CN107557456B

CN107557456B - 解脲脲原体的lamp检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN107557456B
Application number: CN201710908465.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡慧娜; 王勇
Original assignee: Guangzhou Hongxiang Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Hongxiang Biomedical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107557456A

Abstract

本发明公开了解脲脲原体的LAMP检测引物组及试剂盒，引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。引物组和试剂盒具有操作简便、检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内；高特异性：只能有效扩增解脲脲原体，不能有效扩增微小脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体；高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝/μL；避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染的优点。

Description

解脲脲原体的LAMP检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种解脲脲原体的LAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术

支原体是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，包括支原体和脲原体等多种类型，因为缺乏细胞壁而对青霉素、头孢类等抗生素天然耐药。脲原体中的解脲脲原体与微小脲原体旧时统称为解脲支原体，均能够引起人类疾病和导致实验室细胞污染，但两者所致感染的类型和具体临床表现却有所差异。解脲脲原体和微小脲原体是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，两者均可引起男性的非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎和女性的子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等疾病，其中解脲脲原体还可引起女性不孕、绒膜羊膜炎、先天性肺炎和新生儿肺炎等疾病。

目前解脲脲原体检测的方法主要有培养法、免疫法和PCR法等，其中培养法的特异性和敏感性都很好，但该方法所耗费的时间却较长，通常需要48h才能出结果。免疫法虽然操作简便和耗时较少，但其特异性和敏感性却不高。PCR法的敏感性很高，而且检测所需的时间也很短，但目前常用的PCR法却存在依赖特殊设备和不能实现POCT等不足。尤为重要的是，此前绝大多数解脲脲原体核酸扩增方法都以mba基因、ure基因、16S rRNA基因或16S-23S rRNA间隔序列作为靶序列，由于上述核酸序列在各种脲原体(特别是解脲脲原体和微小脲原体)之间差异较小或同种脲原体临床株间的多态性较大，因此该类方法通常需要采用多重引物或多次试验才能准确地检测临床标本中的解脲脲原体。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是本世纪初问世的一种新的核酸扩增技术，该技术进行核酸扩增时无需变换温度，在等温条件下即可完成整个扩增反应，而且最终的结果判断可通过肉眼观察颜色变化即可实现，因此LAMP不需要能够精确控温和进行荧光监测的PCR仪等特殊设备。因为LAMP能够弥补PCR法某些方面的不足，所以该技术在水产病害检测、动物源性检测、转基因农产品检测、公共卫生检疫检测和医学病原体检测等众多领域得到了应用，但目前在解脲脲原体检测方面LAMP尚未得到应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种解脲脲原体的LAMP检测引物组、检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种解脲脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：

外引物F3:5’-TCTCTAACTTCTGGTAATCAGA-3’

外引物B3:5’-TTGTTAGATATCGTCAAGGTGT-3’

内引物FIP:5’-CCTGATTTACCACCTCCCACAGTTCGCTGGCTCATTATCT T-3’

内引物BIP:5’-TCCAACATTATTAGTGTTCGCTTCCAACACAAGAACACG AG-3’

环引物LF:5’-CTTCATTTGGAAATCAGCATGA-3’

环引物LB:5’-AATAGCTGAACCACCGTTAT-3’。

作为上述外LAMP检测引物组的进一步改进，引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、Bst DNA聚合酶、荧光染料或显色剂、密封液、去核酸水，引物为上述的LAMP检测引物组。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO₄和甜菜碱。更进一步的，反应液中，dNTP的浓度为1.6mM，MgSO4的浓度为8mM，甜菜碱的浓度为1mM。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，荧光染料为SYBR green，显色剂为羟基萘酚蓝HNB。

作为上述LAMP检测试剂盒的进一步改进，密封液为石蜡油。

本发明的有益效果是：

(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增无需PCR仪等特殊设备；

(2)检测快速：DNA提取只需30min，等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内；

(3)高特异性：检测引物组包括六条特异性引物，只能有效扩增解脲脲原体，不能有效扩增微小脲原体、人型支原体和衣原体等其它病原体；

(4)高灵敏性：能检测出的最低值为100个拷贝；

(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。

附图说明

图1是靶基因特异性扩增电泳图；从左至右泳道分别为：L1：DNAmarker；L2：菌株1UUR10_0680基因扩增产物；L3：菌株1mba基因扩增产物；L4：菌株2UUR10_0680基因扩增产物；L5：菌株2mba基因扩增产物；L6：菌株3UUR10_0680基因扩增产物；L7：菌株3mba基因扩增产物；L8：DNAmarker；菌株1和2为解脲脲原体临床株；菌株3为微小脲原体临床株；

图2是特异性分析荧光曲线图；从左至右三条S型曲线分别为解脲脲原体标准株、解脲脲原体临床株和阳性质控物的扩增曲线；

图3是特异性分析肉眼观察图；从左至右PCR反应管扩增的病原体分别为：解脲脲原体标准株、解脲脲原体临床株、微小脲原体、人型支原体、沙眼衣原体、淋球菌、阴性质控物和阳性质控物；

图4是灵敏性分析荧光曲线图；从左至右三条S型曲线分别为10⁶copies/μL、10⁴copies/μL、10²copies/μL浓度模板的扩增曲线；

图5是灵敏性分析肉眼观察图；从左至右PCR反应管扩增的模板浓度分别为：10⁶copies/μL、10⁴copies/μL、10²copies/μL和1copies/μL；

图6是临床标本检测荧光曲线图；共检测13份泌尿生殖道拭子标本，其中2份标本解脲脲原体检测阳性；

图7是临床标本检测肉眼观察图；共检测13份泌尿生殖道拭子标本，其中2份标本解脲脲原体检测阳性。下排最右边的两个PCR反应管分别为阳性和阴性质控物扩增管。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但所描述的实例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，在无创造性劳动前提下对本发明方法、步骤或条件的修改或替换，都属于本发明保护的范围。

引物设计：

解脲脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，发现人在现有LAMP引物设计的基础上，对得到的引物进行人工优化，得到的核酸序列分别如下所示：

外引物F3:5’-TCTCTAACTTCTGGTAATCAGA-3’(SEQ ID NO：1)

外引物B3:5’-TTGTTAGATATCGTCAAGGTGT-3’(SEQ ID NO：2)

内引物FIP:5’-CCTGATTTACCACCTCCCACAGTTCGCTGGCTCATTATCT T-3’(SEQ ID NO：3)

内引物BIP:5’-TCCAACATTATTAGTGTTCGCTTCCAACACAAGAACACG AG-3’(SEQ ID NO：4)

环引物LF:5’-CTTCATTTGGAAATCAGCATGA-3’(SEQ ID NO：5)

环引物LB:5’-AATAGCTGAACCACCGTTAT-3’(SEQ ID NO：6)。

直接使用常规引物设计软件设计的引物如下：

0680F：5’-GGATTTGTTAGATATCGTCAAGG-3’(SEQ ID NO：7)

0680R：5’-TCATCTTTTAAAGCTCCACATTATTAGT-3’(SEQ ID NO：8)

UPF：5’-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3’(SEQ ID NO：9)

UPR：5’-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3’(SEQ ID NO：10)

应用上述两对引物分别检测解脲脲原体、微小脲原体和人型支原体等支原体临床株的两种靶基因(即UUR10_0680和mba基因)，比较两种靶基因扩增阳性结果并分析其正确率，正确率越高表示该靶基因扩增检测解脲脲原体的特异性越高，也表明该靶基因更适合被用于临床标本中解脲脲原体的检测。如图1所示，只有解脲脲原体能成功扩增出UUR10_0680基因，而解脲脲原体和微小脲原体都能成功扩增出mba基因，因此在检测解脲脲原体时，UUR10_0680基因作为扩增靶基因比mba基因的特异性更高。

体系建立

设置不同浓度的引物终浓度(反应体系中各引物的摩尔比始终保持不变)分别在不同温度条件下(60℃、63℃、65℃)对同一份模板进行等温扩增，应用荧光定量PCR仪监测荧光变化和分析扩增曲线，以能够获得最小Ct值的引物终浓度和反应温度作为本发明的最终反应条件。

分析特异性评价

选取人体泌尿生殖道常见的病原体和定植菌作为检测对象来评价分析特异性，具体包括微小脲原体、人型支原体、沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等12种微生物。结果显示(附图2、3)，本发明对上述微生物均未能检出，因此本发明具有很好的分析特异性。

分析灵敏性评价

应用已连接靶基因的质粒制备10⁰～10⁷copies/μL浓度的模板，每种浓度均取1μL进行LAMP检测，分别通过肉眼观察颜色变化和荧光PCR仪监测分析荧光进行结果判读，以荧光分析判读方法的最低检测量作为检测下限。结果显示(如图4、5)，本发明检测解脲脲原体的下限为100个拷贝，因此本发明具有很好的分析灵敏性。

临床标本检测

1、试剂准备

(1)引物、反应液、Bst DNA聚合酶、荧光染料、显色剂、去核酸水、石蜡油、阴性对照、阳性对照，取相应量的各种成分混匀(具体加入量见下表)，瞬时离心后4℃下保存备用。

2、样本制备

(1)取拭子标本在1mL生理盐水中进行洗脱，或取培养细胞标本1mL；

(2)13000rpm离心5min，然后去掉上清，加入1mL生理盐水并震荡混匀；

(3)13000rpm离心5min，然后去掉上清，加入50μL生理盐水并震荡混匀；

(4)100℃煮沸裂解10min后，13000rpm离心5min备用。

3、样本加入

取2μL模板加入已有各种反应成分的PCR管中并混匀，标记好后瞬时离心；如果采用肉眼观察法，此时再将显色剂加在管盖内面中心处，切勿再离心。

4、等温扩增

(1)荧光分析法：将PCR反应管放入荧光定量PCR仪的样本架上，在分析软件中根据放置顺序编制样本名称和阴阳性对照；设置扩增条件为：63℃反应60min、90℃反应2min、25℃冷却1min，荧光检测通道选择FAM通道；应用荧光定量PCR仪监测和分析荧光信号，样本扩增曲线呈S型，且信号值高于阈值才判定为阳性，无扩增曲线或扩增曲线平直均判定为阴性，只有在阴阳性对照结果符合的前提下才能进行样本结果判读；

(2)肉眼观察法：将PCR反应管放入干浴锅中63℃反应60min，然后升至90℃反应2min，冷却后瞬时离心；肉眼观察结果，紫兰色为扩增阴性，淡蓝色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果。

图6是临床标本检测荧光曲线图，图7是临床标本检测肉眼观察图。从图中可以看出，13份标本中有2份标本的检测结果为阳性(图6中出现典型的S型扩增曲线，图7中扩增管颜色为淡蓝色)，这与培养的结果完全一致，说明本发明具有很好的临床诊断性能。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州洪祥生物医药科技有限公司

<120> 解脲脲原体的LAMP检测引物组及试剂盒

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

tctctaactt ctggtaatca ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

ttgttagata tcgtcaaggt gt 22

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

cctgatttac cacctcccac agttcgctgg ctcattatct 40

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

tccaacatta ttagtgttcg cttccaacac aagaacacg 39

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

cttcatttgg aaatcagcat ga 22

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

aatagctgaa ccaccgttat 20

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<212> DNA

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<400> 7

ggatttgtta gatatcgtca agg 23

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<400> 8

tcatctttta aagctccaca ttattagt 28

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<212> DNA

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<400> 9

gtatttgcaa tctttatatg ttttcg 26

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

cagctgatgt aagtgcagca ttaaattc 28

Claims

1.一种解脲脲原体的LAMP检测引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：

外引物F3:5’-TCTCTAACTTCTGGTAATCAGA-3’；

外引物B3:5’-TTGTTAGATATCGTCAAGGTGT-3’；

内引物FIP:5’-CCTGATTTACCACCTCCCACAGTTCGCTGGCTCATTATCTT-3’；

内引物BIP:5’-TCCAACATTATTAGTGTTCGCTTCCAACACAAGAACACGAG-3’；

环引物LF:5’-CTTCATTTGGAAATCAGCATGA-3’；

环引物LB:5’-AATAGCTGAACCACCGTTAT-3’；

外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

2.一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，包括引物、反应液、Bst DNA聚合酶、荧光染料或显色剂、密封液、去核酸水，其特征在于：引物为权利要求1所示的LAMP检测引物组；

反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO₄和甜菜碱， Bst DNA聚合酶的浓度为8U/L；

荧光染料为SYBR green，显色剂为羟基萘酚蓝HNB；

密封液为石蜡油；

反应液中，dNTP的浓度为1.6mM，MgSO4的浓度为8mM，甜菜碱的浓度为1mM。