WO2015126078A1 - 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 - Google Patents

핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 Download PDF

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    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to an isothermal amplification method of a nucleic acid and a signal probe and a method for detecting a nucleic acid using an amplified signal probe, and more particularly, an external primer set, a DNA-RNA-DNA hybrid primer set, and a DNA-RNA-DNA hybrid signal.
  • the present invention relates to a method for amplifying a target nucleic acid and a signal probe simultaneously using a probe and rapidly detecting the target nucleic acid. More specifically, the ratio of the forward DNA-RNA-DNA hybrid primers and the reverse DNA-RNA-DNA hybrid primers is asymmetrically amplified and asymmetrically amplified.
  • the present invention relates to a method for detecting nucleic acid at an isothermal temperature by amplifying a signal using a DNA-RNA-DNA hybrid signal probe having a nucleotide sequence complementary to an excessively amplified DNA.
  • Nucleic acid amplification is a very useful technique for detecting and analyzing small amounts of nucleic acids.
  • the high sensitivity of nucleic acid amplification to target nucleic acids has led to advances in the isolation of genes and the detection of specific nucleic acids in forensic aspects for the diagnosis and analysis of infectious and hereditary diseases. Methods have been developed to perform highly sensitive diagnostic assays (Belkum, Current Opinion in Pharmacology, 3: 497, 2003).
  • nucleic acid is due to the complementarity of the DNA strand and the ability of a single stranded nucleic acid to form a double stranded hybrid molecule in vitro , by which the specific nucleic acid can be detected in a sample (Barry et al ., Current Opinion in Biotechnology, 12: 21, 2001).
  • Probes used for nucleic acid detection consist of specific sequences that can hybridize with target sequences present in nucleic acid samples.
  • the probe is read by chemicals, immuno-chemicals, fluorescence or radioisotopes.
  • the probe is configured to include a label or reporter molecule, such as biotin and dioxygenin, or a fluorescent material capable of reading DNA hybridization with a short fragment of nucleic acid having a complementary sequence to the target nucleic acid.
  • nucleic acid detection method in particular, cannot detect short sequences on chromosomal DNA, has a low copy number, and has a limitation in solving limited copy numbers of modified alleles for wild-type genes.
  • Other problems with nucleic acid detection methods relate to environmental conditions in vitro or in situ that limit the physical interaction of target sequences, chemicals, or probes with other molecules or structures.
  • Methods for detecting target nucleic acids can be grouped into three categories: amplification of a target nucleic acid sequence, which is a method of amplifying target nucleic acids, amplification of a probe that amplifies the probe molecule itself, and a signal indicating each probe by a complex probe or a connecting probe. There is signal amplification that is increased by technology.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a replica of each helix of is synthesized.
  • a pre-programmed thermal cycling instrument is required.
  • this method is expensive, relatively low in specificity, and has the disadvantage of extremely standardizing the performance steps in order to reproduce the results.
  • LCR ligase chain reaction
  • LCR Since LCR has a higher discriminatory power than the primer extension of a nucleic acid using a primer, it exhibits allele specificity higher than PCR in genotyping point mutation. LCR has the highest specificity among the nucleic acid amplification techniques developed so far, and since all identification mechanisms are optimized, it is the easiest method to perform, but it has the slowest reaction rate and requires a large number of modified probes. have.
  • Strand displacement amplification is a method of amplifying a target nucleic acid sequence in a sample and its complementary helix by strand displacement through an endonuclease.
  • This method comprises a mixture containing at least one nucleic acid polymerase, dNTPs comprising at least one substituted deoxynucleoside triphosphate (dNTP), and at least one primer complementary to the 3 'end of the target fragment.
  • dNTPs comprising at least one substituted deoxynucleoside triphosphate (dNTP)
  • dNTP substituted deoxynucleoside triphosphate
  • Each primer has a sequence recognized by a restriction endonuclease at the 5 'end (Walker et al., Nucleic Acids Res., 20: 1691, 1992).
  • the primers are stretched using RNA-DNA hybrid primers or RNA primers in a similar manner to the SDA method, and then the primers and template DNA are cleaved using an RNaseH enzyme that cleaves RNA primers that hybridize with the template DNA.
  • Method of stretching new primer by substitution single primer isothermal amplification (SPIA) method using 5'-RNA-DNA-3 'primer (US Pat. No. 6,251,639), using 5'-DNA-RNA-3' primer Isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid (ICAN) method (U.S. Patent Application 2005/0123950), Riboprimer method using RNA primer (U.S. Patent Application 2004/0180361), external primer and internal DNA-RNA-DNA hybrid primer Methods (US Pat. No. 5,824,517) and the like.
  • SPIA single primer isothermal amplification
  • ICAN Isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid
  • TMA Transcription mediated amplification
  • the TMA method combines a mixture consisting essentially of the target nucleic acid with a promoter-primer, an oligonucleotide that is complementary to the 3 'end of the target sequence for hybridization with the 3' end of the target nucleic acid or a region adjacent thereto. It is characterized by.
  • the promoter-primer also includes a promoter region sequence for an RNA polymerase located at the 5 'end of the complexing sequence. The promoter-primer and target sequence form a promoter-primer / target sequence hybrid so that the DNA is stretched.
  • the 3 'end of the target sequence extends from a position close to the complex in which the promoter primer hybridizes between the complexing sequence and the target sequence.
  • the promoter sequence acts as a template for the stretching process, producing the first DNA stretch product to form a double helix promoter sequence.
  • the 3 'end of the promoter-primer can also be used as a primer for the second DNA extension process.
  • a double-stranded nucleic acid complex is formed using a target sequence as a template.
  • the complex is a DNA / RNA complex when the RNA target sequence is used, and a DNA / DNA complex when the DNA target sequence is used.
  • an RNA polymerase that recognizes a promoter-promoter promoter to produce various RNA copies of the target sequence synthesizes RNA using the first DNA kidney product.
  • Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) methods include the synthesis of single-stranded RNA, the synthesis of single-stranded DNA and the synthesis of double-stranded DNA (Compton, Nature , 350: 91, 1991).
  • the single helix RNA is the first template for the first primer
  • the single helix DNA is the second template for the second primer
  • the double helix DNA is the third in synthesizing a copy for the first template. It becomes a template.
  • thermocycling processes such as PCR require a thermocycling block to reach the "target" temperature of each cycle, and a delay time until the thermal block reaches the target temperature requires amplification.
  • the disadvantage is that it requires a long time until.
  • Isothermal target nucleic acid amplification methods such as SDA, NASBA, and TMA
  • SDA SDA
  • NASBA NASBA
  • TMA isothermal target nucleic acid amplification method
  • Nucleic acid amplification according to the SDA method is limited in its applicability because there must be a site for a defined restriction enzyme, and transcription-based amplification methods such as NASBA and TMA require binding of the polymerase promoter sequence and amplification products by primers. This process tends to result in non-specific amplification. Because of this drawback, the amplification mechanism of DNA targets by these transcription-based amplification methods is not well established.
  • the current amplification method is another disadvantage is that the test sample may be contaminated by the amplification product of the prior amplification reaction, thereby resulting in non-target specific amplification of the sample.
  • methods for detecting contamination of test solutions employing various means and physical means for decontaminating the test sample at the end of the amplification reaction or before initiation of amplification of the target nucleic acid have been developed. Make it.
  • Another method for nucleic acid detection is to amplify a signal rather than amplifying a target nucleic acid or a probe.
  • bDNA branched DNA
  • Hybrid capture method using signal amplification has sensitivity similar to that of direct detection of target nucleic acid and amplification of target nucleic acid, and uses antibody or chemiluminescent material for signal detection.
  • a method of amplifying a signal probe (cycling probe technology) amplification method uses a DNA-RNA-DNA hybrid signal probe having a nucleotide sequence complementary to the target nucleic acid, and when the target nucleic acid is hybridized with the target nucleic acid, the RNA portion of the hybrid signal probe is cleaved and cleaved by an RNaseH enzyme.
  • a method that separates the target nucleic acid and another DNA-RNA-DNA hybrid signal probe hybridizes with the target nucleic acid to produce a cleaved probe, resulting in cyclic amplification of the signal probe.
  • Probe detection method using fluorescent resonance energy transfer (FRET) that detects cleaved signal probes by labeling fluorescent material and fluorescent inhibitor at both ends of DNA-RNA-DNA
  • FRET fluorescent resonance energy transfer
  • the CPT method has a relatively low amplification efficiency of 10 2 to 10 4 , making it difficult to use for independent diagnosis, and by increasing the amount of a specific site of a target nucleic acid primarily by conventional nucleic acid amplification such as PCR, a signal probe is separately applied. Amplification is complicated to use and has a disadvantage of high cost.
  • Asymmetric PCR is a derivative of PCR that selectively amplifies a single DNA only from a double-stranded DNA template and is useful for the synthesis of single-stranded DNA templates for sequencing sequences.
  • asymmetric PCR methods are much more effective in detecting adenoviruses compared to symmetric PCR methods using molecular beacon probes. gave.
  • Asymmetric PCR was also used for template synthesis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) hybridization probes for single nucleotide polymorphism of the factor V gene.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the asymmetric PCR method induces different concentrations of the forward and reverse primers so that the amount of the amplified product synthesized by the forward primer and the amplified product synthesized by the reverse primer is different. It provides a method for solving the problem of binding between amplification products.
  • the excess primers induce linear amplification, increasing the PCR amplification efficiency. .
  • asymmetric PCR has higher amplification efficiency than symmetric PCR, but the difference is not so great.
  • the reason for this can be interpreted as the re-association of amplification products or amplification products and primers in PCR during denaturation of temperature.
  • the asymmetric method is more effective than PCR.
  • the asymmetric amplification method is very effective in the case of using a probe that binds to the amplification product synthesized by the forward or reverse primer.
  • the binding between the amplification products synthesized by the forward and reverse primers and the competitive binding between the probe and the complementary amplification product and the probe occur.
  • the length of the nucleotide sequence of the amplification product is longer than the length of the nucleotide sequence of the probe, the probability of signal generation due to the binding between the amplification products is much higher than the probability of signal generation by the binding of the amplification product and the brobe.
  • the concentration of the probe is higher than that of the amplification product, but the binding between the amplification product and the probe is superior.
  • the concentration of the amplification product is increased. Signaling by the coupling is reduced and signal generation is eventually stopped. Therefore, if an excessive amount of primers for synthesizing an amplification product that binds to the probe among the amplification products synthesized by the forward or reverse primers is induced, induction of binding between the amplification product having the nucleotide sequence complementary to the probe and the probe may result. Increasing the signal generation probability by the combination of probes ultimately become a more efficient amplification method.
  • Nonspecific amplification is classified as a very serious problem that results in false positives, which makes the diagnosis less accurate. Therefore, most primers are designed using advanced technologies such as computer simulation using bioinformatics. However, computer simulations are not always consistent with actual experimental results, so even non-specific amplification of primers designed by bioinformatics techniques cannot be completely ruled out.
  • the primer-dimer phenomenon amplification by binding between primers using excessive amounts in the amplification process, results in a decrease in the accuracy of nucleic acid amplification.
  • the problem is very large in isothermal amplification using primers having a relatively long length compared to PCR primers.
  • the inventor's prior patent is a symmetric isothermal amplification method for detecting target nucleic acids by isothermally amplifying nucleic acid and a signal probe simultaneously using the same amount of forward and reverse DNA-RNA-DNA hybrid primers.
  • the prior art has a problem of a cumbersome method of adding an enzyme reaction mixture after denaturing the reaction mixture comprising a target DNA and a primer set for amplification.
  • the present inventors have overcome the disadvantages described above, improve the detection sensitivity of the target nucleic acid to develop a method for accurately amplifying and detecting the amplified product at the same time as the target nucleic acid amplification, as a result, the base complementary to the target nucleic acid Using asymmetric methods to vary the ratio of the forward and reverse primers of a set of external primers with sequences and a set of DNA-RNA-DNA hybrid primers with partially complementary nucleotide sequences to target nucleic acids, The present invention has been accomplished by confirming that amplification can be more efficiently amplified than symmetrical methods and lower nonspecific amplification by binding between primers.
  • the present inventors focus on the precedent of the LAMP method (Maruyama et al. Appl. Environ. By applying to the present invention to confirm that it can be easily and efficiently amplified without a separate denaturation process and completed the present invention.
  • Another object of the present invention to provide a method for rapidly and accurately amplifying a target nucleic acid and a signal probe at isothermal. Another object of the present invention to provide a method for detecting a target nucleic acid, characterized in that the amplification of the target nucleic acid and the probe signal at an isothermal at the same time.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a target DNA, (ii) an external primer set having a base sequence complementary to the target DNA, (iii) the target DNA and the 3 'terminal DNA portion are complementary and 5' A DNA-RNA-DNA hybrid primer set in which the terminal DNA-RNA portion has a non-complementary sequence, and (iv) a DNA-RNA- having a base sequence complementary to an amplification product produced by the hybrid primer set with the external primer set.
  • a target comprising a step of adding an enzyme reaction mixture containing a DNA polymerase capable of chain substitution and an RNA degrading enzyme to a reaction mixture including a DNA hybrid signal probe, and then simultaneously amplifying the target DNA and the signal probe at an isothermal temperature.
  • the ratio of the forward primer and the reverse primer of the DNA-RNA-DNA hybrid primer set used in the reaction mixture includes amplification of the single stranded nucleic acid asymmetrically using an excess in one side.
  • the present invention has an effect of providing a method for rapidly and accurately amplifying a target nucleic acid at isothermal temperature and a method for detecting a nucleic acid simultaneously performing amplification of a target nucleic acid and amplification of a signal probe at an isothermal temperature.
  • the target nucleic acid can be amplified quickly and accurately without the risk of contamination, and can be amplified at the same time. It is useful in the detection of genetic alterations, diagnosis of genetic diseases or diseases, diagnosis of gene expression, and various genome projects, which are useful for molecular biological research and disease diagnosis.
  • the asymmetric isothermal amplification method improves sensitivity and specificity compared to the conventional symmetric isothermal amplification method, thereby enabling a more accurate diagnosis.
  • Figure 1 schematically shows the isothermal amplification method of the target DNA according to the present invention.
  • Figure 2 schematically shows an isothermal amplification method of the target DNA and the signal probe according to the present invention.
  • Figure 3 schematically shows the difference between the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention.
  • Figure 4 shows the results of measuring the fluorescent signal (Delta Rn) generated by the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention targeting the Mycobacterium tuberculosis with real-time fluorescence detection equipment.
  • Figure 5 shows the results of measuring the fluorescence signal (Delta Rn) generated by the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention targeting Chlamydia by real-time fluorescence detection equipment.
  • Figure 6 shows the result of measuring the fluorescent signal (Delta Rn) generated by the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention with a target of the bacterium by real-time fluorescence detection equipment.
  • Figure 7 shows the results of measuring the fluorescent signal (Delta Rn) generated by the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention to the Listeria bacteria by real-time fluorescence detection equipment.
  • Figure 8 shows the results of measuring the fluorescence signal (Delta Rn) generated by the symmetric isothermal amplification method and the asymmetric isothermal amplification method according to the present invention targeting Salmonella with real-time fluorescence detection equipment.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a target DNA, (ii) an external primer set having a base sequence complementary to the target DNA, (iii) a 3 'terminal DNA portion complementary to the target DNA and a 5' terminal DNA- DNA-RNA-DNA hybrid primer set in which the RNA portion has non-complementary sequences, and (iv) DNA-RNA-DNA hybrid signal having a nucleotide sequence complementary to the amplification product produced by the hybrid primer set with the external primer set.
  • a kit comprising: (i) a target DNA, (ii) an external primer set having a base sequence complementary to the target DNA, (iii) a 3 'terminal DNA portion complementary to the target DNA and a 5' terminal DNA- DNA-RNA-DNA hybrid primer set in which the RNA portion has non-complementary sequences, and (iv) DNA-RNA-DNA hybrid signal having a nucleotide sequence complementary to the amplification product produced by the hybrid primer set with the external primer set.
  • the ratio of the forward primer and the reverse primer of the DNA-RNA-DNA hybrid primer set used in the reaction mixture includes amplification of the single stranded nucleic acid asymmetrically using an excess in one side.
  • isothermal amplification of the target DNA according to the present invention may be performed by the following procedure.
  • an enzyme reaction solution containing a DNA polymerase and an RNA degrading enzyme is mixed with a mixture of a target DNA, an external primer set, a DNA-RNA-DNA hybrid primer set, and a DNA-RNA-DNA hybrid probe to be a template for amplification. Then amplify.
  • the external primer set and the DNA-RNA-DNA hybrid primer set are annealed to the target DNA in the reaction solution.
  • the outer primer set includes a sequence complementary to a sequence closer to both ends of the target DNA than the hybrid primer set
  • the hybrid primer set includes a sequence closer to the center of the target DNA than the outer primer.
  • the hybrid primers are annealed ahead of the DNA chain extension direction than the outer primers.
  • the annealed external primers and hybrid primers are stretched by a DNA polymerase capable of chain substitution, and as the external primers are stretched along the target DNA, the stretched DNA chain is separated from the target DNA in the hybrid primer located in the forward direction of the extension direction. Chain substitution occurs as a result, and finally, a single-stranded DNA amplification product elongated in the hybrid primer and a double-stranded DNA amplification product elongated in the outer primer are obtained.
  • External primers and hybrid primers are annealed using the single-stranded DNA which is the amplification product as a template.
  • the annealed external primers and hybrid primers are stretched by DNA polymerase capable of chain substitution, and the DNA chains stretched from the hybrid primers located in the front of the stretch direction as the external primers are stretched along the single-stranded DNA are single-stranded DNA. Chain substitutions occur at and off, resulting in new single-stranded DNA amplification products stretched in hybrid primers and double-stranded DNA amplification products stretched in outer primers.
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers are annealed and stretched using the amplified single-stranded DNA as a template to obtain a double-stranded DNA amplification product including RNA.
  • RNA portion of double-stranded DNA is degraded by RNase H, and single-stranded DNA is produced by elongation and chain substitution.
  • the target DNA is amplified by repeating the process of annealing, stretching, chain substitution, and RNA cleavage of the primer using the single-stranded DNA as a template (FIG. 1).
  • the amplification of the signal probe according to an embodiment of the present invention is performed simultaneously with the nucleic acid isothermal amplification.
  • the DNA amplified through the isothermal amplification of the target DNA is annealed with the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe to form an RNA / DNA hybrid double helix, the RNA portion of the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe is activated by RNase H activity.
  • the cleaved and cleaved signal probe is separated from the target DNA, the new DNA-RNA-DNA hybrid signal probe is coupled, and the cycle of cleavage and cleavage by RNase H is repeated, thereby amplifying the signal probe.
  • the excess primer generates an amplification product in one direction and is amplified in excess.
  • the asymmetric isothermal amplification method increases the amplification of the signal probe as compared to the symmetric isothermal amplification method.
  • the length of the amplified product amplified by the primer is longer than the length of the probe, so in the symmetrical amplification method, the coupling between the amplification products is more likely than the coupling between the amplification product and the probe.
  • the asymmetric isothermal amplification method is improved in sensitivity compared to the conventional symmetric isothermal amplification method.
  • the asymmetric isothermal amplification method shows an improvement in specificity compared to the conventional symmetric isothermal amplification method.
  • the external primer set used in the present invention may use any one selected from the group consisting of oligo DNA, oligo RNA, and hybrid oligo RNA / DNA, and is complementary to the target nucleic acid sequence and has 15 to 30 bases. It is preferable.
  • the target DNA sequence complementary to the external primer is preferably a sequence adjacent to the target DNA sequence complementary to the hybrid primer (1 to 60bp difference), and the target DNA sequence complementary to the outer primer is a DNA sequence complementary to the hybrid primer. It is more preferred that the sequence is closer to the 3 'end of the target DNA sequence.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid primer set used in the present invention has a 5 'terminal DNA-RNA portion having a non-complementary base sequence with the target DNA sequence, and a 3' terminal DNA portion has a base sequence complementary to the target DNA. It features.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid primer is preferably composed of 32 to 66 bases, wherein the length of the DNA portion is each 15 to 30 bases, and the RNA portion is preferably 1 to 6 bases in length.
  • the sequence of the target DNA complementary to the DNA-RNA-DNA hybrid primer includes a sequence located 3 'to the end of the sequence of the target DNA complementary to the external primer, the target DNA sequence complementary to the hybrid primer Is preferably a sequence adjacent to the target DNA sequence complementary to the external primer (1 to 60bp difference).
  • the DNA polymerase used in the present invention is an enzyme capable of expanding a nucleic acid primer along a DNA template, and should be able to replace the nucleic acid strand from the polynucleotide to which the substituted strand is bound.
  • DNA polymerase that can be used in the present invention is preferably a heat-resistant DNA polymerase, heat-resistant DNA polymerase Bst DNA polymerase, exo (-) vent DNA polymerase, exo (-) Deep vent DNA polymerase, exo (-) Pfu DNA polymerase, Bca DNA polymerase, pi 29 DNA polymerase, etc. can be illustrated.
  • RNA degrading enzyme used in the present invention is specific for cleaving the RNA strand of the RNA / DNA hybrid, preferably does not degrade single-stranded RNA, and preferably RNase H is used.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe used in the present invention is an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid amplification product amplified by a primer used in excess of a forward or reverse primer in the DNA-RNA-DNA hybrid primer set.
  • the 5 'end and 3' end of the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe are composed of oligo DNA, and the middle part is composed of oligo RNA.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe is preferably composed of 18 to 38 bases, the DNA portion at the 5 'end and the third end is preferably composed of 8 to 16 bases, respectively, the middle RNA portion is 1 It is preferably composed of ⁇ 6 bases.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe may be characterized in that the terminal is labeled with a labeling substance, and the labeling substance may be a fluorescent substance, a fluorescent signal inhibitor, or the like.
  • Concentration ratio of the forward primer and the reverse primer in the hybrid primer set used in the present invention may be used from 1: 5 to 1:20 or 5: 1 to 20: 1, more preferably 1:10 or 10: 1. Can be.
  • the hybrid primer used in excess has a base sequence complementary to the hybrid probe.
  • the isothermal amplification is preferably performed at a temperature at which the primer of the present invention and the template DNA can be annealed and do not substantially inhibit the activity of the enzyme used.
  • the temperature at which the amplification reaction is performed is preferably 30 to 75 ° C, more preferably 37 to 70 ° C, and most preferably 50 to 65 ° C.
  • the method for isothermal amplification of nucleic acids according to the present invention uses additional external primers, the specificity thereof is higher than that of the conventional method using a single RNA-DNA hybrid primer (US Pat. No. 6,251,639), and is substituted by an external primer. It is possible to dramatically improve the amplification efficiency by the internal primer prepared as a new template to amplify exponentially.
  • RNA-DNA hybrid primer to use a separate blocker or template switch oligonucleotide (TSO) that blocks amplification to amplify a specific site when amplifying a target sequence
  • TSO template switch oligonucleotide
  • the present invention has the advantage of using a forward primer and a reverse primer pair to cleanly amplify only the desired site without using a separate blocker or template switch oligonucleotide.
  • the amplified DNA can be amplified by repeating the cycle of DNA-RNA-DNA hybrid signal probe binding and separation, so that the nucleic acid amplification and signal probe amplification can be performed simultaneously in a single-tube.
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers US Pat. No. 5,824,517
  • DNA-RNA-DNA hybrid signal probes which can simultaneously perform nucleic acid amplification and signal probe amplification.
  • US Patent Application 2005/0214809 there is an advantage of simultaneously amplifying a nucleic acid and a signal probe.
  • the isothermal amplification method of a nucleic acid according to the present invention is asymmetrically amplified in excess of asymmetric isothermal nucleic acid and signal probe amplification methods using the same amount of forward primers and reverse primers in an asymmetric excessive amount, which varies the ratio of the forward primers and the reverse primers.
  • a signal probe having a complementary sequence can be annealed, thereby effectively amplifying the signal probe, thereby improving the sensitivity and specificity of nucleic acid detection.
  • the present invention also provides a 5 'terminal DNA-RNA portion of the DNA-RNA-DNA hybrid primer to be used has a non-complementary sequence with the template, so that the RNA degradation enzyme in the conventional method using a single RNA-DNA hybrid primer There is an advantage that it is not necessary to consider the problem that occurs when the reaction activity is higher than the primer extension activity of the DNA polymerase.
  • the template and the non-complementary RNA site act as a complementary template to the primer.
  • Increasing the annealing temperature with the primer not only increases the amplification efficiency, but also prevents the formation of primer-dimer, thereby increasing the purity of the amplification product.
  • the isothermal amplification method of nucleic acid of the present invention takes about 1 hour from DNA extraction to complete amplification of the sample, and if the extraction of the sample DNA takes about 40 minutes, the amplification reaction can be performed very quickly. There is this.
  • the present invention provides a kit comprising: (i) a target DNA, (ii) an external primer set having a nucleotide sequence complementary to the target DNA, (iii) the target DNA and a 3 'terminal DNA portion are complementary and 5' terminal DNA- DNA-RNA-DNA hybrid primer set in which the RNA portion has non-complementary sequences, and (iv) DNA-RNA-DNA hybrid signal having a nucleotide sequence complementary to the amplification product produced by the hybrid primer set with the external primer set.
  • Adding isoenzyme reaction mixture containing chain polymerizable DNA polymerase and RNA degrading enzyme to a reaction mixture including a probe, and then amplifying the target DNA and the signal probe at an isothermal temperature simultaneously.
  • the ratio of the forward primer and the reverse primer in the hybrid primer set used in the reaction mixture includes amplification of the single stranded nucleic acid asymmetrically using an excess of one.
  • the signal probe amplified by the method of the present invention can detect a fluorescent signal directly in the reaction tube without a separate post-processing process using a fluorescence detector.
  • the DNA-RNA-DNA hybrid probe is labeled with a fluorescent material and a fluorescent signal suppressor at the ends thereof, and before the probe is cleaved, the fluorescent energy is transferred to the fluorescent signal inhibitor and the emission of the fluorescent signal is suppressed. It is a signal probe in the form of fluorescence resonance energy transfer (FRET) that does not occur after the probe is cut.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the isothermal amplification method and nucleic acid detection method of a nucleic acid according to the present invention is a one-step nucleic acid and signal probe isothermal amplification that performs a reaction at a constant temperature.
  • the target nucleic acid can be easily amplified, and by using two pairs of primer sets and probes in the amplification process, there is an advantage that it can amplify not only the target nucleic acid accurately but also the signal probe as compared to the conventional method.
  • Asymmetric nucleic acid and signal probe methods that vary the ratio of forward hybrid primers and reverse hybrid primers in the process, which enhances annealing opportunities of amplified DNA templates and signal probes, resulting in improved sensitivity and specificity. .
  • the isothermal amplification method and the nucleic acid detection method of the nucleic acid according to the present invention is made in one isothermal one-tube (one-tube), has the advantage that a large amount of processing for the real-time detection of the nucleic acid is possible. This advantage can minimize the risk of additional reactions due to contamination, which has limited the widespread use of amplifier technology.
  • the outer primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) were designed to include sequences complementary to the Mycobacterium tuberculosis IS6110 nucleotide sequence, and SEQ ID NO: 1 (forward, sense) and SEQ ID NO: 2 (reverse, anti-sense) are as follows. .
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) have a 5 'terminal oligo DNA-RNA portion having a non-complementary sequence to the Mycobacterium tuberculosis IS6110 sequence, and the 3' terminal oligo DNA portion is a Mycobacterium tuberculosis IS6110 base Designed to have a sequence complementary to the sequence, SEQ ID NO: 3 (forward, sense) and SEQ ID NO: 4 (reverse, anti-sense) are as follows (uploaded and the RNA portion is underlined).
  • the DNA-RNA-DNA hybrid signal probe (SEQ ID NO: 5) for performing signal probe amplification has a nucleotide sequence complementary to the DNA amplified by the primer set above, and the 5 'end is FAM dye and the 3' end is Labeled with DABCYL quencher, SEQ ID NO: 5 (anti-sense) is as follows (uploaded and RNA portions are underlined).
  • reaction mixture In order to amplify a target nucleic acid using the external primer set and the hybrid primer set, first, a reaction mixture and an enzyme mixture containing the external primer set and the hybrid primer set were prepared.
  • the reaction mixture is 10 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM MgSO 4 , 50 mM KCl, 1.6 mM dNTP (Fermentas), 1.6 mM DTT, 0.1 ⁇ g BSA, 0.6 mM spermine, 100 mM prepared by adding trehalose, 0.11 ⁇ M external primer set (IDT), 1.1 ⁇ M hybrid primer set (IDT) (2.2 ⁇ M forward hybrid primer (sense) and 0.22 ⁇ M reverse hybrid primer (anti-sense) for asymmetric isothermal amplification) It was.
  • the enzyme mixture was prepared by adding 1 unit Bst polymerase (NEB), 6 units RNase H (Epicentre), 6 units
  • the asymmetric isothermal amplification method showed better detection capability than the symmetric isothermal amplification method.
  • Chlamydia trachomatis genomic DNA was used as the target DNA.
  • genomic DNA was extracted from Chlamydia strain (ATCC Cat. No. VR-887) using G-spin TM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121) and then amplified. Was carried out. Genomic DNA extraction was performed by centrifuging the microbial suspension at 13,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, gently mixing with 500 ⁇ l PBS (pH 7.2), centrifuging to remove the supernatant, and then adding RNase A and Proteinase K.
  • the cell pellet was suspended by adding 300 ⁇ l of a -buffer solution and allowed to stand at 65 ° C. for 15 minutes. Next, 250 ⁇ l of Binding Buffer was added and mixed well, and DNA was bound to the spin column. 500 ml of washing buffer A was added and then removed by centrifugation at 13000 rpm for 1 minute, 500 ml of washing buffer B was added and centrifuged. The column was transferred to a 1.5ml microcentrifuge tube, 50 ⁇ l of eleution buffer was added, and centrifuged for 1 minute to obtain 15.8ng / ml genomic DNA. This was diluted to a certain amount and used as a template for the isothermal amplification reaction.
  • the external primers (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7) are designed to include sequences complementary to the Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA sequence, and SEQ ID NO: 6 (forward, sense) and SEQ ID NO: 7 (reverse, anti-sense) Same as
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers (SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9) have 5 'terminal oligo DNA-RNA moieties that are non-complementary to Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA, and 3' terminal oligo DNA moieties are Chlamydia trachomatis cryptic plasmid Designed to have a sequence complementary to the DNA base sequence, SEQ ID NO: 8 (forward, sense) and SEQ ID NO: 9 (reverse anti-sense) are as follows (uploaded and RNA parts are underlined).
  • DNA-RNA-DNA hybrid signal probe (SEQ ID NO: 5) for performing signal probe amplification has a base sequence complementary to DNA amplified by the above primer set, 5 'end is FAM dye, and 3' end is Labeled with BHQ1 quencher, SEQ ID NO: 10 (sense) is as follows (uploaded and the RNA portion is underlined).
  • SEQ ID NO: 10 5'-FAM-GGTAAAGCTC UGAUAU TTGAAGACTCT-BHQ1-3 '
  • reaction mixture was 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 20 mM MgSO 4 , 10 mM KCl, 1 mM dNTP (Fermentas), 1 mM DTT, 0.1 ⁇ g BSA, 0.15 mM spermine, 20 mM trehalose, in a 5 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer.
  • the enzyme mixture was prepared by adding 3 units Bst polymerase (NEB), 8 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), and 50 nM hybrid signal probe (IDT).
  • the asymmetric isothermal amplification method showed better detection capability than the symmetric isothermal amplification method.
  • Neisseria gonorrhoease genomic DNA was used as target DNA.
  • genomic DNA was extracted from Gonococcus strain (ATCC Cat. No. 49226) using G-spin TM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121) and then amplified. .
  • Genomic DNA extraction was performed by centrifuging the microbial suspension at 13,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, gently mixing with 500 ⁇ l PBS (pH 7.2), centrifuging to remove the supernatant, and then adding RNase A and Proteinase K.
  • the cell pellet was suspended by adding 300 ⁇ l of a -buffer solution and allowed to stand at 65 ° C.
  • Binding Buffer 250 ⁇ l was added and mixed well, and DNA was bound to the spin column. After 500 ⁇ l of washing buffer A was added, it was removed by centrifugation at 13000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ l of washing buffer B was added and centrifuged. The column was transferred to a 1.5ml microcentrifuge tube, 50 ⁇ l of eleution buffer was added, and centrifuged for 1 minute to obtain 4.7ng / ml genomic DNA. This was diluted to a certain amount and used as a template for the isothermal amplification reaction.
  • the external primers are designed to include sequences complementary to the Neisseria gonorrhoease opa gene DNA sequence, SEQ ID NO: 11 (forward, sense) and SEQ ID NO: 12 (reverse, anti-sense) Same as
  • the DNA-RNA-DNA hybrid primers (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14) are designed to contain sequences that are non-complementary to the 5 'terminal oligo DNA-RNA portion of the Neisseria gonorrhoease opa gene DNA sequence, and the 3' terminal oligo DNA portion.
  • Neisseria gonorrhoease opa gene was designed to include a sequence complementary to the DNA sequence, SEQ ID NO: 13 (forward, sense) and SEQ ID NO: 14 (reverse anti-sense) are as follows. (Uploaded and RNA parts are underlined)
  • DNA-RNA-DNA hybrid signal probe (SEQ ID NO: 15) for performing signal probe amplification has a base sequence complementary to DNA amplified by the above primer set, 5 'end is FAM dye, and 3' end is Labeled with DABCYL quencher, SEQ ID NO: 15 (anti-sense) is as follows (uploaded and the RNA portion is underlined).
  • reaction mixture In order to amplify a target nucleic acid using the external primer set and the hybrid primer set, first, a reaction mixture and an enzyme mixture containing the external primer set and the hybrid primer set were prepared.
  • the reaction mixture was 10 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM MgSO 4 , 10 mM KCl, 1.6 mM dNTP (Fermentas), 5 mM DTT, 0.1 ⁇ g BSA, 0.4 mM spermine, 20 mM trehalose , 0.1 ⁇ M external primer set (IDT), 1 ⁇ M hybrid primer set (IDT) (4.4 ⁇ M forward hybrid primer (sense) and 0.44 ⁇ M reverse hybrid primer (anti-sense) for asymmetric isothermal amplification) were added.
  • the enzyme mixture was prepared by adding 5 units Bst polymerase (NEB), 5 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (
  • the asymmetric isothermal amplification method showed better detection capability than the symmetric isothermal amplification method.
  • genomic DNA was extracted from Listeria strain (ATCC Cat. No. 35152) using G-spin TM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121) and then amplified. It was. Genomic DNA extraction was performed by centrifuging the microbial suspension at 13,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, gently mixing with 500 ⁇ l PBS (pH 7.2), centrifuging to remove the supernatant, and then adding RNase A and Proteinase K. The cell pellet was suspended by adding 300 ⁇ l of a -buffer solution and allowed to stand at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Binding Buffer 250ml was added and mixed well, and DNA was bound to the spin column. After 500 ⁇ l of washing buffer A was added, it was removed by centrifugation at 13000 rpm for 1 minute, and 500 ⁇ l of washing buffer B was added and centrifuged. The column was transferred to a 1.5ml microcentrifuge tube, 50 ⁇ l of eleution buffer was added, and centrifuged for 1 minute to obtain 8.4ng / ml genomic DNA. This was diluted to a certain amount and used as a template for the isothermal amplification reaction.
  • the external primers are designed to include sequences complementary to the Listeria monocytogene actA gene DNA sequence, SEQ ID NO: 16 (forward, sense) and SEQ ID NO: 17 (reverse, anti-sense) Same as
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers (SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19) are designed to contain sequences that are 5 'terminal oligo DNA-RNA portions that are non-complementary to the Listeria monocytogene actA gene DNA sequence, and the 3' terminal oligo DNA portion was designed to include a sequence complementary to the Listeria monocytogene actA gene DNA sequence, SEQ ID NO: 18 (forward, sense) and SEQ ID NO: 19 (reverse anti-sense) are as follows. (Uploaded and RNA parts are underlined)
  • DNA-RNA-DNA hybrid signal probe for performing signal probe amplification has a base sequence complementary to DNA amplified by the above primer set, 5 'end is FAM dye, and 3' end is Labeled with black hole quencher 1 (BHQ1), SEQ ID NO: 20 (anti-sense) is as follows (uploaded and the RNA portion is underlined).
  • reaction mixture In order to amplify a target nucleic acid using the external primer set and the hybrid primer set, first, a reaction mixture and an enzyme mixture containing the external primer set and the hybrid primer set were prepared.
  • the reaction mixture was 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) buffer, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 12 mM MgSO 4 , 10 mM KCl, 1.8 mM dNTP (Fermentas), 6 mM DTT, 0.1 ⁇ g BSA, 0.8 mM spermine, 0.1 ⁇ M Outer primer set (IDT), 1 ⁇ M hybrid primer set (IDT) (0.01 ⁇ M forward external primer (sense) for asymmetric isothermal amplification, 0.1 ⁇ M forward hybrid primer (sense) and 0.1 ⁇ M reverse external primer (anti-sense), Prepared by addition of 1 ⁇ M reverse hybrid primer (anti-sense).
  • the enzyme mixture was prepared by adding 3 units Bst poly
  • strains for measuring specificity are Staphylcoccus aureus: Korean collection type culture (KCTC) 1927, Salmonella enterica (KCTC 1925), enteritis Vibrio (Vibrio parahaemolyticus; ATCC 17802), and Bacillus cereus; ATCC 49953) Shigella flexneri (KCTC 2517) and E.
  • the asymmetric isothermal amplification method showed that the specificity is superior to the symmetric isothermal amplification method.
  • Salmonella enterica genomic DNA was used as the target DNA.
  • genomic DNA was extracted from Salmonella strain (KCTC 1925) using G-spin TM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121) and subjected to amplification reaction.
  • Genomic DNA extraction was performed by centrifuging the microbial suspension at 13,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, gently mixing with 500 ⁇ l PBS (pH 7.2), centrifuging to remove the supernatant, and then adding RNase A and Proteinase K.
  • the cell pellet was suspended by adding 300 ⁇ l of a -buffer solution and allowed to stand at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Binding Buffer 250 ⁇ l was added and mixed well, and DNA was bound to the spin column. After adding 500 ml of washing buffer A, the mixture was removed by centrifugation at 13000 rpm for 1 minute, 500 ⁇ l of washing buffer B was added thereto, and centrifuged. The column was transferred to a 1.5ml microcentrifuge tube, 50 ⁇ l of eleution buffer was added, and centrifuged for 1 minute to obtain 6.7ng / ml genomic DNA. This was diluted to a certain amount and used as a template for the isothermal amplification reaction.
  • the external primers (SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17) were designed to include sequences complementary to the Salmonella enterica invA gene DNA sequence, SEQ ID NO: 21 (forward, sense) and SEQ ID NO: 22 (reverse, anti-sense) Same as
  • DNA-RNA-DNA hybrid primers (SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24) are designed to include sequences that are 5 'terminal oligo DNA-RNA portions that are non-complementary to the Salmonella enterica invA gene DNA sequence, and that the 3' terminal oligo DNA portion is Was designed to include a sequence complementary to the Salmonella enterica invA gene DNA sequence, SEQ ID NO: 23 (forward, sense) and SEQ ID NO: 24 (reverse anti-sense) are as follows. (Uploaded and RNA parts are underlined)
  • DNA-RNA-DNA hybrid signal probe for performing signal probe amplification has a base sequence complementary to DNA amplified by the above primer set, 5 'end is FAM dye, and 3' end is Labeled with black hole quencher 1 (BHQ1), SEQ ID NO: 25 (anti-sense) is as follows (uploaded and the RNA portion is underlined).
  • reaction mixture In order to amplify a target nucleic acid using the external primer set and the hybrid primer set, first, a reaction mixture and an enzyme mixture containing the external primer set and the hybrid primer set were prepared.
  • the reaction mixture is 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) buffer, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 12 mM MgSO 4 , 10 mM KCl, 1.8 mM dNTP (Fermentas), 6 mM DTT, 0.1 ⁇ g BSA, 0.75 mM spermine, 0.075 ⁇ M Outer primer set (IDT), hybrid primer set (IDT) of 1.125 ⁇ M (0.075 ⁇ M forward outer primer (sense) for asymmetric isothermal amplification, 2.25 ⁇ M forward hybrid primer (sense) and 0.075 ⁇ M reverse outer primer (anti-sense) , 0.225 ⁇ M reverse hybrid primer (anti-sense) was added.
  • the enzyme mixture was prepared by adding 3
  • strains for measuring specificity are Staphylcoccus aureus: Korean collection type culture (KCTC) 1927, Listeria monocytogene (ATCC 5152), Enteritis Vibrio (Vibrio parahaemolyticus; ATCC 17802), Bacillus (Bacillus) cereus; ATCC 49953) Shigella flexneri (KCTC 2517) and E.
  • KCTC Korean collection type culture
  • the asymmetric isothermal amplification method showed that the specificity is superior to the symmetric isothermal amplification method.

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Abstract

본 발명은 외부 프라이머 세트, 정방향 (forward)과 역방향 (reverse) DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머의 비율을 달리하는 내부 프라이머 세트, DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 사용하여 등온에서 비대칭적으로 표적핵산을 증폭하고 동시에 프로브의 신호를 증폭하여 표적핵산을 정확하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 종래 방법인 프라이머의 비율을 동일하게 하는 등온 프라이머 및 프로브 증폭방법인 대칭 iTPA 방법 등에 비하여 효율적으로 프로브의 신호를 증폭할 수 있어, 정확한 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환에 대한 감수성 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다.

Description

핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
본 발명은 핵산과 신호 프로브의 등온 증폭방법 및 증폭된 신호 프로브를 이용한 핵산의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 외부 프라이머 세트, DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 이용하여 표적핵산과 신호 프로브를 동시에 증폭하고, 표적핵산을 신속하게 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 더 상세하게는 정방향 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머와 역방향 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머의 비율을 달리하여 비대칭적으로 핵산을 증폭하고 동시에 비대칭적으로 증폭된 DNA 가운데 프라이머가 과량으로 사용되어 비대칭적으로 과량으로 증폭된 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 이용하여 신호를 증폭하여 등온에서 핵산을 검출방법에 관한 것이다.
핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출하고, 분석하는 데 있어서, 매우 유용한 기술이다. 표적핵산에 대한 핵산 증폭기술의 높은 민감성은 감염성 질환 및 유전성 질환의 진단과 분석을 위한 유전자의 분리 기술 및 법의학적 측면에서 특정 핵산의 검출하는 기술에 발전을 가져왔으며, 이러한 핵산 검출 방법을 기초로 매우 민감한 진단 분석을 수행할 수 있는 방법들이 개발되어 왔다 (Belkum, Current Opinion in Pharmacology, 3:497, 2003). 핵산의 검출은 DNA 가닥의 상보성과 in vitro에서 단일 가닥 핵산이 이중 가닥의 하이브리드 분자를 형성하는 능력에 기인한 것으로, 상기 능력에 의하여, 시료에서 특정 핵산을 검출할 수 있다 (Barry et al., Current Opinion in Biotechnology, 12:21, 2001).
핵산 검출에 사용되는 프로브는 핵산 시료에 존재하는 표적서열과 혼성화될 수 있는 특정서열로 구성된다. 상기 프로브는 화학물질, 면역-화학물질, 형광 또는 방사선 동위원소에 의해 판독된다. 대체적으로, 프로브는 표적핵산에 대한 상보적 서열을 가지는 짧은 단편의 핵산과 DNA 하이브리다이제이션을 판독할 수 있는 형광물질이나, 비오틴 및 딕옥시제닌과 같은 표지 또는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.
그러나, 상기와 같은 핵산 검출방법에 의해서는 특히, 염색체 DNA 상의 짧은 서열을 검출할 수 없으며, 카피 수가 낮고, 야생형 유전자에 대한 변형된 대립유전자의 제한된 카피수를 해결하는데 한계가 있었다. 핵산 검출방법의 다른 문제점으로는 표적서열, 화학물질, 또는 프로브와 다른 분자 또는 구조와의 물리적 상호작용을 제한하는 in vitro 또는 in situ의 환경조건과 관련이 있다.
표적핵산을 검출하기 위한 방법은 세 가지 카테고리로 그룹지을 수 있으며, 표적핵산을 증폭시키는 방법인 목표 핵산 서열의 증폭, 프로브 분자 자체를 증폭시키는 프로브 증폭, 각 프로브가 나타내는 신호를 복합 프로브 또는 연결 프로브 기술에 의해 증가시키는 신호 증폭이 있다.
In vitro 핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출 및 분석하는데 강력한 방법으로 사용되어 왔다. 그 중에서도 PCR(polymerase chain reaction)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 핵산의 증폭방법으로, 상보적 서열의 각 나선(strand)을 주형으로 사용하여, 프라이머에 의하여 핵산의 합성이 반복적으로 진행됨으로써, 상보적 서열의 각 나선의 복제본이 합성되는 것이다. PCR 과정을 수행하기 위해서는 미리 프로그램된 열 순환 장비(thermal cycling instrument)가 필요하다. 그러나 이 방법은 비용이 많이 들고, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 결과를 재현하기 위해서는 수행단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다.
또 다른 핵산증폭방법인 LCR(ligase chain reaction)은 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드가 표적핵산과 혼성화되고, 리가아제(ligase)에 의해 라이게이션된다. 이를 통하여 형성된 프로브(probe)는 상보적인 뉴클레오티드와 함께 온도-사이클링(temperature cycling)에 의해 증폭된다.
LCR은 프라이머를 이용한 핵산의 신장(primer extension)보다 높은 식별력(discriminatory power)을 가지고 있기 때문에, 유전자의 점돌연변이(genotyping point mutation)에 있어서는 PCR 보다 높은 대립유전자 특이성(allele specificity)을 나타낸다. LCR은 지금까지 개발된 핵산 증폭 기술 중에서 가장 높은 특이성을 가지며, 모든 식별 기작이 최적화되어 있기 때문에 가장 손쉽게 수행할 수 있는 방법이지만, 반응속도가 가장 느리고, 많은 수의 변형 프로브를 필요로 하는 단점이 있다.
LCR과 같이 라이게이션을 이용하는 방법은 LCR 또는 RCA(rolling circle amplication) 과정에서 수반되는 DNA 접합에 의해 첫 번째로 원형화되는 패드록 프로브(padlock probe)를 이용하여 RCA방법으로 증폭시킴으로써, 표적 증폭 PCR을 수행하지 않고도 유전자형을 분석(genotyping)할 수 있다 (Qi et al., Nucleic Acids Research, 29:e116, 2001).
SDA(strand displacement amplification)는 엔도뉴클레아제를 통해 나선을 치환(strand displacement)시킴으로써, 샘플 내의 표적핵산 서열 및 이의 상보적 나선을 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 핵산 중합효소(nucleic acid polymerase), 적어도 하나의 치환된 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)를 포함하는 dNTPs 및 표적 단편(target fragment)의 3' 말단에 대해 상보적인 프라이머를 적어도 하나 이상 함유하는 혼합물을 사용한다. 각 프라이머는 5' 말단에 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)가 인지할 수 있는 서열을 가지고 있다 (Walker et al., Nucleic Acids Res., 20:1691, 1992).
SDA 방법과 유사한 방법으로 RNA-DNA 혼성 프라이머 또는 RNA 프라이머를 사용하여 프라이머를 신장시킨 다음, 주형 DNA와 혼성화를 이루고 있는 RNA 프라이머를 절단하는 RNaseH 효소를 사용하여 프라이머와 주형 DNA를 절단한 후, 사슬치환에 의해 새로운 프라이머를 신장시키는 방법, 5'-RNA-DNA-3' 프라이머를 사용하는 SPIA(single primer isothermal amplification) 방법 (미국특허 6,251,639), 5'-DNA-RNA-3' 프라이머를 사용하는 ICAN(isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid) 방법 (미국 특허출원 2005/0123950), RNA 프라이머를 사용하는 Riboprimer 방법 (미국 특허출원 2004/0180361), 외부 프라이머와 내부 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머를 이용하는 방법 (미국 특허 5,824,517) 등이 있다.
TMA(transcription mediated amplification) 방법은 일정한 온도, 일정한 이온 세기(ionic strength) 및 일정한 pH에서 하나의 프로모터-프라이머만을 사용하여 표적핵산을 증폭하는 방법이다 (Kwoh et al., Proc. Nat. Aca. Sci. USA, 86:1173, 1989). TMA 방법은 실질적으로 표적핵산으로 구성된 혼합물과 표적핵산의 3' 말단부위 또는 그와 인접한 부위와 혼성화시키기 위한 표적서열의 3' 말단부위와 상보적인 올리고뉴클레오티드인 프로모터-프라이머(promoter-primer)를 결합시키는 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터-프라이머는 컴플렉싱 서열(complexing sequence)의 5' 말단부위에 위치한 RNA 중합효소에 대한 프로모터부위 서열도 포함한다. 상기 프로모터-프라이머 및 표적서열은 프로모터-프라이머/표적서열 하이브리드를 형성하여 DNA가 신장되게 된다.
상기 TMA 방법의 DNA 신장(extension) 과정에서, 표적서열의 3' 말단은 컴플렉싱 서열과 표적서열 사이에서 프로모터 프라이머가 혼성화된 복합체(complex)에 근접한 위치로부터 신장하는 것으로 추측된다. 프로모터 서열은, 첫 번째 DNA 신장생성물을 생성하여 이중나선 프로모터 서열을 형성하는 상기 신장과정에 대한 주형으로 작용하게 된다. 프로모터-프라이머의 3' 말단은 두 번째 DNA 신장과정에 대한 프라이머로도 사용될 수 있다. 상기 신장과정에서는 주형으로 표적서열을 사용하여 이중나선 핵산 복합체가 형성된다. 상기 복합체는 RNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/RNA 복합체이고, DNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/DNA 복합체가 된다. 그 다음, 표적서열의 다양한 RNA 복제본을 생산하기 위하여 프로모터-프라이머의 프로모터를 인지하는 RNA 중합효소가 상기 첫 번째 DNA 신장생성물을 사용하여 RNA를 합성한다.
NASBA(nucleic acid sequence-based amplification) 방법에는 단일나선 RNA의 합성, 단일나선 DNA의 합성 및 이중나선 DNA의 합성이 포함한다 (Compton, Nature, 350:91, 1991). 상기 단일나선 RNA는 첫 번째 프라이머에 대한 첫 번째 주형이 되고, 상기 단일나선 DNA는 두 번째 프라이머에 대한 두 번째 주형이 되며, 상기 이중나선 DNA는 상기 첫 번째 주형에 대한 복제본을 합성하는데 있어 세 번째 주형이 된다.
PCR 등의 열순환 과정을 사용하는 증폭방법은 각 사이클의 "표적" 온도에 도달하기 위해 열순환 블록을 필요로 하고, 열블럭이 표적온도에 도달하기 까지 지연 시간이 필요하므로 증폭반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하다는 단점이 있다.
SDA, NASBA 및 TMA 등의 등온 표적핵산 증폭방법은 일정한 온도에서 핵산 증폭이 이루어지기 때문에 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 쉬운 장점이 있다. 그러나 지금까지 개시된 등온 표적핵산 증폭방법은 몇 가지 단점을 가지고 있다. SDA 방법에 따른 핵산증폭은 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되고, NASBA 및 TMA와 같은 전사-기초 증폭방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 이러한 단점때문에, 이들 전사-기초 증폭 방법에 의한 DNA 표적의 증폭 메카니즘은 잘 수립되어 있지 않다.
또한, 현재 사용되고 있는 증폭방법은 또 다른 단점으로는 선행 증폭반응의 증폭 생성물에 의해 시험 샘플이 오염될 가능성이 있고, 이에 의해 샘플의 비-표적 특이적 증폭을 가져오는 단점이 있다. 이를 방지하기 위하여, 증폭 반응의 마지막에, 또는 표적핵산의 증폭 개시 전에 시험 샘플을 탈오염하는 다양한 수단과 물리적 수단을 채용하는 시험 용액의 오염 검출 방법이 개발되고 있으나, 이들은 대부분 핵산 증폭 조작을 복잡하게 만든다.
핵산검출을 위한 또 다른 방법으로는 목적핵산이나 프로브를 증폭시키는 것이 아니라 신호를 증폭시키는 방법이 있다. 이들 방법 중에는 표적핵산을 캡처하기 위하여 네 가지 세트의 프로브를 사용하는 bDNA(branched DNA) 증폭법이 있다 (Ross et al., J. Virol. Method., 101:159, 2002). 신호 증폭을 이용한 하이브리드 캡처 방법은 표적핵산을 직접적으로 검출하고 표적핵산을 증폭하는 방법과 비교할만한 민감성을 가지고 있으며, 신호 검출을 위하여 항체나 화학발광물질을 사용한다. (van der Pol et al., J. ClinicalMicrobiol., 40:3564, 2002; Nelson et al., Nucleic Acids Research, 24:4998, 1996)
또한, 신호 프로브를 증폭하는 방법으로 CPT(cycling probe technology) 증폭방법이 있다 (Duck et al., BioTechniques, 9:142, 1990). 상기 방법은 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 사용하며 표적핵산과 상기 프로브가 혼성화될 경우 혼성 신호 프로브의 RNA 부분이 RNaseH 효소에 의해 절단되고 절단된 혼성 신호 프로브는 표적핵산과 분리되고 또 다른 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브가 표적핵산과 혼성화되어 다시 절단된 프로브가 생성되어 결과적으로 순환적으로 신호 프로브를 증폭하는 방법이다. DNA-RNA-DNA 양 말단에 형광물질과 형광억제물질 (quencher) 표지하여 절단된 신호 프로브를 검출하는 형광공명에너지전이현상 (FRET; fluorescent resonance energy transfer)을 이용한 프로브 검출방법 (미국 특허출원 2005/0214809) 등이 있다. 그러나 상기 CPT 방법은 증폭효율이 102~104으로 비교적 낮아 독립적으로 진단에 사용하기는 어렵고 PCR 방법 등 종래의 핵산증폭에 의해 일차적으로 표적핵산의 특정 부위의 양을 증가시킨 후 별도로 신호 프로브를 증폭하게 되어 사용이 복잡하고, 고비용이 소요되는 단점이 있다.
비대칭(asymmetric) PCR 방법은 이중나선 DNA template에서 단일 DNA만 선택적으로 증폭하는 PCR의 파생기술로 염기서열 sequencing을 위한 단일가닥 DNA 주형(template) 합성에 유용하게 사용되었다. (Innis et al. Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 85:9436, 1988, 미국 특허 5,066,584) 또한 비대칭 PCR 방법은 molecular beacon probe를 사용하여 대칭 PCR 방법과 비교하여 아데노바이러스를 검출하는데 훨씬 효과적임을 보여주었다. (Poddar Mol. Cell. Probes 14:25, 2000) 또한 비대칭 PCR 방법은 factor V 유전자의 단일염기변이 (Single nucleotide polymorphism)을 위한 형광공명에너지 전이 (FRET) 형태의 hybridization 프로브의 template 합성에 사용되었다. (Szilvasi et al. Clin. Chem. 38:727, 2005) 정방향 (forward) 프라이머와 역방향 (reverse) 프라이머를 같은 양을 사용하는 일반적인 대칭 (symmetric) PCR 방법은 어느 정도의 증폭산물이 합성된 후에는 증폭산물 간의 결합이 증폭산물과 프라이머의 결합보다 확률적으로 매우 높다. 그 이유는 프라이머의 염기서열 길이가 증폭산물의 염기서열 길이 보다 현저하게 짧기 때문이다. 따라서 증폭산물과 프라이머의 결합보다 증폭산물 간의 결합 기회가 높아져 결과적으로 증폭효율이 떨어지고 궁극적으로는 증폭이 중단되는 프래토(plateau) 단계에 이르게 된다. (Rice et al. Prenatal Diagn. 22:1130, 2002) 비대칭 PCR 방법은 정방향과 역방향 프라이머의 농도를 다르게 하여 정방향 프라이머에 의해 합성된 증폭산물과 역방향 프라이머에 의해 합성된 증폭산물의 양이 다르도록 유도하여 증폭산물 간의 결합의 문제점을 해결하는 방법을 제공한다. (Gyllensten et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7652, 1988) 정방향 혹은 역방향 중 소량의 프라이머가 모두 소진되면 과량의 프라이머가 선형 증폭을 유도하여 PCR의 증폭효율을 높여주는 효과가 있다. 그러나 비대칭 PCR이 대칭 PCR에 비해 증폭효율이 높다고는 하나 그 차이는 그다지 크지 않다. (Gyllensten et al. Methods Enzymol 218: 3, 1993) 그 이유는 PCR의 경우 온도를 높이는 denaturation 과정에서 증폭산물 간의 결합 혹은 증폭산물과 프라이머 간의 결합이 다시 일어나기때문으로 해석할 수 있다. 온도를 높여 denaturation과정이 생략된 등온증폭의 경우 비대칭 방법이 PCR에 비해 한층 효과적이다. 특히 정방향 혹은 역방향 프라이머에 의해 합성된 증폭산물과 결합하는 프로브를 사용하는 방법의 경우 비대칭 증폭방법은 매우 효과적이다. 즉 정방향과 역방향 프라이머를 동량 사용하는 대칭 증폭의 경우 정방향과 역방향 프라이머에 의해 합성된 증폭산물 간의 결합과 프로브와 상보적인 증폭산물과 프로브 간의 경쟁 결합이 일어난다. 일반적으로 증폭산물의 염기서열 길이가 프로브의 염기서열 길이 보다 길기 때문에 증폭산물과 브로브의 결합에 의한 신호발생 확률보다 증폭산물 간의 결합으로 인해 신호발생이 일어나지 않을 확률이 훨씬 높다. 반응초기에는 프로브의 농도가 증폭산물의 농도 보다 높아 증폭산물과 프로브 간의 결합이 우세하나 증폭반응이 진행됨에 따라 증폭산물의 농도가 높아져 증폭산물 간의 결합이 증폭산물과 프로브 간의 결합 보다 우세하여 프로브의 결합에 의한 신호 발생이 줄어들고 종국에는 신호발생이 중단된다. 그러므로 정방향 혹은 역방향 프라이머에 의해 합성된 증폭산물 중 프로브와 결합하는 증폭산물을 합성하는 프라이머를 과량 사용하면 증폭산물 간의 결합 보다 프로브와 상보적인 염기서열을 갖는 증폭산물과 프로브 간의 결합을 유도하여 결과적으로 프로브의 결합에 의한 신호발생 확률을 높여 궁극적으로 보다 효율적인 증폭방법이 된다.
PCR을 포함하는 핵산증폭 방법의 가장 큰 문제점의 하나는 비특이적 증폭이다. 비특이적 증폭은 위양성 결과를 초래하여 진단의 정확도를 떨어뜨리는 매우 심각한 문제점으로 분류된다. 따라서 대부분의 프라이머는 바이오정보학을 이용한 컴퓨터 시뮬레이션 등 첨단 기술을 이용하여 디자인을 한다. 그러나 컴퓨터 시뮬레이션이 실제 실험결과와 항상 일치하는 것이 아니어서 생물정보학 기술에 의한 디자인된 프라이머도 비특이적 증폭이 완전히 배제할 수는 없다. 증폭과정에서 과량을 사용하는 프라이머 간의 결합에 의한 증폭인 primer-dimer 현상은 핵산증폭의 정확도를 저해하는 결과를 초래한다. 특히 PCR 프라이머에 비해 상대적으로 길이가 긴 프라이머를 사용하는 등온증폭에서 그 문제점은 매우 크다. 이러한 문제점 때문에 등온증폭 방법의 경우 다양한 종류의 프라이머를 사용하는 다중 (multiplex) 증폭이 PCR에 비해 어려운 것이 사실이다. 그러나 비대칭 증폭방법을 이용할 경우 이러한 문제점을 해결할 수 있다. 즉 정방향 혹은 역방향 프라이머 가운데 하나를 대칭 증폭방법에 비해 현저하게 낮은 농도를 사용함으로써 프라이머 간의 결합 기회를 현저하게 낮춰 primer-dimer 현상을 줄일 수 있다.
본 발명인의 선행특허(한국 특허 10-0957057호)는 동량의 정방향과 역방향 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머를 이용하여 핵산과 신호 프로브를 동시에 등온증폭시킴으로써, 표적핵산을 검출하는 대칭 등온증폭 방법으로 민감도가 반응당 100 세포수 이상으로 진단에 사용하기에 한계가 있다는 문제점과 비특이적 반응에 의한 위양성 결과를 초래하는 문제점이 있다. 또한 본 선행 특허기술은 증폭을 위해 표적 DNA와 프라이머 세트를 포함하는 반응혼합물을 변성시킨 후 효소반응 혼합액을 첨가해야하는 번거로운 방법의 문제점이 있다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 단점을 극복하고, 표적핵산의 검출 민감도를 개선하여 정확하게 증폭시키는 방법 및 표적핵산의 증폭과 동시에 상기 증폭산물을 검출하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트와 표적핵산과 부분적으로 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율을 달리하는 비대칭 (asymmetric) 방법을 이용하면 등온에서 신호 프로브의 증폭을 대칭 방법에 비해 더 많이 효율적으로 증폭하고 프라이머 간의 결합에 의한 비특이적 증폭도 낮출 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 또한 본 발명자는 등온에서 목적 핵산의 증폭과정에서 별도의 변성과정 없이도 증폭이 가능하다는 또 다른 등온증폭 방법인 LAMP 방법의 선례 (Maruyama et al. Appl. Environ. Microbiol. 69:5023, 2003)에 착안하여 본 발명에 적용하여 별도의 변성과정 없이 간편하고 효율적으로 증폭할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 표적핵산과 신호 프로브를 등온에서 신속하고 정확하게 증폭하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 등온에서 표적핵산 및 프로브 신호의 증폭을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 표적핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 표적 DNA, (ii) 상기 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, (iii) 상기 표적 DNA와 3' 말단 DNA 부분이 상보적이고 5' 말단 DNA-RNA 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 (iv) 상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 포함하는 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계를 포함하는 표적 DNA의 등온 증폭방법 및 상기 증폭된 신호 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA의 검출방법을 제공한다. 상기 반응 혼합물에 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율은 한쪽을 과량으로 사용하여 비대칭적으로 단일가닥 핵산이 증폭되는 것을 포함한다.
본 발명은 표적핵산을 등온에서 신속하고 정확하게 증폭하는 방법 및 등온에서 표적핵산의 증폭 및 신호 프로브의 증폭을 동시에 수행하는 핵산의 검출방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 종래 방법인 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속정확하게 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 신호 프로브를 동시에 증폭할 수 있어, 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다. 또한 비대칭 등온증폭 방법으로 종래의 대칭 등온증폭 방법에 비하여 민감도와 특이도가 개선되어 보다 정확한 진단이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 표적 DNA의 등온증폭 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 표적 DNA와 신호 프로브의 등온증폭 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 대칭 등온증폭 방법과 비대칭 등온증폭 방법의 차이점을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 결핵균을 타겟으로 하여 본 발명에 따른 대칭 등온 증폭방법과 비대칭 등온 증폭방법에 의해 생성된 형광신호(Delta Rn)를 실시간 형광검출 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 클라미디아균을 타겟으로 하여 본 발명에 따른 대칭 등온 증폭방법과 비대칭 등온 증폭방법에 의해 생성된 형광신호(Delta Rn)를 실시간 형광검출 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 임균을 타겟으로 하여 본 발명에 따른 대칭 등온 증폭방법과 비대칭 등온 증폭방법에 의해 생성된 형광신호(Delta Rn)를 실시간 형광검출 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 리스테리아균을 타겟으로 하여 본 발명에 따른 대칭 등온 증폭방법과 비대칭 등온 증폭방법에 의해 생성된 형광신호(Delta Rn)를 실시간 형광검출 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 살모넬라균을 타겟으로 하여 본 발명에 따른 대칭 등온 증폭방법과 비대칭 등온 증폭방법에 의해 생성된 형광신호(Delta Rn)를 실시간 형광검출 장비로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (i) 표적 DNA, (ii) 상기 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, (iii) 상기 표적 DNA와 3' 말단 DNA 부분이 상보적이고 5' 말단 DNA-RNA 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 (iv) 상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 포함하는 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계를 포함하는 표적 DNA의 등온 증폭방법 및 상기 증폭된 신호 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA의 검출방법을 제공한다. 상기 반응 혼합물에 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율은 한쪽을 과량으로 사용하여 비대칭적으로 단일가닥 핵산이 증폭되는 것을 포함한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 표적 DNA의 등온 증폭은 하기의 과정으로 수행될 수 있다.
우선, 증폭을 수행할 주형이 되는 표적 DNA, 외부 프라이머 세트, DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브의 혼합물에 DNA 중합효소와 RNA 분해효소가 포함된 효소반응용액을 혼합시킨 후 증폭시킨다. 이때, 반응액 내에서 표적 DNA에 상기 외부 프라이머 세트와 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트가 어닐링된다. 상기 외부 프라이머 세트는 혼성 프라이머 세트보다 표적 DNA의 양 말단쪽에 가까운 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 혼성 프라이머 세트는 외부 프라이머보다 표적 DNA의 중심에 가까운 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하며, 이 경우, 혼성 프라이머는 외부 프라이머 보다 DNA 사슬 신장 방향의 앞쪽에 어닐링된다. 어닐링된 외부 프라이머와 혼성 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며 외부 프라이머가 표적 DNA를 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 혼성 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 표적 DNA에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 혼성 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 이중나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다.
상기 증폭산물인 단일나선 DNA를 주형으로 외부 프라이머와 혼성 프라이머가 어닐링된다. 어닐링된 외부 프라이머와 혼성 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며, 외부 프라이머가 단일나선 DNA를 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 혼성 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 단일나선 DNA에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 혼성 프라이머에서 신장된 새로운 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 이중나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다. 상기 증폭된 단일나선 DNA를 주형으로 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머가 어닐링되고 신장되어 RNA를 포함하는 이중나선 DNA 증폭산물이 얻어진다. 이중나선 DNA의 RNA부분은 RNase H에 의해 분해되고 신장, 사슬치환에 의해 단일나선 DNA가 생성된다. 상기의 단일나선 DNA를 주형으로 프라이머의 어닐링, 신장, 사슬치환, RNA 절단의 과정이 반복되면서 표적 DNA가 증폭된다 (도 1).
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 신호 프로브의 증폭은 상기의 핵산 등온증폭과 동시에 수행된다. 상기 표적 DNA의 등온증폭을 통하여 증폭된 DNA가 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브와 어닐링되어 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되면, RNase H의 활성에 의해 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브의 RNA 부분이 절단되고, 절단된 신호 프로브는 표적 DNA로부터 분리되어 떨어지고, 새로운 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브가 결합되고, RNase H에 의해 절단, 분리되는 싸이클이 반복되면서, 신호 프로브가 증폭되게 된다. (도 2)
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 혼성 프라이머 세트 중 정방향 혼성 프라이머와 역방향 혼성 프라이머의 비율을 달리하여 과량의 프라이머가 한쪽 방향의 증폭산물을 생성하고 과량으로 증폭된 한쪽 방향의 DNA와 상보적인 염기서열을 갖는 신호 프로브와 결합할 기회를 높여주어 결과적으로 비대칭 등온증폭 방법이 대칭 등온증폭 방법에 비해 신호 프로브의 증폭기회를 높여준다. 특히 프라이머에 의해 증폭된 증폭산물의 길이가 프로브의 길이 보다 길어 대칭적인 증폭 방법의 경우 증폭산물들 간의 결합이 증폭산물과 프로브 간의 결합 보다 확률적으로 높아 프로브 증폭의 효율성이 떨어지는데 반하여 비대칭 방법은 과량으로 증폭된 증폭산물과 프로브 간의 결합을 효과적으로 유도할 수 있어 프로브의 증폭효율 높여 결과적으로 표적 DNA의 검출 민감도가 크게 개선된다.
도 4 ~ 도 6의 결과에서 보듯이 종래의 대칭 등온증폭 방법에 비해 비대칭 등온증폭 방법은 민감도가 개선됨을 보여준다.
도 7와 도 8의 결과에서 보듯이 종래의 대칭 등온증폭 방법에 비해 비대칭 등온증폭 방법은 특이도가 개선됨을 보여준다.
본 발명에서 사용되는 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있고, 표적핵산 서열에 상보적(complementary)이며, 15~30 염기를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 외부 프라이머와 상보적인 표적DNA 서열은 혼성 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열과 인접한 서열(1~60bp 차이)인 것이 바람직하며, 외부 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열은 혼성 프라이머와 상보적인 DNA 서열보다 표적 DNA 서열의 3' 말단쪽에 가까운 서열인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 5' 말단 DNA-RNA 부분이 표적 DNA 서열과 비상보적인 염기서열을 가지고, 3' 말단 DNA 부분이 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 32~66 염기로 이루어진 것이 바람직하며, 이때, DNA 부분의 길이가 각각 15~30 염기로 이루어지고, RNA 부분은 길이가 1~6 염기로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명에서 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머와 상보적인 표적 DNA의 서열은 외부 프라이머와 상보적인 표적 DNA의 서열보다 3' 말단 쪽으로 위치한 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하며, 혼성 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열은 외부 프라이머와 상보적인 표적 DNA 서열과 인접한 서열(1~60bp 차이)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 주형을 따라서 핵산 프라이머를 확장할 수 있는 효소로서, 치환된 가닥이 결합되는 폴리뉴클레오티드로부터 핵산 가닥을 치환할 수 있어야 한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것이 바람직하며, 내열성 DNA 중합효소로는 Bst DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소, exo(-) Deep vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소, 파이 29 DNA 중합효소 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 RNA 분해효소는 RNA/DNA 혼성체의 RNA 가닥을 절단하는데 특이적이며, 단일가닥 RNA는 분해시키지 않는 것이 바람직하며, 바람직하게는 RNase H를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 중 정방향 혹은 역방향 프라이머 중 과량으로 사용된 프라이머에 의해 증폭되는 핵산 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하며, DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브의 5' 말단과 3' 말단은 올리고 DNA로 구성되고, 중간 부분은 올리고 RNA로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 18~38 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 5' 말단 및 3말단의 DNA 부분은 각각 8~16 염기로 구성되는 것이 바람직하며, 중간에 위치한 RNA 부분은 1~6 염기로 구성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표지 물질은 형광물질(fluorescein)과 형광신호 억제물질 (quencher) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 혼성 프라이머 세트 중 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 농도 비율은 1:5에서 1:20 혹은 5:1에서 20:1로 사용될 수 있고 더욱 바람직하게는 1:10 혹은 10:1로 사용될 수 있다. 과량으로 사용된 혼성 프라이머는 혼성 프로브와 상보적인 염기서열을 가지고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 등온증폭은 본 발명의 프라이머와 주형 DNA가 어닐링될 수 있고, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 온도는 바람직하게는 30~75℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 37~70℃가 바람직하며, 50~65℃인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산의 등온 증폭방법은, 추가의 외부 프라이머를 사용하므로, 단일 RNA-DNA 혼성 프라이머를 사용하는 종래 방법(미국특허 6,251,639)에 비하여, 그 특이성이 높을 뿐만 아니라, 외부 프라이머에 의해 치환된 내부 프라이머가 새로운 주형으로 작용하여 기하급수적으로 증폭됨으로써 증폭 효율을 획기적으로 개선하는 것이 가능하다. 또한 종래의 방법이 단일 RNA-DNA 혼성 프라이머를 사용하여 표적 염기서열 증폭시 일정한 부위를 증폭하기 위해 증폭을 차단하는 별도의 차단기(blocker) 또는 주형 스위치 올리고뉴클리오티드(TSO)를 사용하는데 반해, 본 발명은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 별도의 차단기 또는 주형 스위치 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않고 원하는 부위만을 깨끗하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 증폭된 DNA를 주형으로 하여 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브가 결합하고 분리되는 싸이클을 반복하여 신호 프로브를 증폭시킬 수 있어, 핵산 증폭과 신호 프로브 증폭이 동시에 단일 단계(single-tube)에서 이루어져, 핵산증폭과 신호 프로브 증폭을 동시에 수행할 수 있어 종래의 기술인 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머를 이용하여 핵산만을 증폭하는 기술 (미국 특허 5,824,517) 혹은 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브만을 증폭하는 기술 (미국 특허출원 2005/0214809)에 비해 핵산과 신호 프로브를 동시에 증폭하는 장점이 있다.
본 발명에 따른 핵산의 등온 증폭방법은, 종래의 동량의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하는 대칭적인 등온 핵산 및 신호 프로브 증폭방법에 비하여 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율을 달리하는 비대칭적으로 과량으로 증폭된 DNA를 제공하여 이와 상보적인 염기서열을 갖는 신호 프로브가 어닐링될 기회를 높여주어 효과적으로 신호 프로브를 증폭하여 결과적으로 핵산 검출의 민감도와 특이도가 개선된다.
본 발명은 또한, 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 중 5' 말단 DNA-RNA 부분이 주형과 비상보적인 염기서열을 가지고 있어, 단일 RNA-DNA 혼성 프라이머를 사용하는 종래 방법에서 RNA 분해효소의 반응활성이 DNA 중합효소의 프라이머 확장 활성보다 높을 때에 발생하는 문제점을 고려할 필요가 없다는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 DNA의 등온 증폭방법은 최초의 프라이머 확장과 사슬치환 반응 후, 새로이 합성된 증폭 산물이 새로운 주형으로 사용될 때, 주형과 비상보적인 RNA 부위가 프라이머와 상보적인 주형으로 작용하여 프라이머와의 결합(annealing) 온도를 상승시킴으로써 증폭효율을 증가시킬 뿐 아니라, 프라이머-다이머(primer-dimer)의 형성을 방지하여 증폭 산물의 순도를 높일 수 있다.
본 발명의 핵산의 등온 증폭방법은 시료의 DNA 추출로부터 완전한 증폭까지 약 1시간 정도가 소요되며, 시료 DNA의 추출이 이루어져 있다면 약 40분 정도가 소요되어 매우 신속하게 증폭반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 표적 DNA, (ii) 상기 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, (iii) 상기 표적 DNA와 3' 말단 DNA 부분이 상보적이고 5' 말단 DNA-RNA 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 (iv) 상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 포함하는 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계를 포함하는 표적 DNA의 등온 증폭방법 및 상기 증폭된 신호 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA의 검출방법을 제공한다. 상기 반응 혼합물에 사용되는 혼성 프라이머 세트 중 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율은 한쪽을 과량으로 사용하여 비대칭적으로 단일가닥 핵산이 증폭되는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 신호 프로브는 형광검출기를 이용하여 별도의 후처리 과정 없이 반응 튜브에서 직접적으로 형광신호를 검출할 수 있다. 이때 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 말단이 각각 형광물질 (fluorescence)과 형광신호 억제물질 (quencher)이 표지되어 있어 프로브가 절단되기 전에는 형광에너지가 형광신호 억제물질로 전이되어 형광신호 방출이 억제되고 프로브가 절단된 후에는 형광신호 전이가 일어나지 않는 FRET (fluorescence resonance energy transfer) 형태의 신호 프로브이다
본 발명에 따른 핵산의 등온 증폭방법 및 핵산 검출방법은 일정온도에서 반응을 수행하는 원-스텝(one-step) 핵산 및 신호 프로브 등온 증폭으로, 특별한 열변환장치를 필요로 하지 않기 때문에, 신속하고 간편하게 표적핵산을 증폭할 수 있고, 증폭과정에서 두 쌍의 프라이머 세트와 프로브를 사용함으로써, 종래의 방법에 비하여, 표적핵산만을 정확하게 증폭할 뿐만 아니라, 신호 프로브까지 증폭할 수 있는 장점이 있고, 증폭과정에서 정방향 혼성 프라이머와 역방향 혼성 프라이머의 비율을 달리하는 비대칭 핵산 및 신호 프로브 방법으로 종래의 방법에 비하여 증폭된 DNA 주형과 신호 프로브의 어닐링 기회를 높여 결과적으로 민감도와 특이도가 개선되는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 핵산의 등온 증폭방법 및 핵산의 검출방법은 등온의 하나의 튜브(one-tube) 내에서 이루어지므로, 핵산의 실시간 검출을 위한 대량처리가 가능하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 장점은 증폭기술의 광범위한 사용을 제한하였던 오염에 의한 부가반응이 발생할 위험을 최소화시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 결핵 DNA의 등온 증폭
표적 DNA로는 상업적으로 판매하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) genomic DNA를 정량 희석하여 등온증폭반응의 주형으로 사용하였다. (Vircell, Spain)
외부 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2)는 Mycobacterium tuberculosis IS6110 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 1 (정방향, sense) 및 서열번호 2 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다.
서열번호 1 : 5'-CGATCGAGCAAGCCA-3'
서열번호 2 : 5'-CGAGCCGCTCGCTGA-3'
DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)는 5' 말단 올리고 DNA-RNA 부분은 Mycobacterium tuberculosis IS6110 염기서열에 비상보적인 서열을 가지고, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 Mycobacterium tuberculosis IS6110 염기서열에 상보적인 서열을 가지도록 설계하였으며, 서열번호 3 (정방향, sense) 및 서열번호 4 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 3 : 5'-CGATGACTGACTATACAAGAGGAAAGGCGTACTCGACCTGA-3’
서열번호 4 : 5'-CATTCCAGTTAAGCTAGCAGGTACTGAGATCCCCT 3’
신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브(서열번호 5)는 상기의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, 5' 말단이 FAM dye로, 3' 말단이 DABCYL quencher로 표지되어 있으며, 서열번호 5 (anti-sense)는 다음과 같다 (올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 5 : 5'-FAM-ATCCGTAUGGTGGATAACGTCTTTCA-DABCYL-3’
상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트를 함유하는 반응 혼합물과 효소 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 10mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgSO4, 50mM KCl, 1.6mM dNTP(Fermentas), 1.6mM DTT, 0.1μg BSA, 0.6mM spermine, 100mM trehalose, 0.11μM 외부 프라이머 세트 (IDT), 1.1μM의 혼성 프라이머 세트 (IDT) (비대칭 등온증폭의 경우 2.2μM 정방향 혼성 프라이머 (sense) 및 0.22μM 역방향 혼성 프라이머 (anti-sense))를 첨가하여 제조하였다. 상기 효소 혼합물은 1 unit Bst polymerase (NEB), 6 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), 50 nM 혼성 신호프로브 (IDT)를 첨가하여 제조하였다.
0.2 ml PCR 튜브에 상기 반응 혼합물 5μl, 효소 혼합물 5μl, 농도를 달리하는 주형 DNA 10μl를 상온에서 첨가하고 61℃에서 1.5시간 동안 등온증폭을 수행하였다. 한편 음성 대조군으로 증류수 10ml를 사용하였다 증폭반응은 등온증폭 형광검출장비 (신코, 대한민국)를 사용하여 반응온도를 61℃로 세팅하고 1분마다 형광신호를 취득하도록 세팅하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 비대칭 등온증폭방법이 대칭 등온증폭방법에 비해 검출 능력이 우수함을 보여주었다.
실시예 2: 클라미디아 DNA의 등온 증폭
표적 DNA로는 클라미디아균(Chlamydia trachomatis) genomic DNA를 사용하였다. 클라미디아균의 genomic DNA를 추출하기 위해 클라미디아 균주 (ATCC Cat. No. VR-887)에서 G-spinTM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후 증폭반응을 실시하였다. Genomic DNA 추출은 균 현탁액 500μl를 13,000rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 500μl PBS (pH 7.2)로 살짝 섞어서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNase A, Proteinase K가 첨가된 G-buffer 용액 300μl를 첨가하여 cell pellet을 현탁시키고, 65oC에서 15분간 정치시켰다. 다음으로 Binding buffer 250μl를 넣고 잘 혼합한 후, spin column에 DNA를 결합시켰다. 500ml의 washing buffer A를 첨가한 후, 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 제거하고, washing buffer B 500ml를 첨가하고 원심분리 하였다. 1.5ml microcentrifuge tube에 column을 옮겨 50μl의 eleution buffer를 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하여 15.8ng/ml의 genomic DNA를 얻었다. 이것을 일정량 희석하여 등온증폭반응의 주형으로 사용하였다.
외부 프라이머(서열번호 6 및 서열번호 7)는 Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 6 (정방향, sense) 및 서열번호 7 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다.
서열번호 6 : 5'-TAAACATGAAAACTCGTTCCG-3'
서열번호 7 : 5'-CAGTTATAGGTAATCCATTGTC-3'
DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머(서열번호 8 및 서열번호 9)는 5' 말단 올리고 DNA-RNA 부분은 Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA에 비상보적인 서열을 가지고, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 Chlamydia trachomatis cryptic plasmid DNA 염기서열에 상보적인 서열을 가지도록 설계하였으며, 서열번호 8 (정방향, sense) 및 서열번호 9 (역방향 anti-sense)는 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 8: 5'-ACCGCATCGAATCGATGTAAAATAGAAAATCGCATGCAAGATA-3'
서열번호 9 : 5'-CGATTCCGCTCCAGACTTAAAAAGCTGCCTCAGAATATACTCAG-3’
신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브(서열번호 5)는 상기의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, 5' 말단이 FAM dye으로, 3' 말단이 BHQ1 quencher으로 표지되어 있으며, 서열번호 10 (sense)은 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 10 : 5'-FAM-GGTAAAGCTCUGAUAUTTGAAGACTCT-BHQ1-3’
상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트를 함유하는 반응 혼합물과 효소 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 5mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 20mM MgSO4, 10mM KCl, 1mM dNTP(Fermentas), 1mM DTT, 0.1μg BSA, 0.15mM spermine, 20mM trehalose, 0.2μM 외부 프라이머 세트 (IDT), 1μM의 혼성 프라이머 세트 (IDT) (비대칭 등온증폭의 경우 0.4μM 정방향 혼성 프라이머 (sense) 및 2μM 역방향 혼성 프라이머 (anti-sense))를 첨가하여 제조하였다. 상기 효소 혼합물은 3 units Bst polymerase (NEB), 8 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), 50 nM 혼성 신호프로브 (IDT)를 첨가하여 제조하였다.
0.2 ml PCR 튜브에 상기 반응 혼합물 5μl, 효소 혼합물 5μl, 농도를 달리하는 주형 DNA 10μl를 상온에서 첨가하고 61℃에서 1.5시간 동안 등온증폭을 수행하였다. 한편 음성 대조군으로 증류수 10ml를 사용하였다 증폭반응은 등온증폭 형광검출장비 (신코, 대한민국)를 사용하여 반응온도를 61℃로 세팅하고 1분마다 형광신호를 취득하도록 세팅하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 비대칭 등온증폭방법이 대칭 등온증폭방법에 비해 검출 능력이 우수함을 보여주었다.
실시예 3: 임균 DNA의 등온 증폭
표적 DNA로는 임균(Neisseria gonorrhoease) genomic DNA를 사용하였다. 임균의 genomic DNA를 추출하기 위해 임균 균주 (ATCC Cat. No. 49226)에서 G-spinTM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후 증폭반응을 실시하였다. Genomic DNA 추출은 균 현탁액 500μl를 13,000rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 500μl PBS (pH 7.2)로 살짝 섞어서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNase A, Proteinase K가 첨가된 G-buffer 용액 300μl를 첨가하여 cell pellet을 현탁시키고, 65oC에서 15분간 정치시켰다. 다음으로 Binding buffer 250μl를 넣고 잘 혼합한 후, spin column에 DNA를 결합시켰다. 500μl의 washing buffer A를 첨가한 후, 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 제거하고, washing buffer B 500μl를 첨가하고 원심분리 하였다. 1.5ml microcentrifuge tube에 column을 옮겨 50μl의 eleution buffer를 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하여 4.7ng/ml의 genomic DNA를 얻었다. 이것을 일정량 희석하여 등온증폭반응의 주형으로 사용하였다.
외부 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12)는 Neisseria gonorrhoease opa 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 11 (정방향, sense) 및 서열번호 12 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다.
서열번호 11 : 5'-TCATCCGCCATATTGTG-3'
서열번호 12 : 5'-TTTCGGCTCCTTATTCGGTTT-3'
DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머(서열번호 13 및 서열번호 14)는 5' 말단 올리고 DNA-RNA 부분은 Neisseria gonorrhoease opa 유전자 DNA 염기서열에 비상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 Neisseria gonorrhoease opa 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 13 (정방향, sense) 및 서열번호 14 (역방향 anti-sense)는 다음과 같다. (올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다)
서열번호 13: 5'-GCATAGCTCAAGTATATGGCACATTGAAACACCGCCCGGAA-3'
서열번호 14 : 5'-CTATCACGTGAAGCTAACGACCGGTTAAAAAAAGATTTTCACTG-3’
신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브(서열번호 15)는 상기의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, 5' 말단이 FAM dye으로, 3' 말단이 DABCYL quencher으로 표지되어 있으며, 서열번호 15 (anti-sense)은 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 15 : 5'-FAM- ATGTTGAAGGACGGATTATATCGGDABCYL-3’
상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트를 함유하는 반응 혼합물과 효소 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 10mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgSO4, 10mM KCl, 1.6mM dNTP(Fermentas), 5mM DTT, 0.1μg BSA, 0.4mM spermine, 20mM trehalose, 0.1μM 외부 프라이머 세트 (IDT), 1μM의 혼성 프라이머 세트 (IDT) (비대칭 등온증폭의 경우 4.4μM 정방향 혼성 프라이머 (sense) 및 0.44μM 역방향 혼성 프라이머 (anti-sense))를 첨가하여 제조하였다. 상기 효소 혼합물은 5 units Bst polymerase (NEB), 5 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), 30 nM 혼성 신호프로브 (IDT)를 첨가하여 제조하였다.
0.2 ml PCR 튜브에 상기 반응 혼합물 5μl, 효소 혼합물 5μl, 농도를 달리하는 주형 DNA 10μl를 상온에서 첨가하고 61℃에서 1.5시간 동안 등온증폭을 수행하였다. 한편 음성 대조군으로 증류수 10μl를 사용하였다 증폭반응은 등온증폭 형광검출장비 (신코, 대한민국)를 사용하여 반응온도를 61℃로 세팅하고 1분마다 형광신호를 취득하도록 세팅하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 비대칭 등온증폭방법이 대칭 등온증폭방법에 비해 검출 능력이 우수함을 보여주었다.
실시예 4: 리스테리아 DNA의 등온 증폭
표적 DNA로는 리스테리아(Listeria monocytogene) genomic DNA를 사용하였다. 리스테리아균의 genomic DNA를 추출하기 위해 리스테리아 균주 (ATCC Cat. No. 35152)에서 G-spinTM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후 증폭반응을 실시하였다. Genomic DNA 추출은 균 현탁액 500μl를 13,000rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 500μl PBS (pH 7.2)로 살짝 섞어서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNase A, Proteinase K가 첨가된 G-buffer 용액 300μl를 첨가하여 cell pellet을 현탁시키고, 65oC에서 15분간 정치시켰다. 다음으로 Binding buffer 250ml를 넣고 잘 혼합한 후, spin column에 DNA를 결합시켰다. 500μl의 washing buffer A를 첨가한 후, 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 제거하고, washing buffer B 500μl를 첨가하고 원심분리 하였다. 1.5ml microcentrifuge tube에 column을 옮겨 50μl의 eleution buffer를 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하여 8.4ng/ml의 genomic DNA를 얻었다. 이것을 일정량 희석하여 등온증폭반응의 주형으로 사용하였다.
외부 프라이머(서열번호 16 및 서열번호 17)는 Listeria monocytogene actA 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 16 (정방향, sense) 및 서열번호 17 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다.
서열번호 16 : 5'-TGCGTGCGATGATGGTAGTTTT-3'
서열번호 17 : 5'-CTTGGCTGCTCTTCTGTTTT-3'
DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머(서열번호 18 및 서열번호 19)는 5' 말단 올리고 DNA-RNA 부분은 Listeria monocytogene actA 유전자 DNA 염기서열에 비상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 Listeria monocytogene actA 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 18 (정방향, sense) 및 서열번호 19 (역방향 anti-sense)는 다음과 같다. (올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다)
서열번호 18: 5'-CATCACCAACAAGAAGTAGAUUATGCATTACGATTAACCCCGAC-3'
서열번호 19 : 5'-CTGTCATTCATAGTCTCGTCUACUTCTTCCCATTCATCTGTGTTCA-3’
신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브(서열번호 20)는 상기의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, 5' 말단이 FAM dye으로, 3' 말단이 black hole quencher 1(BHQ1)으로 표지되어 있으며, 서열번호 20 (anti-sense)은 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 20 : 5'-FAM-ATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGABHQ1-3’
상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트를 함유하는 반응 혼합물과 효소 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 10mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 12mM MgSO4, 10mM KCl, 1.8mM dNTP(Fermentas), 6mM DTT, 0.1μg BSA, 0.8mM spermine, 0.1μM 외부 프라이머 세트 (IDT), 1μM의 혼성 프라이머 세트 (IDT) (비대칭 등온증폭의 경우 0.01μM 정방향 외부 프라이머 (sense), 0.1μM 정방향 혼성 프라이머 (sense) 및 0.1μM 역방향 외부 프라이머 (anti-sense), 1μM 역방향 혼성 프라이머 (anti-sense))를 첨가하여 제조하였다. 상기 효소 혼합물은 3 units Bst polymerase (NEB), 6 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), 15 nM 혼성 신호프로브 (IDT)를 첨가하여 제조하였다.
0.2 ml PCR 튜브에 상기 반응 혼합물 5μl, 효소 혼합물 5μl, 농도를 달리하는 주형 DNA 10μl를 상온에서 첨가하고 61℃에서 1.5시간 동안 등온증폭을 수행하였다. 한편 특이도를 측정하기 위한 균주는 황색포도상구균 (Staphylcoccus aureus: Korean collection type culture(KCTC) 1927), 살모넬라균 (Salmonella enterica; KCTC 1925), 장염 비브리오 (Vibrio parahaemolyticus; ATCC 17802), 바실러스균 (Bacillus cereus; ATCC 49953) 시겔라균 (Shigella flexneri; KCTC 2517), 장출혈성대장균 (Escherichia coli O157:H7; ATCC 35150)을 리스테리아균 DNA 추출방법과 동일한 방법으로 추출한 DNA 10ml를 사용하였다 증폭반응은 등온증폭 형광검출장비 (신코, 대한민국)를 사용하여 반응온도를 61℃로 세팅하고 1분마다 형광신호를 취득하도록 세팅하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 비대칭 등온증폭방법이 대칭 등온증폭방법에 비해 특이도가 우수함을 보여주었다.
실시예 5: 살모넬라 DNA의 등온 증폭
표적 DNA로는 살모넬라 (Salmonella enterica) genomic DNA를 사용하였다. 살모넬라균의 genomic DNA를 추출하기 위해 살모넬라균주 (KCTC 1925)에서 G-spinTM Genomic DNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Cat. No. 17121)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 후 증폭반응을 실시하였다. Genomic DNA 추출은 균 현탁액 500μl를 13,000rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 500μl PBS (pH 7.2)로 살짝 섞어서 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNase A, Proteinase K가 첨가된 G-buffer 용액 300μl를 첨가하여 cell pellet을 현탁시키고, 65oC에서 15분간 정치시켰다. 다음으로 Binding buffer 250μl를 넣고 잘 혼합한 후, spin column에 DNA를 결합시켰다. 500ml의 washing buffer A를 첨가한 후, 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 제거하고, washing buffer B 500μl를 첨가하고 원심분리 하였다. 1.5ml microcentrifuge tube에 column을 옮겨 50μl의 eleution buffer를 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하여 6.7ng/ml의 genomic DNA를 얻었다. 이것을 일정량 희석하여 등온증폭반응의 주형으로 사용하였다.
외부 프라이머(서열번호 16 및 서열번호 17)는 Salmonella enterica invA 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 21 (정방향, sense) 및 서열번호 22 (역방향, anti-sense)는 다음과 같다.
서열번호 21 : 5'-CTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATC-3'
서열번호 22 : 5'-CTGAGGATTCTGTCAATGTAGAACGA-3'
DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머(서열번호 23 및 서열번호 24)는 5' 말단 올리고 DNA-RNA 부분은 Salmonella enterica invA 유전자 DNA 염기서열에 비상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 3' 말단 올리고 DNA 부분은 Salmonella enterica invA 유전자 DNA 염기서열에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 23 (정방향, sense) 및 서열번호 24 (역방향 anti-sense)는 다음과 같다. (올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다)
서열번호 23: 5'-ACCTCAGACATCCAGGAGAGTTCGTCATTCCATTACC-3'
서열번호 24 : 5'-ATCGCAGATTAGGCTCAGAGAACACCAATATCGCCAGTA-3’
신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브(서열번호 20)는 상기의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA에 상보적인 염기서열을 가지고, 5' 말단이 FAM dye으로, 3' 말단이 black hole quencher 1(BHQ1)으로 표지되어 있으며, 서열번호 25 (anti-sense)는 다음과 같다(올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 25 : 5'-FAM-TCAGTGCGATCAGGAAATCAACCAGATABHQ1-3’
상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 혼성 프라이머 세트를 함유하는 반응 혼합물과 효소 혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 10mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 12mM MgSO4, 10mM KCl, 1.8mM dNTP(Fermentas), 6mM DTT, 0.1μg BSA, 0.75mM spermine, 0.075μM 외부 프라이머 세트 (IDT), 1.125μM의 혼성 프라이머 세트 (IDT) (비대칭 등온증폭의 경우 0.075μM 정방향 외부 프라이머 (sense), 2.25μM 정방향 혼성 프라이머 (sense) 및 0.075μM 역방향 외부 프라이머 (anti-sense), 0.225μM 역방향 혼성 프라이머 (anti-sense))를 첨가하여 제조하였다. 상기 효소 혼합물은 3 units Bst polymerase (NEB), 6 units RNase H (Epicentre), 6 units RNase inhibitor (NEB), 25 nM 혼성 신호프로브 (IDT)를 첨가하여 제조하였다.
0.2 ml PCR 튜브에 상기 반응 혼합물 5μl, 효소 혼합물 5μl, 농도를 달리하는 주형 DNA 10μl를 상온에서 첨가하고 61℃에서 1.5시간 동안 등온증폭을 수행하였다. 한편 특이도를 측정하기 위한 균주는 황색포도상구균 (Staphylcoccus aureus: Korean collection type culture(KCTC) 1927), 리스테리아균 (Listeria monocytogene: ATCC 5152), 장염 비브리오 (Vibrio parahaemolyticus; ATCC 17802), 바실러스균 (Bacillus cereus; ATCC 49953) 시겔라균 (Shigella flexneri; KCTC 2517), 장출혈성대장균 (Escherichia coli O157:H7; ATCC 35150)을 리스테리아균 DNA 추출방법과 동일한 방법으로 추출한 DNA 10ml를 사용하였다 증폭반응은 등온증폭 형광검출장비 (신코, 대한민국)를 사용하여 반응온도를 61℃로 세팅하고 1분마다 형광신호를 취득하도록 세팅하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 비대칭 등온증폭방법이 대칭 등온증폭방법에 비해 특이도가 우수함을 보여주었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 다음의 단계를 포함하는 표적 DNA의 등온 증폭방법:
    (i) 표적 DNA, (ii) 상기 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, (iii) 상기 표적 DNA와 3' 말단 DNA 부분이 상보적이고 5' 말단 DNA-RNA 부분이 비상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트 및 (iv) 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율이 한 쪽을 과량으로 사용하여 비대칭적으로 핵산이 증폭되는 세트 및 (v) 상기 외부 프라이머 세트와 혼성 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브를 포함하는 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소를 첨가한 다음, 상기 표적 DNA와 상기 신호 프로브를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계를 포함하는 표적 DNA의 등온 증폭방법 및 상기 증폭된 신호 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 DNA의 검출방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머 세트는 5' 말단 DNA-RNA 부분이 표적 DNA 서열과 비상보적인 염기서열을 가지고, 3' 말단 DNA 부분이 표적 DNA와 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 상기 DNA-RNA-DNA 프라이머 세트 중 과량으로 사용되는 프라이머에 의해 증폭된 산물과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율은 1:5부터 1:20까지 혹은 그 반대로 구성되는 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 상기 DNA-RNA-DNA 프라이머 세트 중 과량으로 사용되는 프라이머에 의해 증폭된 산물과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소, exo(-) Deep vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소 및 파이 29 DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 RNA 분해효소는 RNase H인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 32~66 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프라이머는 DNA 부분의 길이가 각각 15~30 염기로 이루어지고, RNA 부분은 길이가 1~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 18~38 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 DNA 부분의 길이가 각각 8~16 염기로 이루어지고, RNA 부분은 길이가 1~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 신호 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광물질 (fluorescence)과 형광신호 억제물질 (quencher)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 등온증폭은 30~75℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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