CN107604085B

CN107604085B - 微小脲原体的lamp检测引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN107604085B
Application number: CN201711090985.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡慧娜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN107604085A

Abstract

本发明公开了微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法，LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。本发明的技术(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增无需PCR仪等特殊设备；(2)检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内。(3)高特异性：检测引物组的特异性引物，只能有效扩增微小脲原体，不能有效扩增解脲脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体。(4)高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝。(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。

Description

微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及微小脲原体的快速检测，具体是一种微小脲原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

支原体是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，包括支原体和脲原体等多种类型，因为缺乏细胞壁而对青霉素、头孢类等抗生素天然耐药。脲原体中的解脲脲原体与微小脲原体旧时统称为解脲支原体，均能够引起人类疾病和导致实验室细胞污染，但两者所致感染的类型和具体临床表现却有所差异。微小脲原体和解脲脲原体是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，两者均可引起男性的非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎和女性的子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等疾病。

目前微小脲原体检测的方法主要有培养法、免疫法和PCR法等，其中培养法的特异性和敏感性都很好，但该方法所耗费的时间却较长，通常需要48h才能出结果。免疫法虽然操作简便和耗时较少，但其特异性和敏感性却不高。PCR法的敏感性很高，而且检测所需的时间也很短，但目前常用的PCR法却存在依赖特殊设备和不能实现POCT等不足。尤为重要的是，此前绝大多数微小脲原体核酸扩增方法都以mba基因、ure基因、16S rRNA基因或16S-23S rRNA间隔序列作为靶序列，由于上述核酸序列在各种脲原体(特别是微小脲原体和解脲脲原体)之间差异较小或同种脲原体临床株间多态性较大，因此该类方法通常需要采用多重引物或多次试验才能准确地检测临床标本中的微小脲原体。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是本世纪初问世的一种新的核酸扩增技术，该技术进行核酸扩增时无需变换温度，在等温条件下即可完成整个扩增反应，而且最终的结果判断可通过肉眼观察颜色变化即可实现，因此LAMP不需要能够精确控温和进行荧光监测的PCR仪等特殊设备。因为LAMP能够弥补PCR法某些方面的不足，所以该技术在水产病害检测、动物源性检测、转基因农产品检测、公共卫生检疫检测和医学病原体检测等众多领域得到了应用，但目前在微小脲原体检测方面LAMP尚未得到应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微小脲原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种微小脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：

外引物F3:5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’；

外引物B3:5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’；

内引物FIP:5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGG AAGGAA-3’；

内引物BIP:5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTG TT-3’；

环引物LF:5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’；

环引物LB:5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’。

作为上述LAMP检测引物组的进一步改进，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

一种微小脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、Bst DNA聚合酶、指示剂、密封液，引物为上述的LAMP检测引物组。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO₄和甜菜碱。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，指示剂为荧光染料或显色剂。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，荧光染料为SYBR green，显色剂为羟基萘酚蓝。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，Bst DNA聚合酶的终浓度为6～10U/μL。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，外引物、内引物和环引物的初始浓度均为10μM。

一种微小脲原体LAMP检测试剂盒检测微小脲原体的方法，包括如下步骤：

1)提取待检样品DNA；

2)使用权利要求3～9任一项所述的LAMP检测试剂盒扩增样品DNA，反应条件为63℃等温反应60min进行扩增，然后90℃等温反应2min终止反应；

3)根据指示剂的指示情况，判断结果；

该方法不用于疾病的诊断。

本发明的有益效果是：

(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增无需PCR仪等特殊设备；

(2)检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内。

(3)高特异性：检测引物组包括六条特异性引物，只能有效扩增微小脲原体，不能有效扩增解脲脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体。

(4)高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝。

(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。

附图说明

图1是靶基因特异性扩增电泳图；

图2是特异性分析荧光曲线图；

图3是特异性分析肉眼观察图；

图4是灵敏性分析荧光曲线图；

图5是灵敏性分析肉眼观察图；

图6是临床标本检测荧光曲线图；

图7是临床标本检测肉眼观察图。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员需要理解的是，所描述的实例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，在无创造性劳动前提下对本发明方法、步骤或条件的修改或替换，都属于本发明保护的范围。

引物设计

发明人通过查询并使用独有方法优化，得到针对微小脲原体特有核酸序列UP063的LAMP引物组如下：

外引物F3:5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’(SEQ ID NO：1)；

外引物B3:5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’(SEQ ID NO：2)；

内引物FIP:5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGG AAGGAA-3’(SEQ IDNO：3)；

内引物BIP:5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTG TT-3’(SEQ ID NO：4)；

环引物LF:5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’(SEQ ID NO：5)；

环引物LB:5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’(SEQ ID NO：6)。

常规方法设计的引物作为对比，用于验证微小脲原体特有基因序列的比较试验包括以下扩增引物：

063F：5’-TGCGGTGTTTGTGAACT-3’(SEQ ID NO：7)；

063R：5’-TGATCAAACTGATATCGCAATTATAGA-3’(SEQ ID NO：8)；

UPF：5’-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3’(SEQ ID NO：9)；

UPR：5’-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3’(SEQ ID NO：10)；

应用上述两对引物分别检测微小脲原体、解脲脲原体和人型支原体等支原体临床株的两种靶基因(即UP063和mba基因)，比较两种靶基因扩增阳性结果并分析其正确率，正确率越高，表示该靶基因扩增检测微小脲原体的特异性越高，也表明该靶基因更适合被用于临床标本中微小脲原体的检测。

检测结果如图1所示，图中从左至右泳道分别为：L1：DNAmarker；L2：菌株1UP063基因扩增产物；L3：菌株1mba基因扩增产物；L4：菌株2UP063基因扩增产物；L5：菌株2mba基因扩增产物；L6：菌株3UP063基因扩增产物；L7：菌株3mba基因扩增产物；L8：菌株4UP063基因扩增产物；L9：菌株4mba基因扩增产物；L10：菌株5UP063基因扩增产物；L11：菌株5mba基因扩增产物；L12：DNAmarker。菌株1、2、3和5为微小脲原体临床株；菌株4为解脲脲原体临床株。从图1中可以清楚的看出，只有微小脲原体能成功扩增UP063基因，而微小脲原体和解脲脲原体都能成功扩增mba基因，因此在检测微小脲原体时，UP063基因作为扩增靶基因比mba基因的特异性更高。

体系建立

设置不同浓度的引物终浓度(反应体系中各引物的摩尔比始终保持不变)分别在不同温度条件下(60℃、63℃、65℃)对同一份模板进行等温扩增，应用荧光定量PCR仪监测荧光变化和分析扩增曲线，以能够获得最小Ct值的引物终浓度和反应温度作为本发明的最终反应条件。

试验结构显示：反应温度为60℃、63℃、65℃时的Ct值分别为35.1、34.5和34.8，内引物终浓度为1μM、2μM和3μM时的Ct值分别为36.2、34.7和35.3，故最后选择63℃反应温度和2μM内引物浓度作为本发明的最终反应条件。

分析特异性评价

选取人体泌尿生殖道常见的病原体和定植菌作为检测对象来评价分析特异性，具体包括解脲脲原体、人型支原体、沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等12种微生物。

实验结果如图2和图3所示，图2是特异性分析荧光曲线图，从左至右两条S型曲线分别为阳性质控物和微小脲原体临床株的扩增曲线；图3是特异性分析肉眼观察图。从左至右PCR反应管扩增的病原体分别为：解脲脲原体、人型支原体、微小脲原体、沙眼衣原体、淋球菌、白色念珠菌、单纯疱疹病毒和阴性质控物。结果显示(附图2、3)，本发明引物对上述干扰微生物无扩增效果，因此本发明检测试剂盒具有很好的分析特异性。

分析灵敏性评价

应用已连接靶基因的质粒制备10⁰～10⁷copies/μL浓度的模板，每种浓度均取1μL进行LAMP检测，分别通过肉眼观察颜色变化和荧光PCR仪监测分析荧光进行结果判读，以荧光分析判读方法的最低检测量作为检测下限。

实验结果如图4和图5所示。图4是灵敏性分析荧光曲线图。从左至右三条S型曲线分别为10³copies/μL、10²copies/μL、10copies/μL浓度模板的扩增曲线。图5是灵敏性分析肉眼观察图。从左至右PCR反应管扩增的模板浓度分别为：10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL和1copies/μL。结果显示本发明检测试剂盒检测微小脲原体的下限为100个拷贝，因此本发明具有很好的分析灵敏性。

临床标本检测

1、试剂准备

(1)引物、反应液、Bst DNA聚合酶、荧光染料、显色剂、去核酸水、石蜡油、阴性对照、阳性对照，取相应量的各种成分混匀(具体加入量见下表)，瞬时离心后4℃下保存备用。

组分名称	加入量(μL)	组分名称	加入量(μL)
				反应液	10	Bst DNA聚合酶	0.8
内引物	4	荧光染料/显色剂	0.4
				外引物	0.5	样品DNA	2
环引物	2	加水补齐至	20

2、样本制备

(1)取拭子标本在1mL生理盐水中进行洗脱，或取培养细胞标本1mL；

(2)13000rpm离心5min，然后去掉上清，加入1mL生理盐水并震荡混匀；

(3)13000rpm离心5min，然后去掉上清，加入50μL生理盐水并震荡混匀；

(4)100℃煮沸裂解10min后，13000rpm离心5min备用。

3、样本加入

取2μL模板加入已有各种反应成分的PCR管中并混匀，标记好后瞬时离心；如果采用肉眼观察法，此时再将显色剂加在管盖内面中心处，切勿再离心。

4、等温扩增

(1)荧光分析法：将PCR反应管放入荧光定量PCR仪的样本架上，在分析软件中根据放置顺序编制样本名称和阴阳性对照；设置扩增条件为：63℃反应60min、90℃反应2min、25℃冷却1min，荧光检测通道选择FAM通道；应用荧光定量PCR仪监测和分析荧光信号，样本扩增曲线呈S型，且信号值高于阈值才判定为阳性，无扩增曲线或扩增曲线平直均判定为阴性，只有在阴阳性对照结果符合的前提下才能进行样本结果判读；

(2)肉眼观察法：将PCR反应管放入干浴锅中63℃反应60min，然后升至90℃反应2min，冷却后瞬时离心；肉眼观察结果，深蓝色为扩增阴性，浅蓝色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。

5、结果分析

图6是临床标本检测荧光曲线图，共检测13份泌尿生殖道拭子标本，其中3份标本微小脲原体检测阳性。图7是临床标本检测肉眼观察图，共检测13份泌尿生殖道拭子标本，其中3份标本微小脲原体检测阳性。下排最右边的两个PCR反应管分别为阳性和阴性质控物扩增管。。从图中可以看出，13份标本中有3份标本的微小脲原体检测结果为阳性(图6中出现典型的S型扩增曲线，图7中扩增管颜色为淡蓝色)，这与培养的结果完全一致，说明本发明具有很好的临床性能。

序列表

<110> 蔡慧娜

<120> 微小脲原体的LAMP检测引物组、试剂盒及方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctggtcctt tattcacctt a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcaatgtga taatatggcc cc 22

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtgccatca tcagtgttat cattaacgac gaattaggaa ggaa 44

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggctgaaat gggttatttt gtaaacttca ttgcggtgtt 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aattgcgata tcagtttgat c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatactgatt gaagagttca ca 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcggtgttt gtgaact 17

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgatcaaact gatatcgcaa ttataga 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtatttgcaa tctttatatg ttttcg 26

Claims

1.一种微小脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：

外引物F3：5’-GCTGGTCCTTTATTCACCTTA-3’；

外引物B3：5’-GGCAATGTGATAATATGGCCCC-3’；

内引物FIP：5’-GGTGCCATCATCAGTGTTATCATTAACGACGAATTAGGAAGGAA-3’；

内引物BIP：5’-TGGCTGAAATGGGTTATTTTGTAAACTTCATTGCGGTGTT-3’；

环引物LF：5’-AATTGCGATATCAGTTTGATC-3’；

环引物LB：5’-AATACTGATTGAAGAGTTCACA-3’；

其中，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

2.一种微小脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、Bst DNA聚合酶、指示剂、密封液，其特征在于：引物为权利要求1所述的LAMP检测引物组。

3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO₄和甜菜碱。

4.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：指示剂为荧光染料或显色剂。

5.根据权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：荧光染料为SYBR green，显色剂为羟基萘酚蓝。

6.根据权利要求2～5任一项所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：密封液为石蜡油。

7.根据权利要求2～5任一项所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：Bst DNA聚合酶的终浓度为6～10U/μL。

8.根据权利要求2～5任一项所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：外引物、内引物和环引物的初始浓度均为10μM。

9.一种微小脲原体LAMP检测试剂盒检测微小脲原体的方法，包括如下步骤：

1)提取待检样品DNA；

2)使用权利要求2～8任一项所述的LAMP检测试剂盒扩增样品DNA，反应条件为63℃等温反应60min进行扩增，然后90℃等温反应2min终止反应；

3)根据指示剂的指示情况，判断结果；

该方法不用于疾病的诊断。