WO2018070659A1 - 표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 lamp 기반의 단일염기 변화 검출 방법 - Google Patents

표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 lamp 기반의 단일염기 변화 검출 방법 Download PDF

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allele
nucleic acid
target nucleic
bip
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전효성
김서현
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주식회사 엠모니터
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present application relates to a method for quickly and accurately discriminating alleles or mutations of target nucleic acids using the LAMP mode.
  • Polymorphism refers to variations in nucleotide sequences that occur more than 1% of the time, 90% of which is Single Nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP Single Nucleotide polymorphism
  • the human genetic sequence is 99.9% identical, and one SNP is present every about 250 to 1000 bp, about 2 million SNPs are present in the human genome, and about 21,000 are present in the gene.
  • variations of other single bases appearing with a frequency of 1% or less are commonly referred to as mutations.
  • SNP Sequence mutation analysis
  • nucleotide sequence mutation or SNP in the case of human beings, it may be helpful in preventing an innate disease caused by a difference in nucleotide sequence or treating a disease caused by a difference in nucleotide sequence.
  • SNP analysis of the foods that people consume is also possible, for example, it is used to discriminate between Korean beef and imported beef according to the opening of the US beef import and the implementation of the labeling of origin. It can also be used to select seed strains of plant breeding to help farmers.
  • PCR-RFLP PCR-restriction fragment length polymorphism
  • an allele which is performed by PCR, which is a polymerase chain reaction, and identified by the difference in fragment length of an amplification product using specific restriction enzymes
  • SSP Sequence-Specific Primed PCR
  • Real-time PCR which measures PCR-amplified DNA in real time using fluorescent materials, and restriction enzymes at both ends of the primer.
  • SDA String Displacement Amplification
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2012-0046018 discloses a single nucleotide polymorphism detection method using live PCR.
  • the present application is to provide a method capable of detecting SNP or single base mutations quickly and accurately using the LAMP method.
  • the present application is to provide a detection method capable of quickly and accurately determining a single base change of a target nucleic acid including a single nucleotide polymorphism (SNP) or a mutation of a target gene based on LAMP.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the present application is a single nucleotide allele detection method comprising a single nucleotide polymorphism (SNP) or mutation present in a target nucleic acid using the LAMP method, wherein the method is a) a target nucleic acid represented by the following formula (1): Providing a nucleic acid sample comprising:
  • Equation 1 5'-N x-n ' N x-1 [X] N x + 1 N x + n -3'
  • X is an allele
  • N represents a base present in the 5 'and 3' directions excluding the allele
  • x-n ' represents the nth position in the 5' direction with respect to X
  • X + n represents the nth position in the 3 'direction with respect to X, wherein n and n' are the same or different and an integer of 2 or more
  • b) two that can bind to the target nucleic acid Providing outer primers F3 and B3 and two inner primers FIP and BIP capable of binding to the target nucleic acid inside the outer primer binding site, wherein the 5 ′ ends of each of the inner primers FIP and BIP are provided.
  • each beam has an emergency bases and different base as a base that does not correspond to the base of the Nx + 1, c) comprises the step of performing the LAMP reaction using the target nucleic acid and the 4 types of primers.
  • the present invention also provides a method for detecting a single base allele of a target nucleic acid comprising a single nucleotide polymorphism (SNP) or mutation in a target nucleic acid using the LAMP method, the method comprising: a) In the step of providing a template, the target nucleic acid is a region used in the primer design used for the LAMP reaction, in the order of 5 ' ⁇ 3' strands in order B3 region, B2 region, B1 region, F1c region, F2c region and F3c Wherein the allele is located at the beginning of the F1c region and at the end of the B1 region; b) providing two outer primers F3 and B3 capable of binding to the target nucleic acid and two inner primers FIP and BIP capable of binding to the target nucleic acid inside the outer primer binding site; , Wherein the F3 primer has a sequence complementary to the F3c region, the B3 primer has a sequence of the B3 region, and the 5
  • the allele X is homozygote or heterozygote, and when the amplification product is not produced, the step of discriminating that the allele is different from the allele is performed. Additionally included.
  • the interval between each region is 1bp-40bp except for B1 and F1c, and the size of the region where the primer is designed may be determined to be about 160bp to 250bp.
  • the method according to the present disclosure may further comprise LF and LB primers as desired, for example when a rapid reaction is required.
  • the analysis of the LAMP reaction result may be performed by using the color change measurement of the reactants or the electrophoresis of the turbidity (turbidity) or amplification products, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for detecting a single nucleotide allele of a target nucleic acid including a single nucleotide polymorphism or a mutation of a target nucleic acid using a LAMP reaction including four primers of FIP, F3, BIP, and B3.
  • each 5 'end of the BIP has a base corresponding to the allele, and a second base from each 5' end of the FIP and BIP corresponds to one upstream and one downstream, respectively, based on the allele
  • a base that does not correspond to a base is located and the base corresponding to the allele located at the 5 ′ end of the FIP is a base complementary to the allele and corresponds to the allele located at the 5 ′ end of the BIP.
  • the base is the same base as the allele, and the base not corresponding to the allele located second from the 5 'end of the FIP is FIP and BIP, wherein the base is non-complementary to the base located upstream of the dog and the base not corresponding to the allele located second from the 5 'end of the BIP is a different base than the base located downstream of the one A primer is used.
  • the present application is a primer set for detecting a single nucleotide allele of a target nucleic acid including a single nucleotide polymorphism (SNP) or a mutation in a target nucleic acid using the LAMP method, wherein the primer set is represented by the following Equation 1.
  • Two inner primers F3 and B3 capable of binding to the target nucleic acid to be formed, and two inner primers FIP and BIP capable of binding to the target nucleic acid inside the outer primer binding site, wherein the inner The 5 'end of each of the primers FIP and BIP has a base corresponding to the allele X of Formula 1 below, and the second base from the 5' end of each of the inner primers FIP and BIP each represents Nx- of the target nucleic acid of Formula 1 below.
  • Equation 1 5'-N xn N x-1 (X) N x + 1 N x + n -3 ': wherein X is Alleles and N is said Indicates a base present in the 5 'direction and 3' direction excluding the lip shape, wherein xn represents the nth position in the 5 'direction with respect to the X, and x + n in the 3' direction with respect to the X The second position, and n is an integer of 2 or more to provide a primer set.
  • the method according to the present invention can quickly determine a single base change of a target nucleic acid including a single nucleotide polymorphism or a mutation of a sample with high specificity, and, if necessary, can be directly analyzed without additional treatment such as electrophoresis after completion of the reaction. Convenience is increased.
  • Figure 1a schematically shows the six regions on the target nucleic acid to which the primers according to the present invention are designed and X represents a monobasic polymorphism or mutation site, where the end point of B1 and the starting point of the region of F1c in the 5 ' ⁇ 3' direction is X. Indicates overlap in. Complementary regions of each region are named B3c, B2c, B1c, F1, F2, and F3, respectively, and are not shown in FIG. 1A.
  • FIG. 1B is a schematic of the general LAMP reaction, in which F3 and FIP (consisting of F1c and F2), and B3 and BIP (consisting of B1c and B2) primers bind to each strand of the template having the region indicated in FIG.
  • the reaction is initiated to produce a nucleic acid having a dumbbell structure, from which exponential amplification proceeds.
  • FIGS. 2A and 2B show sequences of target nucleic acids comprising allelic loci [C / T] used in one embodiment according to the present application and positions / sequences of primers used in one embodiment of the present application.
  • the two bases respectively, upstream and downstream, based on the base corresponding to the allele, are designed not complementary in designing the FIP and BIP primers, and these bases are shown in italics.
  • Figure 2b further shows the position / sequence of the LF and LB primers.
  • 3 to 7 are LAMP reactions performed using primer sets I / II, III / IV, V / VI, VII / VIII and IX / X, respectively, designed with the target nucleic acids of FIG. 2 as templates. The results are analyzed with agarose gel.
  • the present application is based on the discovery that single base variation of target nucleic acid can be easily detected with high accuracy and sensitivity using LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) method.
  • LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification
  • each of the 5 'ends of the two inner primers FIP and BIP among the four types of primers used for LAMP have a base corresponding to the allele base to be detected, and the second base from each 5' end is the base of the target nucleic acid.
  • the presence of specific alleles can be confirmed by amplification of the LAMP reaction.
  • the present invention relates to a method for detecting a single base allele of a target nucleic acid comprising a monobasic polymorphism or mutation of a target nucleic acid using LAMP.
  • the method according to the present invention is a single nucleotide allele detection method comprising a single nucleotide polymorphism (SNP) or a mutation present in a target nucleic acid using the LAMP method, a) Providing a nucleic acid sample containing a target nucleic acid:
  • Equation 1 5'-N xn N x-1 (X) N x + 1 N x + n -3 '
  • X is an allele
  • N represents a base present in the 5 'direction and 3' direction excluding the allele
  • xn represents the n-th position in the 5 'direction based on the X
  • x + n represents an n-th position in the 3 'direction with respect to X
  • n is an integer of 2 or more
  • each of the inner primers FIP and BIP have a base corresponding to the allele X, and a second base from the 5 ′ end of each of the inner primers FIP and BIP has Nx-1 and Nx of the target nucleic acid, respectively.
  • Single base changes or alleles used in the method according to the present invention comprise Single Nucleotide polymorphisms (SNPs) and common mutations, which account for about 90% of polymorphisms occurring at frequencies above about 1%. mutations, including but not limited to, appearing at a frequency of 1% or less, including substitutions with other bases, and are not limited to names as long as the single base is accompanied by a change in concept. It is included in the range of.
  • SNPs Single Nucleotide polymorphisms
  • common mutations including but not limited to, appearing at a frequency of 1% or less, including substitutions with other bases, and are not limited to names as long as the single base is accompanied by a change in concept. It is included in the range of.
  • LAMP is a strand nucleic acid amplification method (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA.Nucleic Acids Res 28, E63) that can amplify target nucleic acids with high sensitivity and specificity under isothermal conditions.
  • 6 sites of DNA polymerase and target nucleic acid having displacement i.e., B3 region, B2 region, B1 region, F1c region, F2c region and F3c region as shown in FIG.
  • At least four to six primer sets designed specifically for B3c, B2c, B1c, F1, F2 and F3 are used (regions complementary to) (Korean Patent No. 612551; Nagamine, K. et al. 2002).
  • Standard LAMP reactions include at least two types of two inner primers, forward inner primer (FIP), backward inner primer (BIP) and two outer primers (F3) and backward outer primer (B3). Accelerated LAMP can be used for a total of six primers, including LF (Loop F) and LB (Loop B).
  • the LAMP reaction largely includes an initiation structure production step, a cycling amplification step, and an elongation and recycling step.
  • the F2 moiety constituting the inner primer FIP in the initiation step binds to the F2c region of the target nucleic acid to initiate a reaction.
  • the outer primer F3 primer then binds to the F3c region of the target nucleic acid to initiate strand replacement DNA synthesis, thereby producing a single stranded nucleic acid. This single strand forms a ring at the 5 ′ end via F1 / F1c binding, where the second inner primer BIP and the outer primer B3 bind to cause DNA synthesis and strand replacement DNA synthesis.
  • single-stranded strands are formed at both ends of the dumbbell, and DNA synthesis starts from the 3 'end of the F1 region.
  • the cycling amplification step only two inner primers are used.At first, one inner primer binds to the ring, resulting in strand-replacement DNA synthesis, resulting in a new ring that doubles the stem region from the original ring-forming single strand and ring structure. Formation single strands are generated and strand replacement DNA synthesis is continued using the template to amplify up to about 10 9 amplification products within 1 hour.
  • the primer set used for the LAMP as described above is designed for six distinct regions (B3 region, B2 region, B1 region, F1c region, F2c region and F3c) on the target nucleic acid, F3 And B3 is two outer primers, FIP and BIP are two inner primers, and two inner primers are hybrid primers comprising sense and antisense sequences, wherein the FIP consists of an F1c region sequence and an F2 region sequence, and BIP is a B1c Consisting of a region sequence and a B2 region sequence.
  • FIP and BIP are specifically designed for the detection of single base mutations or alleles of SNPs.
  • the end of the B1 region and the starting point of the F1c region in the target nucleic acid are located in the allele to be detected and one or two bases downstream and / or upstream thereof. Design primers in a way that alters them.
  • the target nucleic acid (or template) including the allele for which the primer according to the present invention is designed may be represented by the following equation 1 for convenience of description:
  • Equation 1 5'-N x-n ' N x-1 (X) N x + 1 N x + n -3'
  • X represents an allele and N represents any base present in the 5 'and 3' directions of the allele, and x-n 'is the nth position in the 5' direction with respect to X.
  • X + n represents an nth position in the 3 'direction with respect to X, and n and n' are the same or different and are integers of 2 or more.
  • the length of the target nucleic acid is for example 813 bp if n is 500 and n 'is 300. However, the length of the target nucleic acid is not particularly limited, and may have various lengths as long as six regions can be designed to design at least four primers as described above for the LAMP reaction.
  • two outer primers F3 and B3 capable of binding thereto and two inner primers FIP and BIP capable of binding to the target nucleic acid inside the outer primer binding site are designed, wherein the base corresponding to X is at the 5 ′ end of each of the FIP and BIP, and the base corresponding to a base different from the base corresponding to N x-1 and N x + 1 , respectively.
  • the FIP primer has a base 5 'end of the FIP that is complementary to the allele to be detected, for example, if the allele X is C, G base, and the second base from the 5' end is the target nucleic acid.
  • the BIP primer is characterized in that the 5 'end of the BIP has the same base as the allele to be detected, i.e., if the allele X is C, the C base, and the second base from the 5' end is the target nucleic acid Nx + 1.
  • the method according to the present disclosure may comprise the following steps.
  • the target nucleic acid is a region used in the primer design used for the LAMP reaction, and the B3 region, B2 region, B1 region, An F1c region, an F2c region, and an F3c region, wherein the allele is located at the beginning of the F1c region and at the end of the B1 region; b) providing two outer primers F3 and B3 capable of binding to the target nucleic acid and two inner primers FIP and BIP capable of binding to the target nucleic acid inside the outer primer binding site; , Wherein the F3 primer has a sequence of the F3 region, the B3 primer has a sequence of the B3 region, and the FIP consists of a sequence of F1c, and F2 having a base complementary to the allele at its 5 ′ end.
  • the second base from the FIP 5 ′ end has a base and a non-complementary base positioned upstream with respect to the allele of the target nucleic acid
  • the BIP has a base whose 5 ′ end is the same as the allele. Having a sequence of B1c and B2, except that the second base from the BIP 5 ′ end is different from the base located one downstream relative to the allele of the target nucleic acid. And c) mixing the template with four kinds of primers to perform a LAMP reaction.
  • the term “primer” refers to a nucleic acid molecule in which a single strand of oligonucleotide is extended by covalent attachment of nucleotides at its 3 ′ end in a nucleic acid amplification or synthesis reaction using polymerase.
  • the primer set according to the present application is used for amplification of nucleic acid, ie LAMP analysis.
  • the primers were designed by adjusting the binding position to specifically bind to or around mutation or monobasic polymorphism.
  • target or “target nucleic acid” refers to a polynucleotide comprising an allele that is to be detected in which the primer set according to the present invention can be combined to use the method according to the present invention, synthesized or amplified in vitro. Of course, it includes all or part of the cell-derived genome, and may be derived from humans, animals, plants.
  • the term “complementary” or “complementary” refers to a condition in which a primer or oligonucleotide can sequence-specifically bind to a target nucleic acid through pairing a Wason-Crick base under certain hybridization (hybridization), binding or annealing conditions. By reference it is meant to include both partially complementary, substantially complementary and perfectly complementary. Substantially complementarity means that the two strands of nucleic acid sequences are not completely complementary to each other, but are bound to the target nucleic acid and the effect according to the present invention, that is, the degree of complementarity that can be amplified by the LAMP method.
  • hybridization refers to a reaction in which two strands of complementary nucleic acid molecules form sequence specific complexes through hydrogen bonding.
  • Hybridization may constitute a step in which a primer binds a target nucleic acid or template in a LAMP reaction in which a primer according to the present invention is used.
  • the degree of hybridization is influenced by various factors such as the degree of complementarity of any two nucleic acid molecules involved, their melting temperature (Tm) or the stringency of the hybridization. Hybridization reaction conditions can also be determined taking this into account.
  • the stringency of the hybridization reaction is a condition that determines how easily any two nucleic acid molecules that are intended to hybridize to each other can bind, including complementarity, reaction temperature, ionic strength and / or concentration of common substances in the hybridization reaction solution. And type, for example J. Sambrook and DW Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; Reference may be made to 5th Ed, 2002, and the like.
  • Specific binding or hybridization herein means that a particular nucleic acid molecule or primer binds only to the target nucleic acid without substantially binding to a nucleic acid other than a nucleic acid other than the target.
  • the primer preparation method according to the present invention can specifically bind to a nucleic acid containing a single nucleotide polymorphism or its complementary sequence under high stringency conditions, and primer sequence length, buffer, nucleic acid type, pH in template-based DNA synthesis. , Magnesium concentration and reaction temperature may be determined.
  • the primers used in the method according to the invention are characterized by the base at the 5 'end and the base at the second position from the FIP and BIP as described above, the base at the 5' end being the base corresponding to the allele, the second The base at position is designed to have a base that does not correspond to the target nucleic acid.
  • the remaining outer primers may be appropriately designed in consideration of the inner primers.
  • the interval between each region may be appropriately determined in consideration of the reaction time, and the like.
  • the end point of B1 and the start point of F1c overlap one base, and the interval between the remaining regions is about 1bp-20bp.
  • B3 to F3c located at the left and right boundaries may be determined to be at least 160bp up to 250bp, in particular, at most 200bp, but is not limited thereto.
  • the F3 primer herein has a sequence of said F3 region that complementarily binds to F3c
  • said B3 primer has a sequence of said B3 region that complementarily binds to B3c
  • said FIP is 5 ' ⁇ A second from the FIP 5 'end, having a sequence of F1c and F2 having a base complementary to the allele at the 5' end in the 3 'direction, but one upstream position relative to the polymorphic site of the target nucleic acid
  • the base has a non-complementary base with the sequence of the 5 ' ⁇ 3' strand of the target nucleic acid
  • the BIP has a sequence of B1c and B2 having the same base as the allele at the 5 'end in the 5' ⁇ 3 'direction.
  • a second base from the BIP 5 ′ end which is a position downstream of the polymorphic site of the target nucleic acid, has a base different from the target nucleic acid.
  • the length of each region and the primer length may coincide with each other, but may not necessarily coincide with each other. When the primer is designed in the region, the length of the primer may be shorter than that of the region.
  • each primer to be used in the method according to the present application will be designed according to the SNP specific allele and specific nucleotide sequence of the target nucleic acid including the same, reaction conditions and the like.
  • the length of the region in which the primers are designed in the method according to the present invention is easy to analyze can be determined from the line where no secondary structure is formed, and in one embodiment according to the present application, the choice should be made from a minimum of 160 pb to a maximum of 250 bp, in particular about 200 bp. Can be.
  • a single nucleotide polymorphism is present at the first 5 ′ ends of F1c and B1c to prepare a primer of about 15-25 bp in length. Once the F1c and B1c sites are determined, the positions of F2 and B2 are produced within about 20bp-40bp intervals in F1c and B1c.
  • the region is determined so that the total region has a length of at least 160 pb and at most 250 bp, from which a primer is designed. If the region where the primer is designed is out of the above range, there is a disadvantage in that the reaction time is long. As shown in FIG. 1B, since the length of the amplification product increases step by step from the FIP to the length of the BIP due to the characteristics of the LAMP reaction, as the size of the region increases, the amplification time is longer and the buffer color change due to the amplification product is delayed. to be.
  • the length of the primer specifically binding to the target nucleic acid or its complementary sequence according to the present application may be appropriately determined in consideration of reaction conditions such as reaction time, temperature, base distribution of the target nucleic acid, for example, at least 15 nucleotides, and F3 And at least 15 nucleotides for B3, at least 30 nucleotides for FIP and BIP, and at least 15 nucleotides for LF and LB, but not limited thereto.
  • the Tm of the F2 and B2 sequences included in BIP and FIP is determined in accordance with the polymerase used, for example in the range of about 60 to 65, which is the optimum temperature when Bst polymerase is used, Outerly located F1c and B1c determine the Tm value slightly higher than this so that a single stranded release from the template can be formed immediately upon looped out structure.
  • the Tm of the outer primers F3 and B3 is set lower than the Tm of F2 and B2 to induce the initial reaction to occur in the inner primer rather than the outer.
  • LF and LB primers can be further used.
  • LF can be produced in the region between F2 and F1c and the spacing between F2 and F1c is produced at 1bp to 10bp, respectively, and GC content (45% ⁇ Primer ⁇ 60%) and Tm (50 ° C) in the region between F2 and F1c. ⁇ Primer ⁇ 60 ° C.)
  • a primer having a length of about 15bp-25bp may be prepared.
  • LB it may be manufactured in the region between B1c and B2, and the manufacturing conditions may refer to LF.
  • the addition of LF and LB improves the sensitivity of LAMP and results in a faster detection of results.
  • each primer according to the present application is about 15-25bp, as described above, the spacing of each region to which the primer binds is designed to be 1-40bp, in particular 1 to 20bp. This is because the longer the length of the primer, the longer the time of mutual binding between the nucleic acids during amplification, and the wider the interval between the primers, the larger the size of the amplification product, resulting in longer amplification time and lower sensitivity. .
  • the size of the ring can be determined by the size between F2c (B2c) and F1c (B1c), to adjust the spacing of the above-described region for this purpose, in one embodiment the size of the ring is about 40base or more.
  • a primer set comprising six primers is used, including but not limited to combinations of Table 1, for example.
  • the present application relates to a composition or kit for detecting SNPs comprising a primer set according to the present disclosure.
  • the methods, primer sets or kits according to the invention can be used for SNP determination in a variety of samples.
  • the sample may be carried out on a specimen containing, for example, food ingredients, blood, urine, feces, or body fluids, such as discriminating Korean cattle.
  • Methods of taking samples are known in the art.
  • proteinase K Proteinase K
  • such a biological sample may be directly obtained by a conventional sample obtaining method just before the test, or may be stored in advance.
  • sample according to the present application may be used as a sample nucleic acid separated from the above-described sample.
  • Isolation is an isolation from a sample containing nucleic acid, and includes isolation in various purity.
  • compositions or kits for LAMP reactions using primer sets according to the present disclosure may further comprise dNTPs, buffers, magnesium and DNA polymerases. It may also include substances such as betaine or DMSO to enhance the reaction.
  • Magnesium is used in the form of salts such as magnesium acetate, magnesium chloride or magnesium sulfate.
  • the buffer may be used, for example, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, Tris-HCl buffer or Tricine buffer.
  • DNA polymerases that can be used in the reaction are polymerases derived from thermophilic microorganisms, in particular polymerases lacking 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease function.
  • Non-limiting examples include Bacillus stearothermophilus , Bst, DNA polymerase; Thermus , thermophilus , Tth, DNA polymerase; Thermus aquaticus , Taq, DNA polymerase; Thermococcus litoralis DNA polymerase; Pyrococcus furiosus , Pfu, DNA polymerase; And Bacillus caldotenax DNA polymerase.
  • Nucleotide analogs may also be used in the reaction in place of dNTPs.
  • Nucleotide analogues are those that are modified or not found in nature that can be polymerized together or alone with natural nucleotides during template-derived DNA synthesis.
  • analogues of nucleotide bases as analogs that can be polymerized through such Wasson Creek base pairing are, for example, substituted purines or pyrimidines, deazapurines, methylpurines, methylpyrimidines, aminopurines, aminopyrimidines, thio Purine, thiopyrimidine, indole, pyrrole, 7-deazaguanine, 7-methylguanine, hypoxanthine, shadowcytosine, shadowisocytosine, isocytosine, isoguanine, 2-thiopyrimidine, 4-thiothymine , 6-thioguanine, nitropyrrole, nitroindole and 4-methylindole.
  • Nucleotides comprising substituted deoxyribose analogs include substituted or unsubstituted arabinose, substituted or unsubstituted xylose and substituted or unsubstituted pyranose.
  • Nucleotides comprising phosphate ester analogs include phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, phosphorocelonoate, phosphoroanilothioate, phosphoroanilide, phosphoroamidate, boron Alkylphosphonates such as phosphate, phosphoester and methylphosphonate.
  • the LAMP reaction is reacted at a temperature suitable for DNA polymerase activity.
  • the reaction temperature can be determined without difficulty in consideration of the enzyme used in the reaction, the nucleic acid sequence of the target.
  • the reaction is then reacted at a time suitable for the amplification of the target nucleic acid.
  • the reaction time may be determined at a time of 20 minutes to 40 minutes, but may vary depending on the amount of target nucleic acid included in the sample. For example, response time can be increased to increase sensitivity.
  • LAMP analysis according to the present application can be analyzed in various analytical formats, for example, may be carried out in a liquid phase reaction or a state in which some components are adsorbed to the high matrix.
  • the method, composition or kit comprising a primer set according to the invention is used for analysis in a LAMP manner using any biological sample for which to determine monobasic polymorphism, the amplified product has a sequence corresponding to the molecule used as a template, It can be analyzed by various methods known in the art.
  • the amplification reaction product can be detected by various methods, for example, by color change, turbidity change, fluorescence and / or electrophoresis of the reaction solution due to DNA synthesis, and the detected product is positive and / or It is compared to the product of the negative control sample and used for quantitative or qualitative analysis.
  • the amplification product according to the present application can be detected by the color change of the reaction solution according to the DNA synthesis.
  • the reaction solution may include an appropriate indicator, and the product of positive and / or negative control samples using hydroxy naphthol blue (HNB) as a dye that changes color in response to the concentration of magnesium ions in the reaction solution.
  • HNB hydroxy naphthol blue
  • Quantitative or qualitative analysis for example, due to nucleic acid amplification, Mg 2+ is combined with pyrophosphate, an amplification by-product of nucleic acid, to produce magnesium pyrophosphate, resulting in the concentration of Mg 2+ in the buffer. As the color is lowered, the color of the dye changes from purple to blue, which is particularly detectable by naked eyes, thereby increasing convenience.
  • composition according to the present invention may comprise the components used in the LAMP reaction as described above except for the template and the four or six primer sets described above.
  • kits according to the present disclosure may provide the components used in the LAMP reaction as described above except for the template and the above-mentioned four or six primer sets separately or in one tube.
  • Kits according to the invention further comprise a positive control, a negative control and instructions for use.
  • Samples that do not contain a nucleic acid as a negative control group, a positive control may include one or more target nucleic acid known alleles.
  • Primer sets, methods, kits and compositions according to the present invention detect alleles of a monobasic polymorphic locus in a sample quickly and accurately with high specificity and sensitivity, for example for various diseases of rheumatoid arthritis, diabetes, systemic lupus ulcer, Crohn's disease, Alzheimer's, glaucoma, hypertension, cancer-related diseases, plant breeding of the seed strain, can be usefully used for screening.
  • the present invention may be practiced using conventional techniques that are within the skill of one of ordinary skill in the art of cell biology, cell culture, molecular biology, gene transformation techniques, microbiology, DNA recombination techniques unless otherwise noted.
  • a more detailed description of the general technology can be found in Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012; Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. Eds., John Wiley & Sons 2002).
  • the use of the rs1047266 locus of the TNFRSF10B gene as a single nucleotide polymorphism marker to specifically detect its allele was tested by making various primer sets as shown in Table 1.
  • the nucleotide sequence of the target gene was obtained from the SNP DB of NCBI and used for the preparation of the detection primer at rs1047266.
  • locus (allele) of rs1047266 of the TNFRSF10B gene as the target nucleic acid used for primer preparation in this example and the target nucleic acid sequence including the same are shown in FIG. 2.
  • Parentheses in the sequence of FIG. 2 represent alleles C or T, and each of the two underlined bases upstream and downstream represents bases designed to not correspond in construction to the FIP and BIP primers.
  • the 5 'ends of FIP and BIP come with a base corresponding to the allele, and the second and third bases are designed to come with a base that does not correspond to the target nucleic acid.
  • primer set I is a primer set for allele C, and includes a base complementary to the allele C base G and a C allele base at 5 ′ ends of FIP and BIP.
  • Primer set II is a primer set for allele T, which includes A, the base complementary to the allele T base, and T, the allele base, at the 5 'end of FIP and BIP.
  • Primer sets III-VIII do not correspond to the corresponding target nucleic acid with one base upstream and one base downstream based on the allele of each target nucleic acid. That is, the SNP allele loci upstream and downstream base G were each replaced with their different A, T, and C, and the corresponding FIP and BIP were designed.
  • G is changed to A
  • the FIP is T at the second residue from the 5 'end
  • the BIP is A at the second residue from the 5' end.
  • G is replaced with T
  • the FIP is A with the second residue from the 5 'end and the BIP is T with the second residue from the 5' end .
  • G is replaced with C
  • the FIP is G at the second residue from the 5 'end and the BIP is C at the second residue from the 5' end.
  • primer sets III / IV, V / VI and VII / VIII were designed.
  • Primer sets IX and X are designed so that each of the two bases, AG and GG, upstream and downstream of the SNP allele locus is not complementary to the corresponding target nucleic acid, and after replacing AG and GG with CA and AA, respectively.
  • Corresponding primer set IX / X was designed.
  • the resulting FIP is a base whose 5 'end is complementary to the allele and the second or third base is one base (Nx-1) or two bases (Nx-2) upstream of the allele of the target nucleic acid. ), And the BIP has the same sequence as the allele and the second or third base has one base (Nx + 1) downstream of the allele of the target nucleic acid. Or bases different from the two bases (Nx + 2).
  • each primer sequence designed according to one embodiment of the present application is as described in Table 1 below.
  • each primer base sequence was verified using NCBI (National Center for Biotechnology Information), Genbank and Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website), and the bases matched with the genes were matched. There was no sequence.
  • the 5 'end of FIP and BIP has a base corresponding to the corresponding allele of the SNP locus, and is indicated by a gray box.
  • the second to third (III to VIII), and the second and third sequences (IX and X) may have one or two bases upstream and downstream based on the SNP locus in the target nucleic acid. Designed to not correspond to the sequence of the target nucleic acid, it is indicated by a black box.
  • primer numbers 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 are each The corresponding FIP or BIP described is indicated.
  • the sequences set forth in Table 1 above are exemplary sequences designed by selecting any SNP site to demonstrate that the method according to the present application may be applied, and the scope of the present application is by no means limited to these sequences.
  • the human genome DNA of rs1047266 is CC homozygous, CT heterozygous, or TT homozygous (generated in human blood and extracted whole DNA from the blood. CC homozygous, CT heterozygous, TT homozygous DNA confirmed by sequencing) was used. After the isothermal amplification under the following conditions using the 10 kinds of primer sets designed in Example 1 using the genomic DNA as a template, the single nucleotide polymorphism by the primer sets was obtained as a result of color change and electrophoresis of the reactants. Detection was confirmed.
  • the above-described genomic DNA was prepared at 500 pg / ⁇ l each. Reactions for LAMP analysis were 0.2 ⁇ M of each F3 and B3 primer, 1.6 ⁇ M of each FIP and BIP primer, 0.8 ⁇ M of each LF and LB primer, 0.4 M betaine, 10 mM in primer volume I to primer X in a total volume of 25 ⁇ l. A solution of a composition comprising MgSO 4 , 1.4 mM dNTPs, 1 ⁇ ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 120 ⁇ M HNB (Sigma) and 2 ⁇ l of genomic DNA, respectively, was used. After the isothermal amplification was carried out at 63 ° C. for 30 minutes with the composition, the reaction was terminated by reaction at 80 ° C. for 5 minutes.
  • Amplification was performed by color analysis as follows. Color analysis was performed by adding HNB (hydroxy naphthol blue) dye to the reaction solution. HNB acts as an indicator of Mg 2+ ion concentration. If there is no Mg 2+ ions, showed a light blue, purple ttinda if the Mg 2+ ions. Therefore, it exists in purple before the reaction, and as the DNA synthesis reaction occurs, the concentration of Mg 2+ ions decreases, thereby changing the color from purple to blue. The change in color is a positive reaction indicating that the nucleic acid has been amplified and can be qualitatively and quantitatively analyzed by measuring absorbance at the naked eye or at a wavelength of about 650 nm.
  • the method according to the present invention can quickly and conveniently see the results visually and perform qualitative analysis, and also has the advantage that qualitative and quantitative analysis is possible when measuring the absorbance at 650 nm wavelength using a spectrophotometer.
  • the second base from the 5 'end i.e., one base of the upstream and downstrip relative to the SNP locus in the target nucleic acid does not correspond to the sequence of the target nucleic acid, i.e. does not bind
  • the specificity is high enough to distinguish alleles when the difference is given to a total of two bases (four bases in total), including a difference due to the polybasic polymorphism.
  • the second and third bases from the 5 'end i.e., two bases each of the upstream and downstrip based on the SNP locus in the target nucleic acid are not complementary to the corresponding sequences of the target nucleic acid. It was found that each allele could not be detected accurately, if it was designed to do so.

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Abstract

본원은 표적핵산의 다형성을 등온증폭 방법으로 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 높은 특이도로 신속하게 검체의 다형성을 검출할 수 있으며, 또한 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

Description

표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 LAMP 기반의 단일염기 변화 검출 방법
본원은 LAMP 방식을 이용한 표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이를 신속하고 정확하게 판별할 수 방법에 관한 것이다.
염기서열 다형성(Polymorphism)은 1% 초과하는 빈도로 나타나는 염기 서열의 변이를 일컫는 것으로, 이 중 90%는 단일핵산염기다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP)이다. 인간 유전적 서열은 99.9% 동일하고, SNP는 약 250~1000bp 마다 하나씩 나타나며, 인간 유전체의 경우 약 2백만개의 SNP가 존재하고 이중 유전자에는 약 21,000개가 존재한다. 또한 1% 이하의 빈도로 나타나는 다른 단일염기의 변이는 통상 돌연변이(mutation)로 칭한다.
염기서열 돌연변이 분석 또는 SNP는 DNA 서열분석은 분석은 물론, 질환 예를 들면 암, 천식, 당뇨병과 같은 질환을 야기하는 유전자 발굴 또는 특정 질환과의 연관성을 판단할 수 있는 마커로서 중요한 역할을 한다(Ye S1, Dhillon S, Ke X, Collins AR, Day IN. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 2001 Sep 1;29(17):E88-8; ookes AJ. The essence of SNPs. Gene. 1999 Jul 8;234(2):177-86.).
따라서 단일염기서열 변이 또는 SNP를 분석함으로써 사람의 경우 특정 질환에 대한 개인의 감수성을 파악하여 염기서열의 차이로 인해 발생하는 선천성 질병에 대한 예방 또는 발병한 질환의 치료에 도움이 될 수 있다.
나아가 또한 사람들이 섭취하는 식재료에 대한 SNP 분석도 가능해지며, 예를 들면, 미국산 쇠고기 수입 개방과 더불어 원산지표시제 시행에 따른 한우와 수입 쇠고기에 대한 감별 등에 사용된다. 또한 식물 육종의 종자 계통 선별에 사용되어 농가에 도움을 줄 수 있다.
단일염기서열 변이를 분석하는 방법으로는 중합효소 연쇄반응인 PCR을 실시한 후 특이적 제한효소를 사용하여 증폭 산물의 단편 길이 차이로 확인하는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism), 대립형질에 특이적 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭한 후 전기영동으로 확인하는 SSP(Sequence-Specific Primed PCR), PCR 증폭 DNA를 형광 물질을 이용하여 실시간으로 측정하는 Real-time PCR, 프라이머 양쪽 말단에 제한효소가 반응할 수 있는 염기서열을 추가적으로 넣어 프라이머의 반응 후 제한효소로 인해 잘려진 프라이머가 다시 증폭반응에 사용되는 SDA(Strand Displacement Amplification) 등의 방법이 있다.
미국 공개특허 공보 2016-0053309 (2016년 2월 25일 공개)는 유전자 다형성 검출에 사용되는 프로브 및 프라이머 세트를 개시한다.
대한민국 공개특허공보 2012-0046018 (2012년 5월 9일 공개)은 실시산 PCR을 이용한 단일 뉴클레오타이드 다형성 검출 방법을 개시한다.
하지만 이들의 방법은 과다한 시간이 소요되고, 비특이적 PCR 산물의 오염 가능성, 고가의 장비 및 시약 등의 단점이 있다. 따라서 본원은 LAMP 방식을 이용하여 신속하고 정확하게 SNP 또는 단일 염기 돌연변이를 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본원은 LAMP 기반의 신속하고 정확하게 표적 유전자의 단일핵산염기다형(SNP, Single Nucleotide Polymorphism) 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일 염기 변화를 판별할 수 있는 검출 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 LAMP 방법을 이용한 표적핵산에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 단일염기 대립형질 검출방법으로, 상기 방법은 a) 하기 식1로 표시되는 표적핵산을 포함하는 핵산시료를 제공하는 단계:
식 1: 5′-Nx-n'Nx-1[X]Nx+1Nx+n-3′
상기 식 1에서 X는 대립형질이고, N은 상기 대립형질을 제외한 5′방향 및 3′방향에 존재하는 염기를 나타내고, 상기 x-n'은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n 및 n'는 동일하거나 상이할 수 있으며 2 이상의 정수이고, b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단은 상기 대립형질 X에 상응하는 염기로 각각 대립형질에 상보적인 염기 및 대립형질과 동일한 염기를 가지며, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단으로부터 두 번째 염기는 각각 상기 표적핵산의 Nx-1 및 Nx+1의 염기에 상응하지 않는 염기로서 각각 비상보적인 염기 및 상이한 염기를 가지며, c) 상기 표적핵산 및 상기 4 종류의 프라이머를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서 본원은 또한 LAMP 방법을 이용한 표적핵산에서 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 상기 표적핵산을 주형으로 제공하는 단계로, 상기 표적핵산은 상기 LAMP 반응에 사용되는 프라이머 디자인에 사용되는 영역으로서, 5′ → 3′가닥에 순서대로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역을 포함하며, 상기 대립형질은 상기 F1c 영역의 시작부위 그리고, 상기 B1 영역의 끝나는 부위에 위치하며; b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로, 상기 F3 프라이머는 상기 F3c 영역에 상보적인 서열을 가지며, 상기 B3 프라이머는 상기 B3 영역의 서열을 가지며, 상기 FIP의 5′말단은 상기 대립형질에 상보적인 염기를 갖는 F1c, 및 F2 영역의 서열로 구성되며, 단 상기 FIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 업스트림에 위치하는 염기와 비상보적 서열을 가지며, 상기 BIP의 5′말단은 상기 대립형질과 동일한 염기를 갖는 B1c, 및 B2 영역의 서열로 구성되나, 단 상기 BIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 다운스트림에 위치하는 염기와 상이한 염기와 동일한 염기를 가지며, 그리고 c) 상기 주형과 상기 4종류의 프라이머를 혼합하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법은 상기 LAMP 반응결과, 증폭산물이 생성된 경우는 상기 대립형질 X에 대하여 homozygote 또는 heterozygote이며, 증폭산물이 생성되지 않은 경우에는 상기 대립형질과 상이한 대립형질을 갖는 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 따른 일 구현예에서 각 영역간의 간격은 상기 B1과 F1c를 제외하고, 1bp-40bp이고, 프라이머가 디자인되는 영역의 크기는 약 160bp 내지 250bp가 되도록 정해질 수 있다.
본원에 따른 방법은 목적하는 바에 따라 예를 들면 신속한 반응이 필요한 경우, LF 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 LAMP 반응결과 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 또는 증폭산물의 전기영동을 이용하여 수행될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 FIP, F3, BIP 및 B3의 4종류의 프라이머 포함하는 LAMP 반응을 이용한 표적핵산의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출방법으로, 상기 방법은 상기 FIP 및 BIP의 각 5′말단은 상기 대립형질에 상응하는 염기를 가지며, 상기 FIP 및 BIP의 각 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 대립형질을 기준으로 각각 한 개의 업스트림 및 한 개의 다운스트림에 해당하는 염기와 상응하지 않은 염기가 위치하고, 상기 FIP의 5′말단에 위치하는 상기 대립형질에 상응하는 염기는 상기 대립형질에 상보적인 염기이고, 상기 BIP의 5′말단에 위치하는 상기 대립형질에 상응하는 염기는 상기 대립형질과 동일한 염기이고, 상기 FIP의 5′말단으로부터 두 번째에 위치하는 상기 대립형질에 상응하지 않은 염기는 상기 한 개 업스트림에 위치하는 염기에 비상보적 염기이고, 상기 BIP의 5′말단으로부터 두 번째에 위치하는 상기 대립형질에 상응하지 않은 염기는 상기 한 개 다운스트림에 위치하는 염기와 상이한 염기인, FIP 및 BIP 프라이머가 사용되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 양태에서 본원은 LAMP 방법을 이용한 표적핵산에서 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출용 프라이머 세트로, 상기 프라이머 세트는 하기 식1로 표시되는 표적핵산에 대하여 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 포함하며, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′단은 하기 식 1의 대립형질 X에 상응하는 염기를 가지며, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단으로부터 두 번째 염기는 각각 하기 식 1의 표적핵산의 Nx-1 및 Nx+1의 염기와 상이한 염기에 상응하는 염기를 갖고, 식 1: 5′-Nx-nNx-1(X)Nx+1Nx+n-3′: 상기 식 1에서 X는 대립형질이고, N은 상기 대립형질을 제외한 5′방향 및 3′방향에 존재하는 염기를 나타내고, 상기 x-n은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n은 2 이상의 정수인, 프라이머 세트를 제공한다.
본원에 따른 방법은 높은 특이성으로 신속하게 검체의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일 염기 변화를 판별할 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 분석이 가능하여 편리성이 증대된다.
도 1a는 본원에 따른 프라이머가 디자인되는 표적핵산 상의 6개의 영역을 도식적으로 나타낸 것이고 X는 단일염기다형성 또는 돌연변이 부위를 나타내며, 5′→3′방향으로 B1의 종점 및 F1c의 영역의 시점이 X에서 겹치는 것을 나타낸다. 상기 각 영역의 상보적 부위는 각각 B3c, B2c, B1c, F1, F2, 및 F3로 명명되며, 도 1a에는 표시하지 않았다.
도 1b는 일반적 LAMP 반응을 도식적으로 나타낸 것으로, 도 1a에 표시된 영역을 갖는 주형의 각 가닥에 F3 및 FIP (F1c 및 F2로 구성), 그리고 B3 및 BIP (B1c 및 B2로 구성) 프라이머가 결합하여 반응이 개시되어 덤벨 구조를 갖는 핵산이 생성되고 이로부터 증폭(exponential amplification)이 진행된다.
도 2a 및 2b는 본원에 따른 일 실시예에서 사용된 대립형질 좌위[C/T]를 포함하는 표적핵산의 서열 및 본원의 일 구현예에서 사용된 프라이머의 위치/서열을 나타낸다. 대립형질에 해당하는 염기를 기준으로 업스트림 및 다운스트림 각각 두 개의 염기는 FIP 및 BIP 프라이머 디자인시 상보적이지 않게 디자인되며, 이러한 염기는 이탤릭체로 표시하였다. 도 2b에는 LF 및 LB 프라이머의 위치/서열을 추가로 나타낸 것이다.
도 3 내지 도 7은 각각 도 2의 표적핵산을 주형으로 하여, 본원에서 디자인된 프라이머 세트 I/II, III/IV, V/VI, VII/VIII 및 IX/X을 각각 이용하여 수행된 LAMP 반응 결과를 아가로스 젤로 분석한 결과이다.
본원은 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법) 방법을 이용하여 표적핵산의 단일염기 변이를 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 특히 LAMP에 사용되는 4종류의 프라이머 중 두 개의 내측 프라이머인 FIP 및 BIP의 각 5′말단이 검출대상 대립형질 염기에 상응하는 염기를 가지며, 상기 각 5′말단으로부터 두 번째 염기는 표적핵산의 염기와 상이한 염기를 갖도록 디자인하고, 이러한 프라이머를 사용하여, 특정 대립형질의 존재를 LAMP 반응의 증폭여부로 확인할 수 있다.
따라서 한 양태에서 본원은 LAMP를 이용한 표적핵산의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 일 구현예에서, LAMP 방법을 이용한 표적핵산에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 단일염기 대립형질 검출방법으로, a) 하기 식1로 표시되는 표적핵산을 포함하는 핵산시료를 제공하는 단계:
식 1: 5′-Nx-nNx-1(X)Nx+1Nx+n-3′
상기 식 1에서 X는 대립형질이고, N은 상기 대립형질을 제외한 5′방향 및 3′ 방향에 존재하는 염기를 나타내고, 상기 x-n은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n은 2 이상의 정수이고,
b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단에는 상기 대립형질 X에 상응하는 염기를 가지며, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단으로부터 두 번째 염기는 각각 상기 표적핵산의 Nx-1 및 Nx+1의 염기와 상이한 염기에 상응하는 염기를 갖고, c) 상기 표적핵산 및 상기 4종류의 프라이머를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에 사용되는 단일염기 변화 또는 대립형질은 약 1%를 초과하는 빈도로 나타나는 염기서열 다형성(Polymorphism) 중 약 90%를 차지하는 단일핵산염기다형성(Single Nucleotide polymorphism, SNP) 및 통상 돌연변이(mutation)로 불리는 1% 이하의 빈도로 나타나 다른 염기로의 치환을 포함하는 변화를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니며, 개념의 측면에서 단일염기가 변화가 수반된 것이면 명칭에 제한되지 않고, 본원의 범위에 포함된다.
LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적핵산의 6개 부위 즉, 5′→ 3′방향으로 도 1a에 표시된 바와 같은 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역 (상기 영역에 상보적인 영역은 B3c, B2c, B1c, F1, F2 및 F3로 표시)에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다 (한국 특허 제612551호; Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고). 표준 LAMP 반응에는 최소 4종류의 두 개의 내측 프라이머 FIP(forward inner primer), BIP(backward inner primer)와 두 개의 외측 프라이머 F3(forward outer primer) 및 B3(backward outer primer)를 포함한다. 신속한 반응(Accelerated LAMP)을 위해서는 LF(Loop F) 및 LB(Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다.
LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산단계, 사이클링 증폭단계와 신장 및 재사용(recycling) 단계를 포함한다. 도 1b에 표시된 바와 같이 개시단계에서 내측 프라이머 FIP를 구성하는 F2 부분이 표적핵산의 F2c 영역에 결합하여 반응을 개시한다. 이어 외측 프라이머 F3 프라이머가 표적핵산의 F3c 영역에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 개시되며 이에 따라 단일가닥 핵산이 생성된다. 이 단일가닥은 F1/F1c 결합을 통해 5′ 말단에 고리를 형성하며, 여기에 두 번째 내측 프라이머 BIP 및 외측 프라이머 B3가 결합하여 DNA 합성 및 가닥교체 DNA 합성이 일어난다. 그 결과 덤벨 모양의 양 말단에 고리가(stem-loop) 형성된 단일가닥이 형성되고, 여기의 F1 영역의 3′말단으로부터 DNA 합성이 시작된다. 이어 사이클링 증폭단계에서는 두 개의 내측 프라이머만이 사용되며, 처음에는 하나의 내측 프라이머가 고리에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 일어나면서 원래의 고리 형성 단일가닥과 고리구조에서 stem 부위가 두 배 늘어난 새로운 고리 형성 단일가닥이 생성되며 이를 주형으로 하여 가닥교체 DNA 합성이 계속 수행되어 증폭산물이 1시간 이내에 약 109개까지 증폭된다.
보다 상세한 원리 및 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F(LF) 프라이머, 및 Loop B(LB) 프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.
도 1a에 기재된 바와 같이, 상술한 바와 같은 LAMP에 사용되는 프라이머 세트는 표적핵산상의 6개의 구분되는 영역(B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c)에 대하여 디자인되며, F3 및 B3는 두 개의 외측 프라이머이고, FIP 및 BIP는 두 개의 내측 프라이머이며, 두 개의 내측 프라이머는 센스 및 안티센스 서열을 포함하는 하이브리드 프라이머로 FIP는 F1c 영역 서열 및 F2 영역서열로 구성되고, BIP는 B1c 영역 서열 및 B2 영역 서열로 구성된다.
본원에서는 LAMP 반응에 사용되는 프라이머 중에서 FIP 및 BIP를 단일염기 돌연변이 또는 SNP의 대립형질의 검출에 특이적으로 디자인된다.
구체적으로 본원에 따른 방법에서 도 1에 기재된 바와 같이, 표적핵산에서 B1 영역의 끝과 F1c 영역의 시작점은 검출하고자 하는 대립형질에 위치시키고, 그 다운스트림 및/또는 업스트림에 한 개 또는 두 개의 염기에 변이를 주는 방식으로 프라이머를 디자인한다.
보다 구체적으로, 본원에 따른 방법에서 본원에 따른 프라이머가 디자인되는 대립형질을 포함하는 표적핵산 (또는 주형)은 설명의 편의상 다음 식 1로 표시될 수 있다:
식 1: 5′-Nx-n'Nx-1(X)Nx+1Nx+n-3′
상기 식 1에서 X는 대립형질을 나타내고 N은 상기 대립형질의 5′방향 및 3′방향에 존재하는 임의의 염기를 나타내고, 상기 x-n'은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n 및 n'는 동일하거나 상이할 수 있으며 2 이상의 정수이다. 표적핵산의 길이는 예를 들면 만약 n이 500이고, n'가 300이면 813bp이다. 하지만 표적핵산의 길이는 특별히 제한되는 것은 아니며, LAMP 반응을 위해 상술한 바와 같은 최소 4개의 프라이머를 디자인할 수 있는 6개의 영역을 확보할 수 있는 한 다양한 길이를 가질 수 있다.
상기 표적핵산에 대하여, 이에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP가 디자인되며, 여기에서 X에 상응하는 염기는 FIP 및 BIP의 각각의 5′말단에 그리고, Nx-1 및 Nx+1에 해당하는 염기와 상이한 염기에 상응하는 염기가 각각 FIP 및 BIP의 각각의 5′말단으로부터 두 번째에 위치한다. 구체적으로 FIP 프라이머는 그 특징상 FIP의 5′말단은 검출하고자 하는 대립형질에 상보적 염기 즉, 예를 들면 대립형질 X가 C이면 G 염기를 가지며, 5′말단부터 두 번째 염기는 표적핵산인 Nx-1에 위치하는 염기에 비상보적인 염기를 가지며, 예를 들면 표적핵산인 Nx-1에 위치하는 염기가 T인 경우, G, C, 또는 A를 가진다. BIP 프라이머는 그 특징상 BIP의 5′말단은 검출하고자 하는 대립형질과 동일한 염기 즉, 예를 들면 대립형질 X가 C이면 C염기를 가지며, 5′말단부터 두 번째 염기는 표적핵산인 Nx+1에 위치하는 염기와 상이한 염기, 예를 들면 표적핵산인 Nx+1에 위치하는 염기가 G인 경우 C, A 또는 T를 가진다.
다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.
먼저 a) 상기 표적핵산을 주형으로 제공하는 단계로, 상기 표적핵산은 상기 LAMP 반응에 사용되는 프라이머 디자인에 사용되는 영역으로서, 5′→ 3′가닥에 순서대로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역을 포함하며, 상기 대립형질은 상기 F1c 영역의 시작부위 그리고, 상기 B1 영역의 끝나는 부위에 위치하며; b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로, 상기 F3 프라이머는 상기 F3 영역의 서열을 가지며, 상기 B3 프라이머는 상기 B3 영역의 서열을 가지며, 상기 FIP는 그 5′말단이 상기 대립형질에 상보적인 염기를 갖는 F1c, 및 F2의 서열로 구성되며, 단 상기 FIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 업스트림 위치하는 염기와 비상보적 염기를 가지며, 상기 BIP는 그 5′말단이 상기 대립형질과 동일한 염기를 갖는 B1c, 및 B2의 서열로 구성되나, 단 상기 BIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 다운스트림에 위치하는 염기와 상이한 염기를 가지며, 그리고 c) 상기 주형과 4종류의 프라이머를 혼합하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머레이즈를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3′말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 분석에 사용되는 것이다. 본원에서는 검출의 민감도, 특이도, 신속성 및 편리성을 고려하여, 돌연변이 또는 단일염기 다형성, 또는 그 주변에 특이적으로 결합할 수 있도록 결합위치를 조정하여 프라이머를 디자인하였다.
본원에서 사용된 용어 “표적” 또는 “표적핵산”은 본원에 따른 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 검출대상 대립형질을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 일컫는 것으로, 인비트로에서 합성 또는 증폭된 것은 물론, 세포유래의 유전체의 전부 또는 일부를 포함하는 것이며, 인간, 동물, 식물체 유래일 수 있다.
본원에서 용어 “상보적” 또는 “상보성”은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 “결합”, “교잡” 또는 “혼성화”는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자 하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것을 참고 할 수 있다.
본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머 제작방법은 높은 엄격도 조건에서 표적인 단일염기다형성이 포함된 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법에 사용되는 프라이머는 상술한 바와 같이 FIP 및 BIP에 5′ 말단의 염기 및 이로부터 두 번째 위치의 염기에 특징이 있으며, 5‘말단의 염기는 대립형질에 상응하는 염기, 두 번째 위치의 염기는 표적핵산에 상응하지 않는 염기를 갖도록 디자인된다.
따라서 특정 표적핵산의 특정 대립형질에 대하여 두 개의 내측 프라이머가 디자인되면 나머지 외측 프라이머는 상기 내측 프라이머를 고려하여 적절하게 디자인될 수 있다.
이를 위해 특정 표적핵산에 존재하는 상술한 바와 같은 각 영역의 확정이 필요하다. 각 영역 간의 간격은 예를 들면, 반응시간 등을 고려하여 적절하게 결정될 수 있을 것이며, 상술한 바와 같이 B1의 끝점 및 F1c의 시점은 한 염기가 겹치며, 이를 제외한 나머지 영역 간 간격은 약 1bp-20bp 이며 왼편 및 오른편 경계에 위치하는 B3부터 F3c 까지는 최소 160bp 최대 250bp, 특히 200bp 이하로 결정될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
영역이 결정되면, 본원에서 F3 프라이머는 F3c에 상보적으로 결합하는 상기 F3 영역의 서열을 가지며, 상기 B3 프라이머는 B3c에 상보적으로 결합하는 상기 B3 영역의 서열을 가지며, 상기 FIP는 5′→3′방향으로 5′말단에 상기 대립형질에 상보적인 염기를 갖는 F1c 및 F2의 서열을 가지나, 단 상기 표적핵산의 다형성 부위를 기준으로 한 개 업스트림의 위치인, 상기 FIP 5′말단으로부터 두 번째 염기가 상기 표적핵산의 5′→ 3′ 방향 가닥의 서열과 비상보적 염기를 가지며, 상기 BIP는 5′→ 3′ 방향으로 5′말단에 상기 대립형질과 동일한 염기를 갖는 B1c 및 B2의 서열을 가지나, 단 상기 표적핵산의 다형성 부위를 기준으로 한 개 다운스트림의 위치인, 상기 BIP 5′말단으로부터 두 번째 염기가 상기 표적핵산과 상이한 염기를 가진다. 상기 각 영역의 길이와 프라이머 길이가 일치하는 경우도 있으나 반드시 일치해야 하는 것은 아니고, 영역내에서 프라이머가 디자인되는 경우, 프라이머의 길이가 해당영역보다 짧을 수도 있다.
따라서, 본원에 따른 방법에 사용되는 각 프라이머는 상기 원칙에 따라서 SNP 구체적 대립형질 및 이를 포함하는 표적핵산의 구체적 염기서열, 반응조건 등에 따라 디자인할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법에서 프라이머가 디자인되는 영역의 길이는 분석에 용이하며, 2차 구조가 형성되지 않는 선에서 결정될 수 있으며 본원에 따른 일 구현예에서는 최소 160pb에서 최대 250bp, 특히 약 200bp가 되도록 선택할 할 수 있다. 예를 들면 가장 먼저 F1c와 B1c의 5′말단 첫 번째 부위에 단일염기다형성이 존재하도록 디자인하여 약 15-25bp 길이의 프라이머를 제작한다. F1c, B1c 부위가 정해지면 F2와 B2의 위치를 F1c와 B1c에서 약 20bp-40bp 간격 안에서 제작한다.
예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서, 총 반응시간이 20 내지 40분인 경우에는 총 영역의 길이가 최소 160pb에서 최대 250bp가 되도록 영역을 결정하고 이로부터 프라이머가 디자인된다. 프라이머가 디자인되는 영역이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 반응시간이 길어지는 단점이 있다. 도 1b에 기재된 바와 같이 LAMP 반응의 특징상 증폭산물의 길이가 FIP에서 BIP 길이만큼 단계마다 증가하기 때문에, 영역의 크기가 커질수록 증폭시간이 길어지고 그 증폭산물로 인한 버퍼색 변화가 늦춰지기 때문이다.
본원에 따른 표적핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머의 길이는 반응시간, 온도, 표적핵산의 염기분포 등 반응 조건을 고려하여 적절하게 정할 수 있으며, 예를 들면 최소 15 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이며, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또한 프라이머의 GC 함량이 45% < Primer < 60%를 벗어나는 경우 G와 C의 핵산 분자 간 삼중결합으로 상호결합하는 특성 때문에 함량이 높게 되면 민감도가 떨어지는 반면 농도가 낮게 되면 특이도가 낮아진다.
또한 프라이머의 Tm과 관련해서 63℃ 등온의 조건에서 반응하는 LAMP 방법의 특성상, Tm이 50℃ < Primer <60℃를 벗어나 프라이머의 Tm 값이 낮게 되면 다이머 등의 영향으로 특이도가 낮아지게 되며, 60℃ 이상이 될 경우 유전자에 결합하는 효율이 떨어져 민감도가 떨어지며, 이를 고려하여 프라이머를 디자인할 수 있다.
특히 개시 단계에서 4개 프라이머가 주형에의 교잡이 중요하기 때문에 Tm 값이 특정 범위에 들어오도록 디자인하는 것이 중요하며, 이를 고려하여 크기 및 서열을 결정할 수 있다. 예를 들면 BIP 및 FIP에 포함된 F2 및 B2 서열의 Tm은 사용되는 폴리머라제에 맞춰, 예를 들면 Bst 폴리머라제가 사용되는 경우 이에 최적 온도인 약 60 내지 65 범위에서 결정하고, F2 및 B2의 외측에 위치하는 F1c 및 B1c은 Tm 값은 이보다 약간 높게 결정하여 주형으로부터 단일가닥 방출즉시 looped out 구조가 형성될 수 있도록 한다. 아울러 외측프라이머인 F3 및 B3의 Tm은 F2 및 B2의 Tm과 비교하여 낮게 설정되어 초기 반응이 외측이 아닌 내측 프라이머에서 발생하도록 유도한다.
본원에 따른 방법에서는 LF 및 LB 프라이머가 추가로 사용될 수 있다. 이 경우, LF는 F2와 F1c 사이 영역에서 제작될 수 있으며 F2와 F1c와의 간격은 각각 1bp 내지 10bp로 제작되며 F2와 F1c 사이 영역에서 GC content (45% < Primer < 60%)와 Tm (50℃ < Primer < 60℃)값을 참고하여 약 15bp-25bp 길이의 프라이머를 제작될 수 있다. LB의 경우, B1c와 B2 사이 영역에서 제작될 수 있으며, 제작 조건은 LF를 참조할 수 있다. LF와 LB를 첨가할 경우, LAMP의 민감도를 향상시키고, 좀 더 빠른 시간안에 결과를 검출 할 수 있는 효과가 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 각 프라이머의 길이는 상술한 바와 같이 약 15-25bp, 프라이머가 결합하는 각 영역의 간격은 1-40bp, 특히 1 내지 20bp로 디자인된다. 이는 프라이머의 길이가 길어질수록 증폭 시 핵산간에 상호결합하는 시간이 길어지며 프라이머 사이의 간격이 넓을수록 증폭산물의 크기가 커지게 되고, 그 결과 증폭시간이 오래 걸리며 이로 인한 민감도가 낮아질 수 있기 때문이다.
또한 상술한 바와 같은 덤벨 구조의 단일가닥에서 형성되는 고리구조의 단일가닥이 사이클링 반응에서 중요하기 때문에 형성되는 고리의 크기를 적절하게 조절할 수 있다. 고리의 크기는 F2c(B2c) 및 F1c(B1c) 사이의 크기로 정해질 수 있으며, 이를 위해 상술한 영역의 간격을 조절할 수 있으며, 일 구현예에서 고리의 크기는 약 40base 이상이다.
일 구현예에서는 6개의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트가 사용되며, 예를 들면 표 1의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 프라이머 세트를 포함하는 SNP 검출용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본원에 따른 방법, 프라이머 세트 또는 키트는 다양한 시료에서 SNP 판별을 위해 사용될 수 있다. 시료는 예를 들면 한우 감별 등과 같은 식재료, 혈액, 소변, 분변, 또는 체액을 포함하는 가검물에 대하여 실시될 수 있다. 시료를 채취하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 단일염기다형성의 판별을 하고자 하는 시료를 채취한 후, 이를 프로테나제 K(Proteinase K)를 처리하여 열수추출하여 LAMP 반응을 수행할 수 있다. 또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.
본원에 따른 프라이머 세트를 사용한 LAMP 반응을 위한 조성물 또는 키트는 dNTPs, 완충액, 마그네슘 및 DNA 폴리머라제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 반응을 향상시키기 위한 베타인 또는 DMSO와 같은 물질을 추가로 포함할 수 있다.
마그네슘은 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염의 형태로 사용된다.
완충액은 예를 들면 소디움포스페이트 완충액, 포타슘포스페이트 완충액, Tris-HCl 완충액 또는 Tricine 완충액 같은 것이 사용될 수 있다.
반응에 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제는 호열성 미생물 유래의 폴리머라제로서, 특히 5′→3′ 엑소뉴클리아제 기능이 결여된 폴리머라제를 포함한다. 비제한적 예로는 Bacillus stearothermophilus, Bst, DNA 폴리머라제; Thermus, thermophilus, Tth, DNA 폴리머라제; Thermus aquaticus, Taq, DNA 폴리머라제; Thermococcus litoralis DNA 폴리머라제; Pyrococcus furiosus, Pfu, DNA 폴리머라제; 및 Bacillus caldotenax DNA 폴리머라제를 포함한다.
또한 반응물에는 dNTP 대신에 뉴클레오타이드 유사체(analog)도 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다. 이러한 와슨 크릭 베이스 페어링을 통해 중합될 수 있는 유사체로 뉴클레오타이드 베이스의 유사를 포함하는 것은 예를 들면 치환된 퓨린 또는 피리미딘, 데아자퓨린, 메틸퓨린, 메틸피리미딘, 아미노퓨린, 아미노피리미딘, 티오퓨린, 티오피리미딘, 인돌, 피롤, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 하이포잔틴, 쉐도사이토신, 쉐도아이소사이토신, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 2-티오피리미딘, 4-티오티민, 6-티오구아닌, 니트로피롤, 니트로인돌 및 4-메틸인돌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치환된 데옥시리보스 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 치환 또는 비치환된 아라비노스, 치환 또는 비치환된 자일로스 및 치환 또는 비치환된 피라노스를 포함한다. 포스페이트 에스테르 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트, 포스포로셀로노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포로아미데이트, 보론포스페이트, 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트와 같은 알킬포스포네이트를 포함한다.
LAMP 반응은 DNA 폴리머라제 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 표적핵산의 증폭에 적합한 시간으로 반응된다. 당업자라면 반응조건을 고려하여 반응시간을 결정할 수 있을 것이며, 예를 들면 20분-40분의 시간에서 결정할 수 있으나, 시료에 포함된 표적핵산의 양에 따라 달라질 수 있으며, 결정될 수 있다. 예를 들면 민감도를 높이기 위해 반응시간을 증가시킬 수 있다.
본원에 따른 LAMP 분석은 다양한 분석 포맷으로 분석될 수 있으며, 예를 들면 액상반응 또는 일부 성분이 고상기질에 흡착된 상태로 수행될 수도 있다.
본원에 따른 방법, 프라이머 세트를 포함하는 조성물 또는 키트는 단일염기다형성을 판별하고자 하는 임의의 생물학적 시료를 사용한 LAMP 방식으로 분석에 사용되며, 증폭된 산물은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다.
증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석에 사용된다.
일 구현예에서 본원에 따른 증폭산물은 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화로 검출될 수 있다. 이 경우, 반응액은 적절한 지시 시약(indicator)을 포함할 수 있으며, 반응액 중 마그네슘 이온 농도에 반응하여 색이 변하는 염료로서 HNB(hydroxy naphthol blue)를 사용하여 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석 할 수 있으며, 예를 들면 핵산의 증폭으로 인해 Mg2+가 핵산의 증폭 부산물인 파이로 포스페이트와 결합하여 마그네슘 파이로포스페이트를 생성하여 버퍼안에 존재하는 Mg2+의 농도가 낮아지면서 염료의 색이 보라색에서 푸른색으로 변하며, 이는 특히 나안으로 검출이 가능하여 그 편리성이 증대된다.
본원에 따른 조성물은 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 반응에 사용되는 성분 및 상술한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본원에 따른 키트는 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 반응에 사용되는 성분 및 상술한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 별도로 또는 하나의 튜브에 제공할 수 있다. 본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 핵산을 포함하지 않는 시료, 양성대조군은 대립형질이 알려진 하나 이상의 검출대상 핵산을 포함할 수 있다.
본원에 따른 프라이머 세트, 이를 이용한 방법, 키트 및 조성물은 시료에서 단일염기다형성 좌위의 대립형질을 신속하고 정확하게 높은 특이도 및 민감도로 검출하고, 예를 들면 다양한 질환 류마티스 관절염, 당뇨병, 전신성 루프스낭창, 크론병, 알츠하이머, 녹내장, 고혈압, 암과 관련된 질병, 식물 육종의 종자 계통 선별, 한우감별 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.
실시예 1. 특정 SNP 검출이 가능한 LAMP 프라이머 세트 디자인
본원에 따른 방법을 검증하기 위해, 일예로서 단일염기다형성 마커로서 TNFRSF10B 유전자의 rs1047266 좌위를 사용하여 이의 대립형질을 특이적으로 검출할 수 있는지를 표 1과 같이 다양한 프라이머 세트를 제작하여 시험하였다.
TNFRSF10B 유전자의 rs1047266 좌위에 대한 단일염기다형성의 정확한 판별을 위해 표적 유전자의 염기서열을 NCBI의 SNP DB에서 수득하여 rs1047266에 검출 프라이머 제작에 사용하였다.
본 실시예에서 프라이머 제작에 사용된 표적핵산으로 TNFRSF10B 유전자의 rs1047266의 좌위 (대립형질) 및 이를 포함하는 표적핵산 서열은 도 2에 표시된 바와 같다.
도 2의 서열에서 괄호는 대립형질 C 또는 T를 나타내고, 업스트림 및 다운스트림의 밑줄 친 각 두 개의 염기는 FIP 및 BIP 프라이머에 제작시에 상응하지 않도록 디자인된 염기를 나타낸다.
상기 서열을 표적핵산으로 하여 대립형질 C와 T의 검출용으로 각각 5종류씩 총 10종류의 FIP와 BIP, 그리고 한 종류의 F3, B3, LF 및 LB의 프라이머를 제작한 후 이를 LAMP 증폭용 프라이머 세트를 완성하였다 (표 1).
후술하는 바와 같이 FIP 및 BIP의 5′말단에는 상기 대립형질에 상응하는 염기가 오며, 그 두 번째 및 세 번째 염기는 표적핵산과 상응하지 않는 염기가 오도록 디자인된다.
구체적으로 프라이머 세트 I은 대립유전자 C에 대한 프라이머 세트로, FIP 및 BIP의 5′말단에 상기 대립형질 C 염기에 상보적인 염기인 G 및 상기 대립형질 염기인 C를 포함한다. 프라이머 세트 II는 대립유전자 T에 대한 프라이머 세트로, FIP 및 BIP의 5′말단에 상기 대립형질 T 염기에 상보적인 염기인 A 및 상기 대립형질 염기인 T를 포함한다.
프라이머 세트 III 내지 VIII은 각각의 표적핵산의 대립형질을 기준으로 업스트림의 한 개의 염기 및 다운스트림의 한 개의 염기가 상응하는 표적핵산에 상응하지 않는다. 즉 상기 SNP 대립형질 좌위 업스트림 및 다운스트림 염기 G 각각을 이와 상이한 A, T, 및 C로 바꾼 후 이에 상응하는 FIP 및 BIP를 디자인하였다. G를 A로 바꾼 경우, FIP는 5′말단부터 두 번째 잔기가 T이고, BIP는 5′말단부터 두 번째 잔기가 A이다. G를 T로 바꾼 경우, FIP는 5′말단부터 두 번째 잔기가 A이고, BIP는 5′말단부터 두 번째 잔기는 T이다. G를 C로 바꾼 경우, FIP는 5′말단부터 두 번째 잔기가 G이고, BIP는 5′말단부터 두 번째 잔기는 C이다. 이런 방식으로 프라이머 세트 III/IV, V/VI 및 VII/VIII을 디자인하였다.
프라이머 세트 IX 및 X은 상기 SNP 대립형질 좌위 업스트림 및 다운스트림의 각각의 두 개의 염기인 AG 및 GG가 상응하는 표적핵산에 상보적이지 않게 디자인한 것으로, AG와 GG를 각각 CA 및 AA로 바꾼 후 이에 상응하는 프라이머 세트 IX/X을 디자인하였다.
그 결과 FIP는 5′말단이 상기 대립형질에 상보적인 염기 그리고 두 번째 또는 세 번째 염기는, 표적핵산의 상기 대립형질 한 개 업스트림의 한 개 염기(Nx-1) 또는 두 개의 염기(Nx-2)와 비상보적인 염기를 가지게 되고, BIP는 5′말단이 상기 대립형질과 동일한 서열 그리고 두 번째 또는 세 번째 염기는, 표적핵산의 상기 대립형질 한 개 다운스트림의 한 개 염기(Nx+1) 또는 두 개의 염기 (Nx+2)와 상이한 염기를 가진다.
본원의 일 구현예에 따라 디자인된 각 프라이머 서열을 하기 표 1에 기재된 바와 같다. 또한 각 프라이머 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information), Genbank 및 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)를 이용하여 검증한 결과 해당 유전자 외에 일치하는 염기서열이 존재하지 않았다.
[표 1]
rs1047266 단일염기다형성 검출을 위한 프라이머의 염기서열
Figure PCTKR2017009359-appb-I000001
Figure PCTKR2017009359-appb-I000002
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Figure PCTKR2017009359-appb-I000010
상기 표 1에서 FIP 및 BIP의 5′말단은 SNP 좌위의 해당되는 대립형질에 상응하는 염기를 가지며, 회색박스로 표시되었다. 또한 전술한 바와 같이 5′말단부터 두 번째(III부터 VIII), 그리고 두 번째 및 세 번째 서열(IX 및 X)은 표적핵산에서 SNP 좌위를 기준으로 업스트림 및 다운스트림의 한 개 또는 두 개의 염기가 표적핵산의 서열과 상응하지 않도록 디자인 된 것으로 검은색박스로 표시되었다. 상기 표 1에서 프라이머 번호 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24는 상기 각 번호에 기재된 해당 FIP 또는 BIP를 나타낸다. 상기 표 1에 기재된 서열은 본원에 따른 방법이 적용될 수 있음을 증명하기 위해 임의의 SNP 부위를 선별하여 디자인된 예시적인 서열로 결코 이 서열로 본원의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 2. LAMP 반응을 통한 단일염기다형성 확인
실시예 1에서 제조한 각 프라이머 세트를 사용하여 rs1047266의 단일염기다형성 좌위가 CC homozygous, CT heterozygous, TT homozygous인 인간 유전체 DNA(인체의 혈액을 채취하여 그 혈액으로부터 전체 DNA 추출하여, 상기 좌위에서의 CC homozygous, CT heterozygous, TT homozygous를 염기서열분석을 통해 확인한 DNA)를 사용하였다. 상기 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 실시예 1에서 디자인된 10 종류의 프라이머 세트를 이용하여 다음에 기재한 조건에서 등온증폭을 실시한 뒤 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 상기 프라이머 세트에 의한 단일염기다형성 검출여부를 확인하였다.
구체적으로, 상술한 유전체 DNA를 각 500pg/μl로 준비하였다. LAMP 분석을 위한 반응은 총 부피 25μl 중 프라이머세트 I ~ 프라이머세트 X에서 0.2μM의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10mM MgSO4, 1.4mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 120μM HNB (Sigma) 및 2μl의 유전체 DNA를 각각 포함하는 조성의 용액을 사용하였다. 상기 조성으로 63℃에서 30분 동안 등온증폭을 실시한 후 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.
증폭여부는 다음과 같이 색분석으로 수행하였다. 색분석은 HNB (hydroxy naphthol blue) 염료를 반응액에 넣어 수행하였다. HNB는 Mg2+ 이온 농도의 지시자(indicator)로서 작용한다. Mg2+ 이온이 없을 경우, 하늘색으로 보이며, Mg2+ 이온이 있을 경우, 보라색을 띤다. 따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg2+ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응으로, 나안 또는 약 650nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
결과는 도 3 내지 도 7에 기재되어 있다.
도 3에 기재된 바와 같이, FIP 및 BIP의 5′말단이 SNP 좌위의 해당되는 대립형질에 상응하는 염기를 갖도록 디자인된 경우, rs1047266의 각 대립형질을 정확하게 검출하지 못하는 것으로 나타났다. 이는 단일염기다형성 차이에 의한 결합력차이가 거의 나타나지 않아 대립형질 유형을 구별해내지 못하는 것으로 판단된다.
하지만 도 4 내지 도 6에 기재된 바와 같이 5′말단부터 두 번째 염기가, 즉, 표적핵산에서 SNP 좌위를 기준으로 업스트림 및 다운스트립의 한 개의 염기가 표적핵산의 서열과 상응하지 않도록, 즉 결합하지 않도록 디자인 된 경우, SNP 각 대립형질을 정확하게 검출하는 것으로 나타났다. 이는 단일염기다형성에 의한 차이를 포함하여 총 두 개의 염기(총 4개의 염기)에 차이를 준 경우 대립형질을 구별할 수 있을 만큼 특이도가 높아지기 때문으로 판단된다.
반면, 도 7에 기재된 바와 같이 5′말단부터 두 번째 및 세 번째 염기가, 즉, 표적핵산에서 SNP 좌위를 기준으로 업스트림 및 다운스트립의 각각 두 개의 염기가 표적핵산의 상응하는 서열에 상보적이지 않도록 디자인 된 경우, 각 대립형질을 정확하게 검출하지 못하는 것으로 나타났다.

Claims (10)

  1. LAMP 방법을 이용한 표적핵산에 존재하는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 단일염기 대립형질 검출방법으로,
    a) 하기 식1로 표시되는 표적핵산을 포함하는 핵산시료를 제공하는 단계:
    식 1: 5′-Nx-n'Nx-1(X)Nx+1Nx+n-3′
    상기 식 1에서 X는 대립형질이고, N은 상기 대립형질을 제외한 5′방향 및 3′방향에 존재하는 염기를 나타내고, 상기 x-n'은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n 및 n'는 동일하거나 상이할 수 있으며 2 이상의 정수이고,
    b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로,
    상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단은 상기 대립형질 X에 상응하는 염기로 각각 대립형질에 상보적인 염기 및 대립형질과 동일한 염기를 가지며,
    상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단으로부터 두 번째 염기는 각각 상기 표적핵산의 Nx-1 및 Nx+1의 염기에 상응하지 않는 염기로서 각각 비상보적인 염기 및 상이한 염기를 가지며,
    c) 상기 표적핵산 및 상기 4 종류의 프라이머를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. LAMP 방법을 이용한 표적핵산에서 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출방법으로, 상기 방법은
    a) 상기 표적핵산을 주형으로 제공하는 단계로,
    상기 표적핵산은 상기 LAMP 반응에 사용되는 프라이머 디자인에 사용되는 영역으로서, 5′ → 3′가닥에 순서대로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역을 포함하며,
    상기 대립형질은 상기 F1c 영역의 시작부위 그리고, 상기 B1 영역의 끝나는 부위에 위치하며,
    b) 상기 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 제공하는 단계로,
    상기 F3 프라이머는 상기 F3c 영역에 상보적인 서열을 가지며,
    상기 B3 프라이머는 상기 B3 영역의 서열을 가지며,
    상기 FIP의 5′말단은 상기 대립형질에 상보적인 염기를 갖는 F1c, 및 F2 영역의 서열로 구성되며, 단 상기 FIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 업스트림에 위치하는 염기와 비상보적 서열을 가지며,
    상기 BIP의 5′말단은 상기 대립형질과 동일한 염기를 갖는 B1c, 및 B2 영역의 서열로 구성되나, 단 상기 BIP 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 표적핵산의 대립형질을 기준으로 한 개 다운스트림에 위치하는 염기와 상이한 염기를 가지며, 그리고
    c) 상기 주형과 상기 4종류의 프라이머를 혼합하여 LAMP 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은
    d) 상기 LAMP 반응결과, 증폭산물이 생성된 경우는 상기 대립형질 X에 대하여 homozygote 또는 heterozygote이며, 증폭산물이 생성되지 않은 경우에는 상기 대립형질과 상이한 대립형질을 갖는 것으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 각 영역간의 간격은 상기 B1과 F1c를 제외하고, 1bp-40bp이고, 상기 B3부터 F3c 까지는 160bp 내지 250bp인, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 LF 및 LB 프라이머를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 LAMP 반응결과 분석은 상기 반응결과물의 색변화 측정, 탁도(turbidity), 또는 증폭산물의 전기영동 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
  7. FIP, F3, BIP 및 B3의 4종류의 프라이머 포함하는 LAMP 반응을 이용한 표적핵산의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출방법으로,
    상기 FIP 및 BIP의 각 5′말단은 상기 대립형질에 상응하는 염기를 가지며, 상기 FIP 및 BIP의 각 5′말단으로부터 두 번째 염기는 상기 대립형질을 기준으로 각각 한 개의 업스트림 및 한 개의 다운스트림에 해당하는 염기와 상응하지 않은 염기가 위치하고,
    상기 FIP의 5′말단에 위치하는 상기 대립형질에 상응하는 염기는 상기 대립형질에 상보적인 염기이고, 상기 BIP의 5′말단에 위치하는 상기 대립형질에 상응하는 염기는 상기 대립형질과 동일한 염기이고,
    상기 FIP의 5′말단으로부터 두 번째에 위치하는 상기 대립형질에 상응하지 않은 염기는 상기 한 개 업스트림에 위치하는 염기에 비상보적 염기이고, 상기 BIP의 5′말단으로부터 두 번째에 위치하는 상기 대립형질에 상응하지 않은 염기는 상기 한 개 다운스트림에 위치하는 염기와 상이한 염기인, FIP 및 BIP 프라이머가 사용되는 것을 특징으로 하는 LAMP 반응을 이용한 단일염기 대립형질 검출방법.
  8. LAMP 방법을 이용한 표적핵산에서 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 또는 돌연변이를 포함하는 표적핵산의 단일염기 대립형질 검출용 프라이머 세트로,
    상기 프라이머 세트는 하기 식1로 표시되는 표적핵산에 대하여 결합할 수 있는 두 개의 외측(outer) 프라이머 F3 및 B3와 상기 외측 프라이머 결합부위 안쪽의 표적핵산에 결합할 수 있는 두 개의 내측(inner) 프라이머 FIP 및 BIP를 포함하며,
    상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′단은 하기 식 1의 대립형질 X에 상응하는 염기를 가지며, 상기 내측 프라이머 FIP 및 BIP 각각의 5′말단으로부터 두 번째 염기는 각각 하기 식 1의 표적핵산의 Nx-1 및 Nx+1의 염기와 상이한 염기에 상응하는 염기를 갖고,
    식 1: 5′-Nx-nNx-1(X)Nx+1Nx+n-3′
    상기 식 1에서 X는 대립형질이고, N은 상기 대립형질을 제외한 5′방향 및 3′방향에 존재하는 염기를 나타내고, 상기 x-n은 상기 X를 기준으로 5′방향으로 n 번째 위치를 나타내고, x+n은 상기 X를 기준으로 3′방향으로 n번째 위치를 나타내고, 상기 n은 2 이상의 정수인, 프라이머 세트.
  9. 제 8 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 기반의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 단일염기 대립형질 검출 방법.
  10. 제 8 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 기반의 단일염기다형성 또는 돌연변이를 포함하는 단일염기 대립형질 검출용 조성물.
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