CN116814821A - 一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用，属于微生态活菌检测及鉴定技术领域。具体包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~24所示；能够同时鉴定微生态四联活菌制品中的4种微生物的种属关系，操作简单，耗时短，鉴定范围广，无需对样品中的细菌进行培养，能够直接对样品进行鉴定，快速省时，成本低，灵敏度高，有利于产品的快速检验。
Description
技术领域
本发明属于微生态活菌检测及鉴定技术领域，具体涉及一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
微生态活菌制品中菌种是药品研究、生产和检定的物质基础，其质量直接与产品的安全和有效性密切相关。现行对菌种的质量控制标准主要包括形态观察、培养特性、产酸活性和安全性等传统方法，缺乏菌株分子生物学特征方面的评价和检测方法，尤其对于多联的微生态活菌制品（药物中含有2种以上的微生态活菌菌株），更无法实现实时快速检测。
双歧杆菌四联活菌片的主要成分是蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌，用于治疗与肠道菌群失调相关的腹泻、便秘、功能性消化不良。基于药品生产用菌种的菌株溯源、制剂工艺优化以及检定等方面考虑，加强药品生产用菌种的质量控制，明确产品中菌株的分子特征和遗传背景，建立一种快速的分子生物学检验方法，同时检测、鉴定四种活菌，将会极大的提升产品的质量保证水平和检验效率。
目前对于单个菌株的检测序列、引物有部分文献记载。检测方法主要包括常规PCR检测、多重PCR检测、实时荧光定量PCR检测、微滴数字PCR检测、环介导等温扩增检测等。这些方法均存在一些不足及缺陷，如精确性低、特异性差、引物交叉反应、假阳性率高、缺乏实时检测微生物的能力、存在漏检和误检等。针对四联活菌的微生物检测鉴定方法在单菌检测基础上，难度更高，现有方法缺陷集中体现在无法单次完成、扩增效率低下、假阳性率过高等，严重影响了多联活菌制剂中微生物的鉴定效率和结果的准确性。
目前常见的用于四联活菌制剂中微生物检测的引物序列包括：蜡样芽胞杆菌：bceT、entFM、hblA、hblC、hblD、cytK、hblA、nheA、nheB、nheC、ces、16S rRNA、gyrB等；粪肠球菌：gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yqiL；嗜酸乳杆菌：pheS、groEL、ileS、recA、recG、murC、murE；婴儿双歧杆菌：clpC、fusA、gyrB、ileS、purF、rplB、rpoB。
上述序列、引物可用于单菌株的测序，但是，不能混合使用，对双歧杆菌四联活菌制品中的四种微生态活菌同时展开检测，引物之间相互干扰严重。
发明内容
针对现有技术检测四联活菌制剂多条引物序列在同一反应体系中干扰严重的问题，本发明提供了一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用，实现多条引物、多个序列在同一反应体系中的互不干扰，同时检测微生态四联活菌制品中的4种微生物，简单、快速、准确，有利于产品的快速检验。
本发明通过以下技术方案实现：
一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合，包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组；
所述的针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因的上游引物glpF-F的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示，下游引物glpF-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针glpF-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述的针对蜡样芽孢杆菌的gmk基因的上游引物gmk-F的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示，下游引物gmk-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针gmk-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述的针对粪肠球菌的gdh基因的上游引物gdh-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，下游引物gdh-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针gdh-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
所述的针对粪肠球菌的gyd基因的上游引物gyd-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物gyd-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针gyd-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；
所述的针对嗜酸乳杆菌的pheS基因的上游引物pheS-F的核苷酸序列如SEQ IDNO. 13所示，下游引物pheS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针pheS-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；
所述的针对嗜酸乳杆菌的ileS基因的上游引物ileS-F的核苷酸序列如SEQ IDNO. 16所示，下游引物ileS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针ileS-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
所述的针对婴儿双歧杆菌的clpC基因的上游引物clpC-F的核苷酸序列如SEQ IDNO. 19所示，下游引物clpC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，探针clpC-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示；
所述的针对婴儿双歧杆菌的fusA基因的上游引物fusA的核苷酸序列如SEQ IDNO. 22所示，下游引物fusA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，探针fusA-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示。
一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，包括上述引物探针组合。
优选地，所述探针的核苷酸序列5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光猝灭基团。
优选地，不同微生物对应的探针上标记不同的荧光报告基团。
优选地，所述的试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照以及专属性对照，所述阳性对照为含有蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌4种菌株的混合菌体样品；所述阴性对照为DEPC水，所述专属性对照为同法测定的大肠埃希菌菌液。
进一步地，上述引物探针组合或上述试剂盒可应用于下列应用中的一种：
a）鉴定蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌中的至少一种菌株；
b）对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌至少一种菌株的进行单端Sanger测序。
优选地，所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合或检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定。
本发明中，还公开了上述对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定的方法，包括以下步骤：
（1）从待测样本中制备样本核酸；
（2）采用上述检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对样本核酸进行定量PCR扩增，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株。
优选地，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株的判定标准如下：
1）扩增曲线平直，无Ct值显示的样本，报告待测样本中核酸检测为阴性；
2）扩增曲线呈S型，Ct值≤35的样本，报告待测样本中核酸检测为阳性；
3）扩增曲线呈S型，Ct值35≤Ct值≤40，则对该部分待测样本进行复检，若复检结果Ct值仍为35≤Ct值≤40则判断样本为阴性，否则为阳性。
本发明中，单端Sanger测序判定标准为：将获得的细菌特征序列（查询序列，Query）与专用数据库（NCBI的核酸数据库nr/nt）进行比对，根据比对结果进行判定。结果评价关键参数按评价关键性次序排列包括：1）Evalue；2）Per.Ident；3）MaxScore以及4）QueryCover等，如同一个引物组合中的两个（含）以上位点（序列）测序结果中的Evalue最低值命中序列对应的ScientificName为目标物种，则认为鉴定有效，产品符合要求。特殊情况下：1）如多条命中序列的Evalue最低值相同，则取Per.Ident值较高的命中序列对应的ScientificName为鉴定结果；2）如多条命中序列的Evalue最低值以及Per.Ident最高值均相同，则取MaxScore值较高的命中序列对应的ScientificName为鉴定结果；3）如多条命中序列的Evalue最低值、Per.Ident最高值以及MaxScore最高值均相同，则取QueryCover值较高的命中序列对应的ScientificName为鉴定结果；4）以此类推。
本发明取得的有益效果为：
本发明提供了一种在种水平上鉴定微生态四联活菌制品中蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌四种微生物的保守基因引物探针组合，能够同时鉴定微生态四联活菌制品中四种微生物的种属关系，操作简单，耗时短，鉴定范围广，无需对样品中的细菌进行培养，能够直接对样品进行鉴定，快速省时，成本低，灵敏度高，有利于产品的快速检验。
附图说明
图1为蜡样芽胞杆菌glpF基因和gmk基因引物探针组合的荧光通道曲线；
图2为粪肠球菌gdh基因和gyd基因引物探针组合的荧光通道曲线；
图3为嗜酸乳杆菌pheS基因和ileS基因引物探针组合的荧光通道曲线；
图4为婴儿双歧杆菌clpC基因和fusA基因引物探针组合的荧光通道曲线；
图5为双歧杆菌四联活菌片四联活菌8种引物探针组合的荧光通道曲线；
图6 为大肠埃希菌及阴性对照荧光通道曲线。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合，具体包含分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组；
本发明中所述的针对蜡样芽孢杆菌glpF基因的上游引物glpF-F的核苷酸序列SEQID NO. 1：5' CGCCGAACTTGAAGCGCAGA 3'，下游引物glpF-R的核苷酸序列SEQ ID NO.2：5'GGCCTTTCTCGTACAGCGTCT 3'，探针glpF-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 3：5'GGCCTTTCTCGTACAGCGTCT 3'；
所述的针对蜡样芽孢杆菌gmk基因的上游引物gmk-F的核苷酸序列SEQ ID NO. 4：5' TGCTCCGCTCCATCGCAT 3'，下游引物gmk-R的核苷酸序列SEQ ID NO.5：5'AACCGTGCCTTGCCCTTG 3'，探针gmk-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 6：5'ATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA 3'；
所述的针对粪肠球菌gdh基因的上游引物gdh-F的核苷酸序列SEQ ID NO. 7：5'ACAATCTACGATTTCGAGACCCCT 3'，下游引物gdh-R的核苷酸序列SEQ ID NO.8：5'CGGAACCACGCGACTTCACC 3，探针gdh-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 9：5'CTCCTCCACCGTGTTGTCGCCGTC 3'；
所述的针对粪肠球菌gyd基因的上游引物gyd-F的核苷酸序列SEQ ID NO. 10：5'ACGCATGACCACGCAGGAC 3'，下游引物gyd-R的核苷酸序列SEQ ID NO.11：5'ACCTCGTCGGTCACATGGC 3'，探针gyd-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 12：5'ACCCCTTCGGCTTCATCGAGACCC 3'；
所述的针对嗜酸乳杆菌pheS基因的上游引物pheS-F的核苷酸序列SEQ ID NO.13：5' TCGTCGTCCAGCTGCCGAT 3'，下游引物pheS-R的核苷酸序列SEQ ID NO.14：5'CGCAGAGCACCGGATAAGCC 3'，探针pheS-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 15：5'TCCTGCTCCGAGAGGTCGCCGTT 3'；
所述的针对嗜酸乳杆菌ileS基因的上游引物ileS-F的核苷酸序列SEQ ID NO.16：5' CCGCCGAACTTGAAGCGCAGA 3'，下游引物ileS-R的核苷酸序列SEQ ID NO.17：5'CACGCGGTAGCCCTTGTATGCCAG 3'，探针ileS-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 18：5'CCTGCCGCGCCTCCGTGCTC 3'；
所述的针对婴儿双歧杆菌clpC基因的上游引物clpC-F的核苷酸序列SEQ ID NO.19：5' AATCCGACGTCCGTATGGT 3'，下游引物clpC-R的核苷酸序列SEQ ID NO.20：5'CGGGTCCTTGAGTCCCAC 3'，探针clpC-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 21：5'ACGGCCTCATCCTGACCGAT 3'；
所述的针对婴儿双歧杆菌fusA基因的上游引物fusA的核苷酸序列SEQ ID NO.22：5' GCACAGGAGTCCCCAGTCGAT 3'，下游引物fusA-R的核苷酸序列SEQ ID NO.23：5'TGCCACGCACAATGGAGTCA 3'，探针fusA-probe的核苷酸序列SEQ ID NO. 24：5'TTCCTCGCTCTCCGCCGCCTCCG 3'。
上述探针的核苷酸序列5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光猝灭基团，不同的探针上标记不同的荧光报告基团。
本发明中检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒除了包括上述引物探针组合物外，还包括阳性对照、阴性对照以及专属性对照，所述阳性对照为含有蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌4种菌株的混合菌体样品；所述阴性对照为DEPC水，所述专属性对照为同法测定的大肠埃希菌菌液。
实施例1 待测样本：双歧杆菌四联活菌片（思连康）
分别对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行鉴定；
（1）从待测样本中制备样本核酸；无菌称取3.0g双歧杆菌四联活菌片，加入27ml0.9%无菌氯化钠溶液，震荡混匀，作为模板进行PCR反应；
（2）分别采用检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒中对应的引物探针组合对双歧杆菌四联活菌片中的四种活菌蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行定量PCR扩增；
所述的PCR反应体系为：
。
*引物浓度均为10 μM
所述的PCR扩增的程序包括以下步骤：
变性：98℃，4min；
循环：40个循环（98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s）；
延伸：72℃，2min；
（3）双歧杆菌四联微生态活菌片中4种活菌蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌的荧光通道曲线分别如图1、图2、图3和图4所示，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株，鉴定标准为：
a）扩增曲线平直，无Ct值显示的样本，报告待测样本中核酸检测为阴性；
b）扩增曲线呈S型，Ct值≤35的样本，报告待测样本中核酸检测为阳性；
c）扩增曲线呈S型，Ct值35≤Ct值≤40，则对该部分待测样本进行复检，若复检结果Ct值仍为35≤Ct值≤40则判断样本为阴性，否则为阳性。
由图1~4可知，双歧杆菌四联活菌片中蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌的鉴定结果均为阳性，表明本发明中试剂盒能中相对应引物探针组合能够分别对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行鉴定。
实施例2 待测样本：双歧杆菌四联活菌片（思连康）
对双歧杆菌四联活菌片中的蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆四种菌株进行同时鉴定
（1）从待测样本中制备样本核酸；无菌称取3.0g双歧杆菌四联活菌片，加入27ml0.9%无菌氯化钠溶液，震荡混匀，作为模板进行PCR反应；
（2）采用检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对双歧杆菌四联活菌片中的四种活菌蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌同时进行定量PCR扩增；
所述的PCR反应体系为：
。
*单一引物探针浓度均为10 μM，等比例混合后取用
所述的PCR扩增的程序包括以下步骤：
变性：98℃，4min；
循环：40个循环（98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s）；
延伸：72℃，2min；
（3）对双歧杆菌四联微生态活菌片中4种活菌蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行同时鉴定时，其荧光通道曲线如图5所示，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株，鉴定标准为：
a）扩增曲线平直，无Ct值显示的样本，报告待测样本中核酸检测为阴性；
b）扩增曲线呈S型，Ct值≤35的样本，报告待测样本中核酸检测为阳性；
c）扩增曲线呈S型，Ct值35≤Ct值≤40，则对该部分待测样本进行复检，若复检结果Ct值仍为35≤Ct值≤40则判断样本为阴性，否则为阳性。
由图5可知，采用本发明中的试剂盒对双歧杆菌四联活菌片中蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行同时鉴定时，检测结果均为阳性，且有较好的区分度，表明本发明中试剂盒合能够对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌进行同时鉴定。
实施例3 专属性鉴定
（1）样本核酸为大肠埃希菌菌液和阴性对照DEPC水；
（2）采用检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对大肠埃希菌菌液和阴性对照进行定量PCR扩增；
PCR反应体系及PCR扩增的程序与实施例2相同，其荧光通道曲线如图6所示，由图6可知，本发明中的引物探针组合专属性好。
实施例4 单端Sanger测序（不使用探针）：
样品制备：无菌称取3.0g成品（双歧杆菌四联活菌片），加入27ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，振荡混匀，充分混匀后即为10-1稀释液，取10-1稀释液1ml至9ml0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，即为10-2稀释液，用相同方法10倍系列稀释至10-3和10-4稀释液，取10-3稀释液100μl，滴入BA琼脂平皿上，平行制备3份；取10-4稀释液100μl，分别滴入改良TPY琼脂培养基、改良MRS琼脂培养基、EC琼脂培养基平皿上，每种培养基平行制备3份，以无菌涂布棒涂匀。观察分析，进行多次菌株纯化，采用磁珠法提取完整基因组，作为核酸模板，进行PCR反应：
PCR反应体系：
。
所述单端Sanger测序PCR扩增程序包括以下步骤：
变性：98℃，4min；
循环：40个循环（98℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s）；
延伸：72℃，2min。
PCR产物纯化：采用ExoSAP-IT Express reagent纯化试剂，与上述PCR产物以2:5的比例进行反应，低速涡旋充分混匀，快速离心，将所有试剂离心至管底。PCR产物纯化的程序包括以下步骤：37℃，4min；80℃，1min；4℃保持。获得的产物作为下一步测序反应的模板。
测序模板制备：将BigDye Terminator Cycle Sequencing和引物完全融化并放置在冰上，振荡2～3s，短暂离心2～3s；按下表添加组分：
。
取扩增产物进行扩增子测序，测序结果进行BLAST检测分析，应与目标菌株一致。
Claims (9)
1.一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合，其特征在于，包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组；
所述的针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因的上游引物glpF-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物glpF-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针glpF-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；
所述的针对蜡样芽孢杆菌的gmk基因的上游引物gmk-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物gmk-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针gmk-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
所述的针对粪肠球菌的gdh基因的上游引物gdh-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，下游引物gdh-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针gdh-probe的核苷酸序列如SEQ IDNO. 9所示；
所述的针对粪肠球菌的gyd基因的上游引物gyd-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物gyd-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针gyd-probe的核苷酸序列如SEQID NO. 12所示；
所述的针对嗜酸乳杆菌的pheS基因的上游引物pheS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物pheS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针pheS-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；
所述的针对嗜酸乳杆菌的ileS基因的上游引物ileS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物ileS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针ileS-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
所述的针对婴儿双歧杆菌的clpC基因的上游引物clpC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物clpC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，探针clpC-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示；
所述的针对婴儿双歧杆菌的fusA基因的上游引物fusA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示，下游引物fusA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，探针fusA-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示。
2.一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
3.根据权利要求2所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光猝灭基团。
4.根据权利要求2所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，其特征在于，不同微生物对应的探针上标记不同的荧光报告基团。
5.根据权利要求2所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照以及专属性对照，所述阳性对照为含有蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌4种菌株的混合菌体样品；所述阴性对照为DEPC水，所述专属性对照为同法测定的大肠埃希菌菌液。
6.一种权利要求1所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合或权利要求2~5任一项所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒的应用，其特征在于，为下列应用中的一种：
a）鉴定蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌中的至少一种菌株；
b）对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌至少一种菌株的进行单端Sanger测序。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合或检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定。
8.一种对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）从待测样本中制备样本核酸；
（2）采用权利要求2~5任一项所述的检测双歧杆菌四联微生态活菌制品中4种活菌的试剂盒对样本核酸进行定量PCR扩增，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株。
9.根据权利要求8所述的对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定的方法，其特征在于，综合荧光通道曲线及Ct值判断待测样本是否含有目标菌株的判定标准如下：
1）扩增曲线平直，无Ct值显示的样本，报告待测样本中核酸检测为阴性；
2）扩增曲线呈S型，Ct值≤35的样本，报告待测样本中核酸检测为阳性；
3）扩增曲线呈S型，Ct值35≤Ct值≤40，则对该部分待测样本进行复检，若复检结果Ct值仍为35≤Ct值≤40则判断样本为阴性，否则为阳性。
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