CN110373452A - 用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，先对受到污染的豆瓣样品进行菌株分离，然后提取DNA，采用细菌通用引物进行PCR扩增，将细菌16SrRNA转化到大肠杆菌感受态细胞培养，采用菌落PCR法获得阳性克隆子，提取质粒，测序，在GenBank数据库做相似性分析，确定菌株的分类学地位，确定毒力致病因子基因，设计引物，先优化单重LAMP反应体系，再优化反应温度，引物浓度和Mg2+浓度，获得二重LAMP反应体系，检测二重LAMP反应体系的特异性和灵敏性，然后将其运用到受污染豆瓣的菌株筛查中。本发明用二重LAMP进行快速、准确鉴定分离的调味品致病菌，可以对调味品中的致病菌进行控制和预防。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，更具体地，本 发明涉及一种郫县豆瓣的致病微生物二重LAMP快速筛查技术。
背景技术
环介导等温扩增(LAMP)技术是日本学者2000年发明的一种新型的恒温核 酸扩增技术，因其独特的核酸反应机理，产物在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出其 典型的阶梯状条带，结果鉴定方便快捷，非常适合食源性致病菌的快速检测。 LAMP技术以特有的灵敏、快速、特异等优势，现已被逐渐应用于病原微生物的 检测如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。Kayo-ko Ohtsuka 等(2010)抽样检测了110个可能被沙门氏菌感染的水样调味品，使用LAMP技 术对沙门氏菌的检出率为100％。李玉峰等(2011)选用了不耐热肠毒素基因设 计出LAMP引物，优化了LAMP的反应条件，并且考察了方法的特异性和灵敏性。 相关报道均未研究调味品中的金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌，且采用LAMP检 测法均为单重，检测效率较低。
发明内容
为了解决现有LAMP检测法检测效率低，不利于对调味品中的污染微生物进 行检测的问题，本发明提供了以下技术方案：
一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，包括如下步骤：
(1)菌株分离
将豆瓣样品梯度稀释后涂布在平板培养基上，培养获得单个菌落，挑取菌 落并利用生理盐水制成菌液；
(2)基因组DNA提取及未知菌鉴定
①细菌DNA的提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，在1％的琼脂糖 凝胶电泳检测所提取菌株的DNA；
②未知菌株的PCR扩增
上引物：Eu27F，10μmol·L-1；下引物：1490R，10μmol·L-1；以提取到 的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：dd water 16μL、冰上解冻的10×Taq 缓冲液2μL、冰上解冻的dNTP 2μL、25mmol·L-1的MgCl21.5μL、上下引物 和模板各1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR条件：95℃预热5min，95℃变 性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min；
③重组质粒构建及16SrRNA鉴定
对细菌16SrRNA基因与p GEM-T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子，选择鉴定为阳性 的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定；测序结果通过16SrRNA序列校对 后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度为99％的菌株，确定 菌株的分类学地位，进行编号；
(3)二重LAMP鉴定致病菌
①LAMP引物设计
根据菌株的分类学地位，确定菌株的毒力致病因子基因，对毒力致病因子 基因进行引物设计，每个毒力致病因子基因设计两对不同特异性的引物；
②单重LAMP反应体系的优化
选择一个编号的菌株，进行单重LAMP实验，对反应体系进行优化，确定25 μL反应体系中的成分；对影响扩增效率的Mg2+浓度、温度及引物浓度进行优化： 在60℃条件下，Mg2 +添加量分别设定为：1.3、1.5、1.6、1.7μL；在Mg2+添加 量为1.5μL时，扩增温度分别设定为：58、60、62、64℃；在上述两个单因素 结果基础上，引物浓度分别设定为：1.8、2.0、2.2、2.4μL；对比扩增结果， 选择条带清晰、重现性好的反应温度、引物浓度和Mg2+浓度作为25μL反应体 系的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg2+浓度；
③二重LAMP特异检测致病菌
把两对不同特异性的引物加入到优化后的同一25μL反应体系中，以步骤 (2)筛选的菌株的基因组DNA及非目标菌株的基因组DNA为模板，分别进行LAMP 检测，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证该方法检测步骤(2)编号的菌 株的准确性及特异性；
④验证二重LAMP的灵敏性
将步骤(2)筛选的菌株的DNA模板进行10倍梯度稀释至最低达到1fg/μL， 进行LAMP扩增，电泳检测结果验证该方法检测步骤(2)编号的菌株的灵敏性；
(4)筛查方法的运用
当验证二重LAMP的准确性及特异性时，扩增结果仅步骤(2)编号的菌株 显示阳性，非目标菌株显示阴性，表明准确性高；两对不同特异性的引物在各 DNA模板共存在的环境中能特异性扩增表明特异性强；验证二重LAMP的灵敏性 时确定检测菌株的最高稀释倍数；将其他豆瓣样品稀释后直接采用步骤(3)确 定的方法筛查是否含有步骤(2)编号的菌株。
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的基因组DNA的操作步骤：取菌 液1.5mL，离心后加缓冲液GA悬浮，37℃处理30min，加入20μL蛋白酶K混 匀加入220μL缓冲液GB，混匀后70℃温浴30min。加入220μL无水乙醇振 荡混匀后移入吸附柱CB3中，离心后加入500μL缓冲液GD后离心；向吸附 柱提加入600μL漂洗PW，离心，最后加入75μL洗脱缓冲液TE离心至收集 管。
步骤(1)的操作方法是：无菌条件下将豆瓣样品分别用200mL无菌生理盐 水冲洗，将所得混悬液使用无菌生理盐水以10倍的梯度逐步稀释，选取3个稀 释度，取所得梯度稀释的各种混悬液0.1mL，无菌条件下分别涂布于5％血琼脂 培养基、亚硫酸铋琼脂培养基中，在37℃恒温条件下培养24h，挑取各培养基 上长出的菌落，利用生理盐水制成菌液。
步骤(2)中所述菌株的分类学地位包括蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。 当菌株为蜡样芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌时：
所述蜡样芽孢杆菌菌株的毒力致病因子基因为nhe基因，所述金黄色葡萄 球菌菌株的毒力致病因子基因为nuc基因。
所述25μL反应体系中的成分为：10×Thermopol Buffer 2.5μL，4mol/L 的Betaine 5μL，两对不同特异性的引物各2μL，8U/μL的Bst DNA polymeraselarge fragment1μL，10mmol/L的dNT 4μL，100mmol/L的MgSO4 1.5μL，模板1μL；灭菌去离子水2μL。
两对不同特异性的引物浓度为：
F3∶B3∶FIP∶BIP＝5μmol/L∶5μmol/L∶40μmol/L∶40μmol/L。
所述25μL反应体系的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg2+浓度分别为 60℃、2.0μL、1.5μL。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明从污染的调味品 中分离致病菌，用16SrRNA分子方法和克隆测序，根据测序结果在NCBI中比对其 在种属上分类。根据种属结果和特异性毒力因子基因设计两种致病菌的二重 LAMP特异性引物，用二重LAMP进行快速、准确鉴定分离的调味品致病菌，为二 重LAMP鉴定食源性致病菌提供参考和理论依据，进而可以对调味品中的致病菌 进行控制和预防，以确保食品的安全。
附图说明
图1为细菌PCR扩增结果图；
图2为阳性克隆子质粒提取结果图；
图1和图2中，X1为蜡样芽孢杆菌，X2为金黄色葡萄球菌，M为DNA Marker。
图3为LAMP反应体系优化图谱；
图3中，M为DL 2000DNA Marker；A中1～4为MgSO4添加量1.3、1.5、 1.6、1.7μL；B中1～4扩增温度58、60、62、64℃；C中1～4引物浓度1.8、 2.0、2.2、2.4μL。
图4为LAMP特异性检测致病菌图谱；
图4A中M为DL 2000DNA Marker，1～9对应四川省疾控中心提供的9 株(依次)菌的阳性质粒；B中0为空白对照，X1蜡样芽孢杆菌，X2金黄色 葡萄球菌，1～9对应四川省疾控中心提供的9株(依次)菌，M为DL 2000DNA Marker。
图5为LAMP灵敏度图谱；
图5中，M为DNA Marker，1～8依次为DNA模板质量浓度10、1ng/μL、 100、10、1pg/μL，100、10、1fg/μL。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
原料与仪器：
豆瓣样品，由四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司提供。
单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、 沙门氏菌(Salmonella)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、德氏乳杆菌保 加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp)、面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli)、福氏志贺氏菌 (Shigella flexneri)、产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxingenic E.coli)四川 省疾控中心，用于提取DNA作为非目标菌株的基因组DNA。细菌基因组DNA提 取试剂盒上海伟杰生物工程有限公司；p GEM-T easy载体系统和质粒小量提 取试剂盒成都敬道生物有限公司；PCR试剂和LAMP试剂引物上海生工公司；DNA Marker DL2000和Premix Ex Taq酶宝生物工程(大连)有限公司。DYY-8B 型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；低速离心机北京医用离心机厂； Eppendorf PCR仪德国Eppendorf公司；台式离心机上海安亭科学仪器厂； 1DHG-9140型电热恒温水浴锅上海精密实验设备有限公司。
郫县豆瓣的致病微生物快速筛查步骤：
(1)菌株分离
无菌条件下将豆瓣样品分别用200mL0.85％(m/V)无菌生理盐水冲洗，将 所得混悬液使用无菌生理盐水以10倍的梯度逐步稀释，选取合适的3个稀释度， 取所得梯度稀释的各种混悬液0.1mL，无菌条件下分别涂布于5％血琼脂培养基、 亚硫酸铋琼脂培养基中，在37℃恒温条件下培养24h，在血琼脂平板上生长出了 中等大小2株菌，编号为X1、X2号，挑取X1、X2菌落，利用生理盐水制成菌液。
5％血琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，脱纤维羊血50mL， 琼脂15g，去离子水1000mL。
亚硫酸铋琼脂培养基：硫酸亚铁0.3g，磷酸氢二钠4g，煌绿0.025g，柠檬 酸铋铵2g，亚硫酸钠6g，琼脂18～20g，蒸馏水1000mL，pH 7.5。
(2)基因组DNA提取及未知菌鉴定
①细菌DNA的提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA：取菌液1.5mL， 离心后加缓冲液GA悬浮，37℃处理30min，加入20μL蛋白酶K混匀加入 220μL缓冲液GB，混匀后70℃温浴30min。加入220μL无水乙醇振荡混匀 后移入吸附柱CB3中，离心后加入500μL缓冲液GD后离心；向吸附柱提加 入600μL漂洗PW，离心，最后加入75μL洗脱缓冲液TE离心至收集管，即提取到细菌的基因组DNA。在1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取菌株的DNA。
②未知菌株的PCR扩增
上引物：Eu27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，10μmol·L-1)；下引物： 1490R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，10μmol·L-1)；以提取到的DNA为模板进 行PCR扩增，PCR反应体系(25μL)：dd water 16μL、10×Taq缓冲液(冰上 解冻)2μL、d NTP(冰上解冻)2μL、MgCl2(25mmol·L-1)1.5μL、上下引物 和模板各1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR条件：95℃预热5min，95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min。
③重组质粒构建及16SrRNA鉴定
对细菌16SrRNA基因与p GEM-T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子，选择鉴定为阳性 的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定。鉴定测序由生工生物工程(上海) 有限公司完成。测序结果通过16SrRNA序列校对后，与NCBI中GenBank数据库 做相似性分析，选取相似度为99％的菌株，确定菌株的分类学地位。结果发现 X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401(AP007209)、金黄色 葡萄球菌Staphylococcusaureus(AP003088)。对Bacillus cereus的nhe和 Staphylococcus aureus的nuc基因进行二重LAMP鉴定。
用细菌通用引物Eu27F和1490R对2株菌进行16S全长序列的PCR扩增， 扩增结果如图1所示，对阳性克隆子进行质粒提取，结果如图2所示。
由图1和图2可知，PCR扩增效果明显，2株菌的16SrRNA扩增均重复性 好，清晰稳定。产物分子大小在2000bp左右，符合原核微生物的16SrRNA基 因片段大小，达到了对致病菌的16SrRNA基因的PCR扩增目的，也证实了所 得菌的DNA提取比较成功。为了简便高效的检测出分离菌株的分类学地位，实 验对PCR产物做克隆分析。图2中质粒DNA分子大小在2000bp和1200bp之 间，和PCR扩增细菌16SrRNA目的基因大小相符，证明了克隆实验比较成功。 通过电泳检测到完整的16SrRNA基因。将质粒进行测序，通过16SrRNA序列 校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度99％的菌株， 结果发现X1和X2分别为：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus NC7401(AP007209)、 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(AP003088)。Bacillus cereus的nhe 和Staphylococcus aureus的nuc基因可以表达出肠毒素，引起人体腹泻， 具有较强的致病性。
(3)二重LAMP鉴定致病菌
①LAMP引物设计
X1的nhe和X2的nuc基因为菌株的毒力致病因子基因，比较GeneBank 数据库中相似菌株序列，显示nhe和nuc基因保守性好，采用LAMP引物设计 的在线网站(http：//primerexplorer.jp/e/)进行引物的设计，依据LAMP引 物设计的特点，选取2组LAMP引物分别包括外引物F3和B3、内引物FIP和 BIP，如表1。
表1两种食源性致病菌LAMP引物
②单重LAMP反应体系的优化
用分离的致病菌X1进行单重LAMP实验，进行单重LAMP实验，对反应体 系进行优化，先确定25μL反应体系中的成分：10×Thermopol Buffer 2.5μL； Betaine(4mol/L)5μL；4种引物各(F3：B3：FIP：BIP＝5：5：40： 40，μmol/L)2μL；Bst DNA polymeraselargefragment(8U/μL)1μL； dNT(10mmol/L)4μL；MgSO4(100mmol/L)1.5μL；模板1μL；灭菌去离子水2μL。
对影响扩增效率较大的Mg2+浓度、温度及引物浓度进行优化：在60℃条件 下，Mg2+添加量分别设定为：1.3、1.5、1.6、1.7μL；在Mg2+添加量为1.5μL 时，扩增温度分别设定为：58、60、62、64℃；在上述两个单因素结果基础上， 引物浓度分别设定为：1.8、2.0、2.2、2.4μL；对比扩增结果，选择条带清晰、 重现性好的反应温度、引物浓度和Mg2+浓度作为25μL反应体系的二重LAMP反 应温度，引物浓度和Mg2+浓度。
蜡样芽孢杆菌LAMP反应结果在1％琼脂糖凝胶电泳检测如图3所示。由图3 中的特异性梯状条带可以知道LAMP反应较理想，所设计的针对nhe基因的引 物可以特异性且准确的鉴定出从调味品中分离的致病菌(X1)蜡样芽孢杆菌， 且实验重现性好，条带清晰。由图3A中可以得到25μL LAMP反应体系最适MgSO4添加量为1.5μL，由图3B可知最适温度为60℃，由图3C可知引物最适浓度为 2.0μL。以蜡样芽孢杆菌的LAMP扩增检测为基础进行LAMP反应体系优化，扩 增条件的确定为进一步二重LAMP鉴定两种致病菌打下基础。
③二重LAMP特异检测致病菌
把两对不同特异性的引物加入到优化后的同一反应体系(25μL)中，以2 株菌株X1和X2的基因组DNA及非目标菌株的基因组DNA为模板，分别进行LAMP 检测，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证该方法检测蜡样芽孢杆菌、金 黄色葡萄球菌的准确性及特异性，结果如图4所示。
由图4可以知道LAMP扩增结果中致病菌X1、X2条带呈梯状，结果为阳 性。其他9株菌(图4中1-9)无梯状条带，扩增结果为阴性。对比0中的 空白对照可以知道阳性结果准确。表明二重LAMP检测污染调味品的两种致病 菌X1蜡样芽孢杆菌、X2金黄色葡萄球菌较成功，且反应快速、简便特异性强， 为快速检测调味品致病菌提供依据。实验中两套引物在11种不同DNA模板环境 中还能相互特异的扩增，表明引物特异性强。实验采用二重LAMP对分离致病菌 进行一步检测，比传统的PCR和现阶段的单重LAMP更加方便、快捷，且反应的 特异性强，灵敏度高，足见在检测致病菌有较多的优势。本发明中的调味品污 染致病菌由于经过扩增培养，其DNA可以较好提取，进而方便快速进行二重LAMP 鉴定，这为相对污染程度较低的加工包装食品致病菌快速检测提供参考。
④验证二重LAMP的灵敏性
将致病菌X1、X2的DNA模板(100ng/μL)进行10倍梯度稀释为100～10-7倍至1fg/μL，即DNA模板质量浓度10、1ng/μL，100、10、1pg/μL，100、10、 1fg/μL进行LAMP扩增，电泳检测结果如图5所示。
由图5可知二重LAMP灵敏度检测效果较理想，两菌DNA模板进行10倍梯度 稀释至10-6倍(10fg/μL)仍能扩增出较清晰的梯状条带，而稀释至10-7倍(1fg/μL) 的低浓度时则检测不出。比较用LAMP检测单增李斯特菌中的灵敏度结果 1.72×101拷贝/反应模板量，检测度高，实验结果的灵敏度与之相差较小，进 一步证明二重LAMP反应中灵敏度受多种引物及模板的影响较小，表明了二重 LAMP鉴定调味品污染致病菌灵敏度高的特点。
(4)筛查方法的运用
将其他豆瓣样品稀释后直接采用建立好的二重LAMP方法筛查是否含有步骤 (2)所述的蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌，具有灵敏度高、特异性好的优点， 可快速获得准确的结果。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理 解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施 方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开的 范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了 对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的 用途也将是明显的。
Claims (8)
1.一种用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌株分离
将豆瓣样品梯度稀释后涂布在平板培养基上，培养获得单个菌落，挑取菌落并利用生理盐水制成菌液；
(2)基因组DNA提取及未知菌鉴定
①细菌DNA的提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，在1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取菌株的DNA；
②未知菌株的PCR扩增
上引物：Eu27F，10μmol·L-1；下引物：1490R，10μmol·L-1；以提取到的DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系：dd water 16μL、冰上解冻的10×Taq缓冲液2μL、冰上解冻的d NTP2μL、25mmol·L-1的MgCl2 1.5μL、上下引物和模板各1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR条件：95℃预热5min，95℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min；
③重组质粒构建及16SrRNA鉴定
对细菌16SrRNA基因与p GEM-T easy进行连接反应，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，过夜培养，采用菌落PCR方法挑选阳性克隆子，选择鉴定为阳性的克隆子扩培，提取质粒，酶切、测序鉴定；测序结果通过16SrRNA序列校对后，与NCBI中GenBank数据库做相似性分析，选取相似度为99％的菌株，确定菌株的分类学地位，进行编号；
(3)二重LAMP鉴定致病菌
①LAMP引物设计
根据菌株的分类学地位，确定菌株的毒力致病因子基因，对毒力致病因子基因进行引物设计，每个毒力致病因子基因设计两对不同特异性的引物；
②单重LAMP反应体系的优化
选择一个编号的菌株，进行单重LAMP实验，对反应体系进行优化，确定25μL反应体系中的成分；对影响扩增效率的Mg2+浓度、温度及引物浓度进行优化：在60℃条件下，Mg2+添加量分别设定为：1.3、1.5、1.6、1.7μL；在Mg2+添加量为1.5μL时，扩增温度分别设定为：58、60、62、64℃；在上述两个单因素结果基础上，引物浓度分别设定为：1.8、2.0、2.2、2.4μL；对比扩增结果，选择条带清晰、重现性好的反应温度、引物浓度和Mg2+浓度作为25μL反应体系的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg2+浓度；
③二重LAMP特异检测致病菌
把两对不同特异性的引物加入到优化后的同一25μL反应体系中，以步骤(2)筛选的菌株的基因组DNA及非目标菌株的基因组DNA为模板，分别进行LAMP检测，应用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，验证该方法检测步骤(2)编号的菌株的准确性及特异性；
④验证二重LAMP的灵敏性
将步骤(2)筛选的菌株的DNA模板进行10倍梯度稀释至最低达到1fg/μL，进行LAMP扩增，电泳检测结果验证该方法检测步骤(2)编号的菌株的灵敏性；
(4)筛查方法的运用
当验证二重LAMP的准确性及特异性时，扩增结果仅步骤(2)编号的菌株显示阳性，非目标菌株显示阴性，表明准确性高；两对不同特异性的引物在各DNA模板共存在的环境中能特异性扩增表明特异性强；验证二重LAMP的灵敏性时确定检测菌株的最高稀释倍数；将其他豆瓣样品稀释后直接采用步骤(3)确定的方法筛查是否含有步骤(2)编号的菌株。
2.根据权利要求1所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的基因组DNA的操作步骤：取菌液1.5mL，离心后加缓冲液GA悬浮，37℃处理30min，加入20μL蛋白酶K混匀加入220μL缓冲液GB，混匀后70℃温浴30min。加入220μL无水乙醇振荡混匀后移入吸附柱CB3中，离心后加入500μL缓冲液GD后离心；向吸附柱提加入600μL漂洗PW，离心，最后加入75μL洗脱缓冲液TE离心至收集管。
3.根据权利要求1所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于步骤(1)的操作方法是：无菌条件下将豆瓣样品分别用200mL无菌生理盐水冲洗，将所得混悬液使用无菌生理盐水以10倍的梯度逐步稀释，选取3个稀释度，取所得梯度稀释的各种混悬液0.1mL，无菌条件下分别涂布于5％血琼脂培养基、亚硫酸铋琼脂培养基中，在37℃恒温条件下培养24h，挑取各培养基上长出的菌落，利用生理盐水制成菌液。
4.根据权利要求1所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于步骤(2)中所述菌株的分类学地位包括蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求4所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于所述蜡样芽孢杆菌菌株的毒力致病因子基因为nhe基因，所述金黄色葡萄球菌菌株的毒力致病因子基因为nuc基因。
6.根据权利要求4所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于所述25μL反应体系中的成分为：10×Thermopol Buffer 2.5μL，4mol/L的Betaine 5μL，两对不同特异性的引物各2μL，8U/μL的Bst DNApolymeraselarge fragment 1μL，10mmol/L的dNT4μL，100mmol/L的MgSO41.5μL，模板1μL；灭菌去离子水2μL。
7.根据权利要求6所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于两对不同特异性的引物浓度为：
F3∶B3∶FIP∶BIP＝5μmol/L∶5μmol/L∶40μmol/L∶40μmol/L。
8.根据权利要求6所述的用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法，其特征在于所述25μL反应体系的二重LAMP反应温度，引物浓度和Mg2+浓度分别为60℃、2.0μL、1.5μL。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191025 |
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