CN110512017B - 鼠棒状杆菌荧光定量pcr检测试剂盒及引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；还提供了鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述引物对、SYBR Premix EX Taq、ROX和RNase Free ddH₂O。本发明采取SYBR GreenⅠ染料法，无需设计探针，可减少成本，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，为鼠棒状杆菌的早期诊断提供依据，能很好地应用于临床病料的检测。该试剂盒使用简单快捷、特异性好、灵敏度高，可将检测周期缩短至2天内。

Description

鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及引物

技术领域

本发明属于分子生物学技术检测领域，具体涉及一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及引物。

背景技术

鼠棒状杆菌，也称“库彻氏棒状杆菌”，是棒状杆菌属的革兰氏阳性杆菌，是一种人畜共患的病原菌。该病原体在多种实验动物宿主中感染，以大鼠和小鼠居多，偶有地鼠和豚鼠感染的报道。鼠棒状杆菌病多呈隐性感染，发病率和死亡率高，严重爆发可导致动物群覆没，因此鼠棒状杆菌是我国实验动物无特定病原体动物(Specific Pathogen Free,SPF)级大鼠与小鼠病原体控制的必检项目。

国家标准GB/T 14926.9-2001中规定实验动物鼠棒状杆菌的检测方法是细菌分离培养，是目前的主要检测方法，但由于该菌培养条件要求严苛，生长缓慢，易漏检。也先后有血清学诊断方法的报道，如微量凝剂试验、间接免疫荧光抗体法(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA) 等，该方法同样存在操作复杂、时间长、灵敏度低、特异性差，容易造成漏检等问题。

实时荧光定量PCR(qPCR)是在常规PCR基础上发展起来的核酸定量技术。它通过加入相应的荧光染料或荧光标记的探针来完成定量功能。该方法指通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，该方法特异性强、敏感度高、减少了假阳性现象的出现，且该技术为完全闭管式操作，不仅避免了常规PCR开盖引起的产物污染问题，无需后续的琼脂糖凝胶电泳鉴定，减少了一定程度的环境污染。该技术现已在基础科学研究、转基因产品和食品安全检测、医学诊断、药物研发、海关检验检疫等科研和实践领域得到广泛应用。

目前根据所用荧光物质的化学原理和PCR检测的特异性，可将实时荧光定量PCR分为两类，第1类为DNA染料法，例如SYBR Green I和Eva Green，对特异性和非特异性的PCR扩增产物进行检测；第2类是荧光探针法，将荧光素与寡聚核苷酸相连，对特异性的PCR产物进行检测，荧光探针法又可根据加入PCR反应的荧光分子的类型分为：引物/探针法、探针法(包括水解探针和杂交探针)和核酸类似物法三种。

就DNA染料法而言，目前有多种双链DNA结合染料可用于实时荧光定量PCR，包括EB、SYBR Green Ⅰ、SYBR Gold、EvaGreen等。其中最常用的是SYBR Green Ⅰ，这种DNA 染料吸收蓝光(λmax＝497nm)、发射绿光(λmax＝520nm)，对DNA双链具有高亲和力。当它结合到双链DNA小沟部位时，会发出很强的荧光，在qPCR延伸阶段能够被检测到，具有较强的敏感性，并且不需要因模板不同而进行特别定制，操作简易，相对于荧光探针类来说价格较低，因此被广泛应用。但是在qPCR扩增过程中，非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合产生荧光信号，这种染料与双链DNA结合非特异性的特点会造成假阳性，从而影响定量的准确性，因此其特异性不如探针法。针对这一问题，需要用熔解曲线(melting curve)鉴定扩增产物的特异性。熔解曲线分析是将样品从50℃升高至95℃，并监测这一过程荧光信号的变化。到达DNA变性温度时，染料分解导致荧光信号剧烈下降，非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比特异性产物低，故可以通过熔解曲线进行鉴别。此外，注重实验细节如合理设计引物和设定对照也有助于消除非特异性荧光。

唐连飞等(2012年)在“鼠棒状杆菌PCR检测方法的建立及其应用”中公开了采用PCR 技术，根据GenBank发表的鼠棒状杆菌16S rRNA基因，设计了特异性引物，建立了准确、快速检测鼠棒状杆菌PCR方法，该方法检测低限为1x10²拷贝/反应，且对小鼠沙门菌、肺炎链球菌和巴氏杆菌无交叉反应。但该方法判定结果需要电泳，操作繁琐，且引物序列经blast 后发现特异性较差，可比对到谷氨酸棒杆菌、结核分枝杆菌等多种细菌。目前现有的qPCR 检测鼠棒状杆菌的试剂种类较少，仍存在一些不足之处，如敏感性低，特异性差等问题。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种特异性好、灵敏度高、快速简单的鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物：包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种用于检测鼠棒状杆菌的产品。

优选地，所述产品包括上述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物。

本发明还提供了一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒。

优选地，所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒包括上述鼠棒状杆菌荧光定量PCR 检测引物。

优选地，所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒还包括SYBR Premix EX Taq、ROX 和RNase Free ddH₂O。

进一步优选地，所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒还包括正向引物20μM、反向引物20μM、SYBR Premix EX Taq 2×和ROX 50×。

优选地，所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒还包括阳性参照，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火延伸31s，且循环35次。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的引物对根据鼠棒状杆菌gyrB(gyrase subunit B)基因保守区域设计合成，经验证具有高度特异性。

(2)本发明采取SYBR Green Ⅰ染料法，无需设计探针，可减少成本，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，为鼠棒状杆菌的早期诊断提供依据，能很好地应用于临床病料的检测。该试剂盒使用简单快捷、特异性好、灵敏度高，可将检测周期缩短至2天内。

附图说明

图1是本发明引物及试剂盒的特异性检测扩增曲线；

图2是本发明引物及试剂盒的特异性检测溶解曲线；

图3是本发明引物及试剂盒的重复性检测的扩增曲线；

图4是本发明引物及试剂盒的重复性检测的溶解曲线。

具体实施方式

以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。

实施例1鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物

本发明根据鼠棒状杆菌gyrB(gyrase subunit B)基因保守区域设计合成引物：

正向引物的核苷酸序列(如SE QID NO:1所示)为：5’-GCGGAGGATATTGATCTTGCC-3’；

反向引物的核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示)为：5’-TGCACGCTCTGGGAATAAC-3’；

扩增片段大小为272bp；

位置：1765620-1765891。

实施例2鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及荧光定量PCR反应条件

反应体系为20μL，含SYBR Premix Ex Taq 2×(Takara，RR420A)10μL、ROX 50×(Takara)0.4μL、正向引物20μM 0.2μL(苏州金唯智生物科技有限公司)、反向引物20 μM0.2μL(苏州金唯智生物科技有限公司)、DNA模板5μL、RNase Free ddH₂O 4.2μL(天根生化科技有限公司)。

PCR反应条件如下：

采用ABI 7500Real Time PCR System PCR仪进行反应，95℃预变性30s，95℃变性5s， 60℃退火延伸31s，采集信号，进行35个循环，收集溶解曲线。

实施例3特异性检测

常见细菌标准菌株DNA提取：

标准菌株鼠棒状杆菌、大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森、支气管鲍特杆菌、乙型溶血性链球菌、白喉杆菌、杰氏棒杆菌等11种菌株，来源见表1，均-70℃保存，常规方法提取菌株基因组DNA。

以提取的11株标准菌株基因组DNA进行PCR扩增，检验实施例2试剂盒的特异性。结果如表1所示，本发明引物对鼠棒状杆菌有较好的特异性，T_m值为82.0±0.5℃且溶解峰单一；其他病原菌的核酸检测均无阳性结果。扩增曲线与溶解曲线分别为图1和图2。

表1鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒的特异性

注：“-”代表阴性；“+”代表阳性。

对比实施例3

为了进一步验证本发明引物对对鼠棒状杆菌有较好的特异性，发明人针对鼠棒状杆菌 gyrB(gyrase subunit B)基因保守区域设计合成了2条对比引物对。

对比引物对1：

正向引物的核苷酸序列为：5’-TCCGAGCTCTATATCGT-3’；

反向引物的核苷酸序列为：5’-GCTTTTTCCACATTGAGG-3’；

位置：1765053-1765168。

对比引物对2

正向引物的核苷酸序列为：5’-GGTCTGCACGGTGTGGGT-3’；

反向引物的核苷酸序列为：5’-TCAGGCCAAAAACGCTG-3’；

位置：1766034-1766206。

按照实施例2的方法制备鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，利用实施例3的特异性检测方法，验证包含对比引物对1和对比引物对2的试剂盒的特异性。结果如表2和表3所示，对比引物对1和对比引物对2方法特异性较差；对比引物对1对鼠棒状杆菌、白喉杆菌的核酸检测均为阳性结果；对比引物对2同样除检测鼠棒状杆菌为阳性外，杰氏棒杆菌的核酸检测也为阳性结果；进一步证明了本发明特定的引物对对鼠棒状杆菌有较好的特异性。

表2对比引物对1鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒的特异性

注：“-”代表阴性；“+”代表阳性。

表3对比引物对2鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒的特异性

注：“-”代表阴性；“+”代表阳性。

实施例4：敏感性检测

以鼠棒状杆菌标准菌株核酸为模板，做系列梯度稀释，进行荧光定量PCR检测，检测下限为94个菌/5μL。

同时将PCR扩增目的片段合成重组质粒以作为阳性参照，梯度稀释后检测PCR试剂盒的最低拷贝数。重组质粒序列如SEQ ID No:3所示。

测定提取质粒的浓度，计算每微升质粒中的拷贝数。将质粒稀释10^-4-10^-10，使其在5μL 中分别含有3.1×10⁶、3.1×10⁵、3.1×10⁴、3.1×10³、3.1×10²、3.1×10¹、3.1拷贝数，PCR检测最低检测下限为31拷贝数，T_m值为82.0±0.5℃且溶解峰单一，结果见表4。

表4敏感性检测

稀释倍数	Ct值	拷贝数
			10<sup>-4</sup>	15.1	3.1×10<sup>6</sup>
10<sup>-5</sup>	18.7	3.1×10<sup>5</sup>
			10<sup>-6</sup>	22.2	3.1×10<sup>4</sup>
10<sup>-7</sup>	25.6	3.1×10<sup>3</sup>
			10<sup>-8</sup>	28.9	3.1×10<sup>2</sup>
10<sup>-9</sup>	32.1	3.1×10<sup>1</sup>
			10<sup>-10</sup>	N	3.1

实施例5重复性检测

将3.1×10⁶copies/reaction、3.1×10⁵copies/reaction、3.1×10⁴copies/reaction、3.1×10³ copies/reaction、3.1×10²copies/reaction、3.1×10¹copies/reaction、3.1copies/reaction的重组质粒标记为S1-S7，分别重复3次检测，检测本发明试剂盒的准确性和稳定性。

结果显示，3次重复荧光定量PCR检测均可检出上述梯度浓度的重组质粒，Ct(threshold cycle)值组内重复测定相对标准偏差(relativestandard deviation，RSD)值在0.51％-1.57％之间，在可接受范围内，说明本试剂盒重复性好、稳定性高。扩增曲线见图3，溶解曲线见图4。

实施例6临床样本培养菌的检测

无菌环境下采集来源于不同机构的32只SPF小鼠上呼吸道分泌物拭子接种于血琼脂平皿36±1℃培养24-48h，刮取平皿菌落混匀于1ml的无菌水中，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根，DP302)提取核酸，DNA用TE洗脱，-20℃保存待用。

将32份DNA分别用本发明的荧光定量PCR试剂盒进行检测，以S4与S5作为阳性对照，本发明对临床样本检测检测结果均为阴性，S4与S5为阳性，阳性对照T_m值为82.0±0.5℃且溶解峰单一，表明方法检测的有效性。本发明无需电泳，PCR完成后可直接判读结果，比唐连飞方法更简便、快捷。

同时，对对比实施例3中分别包含对比引物对1和对比引物对2的试剂盒进行敏感性和重复性检测发现，二种含对比引物对的试剂盒的重复性和稳定性较差。按照实验例6的方法，分别用对比实施例3的含对比引物对1的试剂盒和含对比引物对2的试剂盒进行检测，发现，含对比引物的试剂盒的临床样本检测结果中有30份为阴性，2份为阳性，S4为阳性，S5为阴性，表明其方法检测的准确性较差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州西山生物技术有限公司

<120> 鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及引物

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggaggata ttgatcttgc c 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcacgctct gggaataac 19

<210> 3

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggaggata ttgatcttgc cgagggagtt tcccttgatc agctagatac tgacgctgat 60

gcagtagctg cgacggctac taagaattcg ggtaagaaga aagaaaagaa aaagactttc 120

ttttatccca atggcttaga agattatgtg gcgcatttga atcgttctaa gactaccatt 180

catccttcca ttattgcctt tgaagcaaaa ggacaggatc atgaggtaga aatcgctatg 240

caatggaatt ctggttattc ccagagcgtg ca 272

Claims (3)

1.一种鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物；所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

扩增片段大小为272bp；

还包括SYBR Premix Ex Taq 2×10μL、ROX 50×0.4μL、正向引物20μM 0.2μL、反向引物20μM 0.2μL、DNA模板5μL、RNase Free ddH₂O 4.2μL；

所述鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒反应条件为：

采用ABI 7500 Real Time PCR System PCR仪进行反应，95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸31s，采集信号，进行35个循环，收集熔 解曲线。

2.根据权利要求1所述的鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性参照。

3.根据权利要求2所述的鼠棒状杆菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性参照的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

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