CN102206703A - 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 - Google Patents
三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.1所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.2所示的序列；志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQNo.3所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.4所示的序列；金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的其上游引物具有如SEQNo.5所示的序列，其下游引物具有如SEQNo.6所示的序列。利用上述检测引物组对待测样品中所提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行LAMP反应，通过对反应产物的鉴定来判定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌或金黄色葡萄球菌。各检测引物组特异性强，能在同一反应体系中准确检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA。
Description
技术领域
本发明属微生物检测领域，涉及一种沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重快速检测方法及其检测引物组和检测试剂盒。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella spp）是公共卫生领域的重要致病菌，属革兰氏染色阴性肠杆菌。据统计在世界各国发生的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区所发生的细菌性食物中毒中也以沙门氏菌为首要原因。除引发食物中毒外，该属的细菌还可以导致胃肠炎、伤寒和副伤寒等疾病。志贺氏菌（Shigella spp）属革兰氏染色阴性肠杆菌，是人类细菌性痢疾最常见的病原菌。近年来，志贺氏菌Ⅰ型的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势，我国至少在十余个省区发生了不同规模流行。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）隶属于葡萄球菌属，革兰氏染色呈阳性。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。
根据现行有效的国家标准和行业标准，几乎所有的食品均需对这三种食源性致病菌进行检测以排除其污染。常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。但目前所采用的普通PCR方法和荧光PCR方法虽可提高检测效率，但对仪器设备要求较高，对检测人员的专业背景和检测能力也有一定要求，因此无法大范围的推广使用。
LAMP方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶DNA上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA），在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。由于LAMP独特的核酸扩增机制，它的产物是由多重复靶序列的茎一环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP反应典型的阶梯状条带；同时，核酸大量生成时，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应体系中的Mg2+结合，产生肉眼可见的扩增反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀；另外，由于扩增产物大量生成，加入荧光染料（如Syber Green I、溴化乙锭、Gel Red等）。因此LAMP扩增结果不但观察方式多样，且结果鉴定简单，非常适合高通量的快速检测。
鉴于LAMP技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。但目前已有的方法只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查，具有广阔的应用前景。经国内外文献查询，尚未见有LAMP应用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌多重快速检测的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明沙门氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的序列。
本发明志贺氏菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的序列。
本发明金黄色葡萄球菌的快速检测引物组的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的序列。
本发明使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法是：将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列。
进一步地，本发明所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行：
第一种方案：所述LAMP反应在59.5-62.5℃下反应70-110min；
第二种方案：所述LAMP反应包含以下步骤：
（1）先在59.5-62.5℃下反应70-110min；
（2）后在80℃下反应6-12min。
进一步地，本发明在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，并且，还包含有浓度为0.6-0.7 M的甜菜碱、浓度为3.8-5.4mM的MgSO4、10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液、浓度为0.4-0.6U/μL的BstDNA聚合酶、浓度各为0.6-1.0mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
本发明快速检测试剂盒包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、三种阳性对照品、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列，所述三种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
本发明快速检测试剂盒的LAMP反应液中，包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、甜菜碱、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水，其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述甜菜碱的浓度为0.6-0.7 M，MgSO4的浓度为3.8-5.4mM，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，BstDNA聚合酶的浓度为0.4-0.6U/μL，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0.6-1.0mM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明是根据已公开的沙门氏菌侵袭蛋白A（invA)基因序列、志贺氏菌侵袭性质粒抗原（ipaH）基因序列、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶（nuc）基因序列，分析设计得到本发明的三重LAMP检测引物组。本发明的三重LAMP检测引物组特异性强，能准确检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA。
（2）本发明能在同一反应体系中和同一反应温度条件下，实现同时对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，准确判断所检样品是否被沙门氏菌、志贺氏菌或金黄色葡萄球菌污染，大大提高实验室检测效率。
（3）本发明的快速检测方法能快速高效扩增沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA目的片段，整个LAMP扩增过程最快可在70分钟内完成，扩增产物得率高，对上述三种致病菌的检测简便、准确。
（4）在本发明的快速检测方法中，LAMP扩增反应可在恒定温度下完成，且允许的温度波动范围较大（±1.5℃），因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。
（5）本发明的快速检测方法灵敏度高，沙门氏菌的阳性扩增结果仅需10fg/μL目的菌基因组DNA，志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的阳性扩增结果均仅需1fg/μL目的菌基因组DNA。
（6）本发明的快速检测方法结果判定简便，且可根据实验室实际条件采用不同的结果判定方式，方法适应性较强。
（7）与常规的平板培养法相比，本发明的快速检测方法可大大缩短检测周期，减少检测环节，从而降低因检测环节过多或人员技术水平和经验的差异造成的误判的几率，使检测结果更为准确可靠。
附图说明
图1是对沙门氏菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。
图2是对志贺氏菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。
图3是对金黄色葡萄球菌LAMP反应产物进行测序的部分DNA序列。
图4是多重扩增产物加入荧光染料后的观察结果。
图5是多重扩增产物离心后沉淀的观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但并不对本发明做任何限定。
实施例1： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测Mg2+浓度测试
本实施例的具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取上述培养产物中的细菌DNA。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
2.2.1、沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组沙门氏菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），沙门氏菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，MgSO4浓度分别为：2.2mM、3mM、3.8mM、4.6mM、5.4mM、6.2mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.2、志贺氏菌的LAMP反应体系
应用不同的Mg2+浓度分别建立6组志贺氏菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），志贺氏菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，MgSO4的浓度分别采用：2.2mM、3mM、3.8mM、4.6mM、5.4mM、6.2mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.3、金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
分别应用不同的Mg2+浓度分别建立6组金黄色葡萄球菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL；并且在以上6组反应体系中，MgSO4的浓度分别采用：2.2mM、3mM、3.8mM、4.6mM、5.4mM、6.2mM；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为：先在61℃下反应 90min；后在80℃下反应6min。
2.4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时，当Mg2+浓度在3.8-5.4mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带；志贺氏菌扩增时，当Mg2+浓度在3-6.2mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当Mg2+浓度在3.8-6.2mM区间时，呈现出明亮的梯状电泳条带。综合三种目标菌检测时的Mg2+浓度范围，确定该三重检测方法的最佳Mg2+浓度为3.8-5.4mM。
实施例2 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测反应温度测试
本实施例具体检测方法如下：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中的细菌DNA。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
2.2.1、沙门氏菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组沙门氏菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系的体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，沙门氏菌基因组DNA模板1μL，以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.2、志贺氏菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组志贺氏菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，志贺氏菌基因组DNA模板1μL，以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.2.3、金黄色葡萄球菌的LAMP反应体系
应用不同的反应温度分别建立6组金黄色葡萄球菌LAMP反应体系，具体如下：
各组反应体系体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，金黄色葡萄球菌基因组DNA模板1μL；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，将本实施例的2.2中所述6组沙门氏菌LAMP反应体系、6组志贺氏菌反应体系、6组金黄色葡萄球菌反应体系，分别先在6种不同温度下进行反应，所采用的温度分别为：58.5℃、59.5℃、61℃、62.5℃、63.5℃、64.5℃，反应时间为90min；后再分别在80℃下反应6min。
2.4、结果观察
将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。其中沙门氏菌扩增时，当反应温度在59.5-64.5℃区间时，呈现明亮的梯状电泳条带；志贺氏菌扩增时，当反应温度在59.5-63.5℃区间时，呈现明亮的梯状电泳条带；金黄色葡萄球菌扩增时，当反应温度在59.5-62.5℃区间时，呈现明亮的梯状电泳条带。综合三种目标菌检测时的温度范围，确定该三重检测体系的最佳反应温度为59.5-62.5℃。
实施例3： 三重LAMP快速检测对沙门氏菌的检测灵敏度
本实施例的具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP的反应体系
建立9个反应管，各反应管中反应体系的总体积为25μL，包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4；各反应管还需分别加入沙门氏菌基因组DNA模板液1μL，所用沙门氏菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL，以测试该检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，先在61℃下反应90min，后在80℃下反应6min。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至10fg/μL时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本发明方法对沙门氏菌DNA的检测灵敏度为10fg/μL。
实施例4：三重LAMP快速检测对志贺氏菌的检测灵敏度
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将志贺氏菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立9个反应管，各反应管反应体系总体积为25μL，分别包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4；各反应管还需加入志贺氏菌基因组DNA模板液1μL，所用模板DNA液浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL，以测试该检测方法对志贺氏菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，先在61℃下反应90min，后在80℃下反应6min。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至1fg/μL时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本方法对志贺氏菌DNA的检测灵敏度为1fg/μL。
实施例5 ：三重LAMP快速检测对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA分别提取试剂盒提取以上培养产物中的细菌DNA。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立9个反应管，各反应管反应体系总体积为25μL，包括0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4；各反应管还需加入金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液1μL，所用金黄色葡萄球菌基因组DNA模板液的浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL，以测试该检测方法对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为：先在61℃下反应90min，后在80℃下反应为6min。
2.4、结果观察
将以上各反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，自动凝胶成像系统下成像观察结果。
通过对反应产物的电泳分析，当模板DNA液的浓度降至1fg/μL时，仍可见较为明亮的梯状电泳条带。说明本发明方法对金黄色葡萄球菌DNA的检测灵敏度为1fg/μL。
实施例6： 三重LAMP快速检测的特异性、准确性分析
本实施例具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、将沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上培养产物中细菌DNA。
1.3、将三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终LAMP检测模板。
2、引物的合成
分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。用于对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的三重LAMP产物进行PCR扩增和测序的引物详见表1。
表1 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重LAMP产物测序引物
2、LAMP反应
2.1、LAMP反应体系
反应体系总体积为100μL，包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，混合DNA模板12μL，以上反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，先在61℃下反应90min，后在80℃下反应6min。
3、产物回收测序验证
3.1、将以上反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳40min，将分子量在100bp-1000bp区域的产物割胶回收，应用QIAGEN琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，作为PCR扩增模板。
3.2、应用表1所述引物分别建立3个PCR反应体系，其中沙门氏菌PCR扩增引物为invA15和invA23，志贺氏菌PCR扩增引物为ipaH15和ipaH24，金黄色葡萄球菌PCR测序引物为nuc12和nuc21；反应体系为TAKARA Premix Ex Taq 12.5μL，上、下游引物各0.5μM，模板DNA 1μL，其余体积以无菌超纯水补充；反应条件均为：95℃反应5min；95℃反应5min，56℃反应30s，72℃反应30s，进行30个循环；72℃反应5min。经电泳分析，各反应体系扩增产物均呈现明亮的、单一的扩增条带，且分子量与预期吻合。将各反应体系扩增产物应用QIAGEN琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，作为测序分析模板。
3.3、分别对所回收的产物进行测序分析，其中应用沙门氏菌测序引物invA15（如表1和SEQ No.7所示）和invA23（如表1和SEQ No.8所示）所测得的序列与沙门氏菌invA基因序列吻合，应用志贺氏菌测序引物ipaH15（如表1和SEQ No.9所示）和ipaH24（如表1和SEQ No.10所示）所测得的序列与志贺氏菌ipaH基因序列吻合，应用金黄色葡萄球菌测序引物nuc12（如表1和SEQ No.11所示）和nuc21（如表1和SEQ No.12所示）所测得的序列与金黄色葡萄球菌nuc基因序列吻合。
图1显示了沙门氏菌反应产物部分测序结果，测序结果与沙门氏菌invA基因序列完全一致，说明本三重LAMP检测方法对沙门氏菌检测特异性强，检测结果准确。
图2显示了志贺氏菌反应产物部分测序结果，测序结果与志贺氏菌ipaH基因序列完全一致，说明本三重LAMP检测方法对志贺氏菌检测特异性强，检测结果准确。
图3显示了金黄色葡萄球菌反应产物部分测序结果，测序结果与金黄色葡萄球菌nuc基因序列完全一致，说明本三重LAMP检测方法对金黄色葡萄球菌检测特异性强，检测结果准确。
4、结论
通过对本实施例LAMP产物测序分析，可以验证本检测方法对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测特异性强，所扩增的产物序列与预期吻合。
实施例7 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测步骤为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将上述三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.2μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.2μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.2μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.6 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.6mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为3.8mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，先在59.5℃下反应110min，后在80℃下反应6min。
2.4、结果观察
将以上各反应液在0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，然后在凝胶成像系统中观察，呈现明亮阶梯状目的条带，说明本实施例的样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或几种。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例8： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将提取的三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.25μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL。以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为：先在61℃下反应 90min，后在80℃下反应9min。
2.4、结果观察
在以上各反应液中加入染料SYBR Green Ⅰ。图4显示了本实施例反应产物加入荧光显色剂后的观察结果。其中1、2号管为样品管，呈现明显荧光，说明所检样品中含有沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或几种；其余6个反应管为阴性对照，未呈现明显荧光。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例9 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中细菌DNA。
1.3、将所提取的三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.3μM的所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.3μM的所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.3μM的所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.7 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.6U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为1.0mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为5.4mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，反应条件为：先在62.5℃下反应70min，后在80℃下反应12min。
2.4、结果观察
将以上各反应液在6000rpm条件下离心5min。图5显示了本实施例反应产物离心后的观察结果。其中1、2号反应管为样品管，底部呈现明显沉淀，说明所检样品中含有沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种；其余6个反应管为阴性对照，反应管底部未呈现沉淀。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例10：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将上述三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.2μM的用于所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.2μM的用于所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.2μM的用于所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.6 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.4U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.6mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为3.8mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，在59.5℃下反应110min。
2.4、结果观察
将反应液在6000rpm条件下离心5min，样品管底部呈现沉淀，说明本实施例样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例11： 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中的细菌DNA。
1.3、将提取的三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.25μM的用于所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.25μM的用于所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的用于所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.65 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为0.8mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为4.6mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL。以上反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，在61℃下反应 90min。
2.4、结果观察
将反应液在6000rpm条件下离心5min，样品管底部呈现沉淀，说明本实施例样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例12 ：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测
本实施例采用乳粉作为检测样品，具体检测方法为：
1、样品DNA的提取
1.1、分别称取25g乳粉样品至225mL缓冲蛋白胨水培养液、225mL GN增菌液和225mL 7.5%氯化钠肉汤培养液中，36℃±1℃培养18小时。
1.2、应用QIAGEN细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取以上三种培养产物中细菌DNA。
1.3、将所提取的三组DNA提取液按等体积比例混合，作为最终检测模板。
2、LAMP反应
2.1、分别人工合成用于沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌检测的上下游引物，其中，用于沙门氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；用于志贺氏菌检测的上游引物具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2.2、LAMP反应体系
建立2个平行反应管，各反应管的反应体系总体积为25μL，包括浓度均为0.3μM的用于所述沙门氏菌检测的上游引物和下游引物、浓度均为0.3μM的用于所述志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.3μM的用于所述金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为0.7 M的甜菜碱，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度为0.6U/μL的BstDNA聚合酶，浓度各为1.0mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGTP）、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTTP）、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP），浓度为5.4mM的MgSO4，加入混合DNA模板液3μL；以上各反应体系的剩余体积以无菌超纯水补充。
2.3、LAMP反应条件
应用恒温水浴器，在62.5℃下反应70min。
2.4、结果观察
将反应液在6000rpm条件下离心5min，样品管底部呈现沉淀，说明本实施例样品中存在沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌中的一种或多种。
2.5、结果验证
采用GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》、GB 4789.10-2010《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对本实施例样品进行检测，检出沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，与LAMP检测结果一致。
实施例13：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测试剂盒
本试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌LAMP检测引物，包括：
用于沙门氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2、BstDNA聚合酶；
3、阳性对照品：沙门氏菌的标准菌株的基因组；志贺氏菌的标准菌株的基因组DNA；金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
4、空白对照品：无菌超纯水；
5、10×BstDNA聚合酶缓冲液；
6、MgSO4溶液；
7、甜菜碱溶液；
8、显色剂：SYBR Green Ⅰ。
实施例14：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测试剂盒
本试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌LAMP检测引物，包括：
用于沙门氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2、BstDNA聚合酶；
3、阳性对照品：沙门氏菌的标准菌株的基因组；志贺氏菌的标准菌株的基因组DNA；金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
4、空白对照品：无菌超纯水；
5、10×BstDNA聚合酶缓冲液；
6、MgSO4溶液；
7、甜菜碱溶液。
实施例15：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重LAMP检测反应液，该LAMP检测反应液的具体组成及浓度为：
浓度均为0.2μM的用于沙门氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.2μM的用于志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.2μM的用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为3.8mM 的MgSO4溶液，，浓度为0.6M的甜菜碱，10 %（体积）10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度均0.6mM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP和浓度为0.4U/μL的 BstDNA聚合酶；其中：
用于沙门氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
3、空白对照品：无菌超纯水；
4、显色剂：SYBR Green Ⅰ。
实施例16：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重LAMP检测反应液，其具体组成及浓度为：
浓度均为0.25μM的用于沙门氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的用于志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.25μM的用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为4.6mM的 MgSO4，浓度为0.65M的甜菜碱，10 %（体积）10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度均0.8mM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP和浓度为0.5U/μL的BstDNA聚合酶；其中：
用于沙门氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
3、空白对照品：无菌超纯水。
实施例17：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌三重LAMP快速检测试剂盒
本实施例试剂盒由如下试剂组成：
1、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌三重LAMP检测反应液，其具体组成及浓度为：
浓度均为0.3μM的用于沙门氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.3μM的用于志贺氏菌检测的上游引物和下游引物，浓度均为0.3μM的用于金黄色葡萄球菌检测的上游引物和下游引物，浓度为5.4mM的 MgSO4，浓度为0.7M的甜菜碱溶液，10 %（体积）10×BstDNA聚合酶缓冲液，浓度均为1.0mM的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP和浓度为0.6U/μL的 BstDNA聚合酶；其中：
用于沙门氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.1所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列。
用于志贺氏菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.3所示的核苷酸序列；用于沙门氏菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.4所示的核苷酸序列。
用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的上游引物，具有如SEQ No.5所示的核苷酸序列；用于金黄色葡萄球菌LAMP检测的下游引物，具有如SEQ No.6所示的核苷酸序列。
2、阳性对照品：
沙门氏菌基因组DNA；
志贺氏菌基因组DNA；
金黄色葡萄球菌基因组DNA；
3、空白对照品：无菌超纯水。
序列表
<110> 浙江省质量技术监督检测研究院
李, 洪波
<120> 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctggtactga tcgataatgc caagtttttc aacgtttcct gcgg 44
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgccggtgaa attatcgcca cacaaaaccc accgccaggc ta 42
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcagcgacct gttcacggat tgcctttccg ataccgtctc t 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atctccggaa aaccctcctg gtagcgccgg tatcattatc ga 42
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttgaagttg cactatatac tgttggcgta aatagaagtg gttct 45
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttgatacac ctgaaacaaa gcatcatttt tttcgtaaat gcacttgc 48
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgcggtact gttaattacc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acaaaaccca ccgccaggct a 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccggattccg tgaacagg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agcgccggta tcattatcga 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggcgtaaata gaagtggttc t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttcgtaaatg cacttgcttc a 21
Claims (8)
1. 一种沙门氏菌的快速检测引物组，其特征是：其上游引物具有如SEQ No.1所示的序列，其下游引物具有如SEQ No.2所示的序列。
2. 一种志贺氏菌的快速检测引物组，其特征是：其上游引物具有如SEQ No.3所示的序列，其下游引物具有如SEQ No.4所示的序列。
3. 一种金黄色葡萄球菌的快速检测引物组，其特征是：其上游引物具有如SEQ No.5所示的序列，其下游引物具有如SEQ No.6所示的序列。
4. 一种使用引物组对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行多重快速检测的方法，其特征是：将沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组和金黄色葡萄球菌的检测引物组与对待测样品的DNA进行LAMP反应，反应结束后对反应液进行阴阳性判定，以确定样品中是否含有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种或任几种；其中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述LAMP反应按以下第一种方案或第二种方案进行：
第一种方案：所述LAMP反应在59.5-62.5℃下反应70-110min；
第二种方案：所述LAMP反应包含以下步骤：
（1）先在59.5-62.5℃下反应70-110min；
（2）后在80℃下反应6-12min。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征是：在进行所述LAMP反应的反应液中，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，并且，还包含有浓度为0.6-0.7 M的甜菜碱、浓度为3.8-5.4mM的MgSO4、10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液、浓度为0.4-0.6U/μL的BstDNA聚合酶、浓度各为0.6-1.0mM的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。
7. 一种快速检测试剂盒，其特征在于：包括沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、三种阳性对照品、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、甜菜碱溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸和无菌超纯水；所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.1所示的序列、下游引物具有如SEQ No.2所示的序列，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.3所示的序列、下游引物具有如SEQ No.4所示的序列，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物具有如SEQ No.5所示的序列、下游引物具有如SEQ No.6所示的序列，所述三种阳性对照品分别为沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株的基因组DNA。
8. 一种快速检测试剂盒，其特征在于：其LAMP反应液中包含有沙门氏菌的检测引物组、志贺氏菌的检测引物组、金黄色葡萄球菌的检测引物组、甜菜碱、BstDNA聚合酶、10×BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4溶液、三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸，无菌超纯水，所述沙门氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述志贺氏菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述金黄色葡萄球菌的检测引物组中的上游引物和下游引物的浓度均为0.2-0.3μM，所述甜菜碱的浓度为0.6-0.7 M，MgSO4的浓度为3.8-5.4mM，10 %（体积）的10×BstDNA聚合酶缓冲液，BstDNA聚合酶的浓度为0.4-0.6U/μL，三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的浓度各为0.6-1.0mM。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111005 |