学的機能の研究は始まったばかりであるが、諸研究は高相同性ｍｉＲＮＡと関連する、異なる生物学的機能がある可能性を示唆する。

細胞がハウスキーピングまたは構造基盤（ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）ＲＮＡを構成的に発現することは周知である。加えて、ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の伝達のあらゆるレベルにおいて遺伝子発現の調節に関与するメカニズムに関与する、多種多様のＲＮＡも発現する。非コードＲＮＡの機能的役割は、クロマチン構造の再構成、遺伝子発現の転写および翻訳調節、タンパク質機能の調節ならびにＲＮＡおよびタンパク質の細胞内分布を含む。

非コード転写物はあらゆる領域の生命に属する生命体において特定されている。これらの転写物は、マイクロＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ハウスキーピング（構造基盤（ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ））ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ，ＳＲＰＲＮＡ）及びｔｍＲＮＡを含む。非コードＲＮＡは、刷り込み転写物（例えば、Ｈ１９及びＡｉｒ）、遺伝子量補償転写物（例えば、Ｘｉｓｔ哺乳動物Ｘ染色体不活性化特異的転写物）、ストレス応答転写物、ｐｏｌＩＩＩ転写物及び疾患関連転写物を含む。多くの疾患関連転写物は癌において過剰発現する。非コード転写物に関する情報のデータベースは、ｎｃｒｎａ．ｒｎａ．ｎｅｔ．ｐｌ／Ｂｒｏｗｓｅｒ．ｈｔｍｌにおいて見出すことができる。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の２１〜２５ヌクレオチドにより、遺伝子発現を阻害する機能を果たす進化的に保存されたプロセスである（Ｆｉｒｅ，Ａ．，Ｓ．Ｘｕ，Ｍ．Ｋ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｓ．Ａ．Ｋｏｓｔａｓ，Ｓ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｃ．Ｍｅｌｌｏ．１９９８．Ｐｏｔｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．３９１：８０６−８１１）。ｓｉＲＮＡ分子は、事前に選択されたタンパク質の発現の特異的阻害による治療剤として、かつ病状に関与するタンパク質を調節するｓｉＲＮＡ分子の活性に影響を与える薬剤の標的としての潜在能力を有する。従って、高特異性を有するｓｉＲＮＡ分子を正確に定量する能力は、特に、規定された刺激または病状に応答する生命体の異なる細胞型におけるそれらの存在をモニタリングするのに望ましい。ｓｉＲＮＡは長さ及び組成においてｍｉＲＮＡに類似している。

本明細書における方法ではｍｉＲＮＡの定量化について述べるが、更に検討することは、ポリＡテールを欠き、またはその検出が本明細書で述べるプライマー設計から利益を得る任意のＲＮＡの検出への、これらの方法の適用である（例えば、ｓｉＲＮＡ）。

対象とする核酸を検出するため、過去３０年にわたって多くの手法が開発されてきた。このような手法は、標識プローブの標的配列への基本的ハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロット法）から、それぞれ、検出プローブまたは複数の増幅プライマーで２つ以上の標的配列を検出する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）に至るあらゆる手法を含む。現在、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または、より具体的には、ＱＰＣＲは、試料中の少量の標的核酸を同定するように設計された手法において一般的に用いられている。

新規ｍｉＲＮＡを発見し、試料または組織中の既知のｍｉＲＮＡを定量しようと試みるため、種々の手法が開発されてきた。これまでに行われた多くの研究はｍｉＲＮＡ発現の相対レベルの測定に重点をおいてきた。一般的な手法では、ｍｉＲＮＡ由来の挿入断片がベクターまたはアダプター配列にライゲーションされ、次に、ヌクレオチド配列が決定される。他の手法では、ｍｉＲＮＡの発現を同定するため、ノーザンブロット法が用いられる。一般的に、ｍｉＲＮＡ研究のためのノーザンブロット法は、細胞試料を溶解するステップと、低分子量ＲＮＡを濃縮するステップと、典型的なノーザンブロットを生じさせるステップと、対象とするｍｉＲＮＡと相補的な標識プローブとハイブリダイズさせるステップと、元試料中のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ，ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの相対量の全般的な理解を得るため、検出種の相対分子量を求めるステップとを含む。

通常、ノーザンブロット法を用いた研究は、予測ｍｉＲＮＡの発現の検出及び確認に重点をおき、試料中のｍｉＲＮＡ発現を定量化し、特に、組織及び時点特異的ｍｉＲＮＡ発現を測定しようと試みることが多い。更に、ノーザンブロット法を用いた研究は、試料中のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ，ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの比率を求めるために行われてきた。

発現しうる新規ｍｉＲＮＡを発見するため、ｉｎｓｉｌｉｃｏ予測が広範に用いられている。新規ｍｉＲＮＡを同定するため、コンピュータ・アルゴリズムが開発され、実行されている。一般的に、これらのｉｎｓｉｌｉｃｏ法は、ヘアピンを形成する可能性を有する配列を求めて生命体のゲノムをスキャンするステップを含む。次に、同定される配列は３’ＵＴＲとの相補性についてスキャンされ、既知の相同体と比較される。次に、ベンチ実験により、例えば、ノーザンブロット実験を通じて潜在的標的が確認される。

ｍｉＲＮＡの相対発現レベルを検出および測定するため、マイクロアレイも用いられている。一般的に、マイクロアレイ法は、アレイ上に既知のｍｉＲＮＡ配列と相補的なオリゴヌクレオチドを見出すステップと、蛍光標識ｍｉＲＮＡを作製するステップと、対象とするｍｉＲＮＡが存在するかを判定するため、該標識ｍｉＲＮＡを該アレイに晒すステップとを含む。マイクロアレイは、予測ｍｉＲＮＡを実証し、既知のｍｉＲＮＡの相同体を発見し、組織においてかつ／あるいは時間経過にわたり、所与のｍｉＲＮＡの発現を同定およびモニタリングし、ｍｉＲＮＡプロセシングを研究するために用いられている。

短い鋳型長（１９〜２４ヌクレオチド）、異なるｍｉＲＮＡ間および同じｍｉＲＮＡヌクレオチド配列内の様々なＧ：Ｃ含量、ならびに近縁ファミリーメンバー間の高配列相同性のため、ｍｉＲＮＡの検出は独特な課題を提示する。

ＲＮＡ定量化の理想的な方法は以下の特徴を含む：高ヌクレオチド配列相同性のＲＮＡ間を識別する高特異性、様々な存在量のＲＮＡを検出する高感度、広範囲のＲＮＡコピー数にわたる線形検出、種々の供給源（細胞溶解物、全ＲＮＡ、低分子ＲＮＡ用に濃縮された試料、ＦＥＰＥ組織試料から単離されたＲＮＡ）由来のＲＮＡに適合、ハイスループットおよび使用容易性を可能にするため、同じ反応条件を用いてすべてのＲＮＡを検出し、同じ試料中の種々のクラスのＲＮＡの検出を可能にする。

ｍｉＲＮＡの長さの短さを克服するため、ｍｉＲＮＡに付加配列を付加し、プライミングおよび検出を容易にする複数の方法が存在する。特に、多くの方法では、単一のユニバーサル伸長プライマーの使用を可能にするため、すべてのｍｉＲＮＡに共通配列を付加する。特に、ＱＰＣＲベースのｍｉＲＮＡ検出法では、逆転写前または逆転写時にその長さを延ばすため、ｍｉＲＮＡに付加配列を付加する。これらの方法は、リンカープライマーの使用（Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｄ．Ｒｉｄｚｏｎ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｋ．Ｑ．ＬａｏおよびＮ．Ａ．Ｓｔｒａｕｓｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄＫｉｔｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇＬｉｎｋｅｒＰｒｏｂｅｓｆｏｒＱｕａｎｔｉｆｙｉｎｇＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．米国特許出願公開第２００６／００７８９０６号）、ＲＴアダプターの使用（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｂ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｐ．Ｇａｒｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ，Ｌ．Ｐ．Ｌｉｍ，Ｊ．ＭＪｏｈｎｓｏｎ．２００５．Ｓｉｍｐｌｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ．ＲＮＡ．１１：１７３７−１７４４およびＲａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇＳｍａｌｌＲＮＡＭｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２５９１号並びにｍｉＲＮＡの３’末端へのＲＮＡ分子の直接ライゲーション（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｎ．，Ｌ．Ｋｏｎｇｓｂａｋ，Ｓ．Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ｓ．Ｍ．Ｅｃｈｗａｌｄ，．Ｍｏｕｒｉｔｚｅｎ，Ｐ．Ｓ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｎｏｒｈｏｌｍ．米国特許出願公開第２００５／０２７２０７５号）を含む。Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．Ａ．およびＲ．Ｌ．Ｍｕｌｌｉｎａｘ（米国特許出願公開第２００６／０２１１０００号）、Ｙｅａｋｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．（ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｍａｌｌＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡａｎｄＭｉｃｒｏ−ＲＮＡ）並びに米国特許出願公開第２００６／００１９２５８号では、ｍｉＲＮＡの長さを超える２つのＤＮＡ分子を事前に選択したｍｉＲＮＡにアニールし、長いＤＮＡ鋳型を形成するためにライゲーションすることにより、付加配列が付加される。加えて、Ｙｅａｋｌｅｙは標識成分を有するリン酸反応性試薬の使用により、標識ｍｉＲＮＡを作製している。

同様の方法では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼを用いたｍｉＲＮＡのポリアデニル化により、付加配列が付加される（Ｓｈａｎｆａ，Ｌ．，Ｙ．−Ｈ．Ｓｕｎ，Ｒ．Ｓｈｉ，Ｃ．Ｃｌａｒｋ，Ｌ．Ｌｉ，Ｖ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．２００５．ＮｏｖｅｌａｎｄＭｅｃｈａｎｉｃａｌＳｔｒｅｓｓ−ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｔｈａｔＡｒｅＡｂｓｅｎｔｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．１７（８）：２１８６−２２０３；およびＬｕ，Ｒ．，Ｖ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．２００５．ＦａｃｉｌｅｍｅａｎｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ．２００５．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３９（４）：５１９−２５）。アンカーオリゴｄＴプライマーがポリＡテールにアニールされ、逆転写反応にて伸長する。

従って、短いＲＮＡ鋳型は、逆転写、ライゲーションまたはポリアデニル化反応における配列の付加により、長さを延ばすことができる。これらの方法は、ＱＰＣＲに鋳型の長さを延ばす手段を付与し、ＱＰＣＲにおいて逆方向プライマーにユニバーサルプライミング部位を付与するが、この付加はｍｉＲＮＡの領域におけるプライミングの効率や特異性を向上させない。

ＰＣＲプライマー設計は標的分子の高感度かつ特異的検出に極めて重要である。この目的のため、多くの規則が設定され、これらの規則を用いる多くのコンピュータプログラムが利用可能である。これらの基本的規則は、ＰＣＲプライマーの融解温度（Ｔｍ）がＰＣＲのアニーリング反応に用いられる鋳型の温度より高く、かつＰＣＲの伸長反応に用いられる温度より低いようにすることを含む。最近傍則を用いるＴｍ計算（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．２００３．Ｍｆｏｌｄｗｅｂｓｅｒｖｅｒｆｏｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｏｌｄｉｎｇａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１（１３）：３４０６−３４１５並びにＭａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｊ．Ｓａｂｉｎａ，Ｍ．ＺｕｋｅｒおよびＤ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ．１９９９．ＥｘｐａｎｄｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃＰａｒａｍｅｔｅｒｓＩｍｐｒｏｖｅｓＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡＳｅｃｏｎｄａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０）は、一般的に、実際のＴｍを予測するに当たってより正確であるが、至適反応条件を特定する当初の試験では実証的試験が依然として推奨される。

具体的には、Ｓｈａｎｆａ，Ｌ．およびＬｕ，Ｒ．（上記）は、検出されるｍｉＲＮＡ配列全体に基づいて順方向プライマーを設計することにより、ｍｉＲＮＡ検出のためのプライマーを設計することを教示している。所定のガイドラインは、順方向プライマーが５つの３’末端ヌクレオチド内に３つを超えるＧ／Ｃを含む場合、ｍｉＲＮＡ配列およびポリ（Ｔ）アダプターにおけるチミンを包含する標的部位へのそれらの結合を確実にするため、これらのプライマーの３’末端に１または２つのアデニンが付加されるというものである（上記Ｌｕ，Ｒ．）。Ｌｕによれば、次に、潜在的プライマーの正確な融解温度（Ｔｍ）は、プライマーをその相補体にアニールし、４５℃〜９５℃の熱解離曲線を生じさせることにより、実験的に求められた。Ｌｕ，Ｒ．（上記）は、標準プロトコルを用いて２つ以上のヌクレオチド配列、また、高ストリンジェンシー増幅を用いて１つ以上のヌクレオチド配列が異なるｍｉＲＮＡ間を識別するため、このプライマー設計法を用いた。この増幅プロトコルは、ミスマッチがなく、または１つ以上のミスマッチを有する鋳型をＰＣＲプライマーにアニールし、ミスマッチを有するすべてのプライマーが低いＴｍを有し、かつ完全にマッチしたプライマーが５℃高いＴｍを有する温度を同定することにより、開発された。この方法は高特異性を有しうるが、すべてのプライマーを評価して至適Ｔｍを求めるには過度の実験を必要とし、異なるＴｍのｍｉＲＮＡを検出するには別個の増幅を必要とするプロトコルとなる。加えて、試験が行われたミスマッチは、識別がより困難であることが公知のＧ：ＴやＴ：Ｔミスマッチを含まなかった。従って、単に様々なアニーリングおよび／または伸長温度では、あらゆる場合に単一ヌクレオチド識別とはなり得ない。

あるいは、マイクロアレイ（Ｃａｓｔｏｌｄｉ，Ｍ．，Ｓ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｖ．Ｂｅｎｅｓ，Ｍ．Ｎｏｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｅ．Ｋｕｌｏｚｉｋ，Ｍ．Ｗ．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｕ．Ｍｕｃｋｅｎｔｈａｌｅｒ．２００６．ＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｒｒａｙｆｏｒｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ｍｉＣｈｉｐ）ｂａｓｅｄｏｎｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）．ＲＮＡ．１２（５）：９１３−９２０）およびＱＰＣＲベース（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．，Ｂ．Ｓ．Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｐ．Ｇａｒｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ，Ｌ．Ｐ．Ｌｉｍ，Ｊ．Ｍ．Ｊｏｈｎｓｏｎ．２００５．Ｓｉｍｐｌｅ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｉｒｅｃｔｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ．ＲＮＡ．１１：１７３７−１７４４およびＲａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｋ．ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇＳｍａｌｌＲＮＡＭｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００２５９１号）のアッセイにてｍｉＲＮＡを検出する試薬を開発するため、修飾ヌクレオチドが用いられている。これらの方法では、修飾ヌクレオチド、例えば、ヌクレオチドのリボース部分に２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋を有する固定核酸（ＬＮＡ）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ．２００３．ＬＮＡ：Ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ．ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７４−８１）が検出分子に組み込まれる。ＬＮＡの使用は、ＬＡＮ塩基を含み、従って、ｍｉＲＮＡ特異的検出試薬に含まれるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション親和性を高める。Ｃａｓｔｏｌｄｉらでは、マイクロアレイ上の捕捉分子は１つ以上のＬＡＮ塩基を含み、Ｒａｙｍｏｎｄらでは、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーは１つ以上のＬＡＮ塩基を含む。マイクロアレイベースの方法は高感度であったが、標識ｌｅｔ−７ｅおよびｌｅｔ−７ｂｍｉＲＮＡとｌｅｔ−７ａ捕捉プローブとの、それぞれ、２０％、３０％もの高い相対シグナルを有する近縁ｌｅｔ−７ファミリーメンバーの複数メンバー間を識別することができなかった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ＳＥＥＥＭＳ／２６．ａｓｐ）。加えて、ＱＰＣＲベースの方法は高い感度および特異性を有したが、鋳型非存在下にて高バックグラウンドシグナルも認められた。このバックグラウンドシグナルは、逆転写に用いられる遺伝子特異的プライマーとＬＮＡを含むｍｉＲＮＡ特異的プライマーとのプライマー・ダイマー形成に起因した。従って、被験試料中のｍｉＲＮＡの量をより正確に定量する、より高い特異性およびより低いバックグラウンドを有する方法が所望される。

クローニングのためのヌクレオチド配列（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位）を付加し、タンパク質の精製に用いられる、該タンパク質をコードするヌクレオチド（例えば、ＨＩＳタグ）を付加し、後の伸長反応におけるプライミング効率を高めるためにプライマーのＴｍを高め、かつ後の伸長反応におけるプライミング部位として機能するように、一般的に、ＰＣＲ時に非鋳型化ヌクレオチド配列が鋳型に付加される。

ヌクレオチド配列の非鋳型化付加の一例には、自然プロセスの間に生じるものがある。特に、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）はレトロウイルスＤＮＡの合成時に鋳型切り替えを行う。このプロセスでは、ＭＭＬＶＲＴは１つのウイルスＲＮＡ上でＤＮＡ合成を開始し、次に、分子間鋳型切り替えと称されるプロセスにて異なるウイルスＲＮＡ鋳型に切り替える。鋳型切り替えは非相同配列間より高配列相同性領域間ではるかに頻回に生じる（ＨｕＷ−Ｓ，Ｈ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ．１９９０．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５０：１２２７−１２３３およびＺｈａｎｇＪ．，Ｈ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ．１９９３．Ｒａｔｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇａｓｉｎｇｌｅｃｙｃｌｅｏｆｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：２３４−２３８）。

同様に、あらゆる真核生物ｍＲＮＡの５’末端に存在する７−メチルグアノシンキャップ構造を用いた鋳型切り替えメカニズム（米国特許第５，９６２，２７１号および第５，９６２，２７２号）は、完全長ｃＤＮＡをクローニングするように設計された方法の基本となる。この方法では、完全長ｃＤＮＡを作製するため、３’末端にて１つ以上のリボヌクレオチド（そのうちの少なくとも１つはＧＭＰ）を有する鋳型切り替えオリゴヌクレオチドが用いられる。この方法では、ＲＮＡ試料はｃＤＮＡ合成プライマーと組み合わせられ、ｃＤＮＡ合成プライマーのｍＲＮＡへのアニーリングを可能にし、プライマー‐ｍＲＮＡ複合体を生成する。プライマー‐ｍＲＮＡ複合体はプライマーの鋳型依存的伸長を可能にする条件下でインキュベートされ、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを生成する。ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドと鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡ配列の３’末端が鋳型切り替えオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含むように、該ハイブリッドのｃＤＮＡの鋳型依存的伸長を可能にする条件下で接触される。最も一般的には、付加配列は後の伸長反応におけるプライマー結合部位として機能した。従って、逆転写反応時に新たに合成されるｃＤＮＡの３’末端への鋳型切り替えオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の付加において、Ｃの非鋳型化付加が用いられる。

その後の研究では、ＭＭＬＶＲＴは、ＲＮＡ鋳型の５’末端に達すると、少数の非鋳型化ヌクレオチド（主に、Ｃ）を新たに合成されたｃＤＮＡ鎖の３’末端に付加し、従って、７−メチルグアノシンキャップ構造の存在に依存しないことが後に見出された（Ｍａｔｚ，Ｍ．Ｄ．Ｓｈａｇｉｎ，Ｅ．Ｂｏｇｄａｎｏｖａ，Ｏ．Ｂｒｉｔａｎｏｖａ，Ｓ．Ｌｕｋｙａｎｏｖ，Ｌ．Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ａ．Ｃｈｅｎｃｈｉｋ．１９９９．ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓｂａｓｅｄｏｎｔｅｍｐｌａｔｅ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇｅｆｆｅｃｔａｎｄｓｔｅｐ−ｏｕｔＰＣＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２７（６）：１５５８−１５６０）。

米国特許出願公開第２００６／００５１７７１号はＲＮＡをテーリングおよび増幅する方法を開示している。より具体的には、それは試料中の標的ＲＮＡをテーリングする効率を高める方法を開示し、該方法は、標的ＲＮＡの二次構造を変化させるステップと、標的ＲＮＡのテーリングを可能にする条件下、テーリング酵素（ｔａｉｌｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）およびヌクレオチドの存在下にて標的ＲＮＡをインキュベートするステップとを含む。標的ＲＮＡの二次構造を変化させる典型的な方法は、一本鎖結合タンパク質の加熱または付加などによって標的ＲＮＡを変性させるステップを含む。

ｍｉＲＮＡの検出および分析には多くの手法および試薬が利用可能であるが、高い特異性および感度を有し、鋳型の非存在下にて低いバックグラウンドシグナルを有し、またはバックグラウンドシグナルを有さず、単一逆転写反応から何百もの異なるｍｉＲＮＡの検出を可能にし、ハイスループットおよび使用容易性を可能にするため、同じ反応条件を用いてすべてのＲＮＡを検出し、かつ同じ試料中の種々のクラスのＲＮＡの検出を可能にするｍｉＲＮＡ検出法の必要性が、当技術分野において依然として存在することを本発明者らは認識した。

本発明は、試料中の核酸を検出するシステムを提供する。該システムは、方法、核酸、組成物およびキットを含む多数の態様を有する。概して、核酸、組成物およびキットは、本発明の方法を実施するのに有用であり、または該方法によって生じ、かつ試料中に存在する対象核酸を検出するために用いることが可能な物質を含む。

第一の態様では、本発明は、対象とするｍｉＲＮＡの増幅のためのプライマーを設計する方法を提供し、この場合、ｍｉＲＮＡは特定の既知の配列を有する。本明細書で用いられるように、ｍｉＲＮＡはＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｍｉＲＮＡＲｅｇｉｓｔｒｙの基準を満たす分子（およびそれらの分子の前駆体）である。一般に、該方法は、対象とするｍｉＲＮＡとの高配列同一性を有する１つ以上のｍｉＲＮＡを選択するステップと、対象ｍｉＲＮＡ配列と１つ以上の他の選択ｍｉＲＮＡ配列との間にミスマッチが生じるヌクレオチド位置を同定するステップと、ミスマッチの１０塩基において、または１０塩基内に３’末端を有するプライマーを設計するステップと（該設計プライマーはプライマーの３’末端においてＧ：Ｔおよび／またはＴ：Ｔミスマッチとなることを回避する）、必要に応じて、該プライマー配列の５’末端に１つ以上のヌクレオチドを付加することにより、５５〜６０℃のＴｍを有するように該プライマー配列を調整するステップとを含む。好ましくは、プライマーの３’末端は、ミスマッチが生じ、特に、多数またはすべての関連配列が整列されると、最大レベルのミスマッチ（異質性）が生じる塩基にある。５’末端に付加される付加ヌクレオチドは任意のヌクレオチドでよいが、グアニンヌクレオチドであることが好ましい。最大で３つのヌクレオチドが５’末端に付加されることも好ましい。該方法は、特異的かつ高感度な増幅に最良の配列を同定するため、１つのｍｉＲＮＡ当たり最大３つまたはそれ以上のプライマーを設計・試験するステップを更に含みうる。

別の態様では、本発明は、試料中に存在する、前駆ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を検出する方法を提供する。従って、本発明の本態様は、試料中のｍｉＲＮＡ分子の有無を判定する方法を提供する。概して、該方法は、ポリアデニル化を用いて試料中の１つ以上の対象ｍｉＲＮＡにポリＡテールを付加するステップと、アダプタープライマーおよび逆転写酵素を用いてｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するステップと、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーを用いてＰＣＲによって該ｃＤＮＡコピーを増幅するステップと、ＰＣＲ産物を検出するステップとを含む。言い換えれば、該方法は、対象とするｍｉＲＮＡをポリアデニル化するステップと、ポリアデニル化ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するステップと、対象とするｍｉＲＮＡを特異的に増幅するように設計されたプライマーを用いて該ｃＤＮＡコピーを増幅するステップと、増幅産物を検出するステップとを含む。

該方法の一例は、対象とするｍｉＲＮＡを含むと思われる試料を、核酸をポリアデニル化することが可能な１つ以上の酵素と組み合わせて混合物を作製するステップと、該混合物中に標的ｍｉＲＮＡが存在する場合、該ｍｉＲＮＡのポリアデニル化が生じるように適切な時間および条件を付与するステップと、該混合物を少なくとも１つのアダプタープライマーおよび少なくとも１つの逆転写酵素と組み合わせて第二の混合物を形成するステップと、該ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのｃＤＮＡコピーが作製されるように適切な時間および条件を付与するステップと、該ｃＤＮＡを、対象とするｍｉＲＮＡに特異的なプライマーおよび該特異的プライマーと反対側の鎖をプライミングすることができる別のプライマーと組み合わせるステップと、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の少なくとも１つの鎖を増幅するために適切な時間および条件を付与するステップと、増幅を検出するステップとを含む。本明細書で開示されるように、該方法は、対象とするｍｉＲＮＡの配列に基づいて特異的プライマーを設計するステップを任意に含む。該方法は、対象とするｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を付与するステップも任意に含む。

更なる態様では核酸が提供される。概して、核酸は、本発明による検出法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用な核酸であり、または本発明によるプライマー設計法の少なくとも１つの実施形態を実施することによって生じる核酸である。従って、核酸は、ポリＡテール分子、逆転写酵素反応においてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド産物、増幅プライマー、ｍｉＲＮＡ（陽性対照用として）および該方法の１つ以上のステップのための対照として機能することができる他の核酸でありうる。

更なる態様では組成物が提供される。通常、組成物は、本発明の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用であり、または本発明の方法の少なくとも１つの実施形態の実施を通じて生じる１つ以上の成分を含む。従って、組成物は本発明による２つ以上のプライマーを含みうる。組成物はプライマー産物も含みうる。組成物は、２つ以上の増幅プライマー、少なくとも１つの逆転写酵素、少なくとも１つのポリメラーゼおよび／または１つ以上の検出可能な標識も含みうる。状況により、組成物は本発明の方法に用いられる緩衝剤を含みうる。

更に別の態様ではキットが提供される。本発明によるキットは、本発明の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用な少なくとも１つの成分を提供する。従って、本発明によるキットは、本発明による検出法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに必要な一部またはすべての成分を提供することができる。典型的な実施形態では、キットは本発明の核酸を含む少なくとも１つの容器を含む。種々の特定の実施形態では、該キットは本発明による検出法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに必要な核酸をすべて含む。

本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付図面は、本発明の複数の実施形態を例示するとともに、本明細書と共に本発明の種々の実施形態の特定の原理または詳細を説明するのに役立つ。

ｍｉＲＮＡの検出のための本発明の一方法を示す概略図である。逆転写効率に対する加熱およびＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈＰＣＲエンハンサーの付加の効果を示す図である。異なる逆転写アダプターおよびＱＰＣＲプライマーを用いた逆転写反応の効果を示す図である。ｌｅｔ−７ｄおよび異種鋳型を用いて生じた標準曲線を示す図である。異なるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの相対的アッセイ感度を示す図である。ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型の検出を示す図である。ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡヌクレオチド配列と残りのｌｅｔ−７ファミリーメンバーのヌクレオチド配列との比較を示す図である。図８Ａは、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を用いた本発明の方法を示す図である。出現順にそれぞれ配列番号６２，５４，６２，１８４を開示する。図８Ｂは、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を用いた本発明の方法を示す図である。出現順にそれぞれ配列番号１８５，１８４，６７，１８９，１８１，ｌ８６を開示する。図８Ｃは、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を用いた本発明の方法を示す図である。出現順にそれぞれ配列番号１８２，１８７，１８３，１８８を開示する。ｌｅｔ−７ａプライマーの５’末端上の異なるヌクレオチドを用いたアッセイ感度を示す図である。ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡヌクレオチド配列と残りのｌｅｔ−７ファミリーメンバーのヌクレオチド配列との比較を示す図である。ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型に関する、異なるｌｅｔ−７ｄプライマーを用いたアッセイ感度を示す図である。ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型に関する、異なるｌｅｔ−７ｄプライマーを用いたアッセイ感度を示す図である。異なるｍｉＲＮＡ合成鋳型を用いたアッセイ感度を示す図である。合成ｍｉＲＮＡ鋳型を用いた相対的アッセイ感度を示す図である。様々な数のｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡを検出することによって求められるアッセイ特異性を示す図である。アッセイへのＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加の効果を示す図である。ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在下でのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲのアッセイ特異性を示す図である。ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在下にてｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−２３ｂ鋳型を用いたアッセイ感度を示す図である。全ＲＮＡにおける様々な存在量のｍｉＲＮＡの検出によるアッセイ線形性および感度を示す図である。様々な量のｃＤＮＡ出発鋳型を用いたｍｉＲＮＡの検出によるＱＰＣＲのシグナル線形性を示す図である。

これより、本発明の種々の例示的な実施形態に詳細に言及し、その例は添付図面に示される。以下の詳細な説明は、本発明の実施形態の特定の特徴および詳細の更なる理解を読者に与えるために提供されるものであり、本明細書で広範に開示され、図に示され、または特許請求される本発明の態様若しくは特徴の制約と理解されるべきではない。

近年、その転写後遺伝子調節における役割のため、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称される非コードクラスのＲＮＡの研究が著しく増大している。新規ｍｉＲＮＡ配列の同定は計算法を含むことが多く、ノーザンブロット解析またはマイクロアレイ解析による検証を伴う。約２２ヌクレオチドの配列が、逆転写酵素によるプライマー伸長、その後の従来の設計のＱＰＣＲプライマーによる検出には十分な長さではないため、従来のＱＲＴ−ＰＣＲ法は成熟ｍｉＲＮＡの検出には実施が困難である。本明細書では、ｍｉＲＮＡ配列の検出のための向上したポリアデニル化、逆転写および増幅の方法について述べる。該方法では、プライマー設計プロトコル、ｍｉＲＮＡへのポリＡテールの付加、および検出可能な産物若しくは、例えば、ＱＰＣＲによる増幅のための鋳型の形成を生じさせることができるユニバーサルプライマーを用いた逆転写を用いる。この手法の適用可能性は、特に、試料中のｍｉＲＮＡを新たに定量し、またはマイクロアレイ若しくはノーザンブロットデータの検証のための方法としての適用を含む。

ｍｉＲＮＡは１７〜２４ヌクレオチド（ｎｔ）長の範囲の非コードＲＮＡ配列の一クラスである。現在、ＳａｎｇｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅのｍｉＲＮＡＲｅｇｉｓｔｒｙＲｅｌｅａｓｅ９．０に４７４のヒトｍｉＲＮＡ配列が登録されている。成熟ｍｉＲＮＡ配列は、Ｄｒｏｓｈａによってｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ中間体を生成し、次に、Ｄｉｃｅｒによって成熟ｍｉＲＮＡを形成する、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物の二段階プロセシングから生じる。成熟形態では、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合してＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成し、これは多くの方法によって翻訳を阻害することができる。ｍｉＲＮＡは発達タイミングを含む複数の多様な機能および癌を含む多くの疾患と関連している。

一部のｍｉＲＮＡは特定の発達段階または特定の細胞のみに発現する。本発明の例示的な実施形態は、その発現レベルが正常細胞と癌細胞との間で変化することが見出されているｍｉＲＮＡ配列のサブセットおよびそれらの発現をモニタリングするためのシステムの開発に関する。ｍｉＲＮＡ発現レベルをモニタリングするためのシステムの開発は、それらの生物学的役割の更なる理解を可能にし得、これにより、癌または他の疾患若しくは障害におけるそれらの潜在的役割の更なる理解を可能にしうる。ｍｉＲＮＡ発現データとその体内における病態との関連との相関は、最終的に、早期診断、潜在的治療標的の同定、治療計画の開発、治療のモニタリングおよび予後に重要な役割を果たしうる。本明細書で示される例ではｍｉＲＮＡのサブセットについて述べるが、他のｍｉＲＮＡを含む任意の非コードＲＮＡに対する検出試薬についても検討する。

一態様では、本発明は、試料中に存在するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を検出する方法を提供する。逆に、該方法は対象とするｍｉＲＮＡの非存在を判定する方法である。概して、該方法は、プライマー設計プロトコルを任意に実施するステップと、対象とするｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を任意に付与するステップと、ｍｉＲＮＡが存在する場合、試料中のｍｉＲＮＡの３’末端にポリＡテールを付加するステップと、ｉ）ポリＡテールにアニールすることができるアダプタープライマー（例えば、逆転写オリゴヌクレオチド）と、ｉｉ）付着されたポリＡテールを有するｍｉＲＮＡを含みうる試料とを組み合わせて混合物を生じさせるステップと、プライマーによる逆転写がｃＤＮＡを形成することを可能にする条件に該混合物を晒すステップと、ｃＤＮＡの有無を検出するステップ（検出はｃＤＮＡの増幅を含む）とを含む。

プライマーオリゴヌクレオチドに関連するかにかかわらず、試料または該方法において用いられる他の任意の物質の付与は、特定の環境に存在する特定の物質を生じさせる如何なる行為でもありうる。概して、それは、実施者が本発明の方法に用いるのに好適な形態の対象物質を得て、所有することになる如何なる処置でもありうる（本明細書で用いられる「アッセイ」という用語は時に代替可能である）。当業者はこの結果を成しうる多くの処置を認識している。加えて、本開示全体にわたって非限定的な例が挙げられる。例えば、付与は、ある物質を別の物質に付加し、組成物を生成することでありうる。それは、２つ以上の物質を混合し、組成物または混合物を生成することを含みうる。それは、物質または組成物をその自然環境またはそれが由来する環境から単離することも含みうる。同様に、付与は、サプライヤーまたはベンダーから精製または部分精製形態の物質または組成物を入手することも含みうる。加えて、付与は、対象とするｍｉＲＮＡを含むと思われる試料を得て、本発明の方法に用いる部分を除去し、試料の残量を本発明の方法に用いられる該部分と別の容器に維持することを含みうる。他の例は多数あり、当業者には明らかであろう。

該方法において物質または組成物を組み合わせるということは、２つのものの単一組成物が生じるように、２つ以上の物質、組成物、成分などを接触させるということである。そのような結果を付与する如何なる行為もこの用語に包含され、当業者はその結果を成す多くの方法を認識している。組合せと考えられる処置の一つの非限定な例は、１つ以上のプライマーオリゴヌクレオチドを含む組成物を、ｍｉＲＮＡ種を含み、または含むと思われる水性試料に加えることである。組合せは、均一組成物または１つの出発材料の物質に１つ以上の他の出発材料由来の物質が散在している混合組成物である組合せとなる処置も含みうる。従って、組合せは混合物を作製する混合も含みうる。従って、それは、撹拌、組合せの反復ピペット操作、組合せを含む容器を反転させ、組合せを振盪し、組合せをボルテックスし、または更には、ランダム拡散が部分的若しくは完全な混合を生じさせるのに十分な時間、組合せを静置させることを含みうる。混合は、均一またはほぼ均一な組成物を維持するのに必要でありうる如何なる処置も含み得、限定されるわけではないが、新規処置の施行または最初の混合物を生じさせた１つ以上の処置の反復を含む。均一アッセイでは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、逆転写およびＱＰＣＲ反応成分並びにＲＮＡ試料が単一チューブ中に組み合わせられ、ｍｉＲＮＡの定量を可能にする条件下でインキュベートされうる。この方法では、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによるＲＴアダプターおよび／またはＱＰＣＲプライマーの変化を阻止することが望ましいといえる。この変化を阻止する潜在的方法は、改良ホットスタートＰＣＲ用のＣｌｅａｎＡｍｐ（商標）プライマー（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いることである。これらのプライマーでは、３’末端は化学的にブロックされ、９５℃で５〜１０分間加熱されるまで伸長しない。

標的ｍｉＲＮＡが試料中に存在しない状況では、ポリＡテールが標的ｍｉＲＮＡに付着されず、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡが逆転写によって作製されず、かつＰＣＲ増幅後にシグナルレベルが検出されず、またはバックグラウンドシグナルレベルのみが検出される。従って、実施形態では、該方法は試料中の対象ｍｉＲＮＡの非存在を判定する方法である。当然ながら、結果が陰性である場合、結論の正確性を判定することは困難であるが、アッセイでの１つ以上のポイントにおける適切な対照反応の使用により、ｍｉＲＮＡ欠如の結論が高信頼度で導き出されうる。本明細書で考察するように、試薬および反応成分の適切な機能を検証するため、１つ以上の対照反応（陽性および／または陰性）がアッセイの各ステップに含まれうる。当業者は本明細書で各々を詳述する必要なしに適切な対照反応を行う資格が十分にある。

実施形態において、ｃＤＮＡは逆転写によって生成されるが、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーはｃＤＮＡにアニールしない。アニールしないとは、生じるアニーリングの量が検出不能であり、またはｍｉＲＮＡｃＤＮＡを欠く組成物において検出可能な量と有意に異なることがないが、他の点では同一であるということである。通常、アニーリングの欠如は、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーで生成される増幅産物の有無についてアッセイすることによって求められる。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡプライマーとｍＲＮＡ標的との間に十分な相補性があり、そのため、ＰＣＲ増幅時にｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｍＲＮＡ標的との間にアニーリングが生じる。この場合、シグナルが認められうる。しかし、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在は、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーのｃＤＮＡへのアニーリングの量を、標的ｍｉＲＮＡの非存在下にて生じうるレベルを超えて有意に増加させる。従って、本発明の方法は、特定のｍｉＲＮＡの有無を検出することができ、好ましくは、ｍｉＲＮＡの存在と類似の標的配列を含むｍＲＮＡの単なる存在とを識別することができる。

本発明の方法は２つ以上のｍｉＲＮＡ種の有無を検出することもできる。言い換えれば、プライマーは特異的であるように設計されるが、特異的という用語は一対一の特異性を示唆しない。むしろ、それは、少なくとも使用条件下でハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さにわたって相補的なすべてのヌクレオチド配列への結合を包含する。本発明はｍｉＲＮＡの特異的検出に最も有用であるため、通常、ハイブリダイゼーション条件は、相補性が連続ヌクレオチドの１０ヌクレオチドウィンドウにわたって約９０％以上と極めて高いように設定される。別例では、相補性はそれほど高くなく、連続ヌクレオチドの１０ヌクレオチドウィンドウにわたって約６０％の低さでよい。他の実施形態では、プライマーのｍｉＲＮＡ種との相補性は、１０未満のヌクレオチドウィンドウ、例えば、８ヌクレオチドウィンドウにわたって６０％または１０超のヌクレオチドウィンドウにわたって６０％でよい。

実施形態において、該方法は１つのＲＮＡ試料中に６０未満または約６０から６００超または約６００の異なるｍｉＲＮＡ種を検出することができる。１つのＲＮＡ試料中に多数の異なるｍｉＲＮＡ種が検出される理由は、異なるｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いた別のＱＰＣＲにおいてＲＴ反応のごく一部がｍｉＲＮＡ鋳型として用いられるためである。

本発明の方法は、逆転写のためにｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いる他の方法と異なる。例えば、本発明では、逆転写のためにユニバーサルプライマーが用いられ、それは存在するすべてのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ種からｃＤＮＡが作製されることになる。次に、他の方法と異なり、試料中の特定のｍｉＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡ）または多くの異種ｍＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡを検出するため、ＰＣＲ増幅ステップにおいて１つまたは多数のｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いることができる。該方法は同試料中のｍＲＮＡ標的および対応するｍｉＲＮＡを検出するためにも用いられうる。

当業者はポリＡテールのＲＮＡ分子への付加のための標準プロトコルを熟知している。任意の好適な手法および一連の条件が本発明の方法の実施に用いられうる。従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼＩが本方法に用いられうる。例えば、Ａｍｂｉｏｎ社、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社およびＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼを含むポリＡテーリングキットを用いて、アデニンをｍｉＲＮＡに付加することができる。本明細書で用いられる酵素は核酸テールをＲＮＡ分子に付加することができる任意の酵素でよく、ホモポリマーテールを付加することができる酵素を含む。様々な酵素がそのようなテールを合成することができ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼＩまたは酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼのようなポリ（Ａ）ポリメラーゼを含む。哺乳動物またはウイルスポリ（Ａ）ポリメラーゼも用いられうる。新規特性を有するポリ（Ａ）ポリメラーゼの変異体（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｄ．，Ｃ．Ｌ．Ｖｅｒｌｉｎｄｅ，Ａ．Ｍ．Ｗｅｉｎｅｒ．２００７．ＲｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣＣＡ−ａｄｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｓ（Ｕ，Ｇ）−ｏｒｄＣｄＣｄＡ−ａｄｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｏｒｐｏｌｙ（Ｃ，Ａ）ａｎｄｐｏｌｙ（Ｕ，Ｇ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０４（１）：５４−９）も検討される。あるいは、ホモポリマー核酸テールはＧ，ＴまたはＣヌクレオチドからなりうる。

当業者は逆転写のための多くの手法も認識している。任意の好適な手法および一連の条件が本発明の方法の実施に用いられうる。従って、以下の任意の逆転写酵素またはその変異体が用いられうる（特定の逆転写酵素の逆転写活性に好適であると当技術分野において公知の条件に従って）：トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）；モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）；ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ−ＲＴ）；ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓｅｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＲＴ）ならびに逆転写酵素活性を有する任意の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ。実施形態において、２つ以上の逆転写酵素が反応に含まれ得、その各々が１つ以上の有利な活性、例えば、熱安定性、基質（ＤＮＡ，ＲＮＡなど）に対する特異性、至適塩、ミスマッチ許容性などを付与する。

実施形態において、逆転写反応は逆転写の効率および／または特異性を高める追加成分を含む。このような添加剤は、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、一本鎖結合タンパク質およびジチオスレイトールを含むが、これらに限定されない。当然ながら、逆転写酵素反応は異なる条件下で行われ得、これにより、逆転写酵素の効率および／または特異性が高まる。このような条件は逆転写酵素添加前後のアニーリング温度および時間の差異を含む。

本発明の方法は、ｃＤＮＡのような逆転写酵素反応産物の存在を、多くの場合、間接的に検出するステップを含む。ｃＤＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡから生じるものでありうる。検出は、核酸を検出するための分子生物学分野において公知の任意の手法によって行われうる。従って、検出は、アガロースゲル電気泳動および核酸特異的染色剤による染色よって行われうる。検出は、標識産物を生じさせるため、検出可能な部分、例えば、蛍光または放射性分子による１つ以上のプライマーの標識化によって行われうる。同様に、検出は、ジゴキシゲニンシステムのような二成分標識システムのメンバーによる標識化によって行われうる。他の非限定的な例は、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、質量分析および配列決定に基づく検出を含む。更に他の非限定的手法は、酵素技術によるシグナルの増幅および検出される産物の１つ以上のヌクレオチドに付着された標識に特異的な抗体の使用を含む。検出は、増幅の進展に従った発光／蛍光のリアルタイムモニタリングよっても行われうる。当業者は核酸を検出するための様々な手法並びにそのために用いられうる種々のデバイス、供給品および試薬を熟知している。従って、検出法、デバイス、供給品および試薬については本明細書で詳述する必要はない。

検出は、標的ｍｉＲＮＡの定性的同定、半定量的同定または定量的同定となりうる。定性的検出は、試験された試料中の標的ｍｉＲＮＡの量との相関なしに、ｃＤＮＡまたは増幅産物の有無の検出を含む。定性的結果は、標的ｍｉＲＮＡが試料中に存在の可否を実施者が結論づけることを可能にするが、その量を確認することを可能にはしない。半定量的検出はシグナルの検出のみならず、シグナルと試験された試料中の標的ｍｉＲＮＡの基礎レベルとの相関も可能にする。例えば、これは、最小閾値量のｍｉＲＮＡが試料中に存在したことを示しうる。このような結果は、所定量のｍｉＲＮＡ標的が試料中に存在するかを実施者が判定することを可能にするが、所定量未満の量が存在するかを判定することを可能にはしない。同様に、これは、実施者が元試料中のｍｉＲＮＡの正確な濃度または量を測定することを可能にはしない。定量的検出は、実施者が広範囲の量にわたって元試料中に存在する標的ｍｉＲＮＡの量を測定することを可能にする。一般的に、定量的検出では、検出量を、過去に作成され（例えば、標準曲線）、若しくは内部標準を用いた標的ｍｉＲＮＡのアッセイ時に作成された基準または標準と比較する。定量的または半定量的分析を行うための多くの手法が当業者には周知であり、本明細書で詳述する必要はない。例えば、当業者は、ＰＣＲ，ＱＰＣＲを行い、標準曲線を作成し、かつ増幅結果を定量および検証するのに好適な手法のための種々の市販品を参考にしうる。

該方法は１つ以上の追加の任意ステップも含みうる。例えば、核酸または他の物質は該方法の前または該方法時にいつでもどの程度にでも精製することができ、検出ステップのような１つ以上のステップの一部として含む。同様に、１つ以上の組成物中に存在しうるインヒビターは、本発明の核酸の精製によってインヒビターから除去されうる。このような精製は本明細書で述べる方法の２つ以上の他のステップ間で行うことができる（しかし、本明細書で述べるステップは、それらが提示または考察される特定の順序に実際に限定されると理解されるべきではないことを理解すべきである）。加えて、該方法の実施時に形成される１つ以上の組成物の一部は除去されうる。これらは任意の目的のために用いることができ、限定されるわけではないが、該方法の１つ以上のステップが確実に適正に機能しているように対照反応を行い、好ましくは予期される量にて確実に存在するように組成物中の１つ以上の物質についてアッセイし、興味深い他の任意の反応パラメータを求めることを含む。

該方法は、検出前または検出時のｃＤＮＡまたは逆転写酵素産物の増幅を含む。ｃＤＮＡの増幅は、ＰＣＲおよびその改良型のすべて（例えば、リアルタイムＰＣＲまたは定量ＰＣＲ）を含むがこれに限定されない任意の好適な増幅法を用いて行うことができる。実施形態では、該方法は、少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドプライマーを付与するステップと、存在する場合、ｃＤＮＡを該増幅プライマーに晒すステップと、生じた混合物を単一ｃＤＮＡ（存在する場合）の増幅を可能にする条件に晒すステップとを含む。好ましくは、増幅に用いられるオリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーを含む。従って、この場合、ユニバーサル逆方向プライマーは逆転写プライマー（またはアダプタープライマー）に見出される配列の一部を含む。他の実施形態では、逆転写反応に用いられるアダプタープライマーを増幅反応に用いることもできる。

この文脈におけるユニバーサル逆方向プライマーの意味は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に用いることができる任意のオリゴヌクレオチド配列である。ユニバーサル逆方向プライマーの意味は、任意特定の配列を指すのではなく、逆転写によって生じる、すべてではないとしても大部分のｃＤＮＡ種に見出される配列を指すように意図されている。従って、その配列はｃＤＮＡ種集団に普遍的に見出すことができる。ＰＣＲ増幅用のユニバーサル逆方向プライマーには任意特定の配列を用いることができる。

実施形態では、増幅プライマーとして用いられるｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーの配列を決定するため、プライマー設計プロトコルが用いられる。このようなプライマーを設計する一般的方法は上述されている。実施形態では、該方法は、対象とするｍｉＲＮＡとの高配列同一性または相同性を有する他のｍｉＲＮＡを同定するステップと、配列が整列された際に最大の異質性を有する種々の配列内のヌクレオチドを同定するステップと、プライマーの３’末端ができる限りミスマッチに近いようにプライマーを設計するステップと、任意に、グアニン：チミンおよびチミン：チミンミスマッチを回避するステップと、必要に応じて、Ｔｍを約５０〜約７０℃に調節するため、１〜１０個のグアニンをプライマーの５’末端上に付加するステップとを含む。典型的な実施形態では、Ｔｍを約４５〜約６５℃に調節するため、０〜３個のグアニンがプライマーの５’末端に付加される。実施形態では、グアニン以外のヌクレオチドが５’末端に付加されるが、グアニンが好ましい。

グアニンのような塩基のプライマーの５’末端への付加は、ＰＣＲ増幅に妥当なレベルへのプライマーのＴｍの上昇を可能にする。ｍｉＲＮＡ特異的プライマーのＴｍが、ＰＣＲ反応に用いられるユニバーサルプライマーのＴｍと一致するように、該付加はプライマーのＴｍが変化することも可能にする。更に、塩基の付加はＰＣＲ増幅の最初のサイクルの効率を高める。ＰＣＲ増幅における重大事象は、プライマーの配列が鋳型核酸の配列との正確なマッチではない可能性がある際の増幅の最初のサイクルである。本発明のｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いた際の本発明の検出法は、ＰＣＲ増幅における最初のサイクルの効率の向上を可能にする。加えて、ＲＴによる非鋳型化付加を通じてｍｉＲＮＡｃＤＮＡの３’末端においてシトシンにアニールする１つ以上のグアニンの付加とともに、本発明のｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いることは、ＰＣＲ増幅における最初のサイクルの効率の向上を可能にする。Ｔｍを調節するためのプライマーの５’末端への塩基の付加は、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの３’末端が具体的に規定されることも可能にし、従って、ファミリーの他のｍｉＲＮＡ種と比べ、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーが３’末端におけるミスマッチの１０ヌクレオチドで、または１０ヌクレオチド内で終止することを可能にし得る。３’末端がミスマッチにおいて終止すると短すぎるであろうプライマーでは、プライマー設計プロトコルはプライマーが５’末端にて伸長され、所望の特異性を達成すると同時に効果的であることを可能にする。

本発明のプライマー設計プロトコルは高選択性を有し、わずか１つのヌクレオチドの相違を有するｍｉＲＮＡをＰＣＲ増幅が識別することを可能にする。当然ながら、該プロトコルはその配列に２つ以上のヌクレオチドの相違を有するｍｉＲＮＡを識別しうる。該プロトコルは高感度も有し、例えば、ＱＰＣＲ鋳型の約１０コピーまでの少ないコピー数を有するｍＲＮＡを定量化することができる。

該プライマー設計法は、ｍｉＲＮＡを増幅することができる如何なる種類のプライマーをも設計するために用いることができ、プライマーの５’末端は、標的配列の一部ではなく、即ち、標的配列に天然には見出されないグアニンヌクレオチドのような塩基を含む。典型的な実施形態では、標的配列に天然には見出されない１、２または３個のグアニンを、ＰＣＲ増幅産物の５’末端に付加することができる。

該検出法は、それらが既知である場合、対象とするｍｉＲＮＡとの高配列相同性を有する他のｍｉＲＮＡを同定しないステップを含みうる。即ち、プライマーは、３’末端の選択に基づき、１つ（またはそれ以上）のｍｉＲＮＡに特異的であるとともに、他のｍｉＲＮＡを特異的に除外するように設計することができる。例えば、高異質性の２つ以上の塩基が存在する場合、特定のｍｉＲＮＡの検出を除外する３’末端塩基を選択することができ、１つ以上の他の可能な３’末端の選択はそのｍｉＲＮＡの検出を除外しないであろう。上述のように、プライマー配列の選択は、単一種由来のｍｉＲＮＡを特異的に同定し、または２つ以上の種により共有されうる特定の配列を特異的に同定するために行うことができる。本発明に包含されるこの概念の必然的結果は、１つ以上のｍｉＲＮＡ種を特異的に除外するとともに、１、２またはそれ以上の他のｍｉＲＮＡを検出するプライマー配列の選択である（設計の重点は、１つ以上のｍｉＲＮＡを特異的に検出することよりも、特定のｍｉＲＮＡの検出を除外することにある）。

従って、実施形態では、該方法は、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの設計のためのプライマー設計プロトコルを付与するステップと、対象とする特定のｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を付与するステップと、存在する場合、ｍｉＲＮＡの３’末端にポリＡテールを付加するステップと、アダプタープライマー若しくはオリゴヌクレオチドおよび付加ポリＡテールを有するｍｉＲＮＡを含み、あるいは含むと思われる試料を含む混合物を、アダプタープライマーを用いた逆転写がｃＤＮＡ産物を形成することを可能にする条件に晒すステップと、特異的順方向ｍｉＲＮＡプライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーを用いたＰＣＲによりｃＤＮＡ分子を増幅するステップとを含む。任意の好適な量のアダプタープライマー、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーが用いられうる。典型的な濃度は、０．００５μＭ，０．０１μＭ，０．１μＭ，０．４μＭおよび０．５μＭを含む。各プライマーは任意の他のプライマーから独立して選択される濃度にて加えられうる。用いられるプライマーの量は試料中の鋳型の量によっても異なりうる。本発明の方法に従って、対象とするｍｉＲＮＡ種（本明細書で「標的ｍｉＲＮＡ」とも称される）の１つ以上の分子が試料中に存在する場合、この晒すステップは２つ以上のｃＤＮＡ産物を生じさせる。理論上、該方法は各プライマーの１コピーのみで実施することができるが、分子生物学分野において実施される方法では典型的であるように、該方法が実施されるたびに各々の多くの同一コピーが付与されることが想定される。従って、本開示全体にわたるある一定数の核酸への言及は、それらがアダプタープライマー、逆転写酵素産物、増幅プライマー、増幅産物または他の如何なる核酸であろうとも、核酸の特定の固有性に関するものであり、その核酸の１つ若しくは複数の正確な、または本質的に正確なコピーを包含する。

増幅プライマー（ユニバーサルプライマーおよびｍｉＲＮＡ特異的プライマー）は、該方法の実施時にいつでも該方法の他の成分に晒されうる。従って、それらは逆転写酵素に晒される前、それと同時またはその後に他の成分に晒されうる。同様に、それらは１つ以上のポリメラーゼが他の成分に晒された後、組成物に晒されうる。従って、本発明の方法は単一チューブ方式または多重チューブ方式にて実施することができる（即ち、一部若しくはすべての成分が同時に加えられ、すべての反応を単一反応容器内で行うことができ、または一部の反応を１つの反応容器内で行うことができ、他の反応を第二の反応容器内で行うことができる）。逆転写酵素プライマーと同様に、増幅プライマーは他の成分に同時に晒される必要はないが、通常、同時に晒されることが想定される。増幅プライマーは逆転写が生じた後に該方法の他の成分に晒されうる。特定の状況下では、増幅プライマーは、複数回、例えば、増幅が生じうる条件に組成物を晒す前、次に、増幅プロセス時に加えることができる。同様に、該方法の実施時に試料が除去される場合、増幅プライマーは、除去試料のみ、残留組成物のみまたは両方に加えられうる。更に、多数の異なるプライマーまたは複数組のプライマーが、単一組成物または該組成物からの１つ以上の部分の除去から生じる、異なる組成物に加えられうる。このようにして、異なる増幅プライマー配列に基づき、異なる増幅効率を求めることができ、または他の増幅パラメータに基づき、他の情報を収集することができる。

例えば、その全体を参照して本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０１１９４６７号に述べられているように、本発明は、ＰＣＲ添加剤、例えば、ＰｆｕｄＵＴＰアーゼ（ＰＥＦ）、ＰＣＮＡ、ＲＰＡ、ｓｓｂ、抗体、ＤＭＳＯ、ベタイン、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、ＰｆｕＧ３８７Ｐ）、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡおよびＴ４ｇｐ３２からなる群より選択される１つ以上のものを含む緩衝液も提供する。

加えて、一般ＤＮＡ結合タンパク質が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチジルトランスフェラーゼの処理能力を刺激すると予想される。本発明の方法は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を用いて例証されているが、他の一般ＤＮＡ結合タンパク質も刺激因子として用いられうる。一般ＤＮＡ結合タンパク質の一非限定的な例はＴ４バクテリオファージの遺伝子３２産物（Ｔ４ｇｐ３２）である。従って、ｃＤＮＡを生成している逆転写時に他の多くの一般ＤＮＡ結合タンパク質が、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの処理能力を刺激することができると予想される。他の一般ＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例は、ｓｓＣＲＥ−ＢＰ／Ｐｕｒ．ｖａｒｉｅｓ．（ラット肺から単離されるタンパク質）；Ｈｂｓｕ（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の不可欠なヌクレオチド関連タンパク質）；ｕｖｓ．ｓｕｐ．ｙ（バクテリオファージＴ４の遺伝子産物）；複製タンパク質Ａ（真核生物におけるヘテロ三量体ｓｓＤＮＡ結合タンパク質）；エプスタイン・バーウイルスのＢＡＬＦ２遺伝子産物；酵母ＲＡＤ５１遺伝子産物；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ファージファイ２９のＳＳＢ；およびアデノウイルスのＳＳＢを含む（Ｗｅｉら、１９９８，Ｉｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７８：４１８−４２；Ｋｏｈｌｅｒら、１９９８，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６０：４８７−４９１；Ｓｗｅｅｚｙら、１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：９３６−９４４；Ｂｒｉｌｌら、１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１８：７２２５−７２３４；Ｔｓｕｒｕｍｉら、１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７９：１２５７−１２６４；Ｎａｍｓａｒａｅｖら、１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：５３５９−５３６８；Ｓｏｅｎｇａｓら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０３−３１０；およびＫａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓら、１９９５，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１５：１１３−１１６）。

加えて、本発明の特異性向上法および組成物から利益を得うるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよび他の任意の好熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。

加えて、増幅用の緩衝液として用いられる組成物は、特異性向上のための抗体（ホットスタートＰＣＲ用、Ｂｏｒｎｓら（２００１）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ１４，５−８頁、更に、市販キットを伴うマニュアルＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣａｔａｌｏｇｕｅ＃６００３２０に述べられている）、ＧＣに富むＰＣＲのためのＤＭＳＯ若しくはより高い特異性のための一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（市販、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣａｔａｌｏｇ＃６００２０１）、ｄＵＴＰおよび／またはウラシルＮ−グリコシラーゼのような添加剤も含みうる。

当業者は合成／増幅反応の忠実度を高めるため、他のＰＣＲパラメータも用いうる。ＰＣＲ忠実度は、ｄＮＴＰ濃度の変化、一反応当たりに用いられる酵素の単位、ｐＨおよび反応において存在するＭｇ^２＋とｄＮＴＰとの比率などの因子の影響を受けうることが報告されている（上記Ｍａｔｔｉｌａら、１９９１）。Ｍｇ^２＋濃度は、プライマー‐鋳型相互作用を安定化させることにより、オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングに影響を与える。Ｍｇ^２＋濃度はプライマー‐鋳型とのポリメラーゼの複製複合体も安定化させる。従って、更に、Ｍｇ^２＋濃度は非特異的アニーリングを増大させ、望ましくないＰＣＲ産物を生成しうる（例えば、ゲル中の多数のバンドまたはＱＰＣＲにおける多数の解離曲線を生じさせる）。非特異的増幅が生じる場合、増幅の精度および特異性を高めるため、Ｍｇ^２＋を低下させる必要があり得、またはＥＤＴＡを加えてＭｇ^２＋をキレートすることができる。

Ｍｎ^２＋またはＣｏ^２＋のような他の二価カチオンもＤＮＡ重合に影響を与えうる。各ＤＮＡポリメラーゼに好適なカチオンは当技術分野において公知である（例えば、上記ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ第二版中）。二価カチオンは、ＭｇＣｌ_２，Ｍｇ（ＯＡｃ）_２，ＭｇＳＯ_４，ＭｎＣｌ_２，Ｍｎ（ＯＡｃ）_２またはＭｎＳＯ_４のような塩の形態で供給されうる。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度は、ＭｎＣｌ_２では０．５〜７ｍＭ、好ましくは、０．５〜２ｍＭであり、ＭｇＣｌ_２では０．５〜１０ｍＭでありうる。Ｂｉｃｉｎｅ／ＫＯＡｃ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度は、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２では１〜２０ｍＭ、好ましくは、２〜５ｍＭでありうる。

ＤＮＡポリメラーゼに必要な一価カチオンは、塩化物または酢酸塩のカリウム、ナトリウム、アンモニウムまたはリチウム塩により供給されうる。ＫＣｌでは、濃度は、特に、１〜２００ｍＭでよく、好ましくは、濃度は４０〜１００ｍＭであるが、最適濃度は反応において用いられるポリメラーゼにより異なりうる。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を、二ナトリウムまたはリチウム塩のようなｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰの塩の溶液として加えることができる。本発明の方法では、各々１μＭ〜２ｍＭの範囲の最終濃度が妥当であり、１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は、総ｄＮＴＰおよび二価金属イオン濃度並びに緩衝液、塩、特定のプライマーおよび鋳型によりＰＣＲ反応において異なりうる。

ｄＮＴＰは二価カチオンをキレートし、従って、使用する二価カチオンの量は反応におけるｄＮＴＰの濃度に従って変更する必要がありうる。過剰量のｄＮＴＰ（例えば、１．５ｍＭ超）はエラー率を高め、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する可能性がある。従って、ｄＮＴＰを低下させる（例えば、１０〜５００μＭまで）ことがエラー率を低下させうる。より大きいサイズの鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応は、より多くのｄＮＴＰを必要としうる。

１つの好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌであり、好ましくはｐＨ８．３であるが、ｐＨは８．０〜８．８の範囲内でよい。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度は５〜２５０ｍＭであるが、１０〜１００ｍＭが最も好ましい。好ましい緩衝剤はＢｉｃｉｎｅ／ＫＯＨであり、好ましくはｐＨ８．３であるが、ｐＨは７．８〜８．７の範囲内でよい。ＢｉｃｉｎｅはｐＨ緩衝剤および金属緩衝剤として作用する。他の緩衝剤の中でもトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）を用いてもよい。

ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための極めて強力なツールであり、従って、鋳型ＤＮＡをほとんど必要としない。しかし、一部の実施形態では、エラーの可能性を低下させるため、より高いＤＮＡ濃度が用いられうるが、多すぎる鋳型は不純物の量を増加させ、効率を低下させうる。

通常、３μＭまでのプライマーが用いられうるが、鋳型に対するプライマーの高い比率は非特異的増幅およびプライマー‐二量体形成をもたらしうる。従って、通常、プライマー‐二量体形成を回避するようにプライマー配列を設計する必要がある。

サイクリングパラメータも異なりうる。鋳型ＧＣ含量が高い場合、変性時間は増加されうる。高ＧＣ含量を有するプライマーまたはより長いプライマーには、より高いアニーリング温度が必要とされうる。勾配ＰＣＲはアニーリング温度を決定する有用な方法である。より大きいＰＣＲ産物の増幅では、伸長時間を延ばす必要がある。しかし、酵素への損傷を抑えるため、伸長時間を可能な限り短縮する必要がありうる。サイクル数は、鋳型ＤＮＡ数が極めて少ない場合は増加させ、多量の鋳型ＤＮＡが用いられる場合は減少させることができる。

増幅の効率を向上させるため、ＰＣＲ増強因子も用いられうる。本明細書で用いられるように、「ＰＣＲ増強因子」または「ポリメラーゼ増強因子」（ＰＥＦ）とは、ポリヌクレオチドポリメラーゼ増強活性を有する複合体またはタンパク質を指す（Ｈｏｇｒｅｆｅら、１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ１０：９３−９６；および米国特許第６，１８３，９９７号、共に参照して本明細書に組み込まれる）。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼでは、ＰＥＦは天然型（Ｐ５０およびＰ４５の複合体として）にて、または組換えタンパク質としてＰ４５を含む。ＰｆｕＰ５０およびＰ４５の天然複合体では、Ｐ４５のみがＰＣＲ増強活性を示す。Ｐ５０タンパク質は構造において細菌フラボタンパク質に類似する。Ｐ４５タンパク質は構造においてｄＣＴＰ脱アミノ酵素およびｄＵＴＰアーゼに類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸に変換するｄＵＴＰアーゼとしてのみ機能する。本発明によるＰＥＦは、古細菌源（例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ））から得られる単離または精製された天然ポリメラーゼ増強タンパク質；ポリメラーゼ増強活性を有する、ＰｆｕＰ４５と同じアミノ酸配列を有する、完全または部分的に合成されたタンパク質またはその類似体；１つ以上の前記天然の、または完全若しくは部分的に合成されたタンパク質のポリメラーゼ増強混合物；１つ以上の前記天然の、または完全若しくは部分的に合成されたタンパク質のポリメラーゼ増強タンパク質複合体；あるいは１つ以上の前記天然タンパク質を含むポリメラーゼ増強部分精製細胞抽出物からなる群より選択することもできる（上記米国特許第６，１８３，９９７号）。他のものを用いてもよい。ＰＥＦのＰＣＲ増強活性は当技術分野において公知の手段により規定される。ＰＥＦの単位の定義は、ｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の生成をモニタリングすることにより求められる、ＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づく。例えば、ＰＥＦはｄＵＴＰ（１×クローンＰｆｕＰＣＲ緩衝液中、１０ｍＭｄＵＴＰ）とインキュベートされ、その間、ＰＥＦはｄＵＴＰを加水分解してｄＵＭＰとＰｐｉにする。生じたＰＰｉの量は、Ｓｉｇｍａ社から市販されている結合酵素アッセイ系（＃Ｐ７２７５）を用いて定量される。活性の１単位は（８５℃で）１時間当たりに形成されるＰＰｉの４．０ナノモルとして機能的に定義される。

他のＰＣＲ添加剤もＰＣＲ反応の精度および特異性に影響しうる。０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが増幅反応混合物中に存在しうる。Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）およびＮｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０のような洗浄剤も酵素希釈緩衝液中に存在しうる。約０．１％以下の非イオン性洗浄剤の最終濃度が適切であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性を妨げない。同様に、グリセロールが酵素調製物中に存在する場合が多く、一般的に、反応混合物中１〜２０％の濃度に希釈される。グリセロール（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜１０％）を、高ＧＣ含量または長い長さ（例えば、１ｋｂ超）を有する鋳型ＤＮＡのＰＣＲにおいて加えることができる。これらの添加剤は、プライマー・鋳型ハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融点）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；最大０．８μｇ／μＬ）はＰＣＲ反応の効率を向上させることができる。ベタイン（０．５〜２Ｍ）も高ＧＣ含量およびＤＮＡの長い断片にわたるＰＣＲに有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、５０ｍＭ超）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）も用いられうる。上述の各添加剤の最適濃度を決定するため、ＰＣＲ試験反応が実施されうる。

本発明は、限定されるわけではないが、抗体（ホットスタートＰＣＲ用）およびｓｓｂ（より高い特異性）を含む添加剤を提供する。ホットスタートＰＣＲの別の方法は、ＤＮＡポリメラーゼが加熱により活性化されるまで活性をほとんどまたはまったく有さないように、該ポリメラーゼを化学修飾することである。本発明は、例えば、米国特許第６３３３１５８号およびＷＯ０１／０９３４７Ａ２（共にその全体を参照して本明細書に組み込まれる）に述べられているように、補助因子と組み合わせた変異古細菌ＤＮＡポリメラーゼも意図する。

種々の特異的ＰＣＲ増幅の応用が当技術分野において利用可能である（参照のため、例えば、Ｅｒｌｉｃｈ，１９９９，ＲｅｖＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１：１２７−３４；Ｐｒｅｄｉｇｅｒ２００１，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６０：４９−６３；Ｊｕｒｅｃｉｃら、２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：３１６−２１；Ｔｒｉｇｌｉａ，２０００，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：７９−８３；ＭａＣｌｅｌｌａｎｄら、１９９４，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．４：Ｓ６６−８１；ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ，１９９３，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：４１−４７を参照されたい；これらの各々は参照して本明細書に組み込まれる）。

本発明は、ｉ）非特異的増幅を低減するホットスタートＰＣＲ；ｉｉ）高アニーリング温度で開始し、次に、段階的にアニーリング温度を低下させ、非特異的ＰＣＲ産物を減少させるタッチダウンＰＣＲ；ｉｉｉ）外側の一組のプライマーおよび内側の一組のプライマーを用いてより信頼度の高い産物を合成するネステッドＰＣＲを含むが、これに限定されないＰＣＲの応用に用いることができる。本発明は、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡを合成し、次に、これがＰＣＲに用いられるＲＴ−ＰＣＲでも用いることができる。この方法は、組織または細胞における特定の配列の発現を検出するのに極めて感度が高い。この方法はｍＲＮＡ転写物を定量するためにも用いられうる。同じ標本中のＤＮＡ配列の２つ以上の独特の標的が同時に増幅される複合ＰＣＲを用いることもできる。ＰＣＲの品質を検証するため、１つのＤＮＡ配列を対照として用いることができる。同様に、遺伝子を合成するために用いられる再帰ＰＣＲを用いることができるように、同じ一組のプライマーに対して標的ＤＮＡと競合する（競合ＰＣＲ）内部標準ＤＮＡ配列（しかし、異なるサイズの）を用いるＱ／Ｃ−ＰＣＲ（定量比較）を用いることができる。他の方法は非対称ＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕＰＣＲを含むが、これに限定されない。

試料は対象とするｍｉＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ（上述のように、この用語にはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが含まれる）を含み得、または対象とするｍｉＲＮＡやｍＲＮＡを含み得ない。本発明の方法は、ｍｉＲＮＡ特異的プライマーのハイブリダイゼーション部位において同一性を有する対象ｍｉＲＮＡ若しくはｍＲＮＡまたは関連ｍｉＲＮＡ若しくはｍＲＮＡが試料中にあるか否かを判定することができる。従って、該方法は試料中の対象ｍｉＲＮＡの有無を判定する方法でありうる。上述のように、標的ｍｉＲＮＡが試料中に存在する場合、逆転写酵素反応時にｃＤＮＡが作製され、ＰＣＲ増幅時に増幅産物が形成される。標的ｍｉＲＮＡの非存在下では、ｃＤＮＡは生成されず、ＰＣＲ産物はまったく検出されず、またはわずかな量のＰＣＲ産物が検出される。

該方法は、対象ｍｉＲＮＡが試料中に存在しない場合、これを検出しないように設計されるため、確実に該方法の１つ以上のステップが適切に行われ、かつ／あるいは１つ以上の物質、成分、試薬などが予想通りに機能しているように、実施者は１つ以上の対照反応を行うことを所望しうる。従って、本発明の方法は、逆転写および／または増幅組成物における該方法の一部として内部的に行われ、あるいは本発明の一般的方法に包含される反応に加えて１つ以上の別の反応として行われる１つ以上の対照反応を任意に含みうる。従って、例えば、試料は既知の固有性のｍｉＲＮＡ（しかし、通常は標的ｍｉＲＮＡと異なる種）および既知のｍｉＲＮＡ種に特異的な増幅オリゴヌクレオチドに晒されうる。確実に該方法が適切に機能し、かつ標的ｍｉＲＮＡからの検出可能なシグナルの欠如が該方法の１つ以上のステップの不具合に起因するというよりも、元試料中のｍｉＲＮＡの欠如に起因するように、逆転写および増幅は存在するそれらの対照核酸により行われうる。同様に、該方法の機能をモニタリングするため、被験試料を含む反応容器とその他の点では同様に処理される別の反応容器での逆転写および増幅により、既知のｍｉＲＮＡ種が検出されうる。逆転写および／または増幅反応を行うのに有用であると当業者には公知の他の対照も用いられうる。そのような対照は当業者には周知であり、従って、本明細書で詳述する必要はない。典型的な陰性対照は、逆転写の基礎レベル（即ち、バックグラウンドレベル）（例えば、ｍｉＲＮＡ標的の非存在、試料中の核酸の非存在、逆転写酵素の非存在などにおける）または増幅の基礎レベル（例えば、ｃＤＮＡ産物を形成する逆転写オリゴヌクレオチドの非存在、１つ以上の増幅プライマーの非存在、ポリメラーゼの非存在などにおける）を求めるために用いることができる。所望のように、または特定の実施される実施形態若しくは試験される試料により決定されるように、陽性または陰性対照を選択しうる。このような選択は十分に当業者の技術水準内にある。

試料は対象とするｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる任意の供給源由来の任意の試料である。従って、これは、動物、植物、ウイルスまたは分裂酵母由来の試料でよい。これは、環境試料、臨床試料、実験室試料または未知の供給源由来の試料でよい。同様に、試料は単一試料を作製するために組み合わせられた２つの別個の供給源に由来するものでよい。本発明の方法が実施される際、多数の試料を一度にスクリーニングするため（例えば、ハイスループット・スクリーニング）、試料の結合または貯留が好ましい場合がある。このような状況では、貯留は多数の試料が単一反応容器にてアッセイされることを可能にする。陽性結果が得られる場合、貯留された個々の試料は対象ｍｉＲＮＡを含む１つ（またはそれ以上の）試料を同定する方法によって後に個々にスクリーニングされうる。

加えて、アニーリングのためのｍｉＲＮＡのアクセシビリティーの向上をもたらす方法が、本発明により意図される。細胞内では、ｍｉＲＮＡは以下：１つ以上のタンパク質、１つ以上のタンパク質複合体、ｍＲＮＡ、標的ｍＲＮＡ、核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、細胞膜および／またはその組合せの１つ以上と結合しうる。ｍｉＲＮＡのアクセシビリティーを高めるそのような方法は、熱変性、タンパク質の変性および／または除去並びに膜の可溶化および／または除去を含みうる。

本発明の方法は、既知の配列を有するｍｉＲＮＡを検出することができる。同様に、本発明の方法は、既知のｍｉＲＮＡ配列と同一の配列を有する場合もあれば有さない場合もありうる関連ｍｉＲＮＡを検出することができる。従って、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡファミリーの２つ以上のメンバーを検出および／または同定し、あるいは新規ｍｉＲＮＡ種を検出および／または同定し、あるいはｍｉＲＮＡ相同体を検出および／または同定する方法でありうる。通常、該方法が新規ｍｉＲＮＡ種を検出するために実施される場合、検出は、ｍｉＲＮＡの所定の領域にわたり、既知のｍｉＲＮＡ種と完全に相補的な配列を有し、または既知のｍｉＲＮＡ配列との高いが完全ではない相補性を有する配列を有する増幅オリゴヌクレオチドの使用に基づく。

あるいは、増幅オリゴヌクレオチドはヌクレオチドが重複している１つ以上の位置を含む。重複とは、ヌクレオチドがＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣまたはその任意の組合せを含む１つ以上のヌクレオチドでありうるということである。１つ以上のヌクレオチドと塩基対合するヌクレオシド、例えば、イノシンまたは１つ以上の所望の特性を有する修飾ヌクレオチドの使用も意図される。所望の特性を有する修飾ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドより高い特異性または結合親和性を有するもの、例えば、固定核酸（ＬＮＡ）分子を含む。ＬＮＡとは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む核酸分子を指す（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ．２００３．ＬＮＡ：ａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓ．ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２）：７４−８１）。

ｍｉＲＮＡは５’末端から２〜７のヌクレオチド位置における配列相同性に基づき、ファミリーメンバーに分類される。従って、新規ｍｉＲＮＡファミリーメンバーを同定する方法は以下のようにＱＰＣＲプライマーを設計することを意図する：１）３’末端にて開始し、８位にて終止するヌクレオチドのすべてまたは大部分を除去し、２）ＱＰＣＲプライマーの５’末端に１つ以上のグアニンを付加する。従って、異なるｍｉＲＮＡファミリーメンバー間を識別する３’末端ヌクレオチドの大部分を除去するとともに、ヌクレオチド位置２〜７からのファミリー特異的部分を保持することは、新規ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの同定を可能にする。プライマーの５’末端への１つ以上のグアニンの付加は、ＱＰＣＲにおけるプライミング効率の向上を可能にする。次に、前記ＱＰＣＲプライマーは、新規ｍｉＲＮＡファミリーメンバーを含みうるＲＮＡ試料から調製されるｃＤＮＡと共にＱＰＣＲに含まれる。

これらの場合、関連ｍｉＲＮＡの検出は、増幅オリゴヌクレオチドと逆転写によって形成されるｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションを可能にする増幅反応条件を調整することによって達成されうる。従って、該方法は、ハイブリダイゼーション領域において既知のｍｉＲＮＡ配列と７０％以上同一の配列、例えば、８０％以上の同一性、９０％以上の同一性、９２％以上の同一性または９６％以上の同一性（またはこの範囲内の任意の整数または端数パーセント）を有する配列を有するｍｉＲＮＡを検出することができる。当然ながら、同一性の量は設計されたプライマーの配列に基づいて予め規定され、その量は所定の領域にわたって１００％同一であることが多い。

配列同一性を有する単一ｍｉＲＮＡまたは複数のｍｉＲＮＡを検出する方法であろうと、本発明の方法の１つの利点は、組織試料にわたり、または経時的に特定のｍｉＲＮＡの発現をモニタリングする能力である。特定のｍｉＲＮＡが特定の組織において、または発達の特定の時期に発現することは周知である。場合により、これらの発現パターンは組織が関連している患者の疾患または障害の状態と相関する。本発明を実施することにより、疾患または障害の進行または状態がモニタリングされうる。更に、所与のレベルの配列同一性を有する特定のｍｉＲＮＡまたは複数のｍｉＲＮＡの発現のモニタリングは、特定の疾患または障害に冒されている新たな組織を実施者が同定することを可能にする。モニタリングは、疾患または障害とｍｉＲＮＡまたはある一定レベルの配列同一性を有するｍｉＲＮＡとの新たな関連を実施者が確定することも可能にする。モニタリングは、疾患または障害に冒されている生命体に存在する、組織によって生じる応答を実施者が同定することも可能にする。例えば、癌を患っている患者における明らかに健常な組織と病変組織のモニタリングは、病変組織および健常組織における細胞応答を実施者が同定することを可能にし得、これは、治療法を開発し、または病態に直面した際に生命体が開始する応答を理解する上で役立ちうる。

好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡが細胞から単離され、ポリＡテールがｍｉＲＮＡの３’末端に付加され、本発明の逆転写−ＰＣＲ増幅アッセイによってｍｉＲＮＡが検出される。最も一般的に用いられる方法は、高溶解性の短いＲＮＡを除去しないように注意し、酸性化フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの組合せを用いてｍｉＲＮＡと全ＲＮＡとを同時精製することである（例えば、Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．，Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ．およびＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＳｍａｌｌＲＮＡＭｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．Ｂ．Ｒ．ら（編））第２６章４．１−４．１８（ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、ニューヨーク、２００３）を参照されたい。この方法では、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ポリＡメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む全ＲＮＡを単離する。所望とあれば、ｍｉＲＮＡはゲル精製を用いたサイズ選択により、全ＲＮＡから濃縮することができる（同書Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｓ．）。

あるいは、長いＲＮＡまたは約２００ヌクレオチド未満のＲＮＡに対して濃縮するため、有機抽出、次に、特殊な結合・洗浄溶液を用いたスピンカップフォーマットでのシリカベースのマトリクス上での精製を用いるｍｉＲＡＣＬＥ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いることができる。生じたＲＮＡ調製物（２００ヌクレオチド未満）は、ｍｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｎＲＮＡのために濃縮される。

加えて、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離するため、従来のチオシアン酸グアニジン法およびスピンカップフォーマットでのシリカベースのマトリクスを用いるＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙＲＮＡ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）が用いられる。溶解緩衝液における組織または培養細胞の溶解および均質化後、微粒子および大部分のＤＮＡ不純物を除去するため、試料は遠心分離によって前置フィルターに通される。浄化ホモジネートは有機溶媒と混合され、シリカベースのマトリクスＲＮＡ結合スピンカップに加えられる。ＲＮＡが洗浄された後、任意に、結合ＤＮＡはＤＮアーゼ消化により加水分解される。更なる洗浄により、ＤＮアーゼ、加水分解ＤＮＡおよび他の不純物が除去され、ＲＮＡが低イオン強度緩衝液によりスピンカップから溶出される。ゲノムＤＮＡがｍｉＲＮＡにおいて転写およびプロセシングされる配列を含むため、全ＲＮＡからのＤＮＡの除去は有益なステップである。全ＲＮＡにおけるその存在が誤った、または誤解を招く結果をもたらしうるため、ゲノムＤＮＡの完全除去が望ましい。本方法は小さいＲＮＡ（１００ヌクレオチド未満）を単離するように設計されていないが、生じるＲＮＡ調製物に有意な量のｍｉＲＮＡがあることが見出されている。これは、それらの同時単離をもたらすｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相互作用に起因すると思われる。

別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを含む小ＲＮＡに対する事前の単離または濃縮なしに、細胞溶解物において検出される。このような方法は、ポリアデニル化、逆転写およびＰＣＲ増幅アッセイを許容し、ＲＮＡ分解を許容しないであろう。好適な方法は、ＳｉｄｅＳｔｅｐ（商標）溶解・安定化緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の使用によって付与される溶解およびＲＮＡ安定化を含む。

典型的な一実施形態では、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を付与するステップと、存在する場合、ｍｉＲＮＡ種にポリＡテールを付加し、ポリＡテールを有するｍｉＲＮＡを形成するステップと、該ポリＡテールにアニールする逆転写用アダプタープライマーを付与するステップと、逆転写酵素を付与するステップと、該アダプタープライマー、該ポリＡテールを有するｍｉＲＮＡ種を含みうる試料および該逆転写酵素を組み合わせて混合物を作製するステップと、該混合物を少なくとも単一のｃＤＮＡ産物が形成されることを可能にする条件に晒すステップと、存在する場合、該ｃＤＮＡをユニバーサル逆方向プライマーおよびｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーに晒すステップと、該混合物を、存在する場合、該ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件に晒すステップと、増幅産物の有無を検出するステップとを含む。

本発明の方法は試料中のｍｉＲＮＡのわずか１，０００コピーを検出することができる。この結果は、数個から５０００００以上に及ぶと報告されている、種々の細胞におけるｍｉＲＮＡの既知のコピー数と遜色がない。従って、本発明の方法はわずか１個の細胞からｍｉＲＮＡを検出することができる。通常、試料は多くの細胞（例えば、何百万もの細胞）由来の細胞溶解物または精製細胞成分を含む。従って、本発明の方法は典型的な試料由来のｍｉＲＮＡの検出に好適である。当然ながら、検出パラメータは個々の実施者の速度および感度に対する要望に合うように調整されうる。従って、本発明の方法は細胞試料中のわずか１０００個のｍｉＲＮＡ分子を検出することができるが、それ以上、例えば、５００００分子、１０００００分子、２５００００分子、５０００００分子、１００００００分子またはそれ以上の分子を検出するためにも用いられうる。同様に、該方法はわずか１個の細胞（またはそれから作製される溶解物）における対象ｍｉＲＮＡを検出することができるが、多くの細胞（またはそれら由来の溶解物）、例えば、１０個の細胞、１００個の細胞、１０００個の細胞、１００００個の細胞、５００００個の細胞、１０００００個の細胞、５０００００個の細胞、１００００００個の細胞、１０００００００個の細胞またはそれ以上の細胞の試料中のｍｉＲＮＡを検出することもできる。当業者には明らかであるように、本発明の方法は、任意特定の数のｍｉＲＮＡ分子またはこれらの例示的な数の範囲内の細胞を検出することができ、従って、各々の特定の数を述べる必要はない。

本発明の別の態様では核酸が提供される。概して、核酸は、本発明による検出法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用な核酸であり、または本発明によるプライマー設計法の少なくとも１つの実施形態によって生じる。従って、核酸は、ポリＡテール分子、逆転写オリゴヌクレオチド（アダプタープライマー）、増幅プライマー、ｃＤＮＡ分子（例えば、増幅鋳型）、ｍｉＲＮＡ（陽性対照用として）、ポリＡテールを有するＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＴ鋳型対照）および該方法の１つ以上のステップのための対照として機能を果たすことができる他の核酸でありうる。当然ながら、実施形態では、核酸は本発明によるプライマーである。

本発明によって提供される第一のクラスの核酸はポリＡテール分子である。ポリＡテールにおけるアデニンの数は約５から約１０００まで様々でありうる。実施形態では、該テールは、約２０〜約３００個のアデニン、例えば、約２０〜約２００、約５０〜約１５０および具体的には述べない他の任意の範囲のアデニンを含む。上述のように、このクラスの核酸はポリＡテールが付加された後のポリアデニンおよびｍｉＲＮＡを含む分子を含む。

本発明によって提供される第二のクラスの核酸は逆転写オリゴヌクレオチド（アダプタープライマー）である。逆転写オリゴヌクレオチドは、適切な条件下で標的ｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる、任意の好適な長さのオリゴヌクレオチドである。本発明の逆転写オリゴヌクレオチドは、標的ｍｉＲＮＡの３’末端において見出されるポリＡテールと完全または部分的に相補的な領域を含みうる。逆転写オリゴヌクレオチドはポリＡテールにアニールし、重合によって伸長する。あるいはまたは更に、プライマーはＰＣＲプライミング部位（またはＰＣＲプライミング部位と相補的な配列）を含みうる。あるいはまたは更に、アダプタープライマーはＰＣＲプライミング部位（または相補体）とポリＡテールとの間にスペーサー領域も含みうる。

逆転写における標的ｍｉＲＮＡに対するアダプタープライマー（または本発明の他のプライマー）およびＰＣＲ増幅におけるｃＤＮＡに対する順方向および逆方向プライマーの融解温度（Ｔｍ）を推定する様々な方法が利用可能である。Ｔｍはヌクレオチド配列およびその完全な相補体の５０％が二重である温度である。これらの方法は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドおよびＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＴｍの推定に適用される。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍを推定する方法は、各Ａ：Ｔに対する２℃および各Ｇ：Ｃに対する４℃により得られる大ざっぱな推定（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｂｏｎｎｅｒ，Ｔ．ＨｉｒｏｓｅおよびＫ．Ｉｔａｋｕｒａ，１９７９．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．６，３５４３）からＭｆｏｌｄによって用いられる最近隣法（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．２００３．Ｍｆｏｌｄｗｅｂｓｅｒｖｅｒｆｏｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｏｌｄｉｎｇａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１（１３）：３４０６−３４１５並びにＭａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｊ．Ｓａｂｉｎａ，Ｍ．ＺｕｋｅｒおよびＤ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ．１９９９．ＥｘｐａｎｄｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｐｅｎｄｅｎｃｅｏｆＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃＰａｒａｍｅｔｅｒｓＩｍｐｒｏｖｅｓＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＲＮＡＳｅｃｏｎｄａｒｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０）に及ぶ。Ｍｆｏｌｄはヌクレオチド配列の作用に基づき、Ｔｍを推定する最も正確な方法であるとみなされている。

最近になり、アンチセンス技術に用いるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＴｍを推定する方法が開発された（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｓ．Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｋａｔｏｈ，Ａ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｈ．Ｎａｋａｍｕｔａ，Ｔ．Ｏｈｍｉｃｈｉ，Ｍ．ＹｏｎｅｙａｍａおよびＭ．Ｓａｓａｋｉ．１９９５．ＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｔｏｐｒｅｄｉｃｔｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＲＮＡ／ＤＮＡｈｙｂｒｉｄｄｕｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３４（３５）：１２，２１１−１２，１１６；Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｍ．，１９９７．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｆｒｏｍｄａｔａｏｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．ＩＩ．ＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆＤＮＡ：ＲＮＡｈｙｂｒｉｄｓａｎｄＤＮＡｄｕｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．４２（７）：７９５−８１０）並びにＬｅＮｏｖｅｒｅ，Ｎ．，２００１．ＭＥＬＴＩＮＧ，ｃｏｍｐｕｔｉｎｇｔｈｅｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｕｐｌｅｘ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１７（１２）：１２２６−１２２７）。ＲＮＡ：ＲＮＡ，ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡ：ＤＮＡの安定性を比較すると、最も安定な二本鎖はＲＮＡ：ＲＮＡであった。ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のいずれがより安定であるかはヌクレオチド配列に依存した。この配列依存は、最近隣法を用いてＤＮＡ：ＲＮＡベースのＴｍを計算する際に考慮される（ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｍｅｌｔｉｎｇ．ｈｔｍｌ）。ＤＮＡおよびＲＮＡベースのオリゴに対する最近隣式は、（１）Ｔｍ＝（１０００ΔＨ／Ａ＋ΔＳ＋Ｒｌｎ（Ｃ／４））−２７３．１５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ＋］（ＤＮＡについては、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，Ｋ，Ｊ．，Ｒ．Ｆｒａｎｋ，Ｈ．Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｍａｒｋｙ，１９８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３７４６−３７５０を、ＲＮＡについては、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｒ．Ｋｉｅｒｚｅｋ，Ｊ．Ａ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｎ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔ．Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ，１９８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９３７３−９３７７を参照されたい）である。ΔＨ（Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は二本鎖の最近隣エンタルピー変化の総計である。Ａはヘリックス開始の補正を含む定数である。ΔＳは最近隣エントロピー変化の総計である。Ｒは気体定数（１．９９ｃａｌＫ^−１ｍｏｌ^−１）であり、Ｃはオリゴヌクレオチドの濃度である。ＤＮＡおよびＲＮＡの最近隣相互作用の例示的なΔＨおよびΔＳ値が表１に示される。多くの場合、この等式では経験値からわずか５℃の値が得られる。この等式が塩濃度のために調整すべき因子を含むことに留意することが好ましい。

これらの方法は二本鎖のＴｍを推定するのに有用であるが、本発明の二本鎖のＴｍを実験的に求める方法も有用である。一般的な方法は、紫外分光光度計にて温度制御された細胞を用い、一連の温度にわたって吸光度を測定することである。温度が吸光度に対してプロットされると、２つの平坦域を有するＳ字型曲線が認められる。該平坦域の中間での温度読み取りがＴｍに対応する。あるいは、温度対吸光度を有するプロットを作成するため、一本鎖核酸より高い親和性で二本鎖核酸に結合する核酸染料、例えば、ＳＹＢＲグリーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）を含む試料を用いたＭＸ３０００Ｐのようなサーモサイクラーが用いられる。

この時点で、本開示において述べられる各値が、別記しない限り、その特定の値に正確に限定されるということではないことに留意すべきである。むしろ、それは、表示値およびその周囲の統計的に有意ではない任意の値を示すものである。一般に、別記せず、または本開示の文脈から明らかでない限り、各値は表示値の上下５％の固有範囲を含む。時には、この概念は「約」という用語の使用に捉われる。しかし、数字に関連する「約」という用語が存在しないことは、値が「正確に」または「厳密に」を意味するように意図されていることを示さない。むしろ、値がそれほど限定されていることを理解するのは、「正確に」または「厳密に」という用語（または正確さを明確に示す別の用語）が用いられる場合のみである。このような場合、表示値は記載の有意な数字に基づく丸め（ｒｏｕｎｄｉｎｇ）の通常の規則により規定される。従って、例えば、値「１００」の記載は９５〜１０５の任意の整数または端数値を意味し、一方、値「厳密に１００」の記載は９９．５〜１００．４を意味する。

ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーが、対象とするｍｉＲＮＡから生じるｃＤＮＡ上の標的配列とハイブリダイズすることができるが、その標的配列との１００％の同一性を示し得ない配列を含みうるという事実に鑑み、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーが他のｍｉＲＮＡ、例えば、対象とするｍｉＲＮＡに関連するｍｉＲＮＡから生じるｃＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができることは明らかである。従って、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーは、既知のｍｉＲＮＡとのある一定レベルの配列同一性を有する未知のｍｉＲＮＡを同定するために用いることができる。同様に、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーが同じｍｉＲＮＡファミリーの２つ以上のメンバーに結合し、これを検出するように、ｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよび／またはハイブリダイゼーション条件は調整することができる。このようにして、ファミリーメンバーが試料中に存在する程度の全般的理解が得られる。このような状況では、実施者が検出されたファミリーの個々のメンバーを同定することを所望する場合、ハイブリダイゼーション条件は調整され得、またはｍｉＲＮＡ特異的プライマーの配列は修飾されうる。ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＨｉｇｇｉｎｓＤ．，Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｔ．Ｊ．Ｇｉｂｓｏｎ．１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｇａｐｐｅｎａｌｔｉｅｓａｎｄｗｅｉｇｈｔｍａｔｒｉｘｃｈｏｉｃｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：４６７３−４６８０）を用いてなされるｍｉＲＮＡ間のｉｎｓｉｌｉｃｏヌクレオチド配列比較は、１つ以上のｍｉＲＮＡを検出するプライマーの設計に役立つ。

アダプタープライマー、逆転写のｃＤＮＡ産物、ｍｉＲＮＡ鋳型およびＰＣＲプライマー内およびそれらの間の分子内および分子間相互作用は、望ましくない副反応を生じさせうる。分子内相互作用は、塩基対よりもループに自由エネルギーを割り当てるために最近隣エネルギー則を用いるＭｆｏｌｄ（バージョン３．１）（上記Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．）のようなプログラムを用いて推定される。分子間相互作用は、ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎｅｒ４．０（ＳｃｉＥｄＣｅｎｔｒａｌ社）のような一般的なプライマー設計プログラムを用いて推定される。当業者は所望の特異性レベルに基づいて基準を選択することができる。

潜在的に有用な配列と公開されているヒトゲノムＤＮＡとのｉｎｓｉｌｉｃｏヌクレオチド配列比較は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．１９９０．Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて行うことができる。この方法は有用であるが、ｉｎｓｉｌｉｃｏでの知見を実証するため、潜在的に有用な配列および鋳型としての対象生命体由来のゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ（例えばヒトゲノムＤＮＡ）を用いたＱＰＣＲを行うべきであることが見出されている。

ポリＡ結合部位に加え、アダプタープライマーは長さを付与する非結合ヌクレオチドおよび、任意に、他の特徴を含みうる。これらの非ポリＡ結合ヌクレオチドはアダプタープライマーに無作為に含めることができ、またはそのようなヌクレオチドの配列は特定の目的のために設計することができる。実施形態では、増幅プライマーまたは検出プローブのような１つ以上の短いオリゴヌクレオチドに結合部位を付与するように、非結合ヌクレオチドは１つ以上の特定の配列あるいはアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン（または、実施者の所望により、ウラシル）の相対量に特異的に含まれる。実施形態では、正確かつ強固な増幅を促進するため、ＰＣＲ増幅において用いられるｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーと同様の融解温度を有する増幅プライマー結合部位を設計することが望ましい場合がある。

アダプタープライマーはポリＡ結合配列に加え、配列特異的機能を付与しない配列を含みうる。これらは様々な時に本明細書で「スペーサー」または「リンカー」配列と称される。これらのスペーサーまたはリンカー配列は、主に、アダプタープライマーに長さを付与し、従って、オリゴクレオチドにより長さが広範に異なる。一般に、アダプタープライマーは約１〜２５０ヌクレオチド以上である。概して、リンカー配列の設計はＰＣＲプライマーに対して考慮すべき一般的事柄に従うべきである（例えば、試験生命体のゲノムの配列との有意な相同性がない、有意な二次構造がない）。

実施形態では、従って、アダプタープライマーは逆転写から生じるｃＤＮＡの長さを延ばすスペーサー配列を含む。スペーサーによって得られる利点の中でも、長さの延長は、検出のためにＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）を用いる場合、ＱＰＣＲに効率的な鋳型を付与することができる。実施形態では、ＰＣＲプライミング部位とポリＡアニーリング配列との間で、アダプタープライマーに無作為に生成された配列を付加することができる。所望とあれば、これらは、１）プライマー設計ソフトウェア（ＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎｅｒ４．０）を用いて分子間相互作用、２）分子内相互作用（Ｍｆｏｌｄ）および３）ヒトゲノムとの相同性（ＢＬＡＳＴ）について分析することができる。これらは、それぞれのＴｍ並びに好適な特性を有するオリゴヌクレオチドを得るために改変された種々のヌクレオチドの固有性および／または位置についても分析することができる。

アダプタープライマー上に付与されうる他のヌクレオチド配列は、限定されるわけではないが、検出部分の結合のための配列（例えば、ＴａｑＭａｎ結合配列）、配列特異的捕捉プローブのための配列、追加増幅プローブのための配列、制限エンドヌクレアーゼ認識および／または切断部位並びに核酸修飾酵素の認識または修飾部位（例えば、メチル化部位）であることが公知の配列を含む。このような配列の付加はアッセイ時にいくつもの追加情報が生じることを可能にする。例えば、ＴａｑＭａｎ結合配列の付加は多重化を可能にする。従って、一実施形態では、アダプタープライマーは、プローブの５’末端に位置しうるフルオロフォアおよび内在的若しくはプローブの３’末端に位置するクエンチャーを有する加水分解プローブのアニーリングを可能にするプローブ結合領域を含む（例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｆｏｃｋｌｅｒ，Ｃ．，Ｄｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．およびＷａｔｓｏｎ，Ｒ．ＫｉｎｅｔｉｃＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓ：ｒｅａｌ−ｔｉｍｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｓ．１９９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１１（９）：１０２６−３０並びにＨｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．，Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｒ．およびＧｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅ５’――−３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１６）：７２７６−８０を参照されたい）。標的ｍｉＲＮＡの検出に加水分解プローブが用いられる場合、ＦｕｌｌＶｅｌｏｃｉｔｙ（商標）ＱＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いることができる。

本発明によって提供される次のクラスの核酸は、逆転写の結果であるｃＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡ分子は任意の長さでよいが、通常、３５〜５００ヌクレオチド長の範囲内である。一部の実施形態では、ｃＤＮＡ分子は６０〜１２０ヌクレオチド長である。ｃＤＮＡ分子はいくつもの既知の手法によりそれ自体を検出することができ、あるいは増幅、消化およびサブクローニングのための鋳型として機能を果たし、または一本鎖核酸を用いることができる他の任意の手法において他の機能を果たすことができる。従って、実施形態では、ｃＤＮＡ分子はその配列全体にわたり、１つ以上のポイントにおいて１つ以上の標識または標識系のメンバーを含む標識産物である。更に、ｃＤＮＡ分子は、いくつもの他の目的、例えば、分子量若しくは発光基準、またはｃＤＮＡが生成された特定の標的ｍｉＲＮＡを検出する本発明の方法のその後の実施のための陽性対照としての使用に用いられうる。

本発明によって提供される次のクラスの核酸は増幅プライマーである。増幅プライマーは、鋳型核酸由来の核酸の重合をプライミングする機能を果たすことができる任意のオリゴヌクレオチドである。当業者は、互いに関連して確実かつ強固に機能し、同じ鋳型から対象とする二本鎖核酸産物を形成するプライマー組を含む、増幅プライマーを生成するための手法および考慮事項を熟知している。本発明に従って、ｍｉＲＮＡ特異的増幅プライマーは、本発明のプライマー設計プロトコルにより設計され、アダプタープライマーの増幅プライマー結合部位と関連して設計され、また、逆の場合も同様である。独特の、または異なる逆方向増幅プライマー配列（およびｃＤＮＡ上の対応する結合部位）を設計する利点があると想定されるが、逆方向プライマーのための標準的増幅プライマー配列、従って、アダプタープライマー上の標準的増幅結合配列の使用が、標的ｍｉＲＮＡの固有性にかかわらず、確実に一貫して再現することができ、または少なくとも変動量を減少させることができる単一の標準的増幅手法を提供する点で有利でありうることも想定される。従って、実施形態では、逆方向増幅プライマーは、５０〜５００ヌクレオチド長の核酸の高忠実度増幅に有用であると当技術分野において公知のプライマーの中から選択される。他の実施形態では、逆方向増幅プライマーはｃＤＮＡ上に存在する選択配列に基づいて生成され、あるいは無作為に生成され、適合性および特異性について試験される。当然ながら、順方向ｍｉＲＮＡ特異的プライマーは標準的ではなく、本発明のプライマー設計プロトコルに従って設計される。

逆方向増幅プライマーは高い特異性でアダプタープライマーの増幅結合部位に結合するように設計される。実施形態では、逆方向増幅プライマーはかなり高い融解温度（例えば、６２℃以上）を有するように設計することができる。各特定のプライマーの長さおよびヌクレオチド組成は如何なる因子にも限定されない。但し、プライマーが組み入れられる組成物中にｃＤＮＡが存在する場合、そのためにプライマーが設計されたｃＤＮＡを許容可能に増幅する機能を果たすプライマーを生成するように、順方向および逆方向プライマー（単数または複数）は併せて選択されるべきである。ｃＤＮＡがｃＤＮＡの配列の結果として１つ以上の二次構造領域を含む実施形態では、増幅プライマーはｃＤＮＡの二次構造が融解する温度を超える温度でｃＤＮＡに特異的に結合することが好ましいが、必要ではない。

当然ながら、当技術分野において公知であるように、逆方向増幅プライマーは標的配列への結合に関与する配列以外の配列を含むことができる。従って、これは５’末端において、いくつもの機能を果たすことができる非結合ヌクレオチドを含みうる。この機能の中に含まれるものは、１）元鋳型と比べた増幅産物の長さの延長（例えば、ヌクレオチドに制限エンドヌクレアーゼ結合を付与する）、２）制限エンドヌクレアーゼ切断部位の含有、３）標識若しくは後の標識化のための基質の付与、４）捕捉若しくは精製のための配列の付与、５）Ｔｍの調整および６）実施者により意図される他の任意の機能である。要約すれば、逆方向増幅プライマーは、長さ、ヌクレオチド含量または配列において限定されるわけではないが、通常、１８〜３０塩基長であり、４０〜６０％のＧ＋Ｃ含量を含み、約５２℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有し、試験下の生命体のゲノム配列との有意な相同性を示さず、プライマー間に形成される有意な二次構造または構造を示さず（例えば、ＺｕｃｋｅｒのＭｆｏｌｄプログラムを用いて）、３’チミジンを有さず、３’末端において多数のＧまたはＣを有さない。主な考慮事項は、プライマーがｃＤＮＡ産物を特異的に増幅する機能を果たすことである。

本発明によって提供される次のクラスの核酸は増幅産物である。増幅産物はｃＤＮＡを増幅することから生じる産物である。増幅産物はｃＤＮＡ鋳型と同じ配列を含み得、またはｃＤＮＡ鋳型と異なりうる。例えば、増幅産物はより長く、標識、標識基質、制限エンドヌクレアーゼ結合／切断部位、多数のプライマー結合部位、検出部位および／または加水分解プローブ結合部位を含みうる。同様に、増幅産物はｃＤＮＡより短い場合もある。その鋳型ｃＤＮＡより短い増幅産物はそれでもｃＤＮＡ鋳型に存在しない１つ以上のヌクレオチド配列を含み得、制限エンドヌクレアーゼ結合／切断部位、プライマー結合部位、標識若しくは標識基質、検出部位および／または加水分解プローブ結合部位を含むが、これらに限定されない。検出に有用であり、従って、対象試料中の標的ｍｉＲＮＡの有無の指標であることに加え、増幅産物はｃＤＮＡと同様に用いることができる。従って、特に、増幅産物は逆転写反応の対照として、またはｍｉＲＮＡの検出の対照として用いられうる。

本発明によって提供される核酸のクラスの別の非限定的な例は、試料中に検出されるｍｉＲＮＡである。本発明は、特定のｍｉＲＮＡを特異的に検出し、既知のｍｉＲＮＡとの配列同一性を有するｍｉＲＮＡを検出し、あるいはｍｉＲＮＡおよび／または既知のｍｉＲＮＡとの配列同一性を有するｍｉＲＮＡを検出するプライマーを設計するため、特定のｍｉＲＮＡの既知の配列が検出されることに依拠する。ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、逆転写の陽性対照として機能し、または実施者により選択される他の任意の目的を果たすために本発明によって提供されうる。多くのｍｉＲＮＡ配列が公的に利用可能であり、当業者は標準的な分子生物学的手法を用いてこれらのいずれをも生成しうる。

更なる態様では、本発明は組成物を提供する。通常、該組成物は、本発明の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用であり、または本発明の方法の少なくとも１つの実施形態の実施を通じて生成される１つ以上の成分を含む。該組成物はその物理的形態において限定されるわけではないが、通常、固体または液体またはこれらの組合せである。更に、該組成物は、反応容器（例えば、マイクロチューブ、ＰＣＲチューブ、プラスチックマルチウェルプレートおよびマイクロアレイ）、バイアル、アンプル、ビン、バッグなどを含むが、これらに限定されない任意好適な環境に存在しうる。組成物が本発明による単一物質を含む状況では、通常、該組成物は、他の何らかの物質、例えば、水若しくは水性溶液、１つ以上の塩、緩衝剤および／または生体物質を含む。本発明の組成物は、任意の割合または形態での本発明の１つ以上の他の成分を含みうる。同様に、本発明の組成物は、ポリＡテール付加、逆転写、ｃＤＮＡの増幅または上記の任意の組合せに必要な一部またはすべての試薬または分子を含みうる。従って、組成物は、ＡＴＰ、マグネシウム若しくはマンガン塩、ヌクレオチド三リン酸などを含みうる。組成物は本発明の標識核酸からのシグナルの生成に必要な一部またはすべての成分も含みうる。概して、組成物は、本発明の核酸を含み、または本発明の核酸を作製若しくは検出するのに用いることができる任意の組成物でよい。

本発明の組成物は１つ以上のアダプタープライマーおよび／または増幅プライマーを含みうる。プライマーは、例えば、精製または部分精製された状態での組成物の主成分として提供され得、または微量成分でありうる。プライマーは、任意数のコピー、任意量または任意濃度での本発明による任意のアダプターまたは増幅プライマーでよい。実施者はその時点で想定される特定の用途に基づき、好適な量および濃度を容易に決定することができる。従って、本発明による組成物は単一のアダプターまたは増幅プライマーを含みうる。組成物は、その各々が組成物中の他のすべてと異なる配列を有し、または異なる標識若しくは標識能を有する、２つ以上のアダプターまたは増幅プライマーも含みうる。アダプターまたは増幅プライマーを含む本発明の組成物の非限定的な例は、１つ以上のアダプタープライマーと、対象とするｍｉＲＮＡ若しくはポリＡテールを有する対象ｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料とを含む組成物を含む。他の非限定的な例は、１つ以上のアダプタープライマー、１つ以上の増幅プライマーおよび対象とするｍｉＲＮＡを含み、若しくは含むと思われる試料を含む組成物を含む。更に他の非限定的な例は、少なくとも１つの増幅プライマー、少なくとも１つのアダプタープライマー、標的ｍｉＲＮＡを含み、若しくは含むと思われる試料および適切な条件下でｃＤＮＡを生成することができる逆転写酵素を含む組成物を含む。組成物の更に別の非限定的な例は、直上に列挙された成分を含み、更に、適切な条件下で少なくとも１つの増幅プライマーの重合を触媒し、ポリヌクレオチドを形成することができる、少なくとも１つのポリメラーゼを含む組成物である。更なる非限定的な例では、組成物は１つ以上の増幅プライマーおよびｃＤＮＡを含みうる。更なる非限定的な例は、少なくとも１つの増幅プライマーおよび増幅産物を含む組成物を含む。実施形態では、組成物は、二本鎖核酸増幅産物を生成するために共に機能するように設計された２つ以上の増幅プライマーを含む。特定の実施形態では、組成物は標識または標識系のメンバーを含む。一部の実施形態では、単一組成物中に多数の増幅プライマーが存在し、その中には１つの特定のｃＤＮＡに特異的なものもあれば、１つ以上の他のｃＤＮＡ分子に特異的なものもある。

あるいは、本発明の組成物は増幅産物を含みうる。増幅産物は本発明の方法の実施を通じて標的ｍｉＲＮＡから得られる（または最終的に生成された）任意の核酸でよい。本発明の核酸を含む他の組成物と同様に、増幅産物を含む組成物は任意数のコピー、量または濃度にてそれを含みうる。増幅産物は、精製または部分精製形態にて得られる場合のように、組成物中の主要物質として得られ得、または組成物中に微量物質として存在しうる。本発明の組成物の非限定的な例は、増幅産物および標的ｍｉＲＮＡを含む試料を含む組成物を含む。他の非限定的な例は、増幅産物および少なくとも２つの増幅プライマーを含む組成物を含む。他の非限定的な例は、組成物が増幅産物および少なくとも１つのポリメラーゼを含む組成物を含む。更に他の非限定的な例は、増幅産物および標識系の少なくとも１つのメンバーを含む組成物を含む。更に別の非限定的な例は、増幅産物および少なくとも１つの逆転写酵素を含む組成物を含む。他の非限定的な例は、増幅産物およびｃＤＮＡ分子を含む組成物を含む。更なる非限定的な例は、標的ｍｉＲＮＡ、少なくとも１つのアダプタープライマー、少なくとも１つの逆転写酵素、ｃＤＮＡ分子、少なくとも１つの増幅プライマー、少なくとも１つのポリメラーゼおよび増幅産物を含む組成物を含む。実施形態では、組成物は、少なくともある程度、核酸を単離または精製するのに適したアガロース、ポリアクリルアミドまたは他の何らかのポリマー物質を含む。実施形態では、組成物は、核酸が結合することができるナイロン、ニトロセルロースまたは他の何らかの固体支持体を含む。一部の実施形態では、組成物は少なくとも１つの標識または標識系のメンバーを含む。単一組成物中に２つ以上の異なる増幅産物が存在しうる。

本発明の組成物は１つ以上のヌクレオチジルトランスフェラーゼ、特に、ポリＡポリメラーゼを含みうる。該ポリメラーゼは、ホモポリマーテールをｍｉＲＮＡに付加するのに有用であるとして当業者に周知の任意のポリメラーゼでよい。従って、該ポリメラーゼは、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼＩでよい。この酵素はその高い処理能力、一本鎖ＲＮＡ分子に対する特異性のため、本方法において特に価値があり、ポリＡテールをＲＮＡに付加するその能力は配列非依存的である。

本発明の組成物は１つ以上の核酸ポリメラーゼを含みうる。該ポリメラーゼは、一本鎖の核酸をヌクレオチド塩基の取り込みのための鋳型として用いて、プライマーから核酸分子を重合するのに有用であるとして当業者に周知の任意のポリメラーゼでよい。従って、該ポリメラーゼは、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたはその組合せ、変異体若しくは融合タンパク質でよい。

本発明の組成物は１つ以上の緩衝液を含みうる。ＰＣＲ反応緩衝液組成物はＰＣＲ反応のための緩衝液において用いられる任意の既知の化学物質および試薬を含みうる。例えば、該緩衝液組成物は、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリシンまたはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）から選択される緩衝組成物を含みうる。この量は１ｍＭ〜５００ｍＭのように反応に適切な緩衝を与える量であり、例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭまたは２５０ｍＭである。実施形態では、該緩衝組成物は７．０〜８．５または７．５〜８．０のような６．５〜９．５のｐＨ範囲、例えば、６．８，７．２，７．８，８．２，８．８，９．０または９．２を有する。ＰＣＲ反応緩衝液は０．５〜２０ｍＭの範囲、例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭまたは１５ｍＭのＭｇ^２＋（例えば、ＭｇＣｌ_２またはＭｇＳＯ_４）を含みうる。該緩衝液は０．１〜１００ｍＭの範囲、例えば、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたは２５ｍＭのＫ^＋（例えば、ＫＣｌ）も含みうる。一部の実施形態では、該緩衝液はＰＣＲ収率を高める成分（例えば、０．１〜５０ｍＭの範囲、例えば、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭまたは２５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）を含む。実施形態では、該緩衝液は１つ以上の非イオン性洗浄剤（例えば、０．１％〜１０％の範囲、例えば、０．５％、１％または５％のＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０またはＢｒｉｊ（登録商標）、ＮＰ４０）を含む。あるいは、該緩衝液は１つ以上の界面活性剤（０．０００１〜１０％）を含む。該緩衝液は０．１〜５００μｇ／ｍｌの範囲、例えば、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ，１５０μｇ／ｍｌ，２００μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌのＢＳＡも含みうる。当然ながら、各々の特定の値を本明細書で具体的に列挙する必要なしに、これらの範囲内の如何なる特定の値も当業者には直ちに明らかとなり、そのようなものとして、各値は具体的に列挙されたものとして理解されるべきである。

他のＰＣＲ添加剤もＰＣＲ反応の精度および特異性に影響を与えうる。例えば、２ｍＭ未満、例えば、１ｍＭ，０．５ｍＭまたは０．１ｍＭ以下でのＥＤＴＡが増幅反応混合物中に存在しうる。更に、またはあるいは、Ｔｗｅｅｎ−２０（商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０およびＢｒｉｊ（登録商標）のような洗浄剤が酵素希釈緩衝液中に存在しうる。０．０１％〜０．１％のような約０．１％以下、例えば、０．０１％、０．０２％または０．０５％の非イオン性洗浄剤の最終濃度が適切であり、これは、ポリメラーゼ活性を有意に妨げないはずの量である。同様に、グリセロールが酵素調製物に存在する場合が多く、一般に、反応混合物中１〜２０％の濃度に希釈される。高ＧＣ含量または長い長さ（例えば、１ｋｂ超）を有する鋳型ＤＮＡのＰＣＲ反応において、グリセロール（約５〜１０％）、ホルムアミド（約１〜５％）および／またはＤＭＳＯ（約２〜１０％）を加えることができる。これらの添加剤は、プライマー‐鋳型ハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融解温度）およびポリメラーゼ酵素の熱安定性を変化させうる。ベタイン（０．１〜２Ｍ）もＤＮＡの高ＧＣ含量および長い断片にわたるＰＣＲに有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、５０ｍＭ超）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）も用いられうる。上述の各添加剤の最適濃度を決定するため、ＰＣＲ試験反応が実施されうる。

本発明は、限定されるわけではないが、抗体（ホットスタートＰＣＲ用）およびｓｓｂ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質；より高い特異性）を含む添加剤を提供する。本発明は、例えば、米国特許第６３３３１５８号およびＷＯ０１／０９３４７Ａ２（その全体を参照して本明細書に組み込まれる）に述べられているように、補助因子と組み合わせた変異古細菌ＤＮＡポリメラーゼも意図する。

Ｍｇ^２＋濃度は、プライマー‐鋳型相互作用を安定化させることにより、オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングに影響を与え得、鋳型‐プライマーとのポリメラーゼの複製複合体も安定化させると考えられている。従って、更に、Ｍｇ^２＋濃度は非特異的アニーリングを増大させ、望ましくないＰＣＲ産物を生成しうる（ゲル中の多数のバンドを生じさせる）。非特異的増幅が生じる場合、増幅の精度および特異性を高めるため、Ｍｇ^２＋を低下させる必要があり得、またはＥＤＴＡを加えて過剰Ｍｇ^２＋をキレートすることができる。

Ｍｎ^２＋またはＣｏ^２＋のような他の二価カチオンもＤＮＡ重合に影響を与えうる。各ＤＮＡポリメラーゼに好適なカチオンは当技術分野において公知である（例えば、上記ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ第二版中）。通常、二価カチオンは、ＭｇＣｌ_２，Ｍｇ（ＯＡｃ）_２，ＭｇＳＯ_４，ＭｎＣｌ_２，Ｍｎ（ＯＡｃ）_２またはＭｎＳＯ_４のような塩の形態で供給される。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度は、ＭｎＣｌ_２では０．０５〜２０ｍＭ、例えば、０．１〜１０ｍＭ、例えば、０．５〜２ｍＭであり、ＭｇＣｌ_２では０．５〜１０ｍＭである。Ｂｉｃｉｎｅ／ＫＯＡｃ緩衝液中の使用可能なカチオン濃度は、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２では１〜２０ｍＭ、好ましくは、２〜５ｍＭである。

ＤＮＡポリメラーゼに必要な一価カチオンは、塩化物または酢酸塩のカリウム、ナトリウム、アンモニウムまたはリチウム塩により供給されうる。概して、ＫＣｌでは濃度は１〜２００ｍＭ、例えば、４０〜１００ｍＭであるが、最適濃度は反応において用いられるポリメラーゼにより異なりうる。

デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、二ナトリウムまたはリチウム塩のようなｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄＴＴＰの塩の溶液として加えられる。本発明の方法では、各々１μＭ〜２ｍＭの範囲内の最終濃度が妥当であり、１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は、総ｄＮＴＰおよび二価金属イオン濃度並びに緩衝液、塩、特定のプライマーおよび鋳型によりＰＣＲ反応において異なりうる。比較的長い産物、即ち、１５００ｂｐ超では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いる場合、５００μＭの各ｄＮＴＰが好ましい場合がある。

ｄＮＴＰは二価カチオンをキレートし、従って、使用する二価カチオンの量は反応におけるｄＮＴＰの濃度に従って変更する必要がありうる。過剰量のｄＮＴＰ（例えば、１．５ｍＭ超）はエラー率を高め、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する可能性がある。ｄＮＴＰを低下させる（例えば、１０〜５０μＭまで）ことがエラー率を低下させうる。より大きいサイズの鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応は、より多くのｄＮＴＰを必要としうる。

標準的ＰＣＲ反応緩衝液中の緩衝成分のｐＨは８．３〜８．８である。しかし、必要に応じて他のｐＨ範囲が用いられうる。例えば、増幅プロセスの特定の目的または酵素若しくは反応混合物の他の任意の成分により、異なるｐＨ範囲が必要とされうる。特に、化学修飾ポリメラーゼとの使用ではｐＨ８．０が必要とされうる。

本発明の更に別の態様ではキットが提供される。本発明によるキットは、本発明の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに有用な少なくとも１つの成分を提供する。従って、本発明によるキットは、試料中のｍｉＲＮＡの存在を検出するのに必要な一部またはすべての成分を提供することができる。典型的な実施形態では、キットは本発明の核酸を含む少なくとも１つの容器を含む。種々の特定の実施形態では、該キットは本発明の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに必要な核酸をすべて含む。

キットは、本発明の１つ以上の核酸または組成物を含む１つ以上の容器を含むパッケージと大まかに定義づけられる。該キットそれ自体は、限定されるわけではないが、ボール紙、金属、ガラス、プラスチック、または生体試料、研究試薬若しくは物質を包装および保存するのに有用であることが公知の他の何らかのポリマー材料を含む、任意好適な材料から製造されうる。該キットは１つ以上の容器を保持するように設計され得、そのような容器の各々は本発明の１つ以上の核酸、組成物または試料を保持するように設計される。該容器は、限定されるわけではないが、ガラス、金属、プラスチックまたは他の何らかの好適なポリマー材料を含む任意好適な材料から製造されうる。各容器は、材料、形状およびサイズについて独立して選択されうる。容器の非限定的な例は、チューブ（例えば、マイクロチューブ）、バイアル、アンプル、ビン、ジャー、バッグなどを含む。各容器はパーマネントシールまたは再密閉可能なシール、例えば、スクリューキャップで密閉されうる。該キット内の１つ以上の容器は該キットへの封入前後に滅菌されうる。

特定の実施形態では、該キットは少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーを含む。これらのプライマーは異なる容器にて別個に、または単一容器にて共に提供されうる。同様に、複数の容器が提供され得、各々が少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーを含む。実施形態では、該キットは、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的の存在を検出するために用いることができる複数の異なるｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーを含む。

特定の実施形態では、該キットは少なくとも１つのアダプタープライマーを含む。種々の構成では、該アダプタープライマーは別個の容器にて別個に、または単一容器にて共に提供される。更に、種々のアダプタープライマーおよび逆転写酵素を含む複数の容器が提供され得、各々が独立して１つ以上の該プライマーおよび逆転写酵素を含む。

実施形態では、該キットは１つ以上のＰＣＲプライマーを含む。従って、実施形態では、該キットは２つのＰＣＲプライマーを含む。他の実施形態では、該キットは、少なくとも１つのアダプタープライマー、少なくとも１つの逆転写酵素および少なくとも１つの合成ｍｉＲＮＡを含む。更に他の実施形態では、該キットは、少なくとも１つのｃＤＮＡ、少なくとも１つのＰＣＲプライマー（例えば、２つのプライマー）および少なくとも１つのポリメラーゼを含む。更に他の実施形態では、該キットは、少なくとも１つのアダプタープライマー、少なくとも１つの逆転写酵素および少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。

ある実施形態では、該キットは、特定の標的ｍｉＲＮＡの検出のための少なくとも１つのアダプタープライマー、該特定の標的ｍｉＲＮＡからｃＤＮＡを生成することができる、少なくとも１つの逆転写酵素、およびｃＤＮＡを増幅することができる、少なくとも２つの増幅プライマーを含む。更に他の実施形態では、該キットは、特定の標的ｍｉＲＮＡの検出のための少なくとも１つのアダプタープライマー、および逆転写から生成されるｃＤＮＡを特異的に増幅する、少なくとも２つの増幅プライマーを含む。該キットの種々の構成では、少なくとも１つのポリメラーゼが含まれる。

該キットのある構成では、所定のｍｉＲＮＡに特異的な１つ以上のｃＤＮＡ分子が提供される。これらは、例えば、アッセイのモニタリングのための陽性対照試薬として用いることができる。該キットの構成では、１つ以上の増幅産物が含まれうる。

本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに有用な１つ以上の他の成分または物質、例えば、滅菌水若しくは水性溶液、本発明の方法に関与する種々の反応を行うための緩衝液および／または逆転写若しくは増幅産物の検出のための試薬を含みうる。従って、実施形態では、該キットはｃＤＮＡ分子の増幅のための１つ以上のポリメラーゼを含む。実施形態では、該キットはｃＤＮＡ合成のための１つ以上の逆転写酵素を含む。該キットは、本発明の実施形態による逆転写および増幅を行うための一部またはすべての成分、試薬および供給品も含みうる。実施形態では、該キットはＱＰＣＲを行うのに必要な一部またはすべての試薬を含む。

（実施例）
本発明は以下の実施例により更に説明され、それは、本発明の単なる例示であるものとし、決して本発明を限定するものとみなすべきではない。

一実施形態による３ステップアッセイの詳細
本明細書で述べる３ステップアッセイは、図１に概略的に示す３つの異なる酵素ステップからなる。第一のステップにおいて、ＲＮＡ分子をポリアデニル化し、次のステップにおいてプライミングを導くために用いることができるユニバーサル配列を付加する。第二のステップにおいて、ポリアデニル化ＲＮＡ分子をアダプタープライマーにアニールし、該ＲＮＡ分子を逆転写し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する。該アダプタープライマーは、ｄＴからなるホモポリマー領域および次のステップにおいてユニバーサル逆方向プライマー結合部位として機能する５’末端における独特な配列を含む。第三のステップにおいて、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーおよびユニバーサルプライマーによりｃＤＮＡを検出する。

ポリアデニル化ＲＮＡを生成するための合成ＲＮＡ鋳型を用いたＰＡＰ反応
ｍｉＲＮＡ分析のため、１倍Ｅ−ＰＡＰ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ社）、０〜１ミリモル（ｍＭ）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、０〜２．５ｍＭ塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、０〜１０^１４コピーの合成ＲＮＡ、０〜２０単位（Ｕ）のＲＮａｓｅＢｌｏｃｋＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（任意；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）および０〜２Ｕ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ；Ａｍｂｉｏｎ社またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にてポリアデニル化（ＰＡＰ）反応を行った。ＰＡＰ反応成分を混合し、３７℃で１５〜６０分間インキュベートした。インキュベーション期後、ＰＡＰ反応物を９５℃で５分間加熱することにより終了させ、更なる分析まで６℃または２０℃で保存した。

緩衝成分は陽性および陰性対照反応を含む、異なる反応において多様であった。陽性対照反応では、ｍｉＲＮＡ鋳型を含むすべての反応成分を反応に含めた。これらの反応では、ＱＰＣＲにおけるシグナルが予想結果であった。陰性対照反応では、通例、ＡＴＰまたはＥ−ＰＡＰを除外した。これらの反応では、ＱＰＣＲにおける無シグナルが予想結果であった。１０〜１００コピー超にてＱＰＣＲにおいてシグナルが検出された実験では、シグナルが検出されず、または１００未満のコピーが検出されるまで実験を繰り返した。許容可能なレベルのバックグラウンドを有する実験についてのみ本明細書で述べる。

加えて、Ｅ−ＰＡＰの複数の製造業者はＥ−ＰＡＰ反応緩衝液中にＭｎＣｌ_２を含めることを推奨しているが、ＭｎＣｌ_２の除外は、全ＲＮＡにおける合成ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのポリアデニル化に悪影響を及ぼすことはないことが見出された。ＰＣＲにおけるＭｎＣｌ_２の存在は、エラープローンＰＣＲとして公知の方法においてランダム変異誘発を生じさせる。従って、所望のＱＰＣＲアッセイ特異性を維持するため、一部のＥ−ＰＡＰ反応産物が逆転写反応および次のＱＰＣＲに直接用いられる場合、ＰＡＰ反応におけるＭｎＣｌ_２の除外が望ましい。

ゲル電気泳動によるＰＡＰ反応産物の直接検出またはＰＡＰ産物の逆転写、その後のＱＰＣＲによる逆転写産物の検出により、ＰＡＰ反応条件を分析した。

ポリアデニル化ＲＮＡのゲル分析
ＰＡＰ反応最適化実験のため、ゲル電気泳動によりＰＡＰ反応産物を分析した。ＰＡＰ反応産物の好適部分を、検出されるＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、同数の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび同量のＮｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（２×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合した。その試料を７０℃で３分間インキュベートし、氷上に保存した。該試料を４〜２０％（ｗ／ｖ）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥＧｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のウェルに添加し、ブロモフェノールブルー色素の前部がゲル長の２／３から３／４に達するまで、核酸を電気泳動により１８０Ｖで分離した。次に、その核酸をＳＹＢＲＧｏｌｄ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）で染色し、製造業者の推奨条件に準拠して、ＥａｇｌｅＥｙｅ（登録商標）ＩＩＳｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で可視化した。

ポリアデニル化ＲＮＡを生成するための細胞由来ＲＮＡ鋳型を用いたＰＡＰ反応
細胞由来のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの検出のため、上述の実施例２のようにＰＡＰ反応を行った。しかし、合成ｍｉＲＮＡ鋳型を０〜１マイクログラム（μｇ）の細胞由来の全ＲＮＡ鋳型に取り換えた。ＰＡＰ反応成分を混合し、３７℃で１５〜６０分間インキュベートした。インキュベーション期後、ＰＡＰ反応物を９５℃で５分間加熱することにより終了させ、更なる分析まで６℃または２０℃で保存した。細胞由来のＲＮＡ試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの量は、ＲＮＡ試料の分離に用いられる方法により異なり得、従って、特定の試料の特定のパラメータは異なりうることに留意すべきである。

ポリアデニル化ＲＮＡの精製
ポリアデニル化ＲＮＡの精製のため、複数の方法を用いた。逆転写前のポリアデニル化ＲＮＡの精製は任意であるが、次の反応からＥ−ＰＡＰおよび緩衝成分を除去するのに有用である。好適な方法には、フェノール：クロロホルムを用いた有機抽出とその後のエタノール沈殿、ＡｂｓｏｌｕｔｅｌｙｍＲＮＡ（商標）精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）において磁性粒子に結合したオリゴ（ｄＴ）のようなオリゴ（ｄＴ）への結合とそれからの溶離、または逆転写に好適なＲＮＡ鋳型を生じさせる他の任意の方法がある。

ｃＤＮＡを生成するためのポリアデニル化ｍｉＲＮＡの逆転写
ポリアデニル化ＲＮＡの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への変換のため、１倍ＲＴ緩衝液、０〜０．５μＭＲＴアダプタープライマー（表２；配列番号５３，５４，５５，５６または５７）、０〜１００％のポリアデニル化産物反応物および０〜２００ＵＲＴにおいて逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。ＲＴに適切な温度および時間でその反応物をインキュベートした。該反応物をＲＮａｓｅ‐ＤＮａｓｅ非含有水（Ｓｉｇｍａ社）で希釈し、ＱＰＣＲ分析前に６℃または２０℃で保存した。概して、ＱＰＣＲ分析前にＲＴ産物を１：３００に希釈した。

本方法の進行時に複数の逆転写酵素（ＲＴ）を評価した。これらの逆転写酵素には、ＭＭＬＶＲＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）５．０多温度逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ（商標）多温度逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）が含まれた。すべてのＲＴを製造業者が推奨する緩衝および反応条件で用いた。例えば、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ（商標）多温度逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）との反応物を５０℃で５分間、２５℃で１５分間、４５℃で３０分間および９５℃で５分間インキュベートした。

ＲＴアダプタープライマーの最適濃度は鋳型の量により異なった。例えば、合成ｍｉＲＮＡを鋳型として用いた場合、全ＲＮＡを鋳型として用いた場合より少量のＲＴアダプタープライマーが最適であった。この相違は、合成ｍｉＲＮＡおよび全ＲＮＡ調製物に存在するポリアデニル化鋳型の量の差異によるものと思われる。

加熱および逆転写反応へのＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（登録商標）ＰＣＲエンハンサーの付加の決定的効果
ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（登録商標）ＰＣＲエンハンサー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）は、一次ＰＣＲ増幅産物の収率および特異性を高め、一致不良のプライマー・鋳型複合体の形成を最小限にし、多くのミスマッチプライマー‐鋳型複合体を不安定化することが示されている。これらの効果は一本鎖ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡプライマーを用いた場合に示されているが、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加は一本鎖ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡプライマーによる逆転写反応においても有益な効果を有しうる。加えて、一本鎖核酸に見出されうる二次構造の低減に熱変性が有益であることが示されている。従って、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加および熱変性が逆転写を向上させうるということが提唱された。

本発明において用いる任意の添加剤を試験するためには、その添加剤を１つ以上の酵素反応において試験することが好ましい。１つの反応に対して有益な効果を有するが、次の反応に対して有害作用を有する添加剤はいずれも、次の反応への添加前に精製により前回の反応から取り除くことができる。あるいは、一部の前回の反応産物の次の反応への添加前の前回の反応産物の希釈により、その作用を低下させることができる。

本実施例では、上述のように、また、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの製品パンフレットに記載されているように、１０^１０コピーのｌｅｔ−７ｄ１４ＡｍｉＲＮＡ鋳型（配列番号６４）を用いて、種々の量のＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈを逆転写反応に加えた。ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（１Ｕ／μＬ）を水中で８×１０^−４から８×１０^−７Ｕ／μＬに希釈し、１．０μＬを２０μＬのＲＴ反応物に加えた。その反応物を四通りに調製した。一組の２つの反応物を５５℃で５分間インキュベートし（鋳型の変性）、一方、第二の組を氷上に維持した。試料を速やかに遠沈し、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔＲＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を全試料に加えた。次に、全反応物を２５℃で１５分間（プライマーのアニーリングおよび伸長）、４２℃で２０分間（プライマーの伸長）および９５℃で５分間（ＲＴ変性）インキュベートした。次の実験では、チューブを開放した際の交差汚染の可能性を低下させるため、５０℃で５分間加熱する前にＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔを加えた。ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔは５５℃でインキュベートした際、その活性の大部分を保持するが、５０℃でより多くの活性が保持される。従って、５５℃の代わりに５０℃を用いた。加えて、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔは２５℃で逆転写酵素活性を有する。従って、おそらく、２５℃でのインキュベーションはＲＴアダプタープライマーのアニーリングおよび伸長を可能にする。

５５℃でのインキュベーション（加熱）若しくは氷上（無加熱）およびＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ量のＲＴ効率に対する効果を判定するため、ＱＰＣＲを用いた（図２）。図２に認められるように、０．０００８ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈは、より少量または無ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈと比べて阻害作用を有するように思われた。８×１０^−６ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈは０ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈより約１０倍高い感度をもたらした。しかし、最大の感度の向上は、０〜８×１０^−７ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在下、逆転写前に試料を加熱することから生じた。従って、ＲＴ反応においてＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔを用いる場合、インキュベーション温度プロファイルに５０℃での加熱ステップを追加した。

これらの結果は、アッセイ感度を高めるために逆転写反応においてＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈを用いる際の指針として用いられる。他の酵素反応の感度を増大させる反応条件を特定するのに同様の実験が用いられる。

この実験では、合成ｍｉＲＮＡ鋳型を用いてアッセイ感度に対するＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの効果が測定された。実際には、異なるＲＮＡ、例えば、全ＲＮＡに存在するＲＮＡの混合物中のｍｉＲＮＡが定量される。既知のコピー数のｍｉＲＮＡ鋳型がこのようなｍｉＲＮＡ鋳型を欠く全ＲＮＡ試料に加えられる実験は、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈおよび／または加熱がアッセイ感度に影響を与え、より正確なｍｉＲＮＡ定量をもたらす反応条件を特定するのに有用である。

ｃＤＮＡのＱＰＣＲ分析
ＱＰＣＲ分析のため、０〜５マイクロリットル（μＬ）の希釈ＲＴ産物を各ＱＰＣＲに加えた。概して、ＱＰＣＲにおける使用前にＲＴ産物を１：３００に希釈した。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＱＰＣＲコア試薬キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ（登録商標）ＰＣＲエンハンサー（任意；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に由来する成分を用いてＱＰＣＲを行った。反応条件は以下の通りであった（反応体積２５μＬ）：１倍コアＰＣＲ緩衝液、２．５〜５．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、２００マイクロモル（μＭ）の各ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、１２５〜２５０ナノモル（ｎＭ）ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲプライマー（表５；配列番号６６〜１８２）、１２５〜２５０ｎＭＲプライマー（表３；配列番号５８〜６１）、０〜１０^−８ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ、３０ｎＭＲＯＸ（基準染料、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、１倍ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標）（検出染料、Ｂｉｏｔｉｕｍ社）若しくは１倍ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｉ原液（検出染料、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および１．２５〜２．５ＵＳｕｒｅＳｔａｒｔ（登録商標）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。サイクル条件は、ステップ１：９５℃で１０分間（ホットスタート）の１サイクルおよびステップ２：９５℃で１０秒間（ｓｅｃ）；５５〜６０℃で１５秒間；７２℃で２０秒間（増幅）の４０サイクルであった。ステップ１：９５℃で６０秒間および５５℃で３０秒間への下降の１サイクル並びにステップ２：５５℃から９５℃への上昇（０．２℃／秒の割合）により、解離曲線を作成した。温度サイクリングのため、かつＱＰＣＲ時に蛍光強度を定量するとともに解離曲線を作成するため、Ｍｘ３０００Ｐ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。所望とあれば、上述のように、ＱＰＣＲ産物のゲル分析により、ＱＰＣＲ産物の更なる検証を行うことができる。

前述のように、使用されるＲプライマーの選択はｃＤＮＡを作製するために用いたＲＴアダプターに依存する。ＲＴアダプターにアニールし、かつポリメラーゼによって伸長することができるＲプライマーを用いる。

非特異的結合を低減し、少量の核酸の回収に役立つように、対象とする遺伝子を含まない核酸を被験試料に任意に加える。これらの核酸には、酵母若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ、酵母若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）全ＲＮＡおよび剪断・変性サケ精子ＤＮＡがある。例えば、Ｔｕｒｕｌｌａ酵母全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）またはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母ｔＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社）。このような核酸は加えられた反応に影響を与えないため、不活性であると考えられる。あるいは、グリコーゲン（Ａｍｂｉｏｎ社）または直鎖状アクリルアミドを用いてもよい。検出可能な対象遺伝子を含まない如何なる物質もこの目的に適する。合成ｍｉＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを分析する場合、全ＲＮＡを出発鋳型として用いた場合の反応条件を模倣するため、０．１〜１０ｎｇの剪断・変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を各ＱＰＣＲに加えてもよい。

ヒトゲノムＤＮＡ鋳型を用いたＱＰＣＲ特異性試験
ヒトゲノムＤＮＡの存在下およびｍｉＲＮＡから生成される配列の非存在下、ＱＰＣＲ時に検出可能なシグナルを発生するかを判定するため、実施例で用いるＰＣＲプライマーを実験的に試験した。ヒトゲノムＤＮＡ１０ｎｇの存在下、複数の被選択ｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよびＲプライマー（配列番号６１）でＱＰＣＲにおいてＰＣＲ産物は検出されなかった。従って、ＱＰＣＲ時に生成されるｍｉＲＮＡの存在を示すシグナルは、試料中の汚染ゲノムＤＮＡの存在に起因する可能性は低い。

ポリアデニル化対照ＲＮＡ鋳型
ＰＡＰ反応においてポリアデニル化対照ＲＮＡ鋳型を陽性および陰性対照として用いた。種々のポリアデニル化条件を試験し、アッセイ感度を測定し、特異性アッセイにおいて相対検出パーセントを定量するため、過去に同定されたｍｉＲＮＡを表す一本鎖ＲＮＡ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｒ．Ｊ．Ｇｒｏｃｏｃｋ，Ｓ．ｖａｎＤｏｎｇｅｎ，Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．Ｊ．Ｅｎｒｉｇｈｔ．２００６．ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓａｎｄｇｅｎｅｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．２００４．ＴｈｅｍｉｃｒｏＲＮＡＲｅｇｉｓｔｒｙ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１）または過去に述べられたｍｉＲＮＡとの有意な相同性を有さないｍｉＲＮＡ（Ａｌｉｅｎ；表２；配列番号５２）を用いた。成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／において提供されている最新公開データベースから得た。本明細書ではデータベースにおける命名法（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，Ｂ．Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，Ｃ．Ｂ．Ｂｕｒｇｅ，Ｊ．Ｃ．Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｘ．Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｍ．Ｍａｔｚｋｅ，Ｇ．Ｒｕｖｋｕｎ，Ｔ．Ｔｕｓｃｈｌ．２００３．ＡｕｎｉｆｏｒｍｓｙｓｔｅｍｆｏｒｍｉｃｒｏＲＮＡａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ＲＮＡ，２００３，９（３）：２７７−２７９）を用いる。

ポリアデニル化対照ＲＮＡ鋳型は５’ＯＨまたは５’リン酸を有しうる。本明細書で述べるＲＮＡ対照鋳型は５’ＯＨを有する。しかし、非対合末端ヌクレオチドおよび５’一リン酸化は、ｉｎｖｉｖｏでの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼＩによる３’ポリアデニル化を高めることが示されている（Ｆｅｎｇ，Ｆ．，Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ２０００．Ｕｎｐａｉｒｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄ５’ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｇｏｖｅｒｎ３’ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ．ＰＮＡＳ９７：６４１５−６４２０）。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＡＰ（Ｅ−ＰＡＰ）を用いた場合、合成ｍｉＲＮＡ鋳型の５’末端への５’一リン酸の付加は、ｉｎｖｉｖｏ状態をより正確に反映し、より高いＰＡＰ反応効率を生じさせうる。

天然ｍｉＲＮＡに対応するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を対照として用いる場合、対照ＲＮＡまたはＤＮＡによる被験試料の汚染の可能性があり、偽陽性を生じさせる。加えて、被験試料中の異種ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の検出は汚染が生じたことの現れである。あるいは、アッセイ感度を測定し、試料を同定し、アッセイ特異性を判定するため、既知のコピー数の異種ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を被験試料に加える。

逆転写酵素（ＲＴ）対照ＲＮＡ鋳型
逆転写反応においてＲＴ対照ＲＮＡ鋳型を陽性および陰性対照として用いた。種々のＲＴ条件を試験し、アッセイ感度を測定し、アッセイ特異性を判定するため、過去に同定されたｍｉＲＮＡを表す一本鎖ＲＮＡまたは１４ＡからなるポリＡテールを有するＡｌｉｅｎｍｉＲＮＡ（表４；配列番号６５）を用いた。

ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型の使用は、ポリアデニル化、逆転写および増幅反応のモニタリングを容易にした。例えば、ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型との別個のＲＴ反応を陽性対照として用い、ＱＰＣＲにおいてシグナルを発生することにより、ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型から合成されたｃＤＮＡを検出した。ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型を含む反応がＱＰＣＲにおいてシグナルを発生しなかった場合、これはＲＴ反応またはＱＰＣＲが機能しなかったことを示す。対照的に、ＲＴ対照ＲＮＡを含む反応がＱＰＣＲにおいてシグナルを発生した場合、これはＲＴ反応およびＱＰＣＲが予想通りに機能したことを示す。加えて、ｍｉＲＮＡが存在する被験試料がＱＰＣＲにおいてシグナルを発生できず、一方、ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型によりシグナルが発生した場合、これは、逆転写反応やＱＰＣＲではなく、ポリアデニル化反応が機能しなかったことを示す。あるいは、ＲＴ反応から１つ以上のＲＴ反応成分を除外することより、陰性対照としてＲＴ対照ＲＮＡ鋳型との別個のＲＴ反応が用いられ、ＱＰＣＲにおいて発生したシグナルを検出した。ＱＰＣＲにおいてシグナルが発生した場合、それは、交差汚染源を特定するために、またはバックグラウンドシグナルとして用いられうる。従って、ＲＴ対照ＲＮＡ鋳型は本明細書で述べる反応のモニタリングに有用であった。

ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型
ＱＰＣＲにおける陽性および陰性対照として、また、相対ｍｉＲＮＡコピー数を求めるため、ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型を用いた。ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型は、過去に同定されたｍｉＲＮＡ若しくは１４Ａを有するＡｌｉｅｎｍｉＲＮＡと同じ配列およびＲＴアダプターに対応するヌクレオチド配列（表３）を有する一本鎖ＤＮＡを含んだ。加えて、ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型はｍｉＲＮＡの５’末端に付加された０〜３個のＧを有した。あるいは、上述のＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型と相補的なＤＮＡ配列を用いた。

ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型によるＱＰＣＲの汚染の可能性は、ＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型における１つ以上のＴをＵに置換し、ＱＰＣＲ反応への０．５単位（Ｕ）のウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の付加により、排除することができる。このような反応物をＱＰＣＲの最初のサイクル前に５０℃で２分間加熱する。従って、１つ以上のＵを有するＱＰＣＲ対照ＤＮＡ鋳型も本発明において有用である。

ｍｉＲＮＡ源
細胞由来のＲＮＡ鋳型は、細胞培養物および新鮮凍結組織（Ａｍｂｉｏｎ社およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から単離された全ＲＮＡにおけるＲＮＡ鋳型を含んだ。加えて、Ｏｐｔｉｍｕｍ（商標）ＦＦＰＥＲＮＡ単離キット（Ａｓｓｕｒａｇｅｎ社）またはＦＦＰＥ用ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）全核酸単離キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から全ＲＮＡを単離した。

標準オリゴヌクレオチドホスホラミダイト合成化学（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ．およびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ．１９８３．Ａｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓｕｓｅｆｕｌｆｏｒｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２４：２４５−２４８）を用いて、ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（ＩＤＴ）およびＯｐｅｒｏｎ社を含む商業ベンダーにより、ｍｉＲＮＡを表す合成ＲＮＡ鋳型（表２）を合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、または電気泳動による分離後のポリアクリルアミドゲルから単離した（ＰＡＧＥ）。

合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド
プライマーとして使用され、ポリアデニル化産物を検出するためにＲＮＡにアニールされ、ＱＰＣＲＤＮＡ対照鋳型として使用される合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、本明細書で述べている合成ＲＮＡ鋳型から得て、本明細書で述べているように合成した。

ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの命名法は以下の通りである。名称は検出されるｍｉＲＮＡを含んだ。Ｆはそれが順方向プライマーであることを示し、ｍｉＲＮＡ名を記述から分けている。Ｇ、２Ｇまたは３Ｇは、１，２または３個のＧがｍｉＲＮＡ特異的プライマーの５’末端に付加され、元のｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の一部ではなかったことを示す。Ａ、ＴまたはＣが５’末端に付加されたプライマーは同じ命名法を用いる。−ＸはｍｉＲＮＡ配列の３’末端から除去されたヌクレオチド数を示し、Ｘは数字である。ｗｔ（野生型）は、プライマーがリボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチドを有するｍｉＲＮＡと同じヌクレオチド配列であることを示す。更に、プライマー名の末端における表示の省略は野生型を示す。＋ＸはｍｉＲＮＡ配列の３’末端に付加されたヌクレオチド数を示す。この場合、ＸはＲＴアダプターヌクレオチド配列と相補的なＡであった。

異なるＲＴアダプターおよびＱＰＣＲプライマーを用いたＲＴ反応効率の向上
ポリアデニル化ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換効率を高めるため、４つの異なるＲＴアダプターおよびそれらの対応するＱＰＣＲプライマー（表３；配列番号５３〜６１）を用いてＲＴ反応を行った。各ＲＴアダプタープライマーは、アンカーオリゴｄＴ配列および次のＱＰＣＲにおいてプライマー結合部位として機能するヌクレオチド配列を含む。従って、各ＲＴアダプターは対応するＱＰＣＲプライマーを有する。

Ｃｈｉａｎｇらの教示（Ｌｕ，Ｓ．，Ｙ．Ｈ．Ｓｕｎ，Ｒ．Ｓｈｉ，Ｃ．Ｃｌａｒｋ，Ｌ．Ｌｉ，Ｖ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．２００５．Ｎｏｖｅｌａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａｔｈａｔａｒｅａｂｓｅｎｔｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ．１７（８）：２１８６−２０３およびＳｈｉ，Ｒ．，Ｖ．Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．２００５．ＦａｃｉｌｅｍｅａｎｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３９（４）：５１９−２５）では、ポリ（Ｔ）アダプター（ＣｈｉａｎｇＲＴアダプター（Ａｍｂｉｏｎ社）；配列番号５３）および対応するＰＣＲプライマー（配列番号５８；Ａｍｂｉｏｎ社）を用いる。まず、６０ＣＲＴアダプターおよびＱＰＣＲプライマー（６０Ｃ；それぞれ、配列番号５４，５９）におけるＱＰＣＲプライマーのＴｍを高めるため、ヌクレオチド付加によってこのアダプターを改良した。次に、６０ＣＲＴアダプターの独特なヌクレオチドを、ＦおよびＲＲＴアダプター（Ｆ；それぞれ、配列番号^＊５５，５６）並びに対応するＦおよびＲＱＰＣＲプライマー（Ｒ；それぞれ、配列番号６０，６１）における２つの異なる独特なヌクレオチド配列に置換した。

図３に認められるように、６０ＣＲＴアダプターのＲＲＴアダプターへの置換により、アッセイ感度が向上した。これらの結果は３つの異なるｍｉＲＮＡ鋳型を用いて実証され、ＲＲＴアダプターおよびＲＱＰＣＲプライマーを用いた場合の感度の向上がｍｉＲＮＡ特異的ではなかったことを示す。従って、ＲＲＴアダプターおよびＲＱＰＣＲプライマーの使用は、当初のポリ（Ｔ）アダプター（Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．ら）を上回る向上を表す。ＦＲＴアダプターも３つのｍｉＲＮＡ鋳型の２つに関して６０ＣＲＴアダプターより感度が高かったが、１つのｍｉＲＮＡ鋳型に関して６０ＣおよびＲＲＴアダプター並びに対応するＱＰＣＲプライマー間で中間の感度であった。

従って、ＲＲＴアダプターおよび対応するＱＰＣＲプライマーの使用は向上を表し、従って、次の実験で用いた。

ＱＰＣＲにおける標準曲線の作成
標準曲線は、反応条件を最適化し、ＱＰＣＲ効率に対するＲＴ反応成分の効果を試験し、検出の下限および上限を求め、一連の鋳型インプットにわたるＱＰＣＲ効率を求め、被験試料中のｍｉＲＮＡのコピー数を求めるのに有用である。被験試料中のｍｉＲＮＡのコピー数と同じ範囲内の本明細書で述べる鋳型およびプライマーを用いて既知のコピー数の標準曲線を作成することにより、被験試料中のｍｉＲＮＡのコピー数を推定した。ＭＸＭｘＰｒｏ（商標）ＱＰＣＲソフトウェア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて相対コピー数を求めるため、ｍｉＲＮＡ被験試料のＣｔを標準曲線と比較した。この方法は、被験ｍｉＲＮＡと標準曲線を作成するために用いられる鋳型との増幅効率の差異の補正を含まないため、理想的ではないが、実験間の比較をすることを可能にしたという点において有用であった。従って、本明細書で述べる方法に従って、ｍｉＲＮＡの増幅分析のために標準曲線を作成した。

これらの例において、ｍｉＲＮＡ特異的５’プライマー結合領域およびユニバーサル３’プライマー結合領域を有する１４Ａを有するＤＮＡ鋳型を用いて標準曲線を作成した。ユニバーサル３’プライマー結合領域は、これらの実験で増幅されるすべての鋳型に関して一般的なＱＰＣＲプライマーの使用を可能にする。これらの鋳型はｍｉＲＮＡのポリアデニル化および逆転写により生成される鋳型を模倣するように設計したが、他の任意のヌクレオチド配列を用いることができる。

好適なＤＮＡ鋳型として表６に示す例において、５’末端はｌｅｔ−７ｄまたはＡｌｉｅｎｍｉＲＮＡ鋳型（配列番号４および５２）に対応し、３’末端はＲＲＴアダプター（配列番号５６）および対応するＲＱＰＣＲプライマー（配列番号６１）に対応する。従って、標準曲線を作成するため、ｌｅｔ−７ｄおよびＡｌｉｅｎｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマー（配列番号９７および１７８）をＱＰＣＲにおいて用いる。

例えば、ＱＰＣＲにおいて１０^１〜１０^７分子のｌｅｔ−７ｄ（配列番号１７９）およびＡｌｉｅｎ（配列番号１８０）ＤＮＡ鋳型並びにそれらの対応するＱＰＣＲプライマー（配列番号：９７および１７８）とＲプライマー（配列番号６１）を用いて、標準曲線を作成した（図４）。図からわかるように、標準曲線は６記録にわたって線形である。

標準曲線の線形性および高相関係数は、インプットＤＮＡ鋳型の広範囲にわたるＱＰＣＲ効率間の高度の類似性を示す。逆転写ポリアデニル化産物を表す鋳型の同様の増幅効率を示す両ＤＮＡ鋳型を用いて、同様の標準曲線を作成した。加えて、Ａ：Ｔに富む領域によって表されるホモポリマー領域の存在は、増幅効率に対する有害作用を有さないように思われる。
て、次の実験で用いた。

Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らが述べているようなｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーによるｍｉＲＮＡｃＤＮＡのＱＰＣＲ
すべての合成ｍｉＲＮＡ鋳型（表２；配列番号１〜８，２７）をポリアデニル化し、ポリアデニル化ｍｉＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換し、Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らが述べているような対応するｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いることによってＱＰＣＲによりｃＤＮＡを定量することにより、相対３ステップアッセイ感度を求めた。

図５において、９つの異なるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーメンバーの相対３ステップアッセイ感度は約１００倍異なる。このばらつきは、合成ｍｉＲＮＡ鋳型量の差異、１つ以上の酵素ステップにおけるアッセイ効率の差異、精製ステップ時に導入されたばらつきおよびＱＰＣＲ効率の差異に起因しうる。これらの結果は、３ステップアッセイがｍｉＲＮＡ鋳型を検出することができることを示すが、Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らが述べているように設計されたｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーが高相同性ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型間を識別することができるかを示さない。

Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らに従って設計されたｌｅｔ−７プライマーのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーメンバー間を識別する判定能力高相同性ｌｅｔ−７ファミリーメンバー間を識別する能力がこれらの実験の主要目的であった。前述のように、ｌｅｔ−７ファミリーメンバーはゲノム重複および突然変異から生じた可能性が高い。これらの変化と共に、種々のファミリーメンバーの発現の変化も生じてきた。これらの差異の重要性については現在研究が行われているが、これらの差異がそれらの生物学的機能の理解に不可欠となる可能性が高い。

Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らに従って設計されたｌｅｔ−７ａＦｗｔおよびｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーが、ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型間を識別可能であるかを判定するため、ｌｅｔ−７合成ｍｉＲＮＡ鋳型をポリアデニル化し、ｃＤＮＡに変換し、Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らが述べているようなｌｅｔ−７ａＦｗｔおよびｌｅｔ−７ｄＦｗｔＱＰＣＲプライマーを用いてＱＰＣＲに付した。この実験において、ＣｈｉａｎｇＲＴアダプタープライマーおよび対応するＱＰＣＲプライマーを用いた。

図６に示すように、ｌｅｔ−７ａＦｗｔおよびｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーは、ｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型を共に検出した。実際、最小Ｃｔ（最多コピー数）はｌｅｔ−７ａおよびｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型に関するｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーであった。これは、ｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーがｌｅｔ−７ａＦｗｔプライマーより効率的にプライミングすることを示しうる。加えて、ｌｅｔ−７ａＦｗｔプライマーを用いた場合、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型より少ないコピーのｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型が検出される。これらの結果は、ｌｅｔ−７ａＦｗｔプライマーもｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーも対応するｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型のみを検出せず、従って、所望の特異性を有さないということを明確に示す。

Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らの方法およびプライマー設計はｍｉＲＮＡの検出に効果的であったが、細胞由来のＲＮＡ試料中のｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ量を正確に定量することを可能にするほどのレベルで高相同性ｌｅｔ−７ファミリーメンバー間を識別しなかった。従って、プライマー設計法の改良について研究された。

ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡと他のｌｅｔ−７ｄファミリーメンバーヌクレオチド配列との比較
ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡと他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーとの比較により、ｍｉＲＮＡ長にわたる、異なるヌクレオチド位置における１〜４ヌクレオチドの差異が明らかになった（図７）。ｌｅｔ−７ａと他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーとの間に生じるミスマッチに関与するヌクレオチド固有性は異なる。ｌｅｔ−７ｃの３’末端から４ヌクレオチドの単一ミスマッチは、ｌｅｔ−７ａプライマーの長さを３’末端から４ヌクレオチド超にて短縮することができないことを示す。他のヌクレオチド差異は、主に、ｍｉＲＮＡの中央部または３’末端方向に生じるが、ｌｅｔ−７ａプライマーの３’末端を配置する最良位置は明らかではない。これらの差異のランダム位置により、ヌクレオチド差異がプライミング特異性に対する最大効果を有しうると同時にアッセイ感度を維持する単一塩基位置を見出すことが困難な課題となった。

プライマーの５’末端において付加ヌクレオチドを有し、３’末端から３ヌクレオチドを除去したｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーのｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出する相対能力
Ｃｈｅｎｃｈｉｋ，Ａ．，Ｙ．Ｚｈｕ，Ｌ．Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｐ．Ｓｉｅｂｅｒｔ（米国特許第５９６２２７２号）において、鋳型切り替えを可能にするため、逆転写酵素によるｃＤＮＡの３’末端へのヌクレオチドの非鋳型化付加に依存する方法が述べられている。この鋳型切り替えメカニズムでは、あらゆる真核生物ｍＲＮＡの５’末端に存在する７−メチルグアノシンキャップ構造を用いる。加えて、鋳型切り替えは、主に、完全長ｍＲＮＡの５’末端において生じ、非鋳型化付加は主にＣである。逆転写法におけるｍｉＲＮＡｃＤＮＡの３’末端への１つ以上のヌクレオチドの付加は、ｍｉＲＮＡ鋳型長を延ばしうるという点において望ましかった（図８Ａから図８Ｃ）。この方法は、巨大完全長クローンを生成するため、ｃＤＮＡサイズ分画と組み合わされた（Ｗｅｌｌｅｎｒｅｕｔｈｅｒ，Ｒ．，Ｉ．Ｓｃｈｕｐｐ，Ａ．Ｐｏｕｓｔｋａ，Ｓ．Ｗｉｅｍａｎｎ．２００４．ＳＭＡＲＴａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｃＤＮＡｓｉｚｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｂｔａｉｎｌａｒｇｅｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｃｌｏｎｅｓ．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ．５：３６）。この方法では、Ｃ残基の付加を確実にし、これらの残基との塩基対合時の鋳型切り替えオリゴヌクレオチドの分解を阻止するため、ＲＮアーゼＨ陰性のＭＭＬＶＲＴアーゼを用いて合成を行う必要があることに留意する。従って、７−メチルグアノシンキャップ構造およびＲＮアーゼＨ活性を有するＭＭＬＶを有さないＲＮＡ鋳型が、非鋳型化ヌクレオチド付加において効果的でありうるかは不明確であった。

これを目的として、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ配列の５’末端に３個のＧ，Ａ，ＴまたはＣを付加したｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計した（表５；配列番号６７，１８１，１８２，１８３）。５’末端に同じように付加し、３’末端から３ヌクレオチドを除去した第二組のプライマーも設計した。

５’末端にＧ，Ａ，ＴまたはＣを付加し、かつ３’末端からヌクレオチドを除去せず、または３ヌクレオチドを除去した種々のｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの相対能力を求めた。図９に示すように、ｌｅｔ−７ａプライマーの５’末端における３Ｇの付加（ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３およびｌｅｔ−７ａＦ３Ｇｗｔ）は、最小Ｃｔにより示されるように、最高アッセイ感度をもたらした。３Ｃを有し（ｌｅｔ−７ａＦ３Ｃｗｔ）、またはＣｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らに準拠して設計した（ｌｅｔ−７ａＦｗｔ）ｌｅｔ−７ａＦプライマーは中間の感度であったが、他の被験プライマーは最低感度を有した。加えて、これらの結果は、完全長プライマー（ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇｗｔ）と比べた場合、３’末端から３ヌクレオチドの除去（ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３）がアッセイの感度を変化させなかったことを示す。これらの結果は、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの５’末端への３Ｇの付加がアッセイ感度に対して有した利点を明確に示す。これらの結果は、更に、逆転写時にｍｉＲＮＡｃＤＮＡの３’末端への１つ以上のＣの非鋳型化付加が生じた可能性が高いことを示す。

ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの５’末端への３Ｇの付加に関して示されたアッセイ感度の向上は、本願において試験した４つの逆転写酵素のすべてに関して認められた。逆転写酵素は検出可能なＲＮアーゼＨ活性を有し、または検出可能なＲＮアーゼＨ活性を欠き、この効果がＲＮアーゼＨ活性と無関係であることを示す。これは、非鋳型化ヌクレオチド付加がＲＮアーゼＨ活性の非存在下でのみ生じることを示した従前の所見（上記Ｗｅｌｌｅｎｒｅｕｔｈｅｒ，Ｒ．ら）と対照的である。

一巡のポリメラーゼ伸長後のプライマーと鋳型とのアニーリングを増大させるためのＰＣＲプライマーの５’末端へのランダムヌクレオチドの付加は、ＰＣＲの有効性を高めるために一般的に用いられる。一見したところ、ｌｅｔ−７ａＦｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの５’末端への３Ｇの付加は、この同じ作用を有するように思われた。しかし、この付加が、単に、最初のプライマー伸長反応後のプライマーと鋳型とのアニーリングを向上させたのであれば、ｌｅｔ−７ａＦｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの５’末端に３Ｃが付加されたプライマーに関して、同じ量だけＴｍを高めるであろうから、同じ作用を認めることが予想されるであろう。しかし、このような結果とはならない。５’末端に付加された３Ｇを有する両プライマーのＣｔは、５’末端に付加された３Ｃを有するプライマーのＣｔより低かった。高感度を生じさせるｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを、全ｌｅｔ−７ファミリーメンバーに関する特異性について試験した。

ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列全体にわたる、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡと他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーとの間にみられる異質性により、より低い異質性またはより少ないヌクレオチド位置における異質性を有するｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡファミリーの異なるメンバーを探索した。このｍｉＲＮＡの検出のための次の一連のプライマーを設計する場合、５’末端へヌクレオチドを付加せず、３’末端からヌクレオチドを除去したプライマーも試験した。

ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡと他のｌｅｔ−７ｄファミリーメンバーヌクレオチド配列との比較
ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡと他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーとの比較により、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡの３’末端から６塩基の位置におけるヌクレオチドが、他のすべてのｌｅｔ−７ファミリーメンバーにおけるヌクレオチドと異なることが明らかになった（図１０）。加えて、その位置で生じたミスマッチは、ｌｅｔ−７ｄプライマー配列におけるＣおよび他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーｃＤＮＡにおけるＡであった。このミスマッチは識別アッセイにおいて有益であることが示されている。従って、３’末端がＣ：Ａミスマッチ位置にあり、またはＣ：Ａミスマッチ位置の３’末端となることを可能にするため、ｌｅｔ−７ｄプライマーの長さを短縮することが望ましかった。しかし、ｌｅｔ−７ｄプライマーの長さをこれらの位置まで短縮すれば、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡｃＤＮＡにアニールし、従来のＱＰＣＲプロトコルを用いて伸長させる可能性が低いポイントにＴｍを低下させるであろう。従って、高い感度および特異性をもたらす、ｌｅｔ−７ｄプライマーの３’末端における５ヌクレオチドの除去を可能にする方法が望ましかった。

これを目的として、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ配列の５’末端に３Ｇを付加し、３’末端から０，２または５ヌクレオチドを除去したｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計した。前述のように、３Ｇの付加および３’末端からのヌクレオチド除去がないプライマーも設計した（表５；配列番号８６、９５、９７）。

アッセイ感度を求めるための、プライマーの５’末端に３Ｇを有し、３’末端からヌクレオチドを除去したｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーのｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型を検出する相対能力
５’末端に３Ｇを付加し、３’末端から０，２または５ヌクレオチドを除去した種々のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーのｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ合成鋳型を検出する相対能力を求めた。図１１に示すように、ｌｅｔ−７ｄプライマーの５’末端における３Ｇの付加（ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇｗｔ，ｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−２およびｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５）は、最低Ｃｔにより示されるように高アッセイ感度を生じさせた。加えて、３Ｇの付加のないｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマー（ｌｅｔ−７ｄＦ−２およびｌｅｔ−７ｄＦ−５）は高感度を示した。Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らに準拠して設計したｌｅｔ−７ｄＦｗｔプライマーは最低感度を有した。このアッセイでは、プライマーの３’末端から最大５ヌクレオチドの除去が、アッセイ感度に対する効果をほとんどまたはまったく有さなかったことに留意することが興味深い。

本実施例では、種々のｌｅｔ−７ｄプライマーによるｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型の検出におけるアッセイ感度を求めた。次の実施例では、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出し、アッセイ特異性を求めるため、同じｌｅｔ−７ｄプライマーを用いた。

アッセイ特異性を求めるための、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーのｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出する相対能力
前実施例では、種々のｌｅｔ−７ｄプライマーに関するアッセイ感度を求めた。本実施例では、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出し、アッセイ特異性を求めるため、同じｌｅｔ−７ｄプライマーを用いた。

５’末端に３Ｇを付加し、３’末端から０，２または５ヌクレオチドを除去した種々のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーのｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ合成鋳型を検出する相対能力を求めた。図１２に示すように、３’末端から０または２ヌクレオチドを除去したｌｅｔ−７ｄプライマー（ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇｗｔ，ｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−２およびｌｅｔ−７ｄＦ−２）は最高感度を有し、これは最低特異性を示した。Ｃｈｉａｎｇ，Ｖ．Ｌ．らに準拠して設計したプライマー（ｌｅｔ−７ｄＦｗｔ）は中間の特異性を有し、一方、３’末端から５ヌクレオチドを除去した両プライマー（ｌｅｔ−７ｄＦ−５およびｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５）は最高特異性を有した。

これらの結果は、５’末端における３Ｇの付加がアッセイ特異性を向上させるようには思われなかったことを示すが、その追加は他のｍｉＲＮＡを検出するように設計されたプライマーのＴｍを高めることに依然として価値がありうる。この見解を試験するため、アッセイ感度について、０〜３Ｇを有し、３’末端から様々の数のヌクレオチドを除去した種々のｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを評価した。

異なるｍｉＲＮＡ合成鋳型および対応するｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いた相対３ステップアッセイ感度
すべての合成ｍｉＲＮＡ鋳型（表２；配列番号１〜５２）をポリアデニル化し、ポリアデニル化ｍｉＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換し、対応するｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いてＱＰＣＲによりｃＤＮＡを定量することにより、相対３ステップアッセイ感度を求めた。

図１３において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いた場合、５つの異なるｍｉＲＮＡの相対３ステップアッセイ感度は１０倍以内である。概して、アッセイ感度はプライマーのＴｍと相関するが、必ずしもそうではない。プライマーの３’末端におけるヌクレオチドの固有性もアッセイ感度に影響を与える可能性がある。例えば、３’末端にＡまたはＴを有するプライマーは、ＧまたはＣよりポリメラーゼ反応において伸長する可能性が低い。

ｌｅｔ−７ａＦ２Ｇｗｔ（１．６１×１０^６コピー）およびｌｅｔ−７ａＦ３Ｇｗｔ（７．８５×１０^６コピー）およびｌｅｔ−７ａＦ−３（１．２９×１０^５コピー）およびｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３（８．７７×１０^６コピー）に関してみられるように、５’末端における１つ以上のＧの付加はアッセイ感度を高めるように思われる。この実施例では、ｌｅｔ−７ａＦプライマーに関してコピーはまったく検出されなかった。このプライマーは他の実験では実際にコピーを検出したため、これは実験エラーであった可能性がある。この実施例は、ｌｅｔ−７ｂプライマーの５’末端にヌクレオチドを付加するとともに、３’末端からヌクレオチドを除去する場合にもアッセイ感度の向上を示す。この実施例では、ｌｅｔ−７ｂＦｗｔプライマーは３．７４×１０^５コピーを検出し、ｌｅｔ−７ｂＦ３Ｇ−３プライマーは１．３２×１０^７コピーを検出し、ｌｅｔ−７ｂＦ３Ｇ−５プライマーは６．５２×１０^６コピーを検出した。従って、ｌｅｔ−７ｂＦｗｔプライマーの３’末端から最大５ヌクレオチドの除去および５’末端への３Ｇの付加は、アッセイ感度の向上をもたらした。

別の実施例では、ｍｉＲ−１５５の感度は他のｍｉＲＮＡより約１００倍低かった。３つの被験プライマーすべてに関するｍｉＲ−１５５の低感度は、ｍｉＲ−１５５合成ＲＮＡ鋳型（配列番号３８）の３’末端における４Ｇの存在およびそのＰＡＰ反応に対する作用による可能性が高い。一本鎖核酸における３超のＧは二次構造を有することが周知である。Ｅ−ＰＡＰは二次構造に対して感応性を示し（Ｆｅｎｇ，Ｙ．，Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ．２０００．Ｕｎｐａｉｒｅｄｔｅｒｍｉｎａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄ５’ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｇｏｖｅｒｎ３’ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｏｌｙ（Ａ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：６４１５−６４２０）、二次構造の存在がその理由でありうる。従って、ｍｉＲ−１５５合成ｍｉＲＮＡ鋳型は、二次構造を有するｍｉＲＮＡのより効率的なポリアデニル化を可能にするＰＡＰ反応条件を特定するのに有用でありうる。

合成ｍｉＲＮＡ鋳型を用いた相対アッセイ感度
本実施例では、合成ｌｅｔ−７ＲＮＡファミリーメンバーから生成されたｃＤＮＡを用いて、特異性について、前実施例において最高感度を有するｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの３つ（ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３，ｌｅｔ−７ｃ３Ｇ−３およびｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−５）を試験した。ヌクレオチド配列相同性に基づき、ｌｅｔ−７ファミリーのメンバーであると考えられるため、この試験にｍｉＲ−９８を含めた。前実施例におけるｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型との特異性について、ｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−５プライマーを試験した。

９つのｌｅｔ−７ファミリーメンバーに対応するｍｉＲＮＡをポリアデニル化し、ポリアデニル化ｍｉＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換し、ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いてＱＰＣＲによりｃＤＮＡを定量することにより、単一ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ特異的プライマーによる全ｍｉＲＮＡ合成鋳型の相対検出パーセントを求めた。

本実施例では、ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数およびその対応するプライマーを１００％として設定することにより、相対検出（％）を計算した。被験プライマーに関する他のｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数をこのコピー数と比較し、相対検出（％）を計算した（図１４）。例えば、ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーで検出されるｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数を１００％として設定した。ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーで検出される他のｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数を、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数と比較し、相対検出（％）を計算した。従って、相対検出（％）は１００％超または１００％未満であり得る。

ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーで検出されるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数を相対検出（％）に変換した（図１４）。ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーで検出されるｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数が、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型の検出コピー数より約２．５倍多かったため、相対検出２５４％であると計算した。最初、これは多少驚くべきことであるが、ｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡとのヌクレオチド配列比較をみると（図７）、これらのｍｉＲＮＡ間にｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型の５’末端から１および１６のヌクレオチド位置において２つのヌクレオチド差異があるのみである。加えて、３’末端に最も近く、従って、プライマーの結合および伸長に対する最大の作用を有しうるヌクレオチド差異は、ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーにおけるＴおよびｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型におけるＧである。前述のように、このミスマッチを識別することは極めて困難である。加えて、このミスマッチはｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーの３’末端から４ヌクレオチドであり、従って、３’末端により近接して、または３’末端で生じるミスマッチよりプライマーの結合および伸長に対する作用を有する可能性が低い。他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーｍｉＲＮＡの相対検出（％）と共に、ｌｅｔ−７ｄとｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡとのヌクレオチド配列の比較およびこれらの結果は、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーおよびこれらのｍｉＲＮＡ間を識別することができる反応条件の設計課題を明示している。

初期の実験において、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーであるｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−５（配列番号９７）は、ｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合に高感度を（図１１）、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合に高特異性を生じさせる（図１２）ことが見出された。図１４における結果は、相対検出０．２４％未満から明らかなように、ｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−５プライマーが全ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型との高特異性も有したことを明示する。ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーについて上記に示す実施例と対照的に、ｌｅｔ−７ｄと他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーｍｉＲＮＡとのヌクレオチド配列の比較により（図１０）、これらのｍｉＲＮＡ間にｌｅｔ−７ｄおよび他のｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型の３’末端から６位のヌクレオチドにおいて単一ヌクレオチド差異があることがわかる。加えて、ヌクレオチド差異はｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５プライマーにおけるＣおよび他のｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型におけるＡである。前述のように、このミスマッチは識別が最も容易なもののうちの１つである。ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５プライマーの設計における３’末端からの５ヌクレオチドの除去は、プライマーの３’末端において、このミスマッチを最も有益な識別位置に配置する。従って、このミスマッチはプライマーの結合およびポリメラーゼ伸長に影響を与える可能性が最も高い。このヌクレオチド配列比較およびこれらの結果は、これらのｍｉＲＮＡ間を識別することができるｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計するための最も有益な条件を明示する。

異なるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合のｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３プライマーとの特異性は、ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３とｌｅｔ−７ｄ３Ｇ−５プライマーにおける結果の中間であり、ｌｅｔ−７ｂおよびｌｅｔ−７ｉｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合、それぞれ、１１．７３，０．０１の最大相対検出（％）であった（図１４）。

従って、必要な特異性を更に高めるため、プライマーの５’または３’末端に対するヌクレオチドの付加も除去も含まない方法が必要とされうることは明らかであったが、組み合わされた場合のｌｅｔ−７ｃとｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型とを識別する能力の実験をまず行った。

一定数のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡにおける種々の数のｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡを検出することによって求められるアッセイ特異性
本発明の方法が同じ反応における近縁ｌｅｔ−７ファミリーメンバー間を識別することができることを示すため、一定数のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡにおける種々の数のｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡを組合せ、定量した。この実験では、１０^６コピーのｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ（配列番号４）を１０^３〜１０^１０コピーのｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡ（配列番号３）と組み合わせた。組み合わせたｍｉＲＮＡは、それぞれ、ｌｅｔ−７ｃとｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡとの１：１，０００〜１０，０００：１コピーの範囲の比率となった。組み合わせたｍｉＲＮＡをポリアデニル化し、逆転写し、ｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３（配列番号８０）またはｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５（配列番号９７）ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを用いてＱＰＣＲにより検出した（図１５）。

全試料における一定数のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡの検出およびｌｅｔ−７ｃの検出の増加はアッセイ特異性を示す。１コピーのｌｅｔ−７ｄと比べて１００００コピーのｌｅｔ−７ｃを含む試料におけるｌｅｔ−７ｄの検出のわずかな増加は、アッセイにおけるわずかなばらつきまたはｌｅｔ−７ｃ３Ｇ−３プライマーによるごく少量のｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡの検出を示しうる。これらの結果は、図１４に示す結果における、これらのプライマーおよび鋳型に関する０．５％未満の相対検出と一致する。

ｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３およびｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５プライマーに関するこれらの結果は高アッセイ特異性を示すが、ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３プライマーに関して同様の結果が得られる可能性は低かった。加えて、ｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３プライマーはｌｅｔ−７ｄｍｉＲＮＡ鋳型に関して極めて低い相対検出（％）を有したが、ｌｅｔ−７ｂｍｉＲＮＡ鋳型に関してはほぼ１２％の相対検出を有した。従って、特異性を高める方法を模索した。

ｌｅｔ−７ｃ３ＦＧ−３ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーでのｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ鋳型の検出による、アッセイ特異性に対するＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの効果の判定
近縁ｌｅｔ−７ファミリーメンバー間の識別においてｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−５ｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いた場合、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在がアッセイ特異性を高めうるかを判定するため、各ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ（配列番号１〜８、２７）をポリアデニル化し、ｃＤＮＡに変換し、ｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマー（配列番号８０）を用いた二組のＱＰＣＲにおける鋳型として用いた。各反応において一組はＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈを含まず、第二の組は０．００００８ＵのＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈを含んだ。ｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡ鋳型およびｌｅｔ−７ｃ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーに対応するコピー数を相対検出１００％として用いた。他のｌｅｔ−７ファミリーメンバーｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数をｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡ鋳型のコピー数に対して計算し、相対検出（％）として表す。

ｌｅｔ−７ｃ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーによるｌｅｔ−７ｃ以外のｌｅｔ−７ファミリーメンバーの検出は、アッセイがすべての近縁ｍｉＲＮＡ間を識別することはできないことを示した（図１６）。しかし、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加はｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｂｍｉＲＮＡ鋳型とを識別する能力を向上させた。詳細には、相対検出（％）はｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型に関して７．３から０．３％に、ｌｅｔ−７ｂｍｉＲＮＡ鋳型に関して１３．５から１．５％に低下した。

更に、ミスマッチにおけるヌクレオチドの固有性、ミスマッチのヌクレオチド位置およびｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３プライマーとｍｉＲＮＡ鋳型とのミスマッチ数を図１８に示す。前述のように、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型とｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとの間に存在するようなＧ：Ｔミスマッチは特に識別が困難である。本実施例において、ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加およびこの位置におけるｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの終止は、相対検出（％）を０．３％に低下させた。ｌｅｔ−７ｂｍｉＲＮＡ鋳型とｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとの間に存在するＡ：Ｃミスマッチは概して有益なミスマッチであるが、この場合はそうではない。その低識別率は、このミスマッチがｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３プライマーの３’末端から３ヌクレオチドであり、従って、プライマー結合およびポリメラーゼ伸長に影響を与える可能性が低いためであると思われる。ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加による相対検出（％）の低下は、識別を許容可能なレベルに高める。予想通りに、プライマーと鋳型との間に存在するミスマッチ数が多いほど、識別率は高い。加えて、ｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの３’末端におけるミスマッチは、他の位置におけるミスマッチより低い相対検出（％）を有する。

ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの付加は、限定数のｍｉＲＮＡ鋳型およびｌｅｔ−７ｃＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーでの結果を向上させたが、種々の濃度のＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈおよび他の鋳型を用いた更なる実験も試験した。

ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在下におけるｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーに関するアッセイ特異性
本発明の方法が近縁ｌｅｔ−７ファミリーメンバー間を識別することができることを示すため、各ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ（配列番号１〜８，２７）をｃＤＮＡに変換し、各ｌｅｔ−７ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマー（配列番号６８、７５、８０、９７、１０１、１０５、１１１、１１５および１５１）を用いたＱＰＣＲにおける鋳型として用い、各ＱＰＣＲにおいて０．０００２ＵＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈを用いた。各検出ｍｉＲＮＡのコピー数を推定するため、１０^１〜１０^７コピーのＡｌｉｅｎＤＮＡ鋳型を用いて作成した標準曲線を用いた。正確に対合したｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーに対応するコピー数を検出１００％であるとみなした。不正確に対合したｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーに対応するコピー数を、正確に対合したｍｉＲＮＡおよびプライマーに対して計算し、相対検出（％）として表す。

図１７にみられるように、ｍｉＲＮＡ特異的アッセイは、ｍｉＲＮＡ合成鋳型を用いたアッセイにおいて用いられるｍｉＲＮＡ特異的プライマーを示す。ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｍｉＲＮＡ合成鋳型との組合せにおけるミスマッチ数を表下に示すように示す。ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｍｉＲＮＡ鋳型とのミスマッチ数の増加は、低相対検出（％）を生じさせることが直ちにわかる。対照的に、ミスマッチ数の減少は高相対検出（％）を生じさせる。

本実験では、相対検出（％）はすべて１％未満であった。これらの結果が既存の技術と比べて如何なるものであるかを判定するため、これらをＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイおよびＥｘｉｑｏｎ社製のｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ＬＮＡアレイと比較した。本実験における相対検出（％）はＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイについて報告されている相対検出（％）より有意に低い（Ｃａｉｆｕ，Ｃ．，Ｄ．Ａ．Ｒｉｄｚｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｒｏｏｍｅｒ，Ｚ．Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｂａｒｂｉｓｉｎ，Ｎ．Ｌ．Ｘｕ，Ｖ．Ｒ．Ｍａｈｕｖａｋａｒ，Ｍ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｑ．Ｌａｏ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｕｅｇｌｅｒ．２００５．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｂｙｓｔｅｍ−ｌｏｏｐＲＴ−ＰＣＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３（２０）：ｅｌ７９）。特に、ｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡアッセイとｌｅｔ−７ｃ合成鋳型およびｌｅｔ−７ｃｍｉＲＮＡアッセイとｌｅｔ−７ｂ合成鋳型に関して、それぞれ、３．７，２．５の相対検出（％）が認められた。更に、本実験での相対検出（％）はｍｉＲＣＵＲＹ（商標）ＬＮＡアレイ（ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ＳＥＥＥＭＳ／２６．ａｓｐ）で示される相対検出（％）より有意に低い。特に、ｌｅｔ−７ａ捕捉プローブに関してｌｅｔ−７ｂおよびｌｅｔ−７ｅのそれぞれ最大２０，３５の相対検出（％）が報告された。加えて、ｌｅｔ−７ａはｌｅｔ−７ｂ，ｌｅｔ−７ｅおよびｌｅｔ−７ｆ捕捉プローブに関して７〜１８の相対検出（％）にて検出された。これらの比較により、本明細書で述べる方法が競合技術より高い特異性を有することが明示される。

ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの存在下におけるｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ並びにｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーに関するアッセイ特異性
ｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計するため、本明細書で述べるプライマー設計を用い、ｍｉＲ−２３ａとｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型とを識別するため、本明細書で述べるＱＰＣＲ条件を用いた。図１８に示すように、ｍｉＲＮＡの３’末端から３ヌクレオチドにおいてｍｉＲ−２３ａとｍｉＲ−２３ｂとの間に単一ヌクレオチド差異がある。このミスマッチは、ｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型とのＴ：ＴミスマッチおよびｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ鋳型とのＡ：Ａミスマッチを生じさせる。

本実施例では、全被験ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの５’末端に３Ｇを付加した。加えて、本実施例では、ｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ特異的プライマーから１および２ヌクレオチドを除去し（配列番号１３３および１３４）、ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマーから０、１および２ヌクレオチドを除去した（配列番号１３７，１３５および１３６）。両ｍｉＲＮＡの３’末端から３位のヌクレオチドがｍｉＲＮＡ間の唯一の差異であるため、更なるヌクレオチドを除去し得ない。

図１８にみられるように、同様のＣｔから明らかなように、それぞれ、ｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型に関してｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマーで感度の差異はほとんどまたはまったく検出されなかった。対照的に、ｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよびｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型に関して感度の有意差（６．５５および１０．６９Ｃｔ）が検出され、高アッセイ特異性を示した。加えて、それぞれ、ｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型を検出する際、ｍｉＲ−２３ｂＦ３ＧｗｔｍｉＲＮＡ特異的プライマーで検出された感度の差異はなかった（２３．８１および２３．８３Ｃｔ）。ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマーの３’末端から１〜２ヌクレオチドの除去は、それぞれ、ｍｉＲ−２３ｂＦ３Ｇ−１，ｍｉＲ−２３ｂＦ３Ｇ−２ｍｉＲＮＡ特異的プライマーに関し、ｍｉＲ−２３ａとｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型とのＣｔ差を３．８，５．４Ｃｔに高めた。

従って、ｍｉＲ−２３ａプライマーはｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合、同様の感度を有するが、ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型の検出により示されるように、ｍｉＲ−２３ａＦ３Ｇ−２は高特異性を有する。従って、高感度を有し、ｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ鋳型に特異的であるため、より短いｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ特異的プライマー（ｍｉＲ−２３ａＦ３Ｇ−２；配列番号１３３）がより優れたプライマーである。

従って、最長ｍｉＲ−２３ｂプライマーはｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型を検出する場合、他のｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマーと同様の感度を有するが、ｍｉＲ−２３ａｍｉＲＮＡ鋳型の検出により示されるように、最低の特異性を有する。従って、高感度を有し、ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ鋳型に特異的であるため、最短ｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的プライマー（ｍｉＲ−２３ｂＦ３Ｇ−２；配列番号１３６）が最良のプライマーである。

ｌｅｔ−７ファミリーメンバーを用いて特定されたプライマー設計ルールおよび反応条件のｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−２３ｂｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの使用への適用は、単一ヌクレオチド差異を有するｍｉＲＮＡ間の識別におけるこれらのルールの有用性を示す。

全ＲＮＡにおける種々の存在量のｍｉＲＮＡの検出による３ステップアッセイの線形性および感度の判定
全ＲＮＡ試料中の種々の存在量のｍｉＲＮＡを検出する３ステップアッセイの能力を示すため、種々の量のヒト肺全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）から調製されたｃＤＮＡにおけるｍｉＲ−２３ａ，ｌｅｔ−７ｄおよびｍｉＲ−１０６ｍｉＲＮＡの相対量を求めた。これらのアッセイでは、出発鋳型として用いる全ＲＮＡの量は別個のＰＡＰ反応において０．９７６６ｎｇから１．０μｇまで２倍希釈にて多様であった。全ＲＮＡをポリアデニル化し、精製し、ｃＤＮＡに変換し、ｍｉＲ−２３ａＦ３Ｇ−２（配列番号１３３）、ｌｅｔ−７ｄＦ３Ｇ−５（配列番号９７）およびｍｉＲ−１０６ａＦ＋２（配列番号１５４）ｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いて３つのｍｉＲＮＡのＣｔを求めた。

図１９に示すように、各ｍｉＲＮＡは異なる存在量にてヒト肺全ＲＮＡに存在し、１５．７〜２５０ｎｇの全ＲＮＡにわたる各ｍｉＲＮＡのＣｔは線形状に多様である。このアッセイにおいてみられるばらつきは、ポリアデニル化・逆転写ステップ間に本明細書で述べるように試料をフェノール：クロロホルム抽出・沈殿させた精製ステップに起因する可能性が高い。出発鋳型として２５０ｎｇ超の全ＲＮＡを用いた場合、アッセイ感度の向上はほとんどなかった。従って、３ステップアッセイは鋳型インプットの変化に感応性を示し、全ＲＮＡ鋳型の量が１５．７〜２５０ｎｇである場合、ほぼ線形状である。

種々の量の出発ｃＤＮＡ鋳型を用いたｍｉＲＮＡの検出による、ＱＰＣＲにおけるシグナル線形性の判定
実施例３０では、３ステップ反応への全ＲＮＡインプット量が多様であった。対照的に、本実施例では、ＱＰＣＲへのｃＤＮＡインプット量が多様であった。種々の量のヒト肺ｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）におけるｍｉＲ−２３ａ，ｌｅｔ−７ｄおよびｍｉＲ−１０６ｍｉＲＮＡの相対量を求めた。これらのアッセイでは、１μｇのヒト肺全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をポリアデニル化し、逆転写反応にてｃＤＮＡに変換した。各ＱＰＣＲに加えたｃＤＮＡ量は２倍希釈にて多様であり、ヒト肺全ＲＮＡの６．５ピコグラム（ｐｇ）〜３．３ｎｇに相当した。

図２０に示すように、各ｍｉＲＮＡは異なる存在量にてヒト肺全ＲＮＡに存在し、０．１〜３．３ｎｇのインプット全ＲＮＡにて、０．９９３〜０．９９９のピアソンの相関係数（ＲＳｑ値）から明らかなように、高シグナル線形性があった。加えて、ｍｉＲ−２３ａおよびｌｅｔ−７ｄの増幅効率は同様であった（９０〜９１％）。ｍｉＲ−１０６ａの増幅効率はわずかに高かった（９６．７％）。これらの結果は、広範な鋳型インプットにわたってｍｉＲＮＡ量の差異が検出されたことを示す。従って、３ステップアッセイは鋳型インプットの変化に感応性を示し、ｃＤＮＡ鋳型量が０．１〜３．３ｎｇのインプット全ＲＮＡに相当した場合、線形であった。

ＱＰＣＲに加えるＲＴ反応産物の量は、少量、多量のｍｉＲＮＡを検出するように、それぞれ、多量、少量の産物を用いることによって調整しうる。加えて、ＱＰＣＲにおけるＲＴ反応成分に起因するアッセイ阻害が疑われる場合、より少ないＲＴ反応産物をＱＰＣＲに加えうる。

高いアッセイ感度および特異性を生じさせるプライマー設計
本実施例では、高いアッセイ感度および特異性を生じさせるプライマー設計の方法について述べる。事前に選択したｍｉＲＮＡ用のプライマーを設計するステップは以下の通りである：１）成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を入手し、２）相同性によりヌクレオチド配列を整列させ、３）事前に選択したｍｉＲＮＡの３’末端との相同性を有するｍｉＲＮＡを特定し、４）事前に選択したｍｉＲＮＡと事前に選択したｍｉＲＮＡとの高い相同性を有する他のｍｉＲＮＡとのミスマッチ（単数または複数）位置を特定し、５）事前に選択したｍｉＲＮＡと事前に選択したｍｉＲＮＡとの高い相同性を有する他のｍｉＲＮＡとのミスマッチ（単数または複数）のヌクレオチドを特定し、６）プライマーの３’末端を１つ以上のミスマッチに近接して配置するため、３’末端からヌクレオチドを除去することにより、プライマーが便益を得うるかを判定し、７）プライマーの３’末端においてＴ：ＴまたはＧ：Ｔミスマッチを有することを回避する位置に３’末端を配置し、８）完全長および短縮プライマーのＴｍを推定し、９）プライマーのＴｍを４８Ｃ超に高めるため、プライマーの５’末端に１つ以上のＧを付加し、１０）事前に選択したｍｉＲＮＡ合成鋳型を用いて３ステップアッセイにてアッセイ感度についてプライマーを試験し、１１）アッセイ特異性を判定するため、高相同性を有するｍｉＲＮＡ合成鋳型を用いて高アッセイ感度を有するプライマーを試験する。全ＲＮＡ試料中のｍｉＲＮＡを検出するため、最高のアッセイ感度および特異性を有するｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを用いる。

プライマー伸長が生じるためには、プライマーは鋳型にアニールし、ポリメラーゼにより伸長される必要がある。高い感度および特異性のｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計する場合、上記方法はプライマーの３’末端におけるヌクレオチドの作用に重点を置くが、プライマーの結合および伸長を阻止し、あるいは有意に低減するには、プライマーの３’末端から最大１１ヌクレオチドのわずか１つのミスマッチで十分でありうることに留意すべきである。この一例はｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｌｅｔ−７ｅｍｉＲＮＡ鋳型との間に示される特異性に示される。図７において、ｌｅｔ−７ａとｌｅｔ−７ｅｍｉＲＮＡとの配列比較は、両ｍｉＲＮＡの５’末端から９ヌクレオチドおよびｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型の３’末端から１４ヌクレオチドの単一ヌクレオチド差異を示す。ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーの設計においてｌｅｔ−７ａｍｉＲＮＡ鋳型から３塩基を除去した。従って、ｌｅｔ−７ａＦ３Ｇ−３ｍｉＲＮＡ特異的プライマーとｌｅｔ−７ｅｍｉＲＮＡ鋳型との単一ヌクレオチドミスマッチの位置は、ｌｅｔ−７ｅｍｉＲＮＡ鋳型の３’末端から１１ヌクレオチドである。図１４に示すように、ｌｅｔ−７ｅｍｉＲＮＡ鋳型の相対検出は最初の実験において約５０％であった。対照的に、ＱＰＣＲ最適化後、相対検出（％）は０．６％に低下した（図１７）。従って、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの３’末端から３塩基超の単一ヌクレオチドミスマッチがある場合でも、プライマー設計およびＱＰＣＲ最適化について本明細書で述べる方法はアッセイ特異性を可能にする。

ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列がｍｉＲＮＡの５’末端において１つ以上の天然Ｇを有する場合、ｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーへの１つ以上のＧの付加はプライマー溶解性を低下させ、または二次構造を導入しうる。そのような制約は本明細書で述べる実施例を用いて特定することができる。

ｍｉＲＮＡは５’末端から２〜７位のヌクレオチドにおける高配列相同性に基づき、ファミリーに分類される。しかし、特異性の欠如を生じさせるのはｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーの３’末端における相同性である。本明細書で示す実施例はｍｉＲＮＡファミリーメンバー間の配列相同性に基づくが、有意な相同性が種々のｍｉＲＮＡ間に３’末端においても存在し、かつｍｉＲＮＡの５’末端よりむしろ３’末端における相同性に基づいてｍｉＲＮＡ特異的ＱＰＣＲプライマーを設計することがより重要であることを認識すべきである。

高いアッセイ感度および特異性を生じさせるＱＰＣＲ条件
本明細書で述べる実験のすべてにおいて、ｍｉＲＮＡ鋳型の非存在下にてバックグラウンドシグナルがほとんどまたはまったくなかったことに留意すべきである。従って、本方法は他の方法に関して述べられているようなプライマー：プライマー二量体由来の有意なバックグラウンドシグナルを有さない。バックグラウンドの欠如はこれらのアッセイにおけるより広いダイナミックレンジをもたらす。

これらの実験はＢｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＱＰＣＲコアキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）と共に用いるＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈの量に関する指針をもたらすが、当業者は他のＱＰＣＲまたはＰＣＲ試薬が適切な結果を生じさせながらも異なる結果をもたらしうることを理解するであろう。従って、本明細書で詳述するような実験は、本発明に従って使用のためにそれらを最適化する試薬を用いて行うことができる。他の市販のシステムを最適化するそのような実験は十分に当業者の技術レベル範囲内にあり、必要以上の実験を必要としない。

本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明の実施において様々な改変および変形が可能であることは当業者には明らかであろう。本明細書の考察および本発明の実施から、当業者には本発明の他の実施形態が明らかであろう。本明細書および実施例は単に例示であるとみなされ、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲により示されるものとする。

Claims

同一性または相同性領域を有する２つ以上のヌクレオチド配列を比較するステップと、
比較された配列の中で異質性を有する１つ以上のヌクレオチド位置を同定するステップと、
同定された異質位置の２ヌクレオチドにおける、または２ヌクレオチド以内のヌクレオチドをプライマーの３’末端として選択するステップと、
他の同一性または相同性領域の一部またはすべてのヌクレオチドをプライマーの更なるヌクレオチドとして選択するステップと、
プライマーの５’末端に０〜１０ヌクレオチドを付加するステップ
とを含む、ヌクレオチドプライマーを設計する方法。
前記プライマーの５’末端に０〜３グアニンヌクレオチドが付加される、請求項１に記載の方法。
前記設計プライマーのＴｍが約４５℃〜約７０℃である、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチド配列が非コードＲＮＡ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ヌクレオチド配列がｍｉＲＮＡ配列から選択される、請求項１に記載の方法。
前記プライマーの３’末端が異質ヌクレオチド位置にあるように選択される、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載のプライマーを含む、組成物。
少なくとも１つの逆転写酵素、少なくとも１つのアダプタープライマー、少なくとも１つの逆方向増幅プライマー、少なくとも１つのポリメラーゼまたはこれらの２つ以上の組合せを含む、請求項７に記載の組成物。
対象とするｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を含む、請求項７に記載の組成物。
ＱＰＣＲを行うのに必要な一部またはすべての成分を含む、請求項７に記載の組成物。
少なくとも３つのｍｉＲＮＡ種の中で異質の３’末端におけるヌクレオチドを含み、かつ標的ｍｉＲＮＡに天然には見出されない５’末端における少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡ特異的プライマーを、パッケージ化された組合せにて含むキット。
少なくとも１つの逆転写酵素、少なくとも１つのアダプタープライマー、少なくとも１つの逆方向増幅プライマー、少なくとも１つのポリメラーゼまたはこれらの２つ以上の組合せを含む、請求項１１に記載のキット。
対象とするｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を含む、請求項１１に記載のキット。
ポリメラーゼを用いて試料中の標的ｍｉＲＮＡにポリＡテールを付加するステップと、
ポリＡテールを有する前記ｍｉＲＮＡを逆転写するステップと、
少なくとも３つのｍｉＲＮＡ種の中で異質の３’末端におけるヌクレオチドを含み、かつ標的ｍｉＲＮＡに天然には見出されない５’末端における少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含むｍｉＲＮＡ特異的プライマーを用いて、ポリＡテールを有する前記ｍｉＲＮＡを増幅するステップ
とを含む、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在を検出する方法。
ポリアデニル化を用いて試料中の対象とする１つ以上のｍｉＲＮＡにポリＡテールを付加するステップと、
アダプタープライマーおよび逆転写酵素を用いて前記ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するステップと、
ｍｉＲＮＡ特異的プライマーおよびユニバーサル逆方向プライマーを用いてＰＣＲにより前記ｃＤＮＡコピーを増幅するステップと、
ＰＣＲ産物を検出するステップ
とを含む、請求項１４に記載の方法。
対象とする標的ｍｉＲＮＡをポリアデニル化するステップと、
前記ポリアデニル化ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡコピーを作製するステップと、
対象とするｍｉＲＮＡを特異的に増幅するように設計されたプライマーを用いて前記ｃＤＮＡコピーを増幅するステップと、
増幅産物を検出するステップ
とを含む、請求項１４に記載の方法。
対象とする標的ｍｉＲＮＡを含むと思われる試料を、核酸をポリアデニル化することができる１つ以上の酵素と組み合わせて混合物を作製するステップと、
前記混合物中に標的ｍｉＲＮＡが存在する場合、前記ｍｉＲＮＡのポリアデニル化が生じるように適切な時間および条件を付与するステップと、
前記混合物を少なくとも１つのアダプタープライマーおよび少なくとも１つの逆転写酵素と組み合わせて第二の混合物を形成するステップと、
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのｃＤＮＡコピーが作製されるように適切な時間および条件を付与するステップと、
前記ｃＤＮＡを、対象とするｍｉＲＮＡに特異的なプライマーおよび前記特異的プライマーと反対側の鎖をプライミングすることができる別のプライマーと組み合わせるステップと、
少なくとも１つのｃＤＮＡ分子の少なくとも１つの鎖を増幅するため、適切な時間および条件を付与するステップと、
増幅を検出するステップ
とを含む、請求項１４に記載の方法。
前記増幅がＰＣＲを用いて行われる、請求項１４に記載の方法。
前記ＰＣＲがＱＰＣＲである、請求項１８に記載の方法。
以下の１つ以上のステップ：
前記ｍｉＲＮＡを含み、または含むと思われる試料を付与するステップと、
前記ポリＡテールにアニールするアダプターオリゴヌクレオチドを付与するステップ
とを含む、請求項１４に記載の方法。