KR20130128334A - 마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, ＴａｑＭａｎ 프로브 및 이를 이용한 Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 시험 방법 - Google Patents

마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, ＴａｑＭａｎ 프로브 및 이를 이용한 Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 시험 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 최적화된 TaqMan real-time PCR 기법을 이용한 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무의 확인 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 서열번호 1과 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 세트 및/또는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프로브를 이용한 TaqMan real-time PCR 기법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 최적화된 TaqMan real-time PCR 기법은 광범위한 마이코플라즈마를 특이적으로 검출해 낼 수 있는 유용한 효과가 있으므로 생물의약품 생산에 앞서 마이코플라즈마 오염유무를 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 마이코플라즈마 부정시험법으로 유용하게 활용 가능한 효과가 있다.

Description

마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, ＴａｑＭａｎ 프로브 및 이를 이용한 Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 시험 방법{Primer set, TaqMan probe, and real-time PCR method for the detection of mycoplasma}
본 발명은 최적화된 TaqMan real-time PCR 방법을 이용한 마이코플라즈마 오염 유무의 확인 방법에 관한 것이다.
마이코플라즈마(Mycoplasma)는 세포벽 (cell wall)이 없는 몰리큐트(Mollicutes) 강에 속하며, 인공배지에서 자가증식을 할 수 있는 가장 작은 미생물 (bacteria)로서 사람, 동물, 곤충, 식물 등에 광범위하게 분포되어 있으며, 이들에서 여러 가지 질병을 유발시킬 수 있는 미생물이다. 현재까지 8개 속의 180여종 이상이 존재한다고 알려져 있다. (장명웅, 1994, AIDS와 Mycoplasma, Life Science, 4: 64-69). 20여종의 마이코플라즈마 속과 아콜레플라즈마(Acholeplasma) 속이 세포배양의 주요 오염원이며, 5 ~ 35%이상에 이르는 세포주들이 6종의 마이코플라즈마(M. arginini , M. fermentans , M. hyorhinis , M. orale , Acholeplasma laidlawii)에 주로 오염되어 있다고 보고되었다. 오염의 근원은 초대배양에 사용되는 동물조직, 배양에 사용되는 혈청 또는 실험자 등에 의해서 유발되며, 실험실 내 세포주의 교차 오염으로 인해 다른 세포주로 오염이 확산될 수 있다(전우진, et al., 2005, 동물용 생 바이러스 백신에서 Mycoplasma 검출을 위한 PCR 기법 적용, The Korean Journal of Microbiology, 41: 269-274). 마이코플라즈마는 세포벽이 있는 세균과는 달리 세포벽이 없어 형태가 쉽게 변하며, 직경이 0.2 ~ 2 μm로 작아 세포배양용 배지 여과에 사용되는 0.22 ~ 0.45 μm의 membrane filter를 통과할 수 있기 때문에 세포배양용 배지를 통해 오염될 수 있다(Hay, R. J., et al., 1989, Mycoplasma infection of cultured cells, Nature, 339: 487-488).
생물의약품 개발에 앞서 유럽 약전에 명시되어있는 7주의 마이코플라즈마를 부정시험법을 통하여 마이코플라즈마의 존재 여부를 확인하여야 한다. 마이코플라즈마 오염유무를 확인하기 위한 방법 중 직접배양법은 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라, 분리배지의 조성, 시료의 특성 및 배양조건 등 많은 요인에 의해 영향을 받을 수 있는 단점이 있다. 따라서, 최근에는 host cell 및 seed virus 내의 마이코플라즈마 오염을 보다 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법들로 DNA fluorochrome 염색법, 효소면역법, 형광염색법, 생화학 검사법, 그리고 DNA probe 기법 등이 보고되고 있다(장명웅, et al., 1993, 배양 세포주에서 Mycoplasmas의 오염검색, 대한미생물학회지, 28: 209-221 및 Spaepen, M., et al., 1992, Detection of bacterial and Mycoplasma DNA and pestivrus by polymerase chain reaction, FEMS Microdiol. Lett., 99: 89-94). 그러나 이러한 기법들도 결과 해석 및 세포배양에서 오염될 수 있는 모든 종류의 마이코플라즈마 오염을 검출하는 데에는 한계가 있다. 현재 가장 신속하고 손쉽게 사용하는 오염 검출방법으로 마이코플라즈마의 특정 rRNA를 대상으로 한 PCR 기법이 보고되고 있으며, 일부 개발된 키트가 상품화되어 있다(Hopert, A., et al., 1993, Specificity and sensitivtiy of polymerase chain reaction(PCR) in comparison with other methods for the detection of Mycoplasma contamination in cell lines, J. Immunol. Methods., 164: 91-100., Tang, J., et al., 2000, A polymerase chain reaction based method for detecting Mycoplasma/Acholeplasma contaminants in cell culture, J. Microdbiol. Method, 39: 121-126., Wong-Lee, J. C. et al., 1993, Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture, p. 257-260).
그러나 일반적인 SYBR Green real-tim PCR 기법 이외에 마이코플라즈마의 유무를 보다 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요한 상황이다.
이에 본 발명자들은 공통 프라이머(universal primer) 등의 새로운 프라이머 세트를 제작하고 이를 바탕으로 특이적인 TaqMan 프로브(probe)를 디자인하여 TaqMan real-time PCR 기법을 수행한 결과, 다양한 종류의 마이코플라즈마를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명의 TaqMan real-time PCR 시험법을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무를 확인하는 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 유전체 DNA, 프라이머 세트(Primer set), 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe)를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및 (c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무 확인 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 실시간 중합효소연쇄반응액은 염화마그네슘(MgCl2)을 추가로 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 전방향 프라이머(forward primer), 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 마이코플라즈마에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 형광발색제는 carboxyfluorescein (FAM), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein (JOE), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), indocarbocyanine-3 (Cy3), indocarbocyanine-5 (Cy5), 6-Carboxy-X-rhodamine (Rox) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3 (BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), deep dark Quencher 2 (DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 마이코플라즈마는 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae), 및 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe), 또는 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 마이코플라즈마 오염 유무 확인용 키트를 제공한다.
공통 프라이머들(universal primers)을 이용한 TaqMan real-time PCR 기법은 광범위한 마이코플라즈마 검출능력을 나타내어 생물의약품 생산에 앞서 마이코플라즈마 오염유무를 신속하고 정확하게 검출 할 수 있어 마이코플라즈마 부정시험법으로 유용하게 이용 가능한 효과가 있다.
도 1은 NCBI database로부터 마이코플라즈마에 보편적인 공통 프라이머 제작을 위한 염기서열 alignment를 나타낸 것이다.
도 2는 NCBI database로부터 마이코플라즈마에 보편적인 공통 프로브 제작을 위한 염기서열 alignment를 나타낸 것이다.
도 3은 (A) 공통 프라이머 세트, (B) M16 프라이머 세트, (C) MGSO 프라이머 세트, (D) M. genus 프라이머 세트를 이용하여 다양한 결합(annealing) 온도에서 일반 PCR을 수행함으로써 마이코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans)를 검출한 결과를 나타낸 것이다(Lane M, 100 bp DNA ladder; Lane 1, 60℃; Lane 2, 59℃; Lane 3, 58℃; Lane 4, 57℃; Lane 5, 56℃; Lane 6, 55℃; Lane 7, 54℃; Lane 8, 53℃).
도 4는 (A) 공통 프라이머 세트, (B) M16 프라이머 세트, (C) MGSO 프라이머 세트, (D) M. genus 프라이머 세트를 이용하여 TD-PCR을 수행함으로써 마이코플라스마 종(Mycoplasma spp.)들을 검출한 결과를 나타낸 것이다(Lane M, 100 bp DNA ladder; Lane 1, M. fermentans; Lane 2, M. gallisepticum; Lane 3, M. pneumoniae; Lane 4, M. hyorhinis; Lane 5, A. laidlawii; Lane 6, M. orale; Lane 7, M. synoviae; Lane 8, 음성 대조군).
도 5는 마이코플라스마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans)에 대한 real-time PCR 기법의 민감성을 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 초기농도에 대한 crossing point 값의 회귀분석에 의한 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 7은 제조사에 따른 Genomic DNA 추출 키트를 비교한 결과를 나타낸 것이다(□ Exgene™ Blood SV mini Kit (GeneALL, Korea); ■ QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN, German); ○ Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea); ● I-genomic BYF DNA Extraction min kit (INtRON, Korea); △ 음성 대조군).
도 8은 제조사에 따른 Genomic DNA 추출 키트를 비교한 결과를 나타낸 것이다(▷ PrepSEQ™ Nucleic Acid Extraction Kit (Applied Biosystems, USA); □ Exgene™ Blood SV mini Kit (GeneALL, Korea); △ 음성 대조군).
도 9는 본 발명에 따른 real-time PCR 기법의 특이성을 실험한 결과를 나타낸 것이다(□ Mycoplasma fermentans; ■ CHO-K1; ○ CHO-DG44; ● 음성 대조군).
도 10은 본 발명에 따른 real-time PCR 기법의 특이성을 실험한 결과를 나타낸 것이다(□ Mycoplasma fermentans; ■ A9; ○ FRhk-4; ● C8166; △ Vero; ▲ MA104; ◇ MPK; ◆ EBtr; ▷ 음성 대조군).
도 11은 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)의 제형을 구성하면서 box 1(도 11a) 및 box 2(도 11b)의 각 구성물들의 구별을 위해 cap color를 각각 다른 색으로 한 상태를 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)의 워크플로우(workflow)를 나타낸 것이다.
도 13 내지 도 15는 종래의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSEQ™)를 이용한 샘플 A, B 및 C의 마이코플라스마 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 16 내지 도 18은 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)를 이용한 샘플 A, B 및 C의 마이코플라스마 검출 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브(probe)를 이용한 최적화된 real-time PCR 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브(probe)를 이용하여 최적화된 real-time PCR을 수행함으로써 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 마이코플라즈마 오염 유무를 신속하고 정확하게 검출하기 위한 방법으로 TaqMan 프로브를 이용한 real-time PCR을 실시하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 특이성과 민감도가 높은 공통 프라이머(universal primers)와 마이코플라즈마 유전자를 검출할 수 있는 각종 프라이머들을 자체 제작하였으며, 공통 프라이머를 이용하여 만들어지는 산물을 토대로 프로브를 제작(실시예 1 참조)하여 TaqMan real-time PCR 조건을 최적화 하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 최적화된 TaqMan real-time PCR 방법으로 프라이머 세트 및 프로브의 특이성을 알아본 결과, 마이코플라즈마 핵산만을 선택적으로 검출해 낼 수 있는 것으로 나타났으며(실시예 7 참조), 최적화된 TaqMan real-time PCR 방법의 직선성 및 재현성을 알아본 결과, 마이코플라즈마 7종 모두 log CFU (CFU/mL; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 결정 계수(r2)가 0.99 이상으로 log CFU와 crossing point 값 간의 회귀성이 높고, 변동계수(CV)도 변화없이 일정하여 변수에 따른 변화가 미미한 것으로 나타나, 본 발명의 방법이 신뢰도가 높음을 알 수 있다(실시예 8 참조). 또한, 최적화된 TaqMan real-time PCR 방법의 견고성을 실험한 결과, 일반적인 변수에 대하여 별다른 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(실시예 9 참조).
상기 결과들을 통해, 본 발명자들은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 공통프라이머와 프로브를 이용하여 최적화된 TaqMan real-time PCR을 수행함으로써 마이코플라즈마 검출 용도로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무 확인 방법을 제공할 수 있다:
(a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 유전체 DNA, 프라이머 세트(Primer set), 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe)를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및
(c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
이때, 용어“시료(sample)”는 예를 들어 배양된 세포, 단백질, 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 동물 또는 인간의 뇌(brain), 눈(eye), 심장(heart), 장(intestine), 신장(kidney), 간(liver), 허파(lung), 근육(muscle), 비장(spleen), 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001))을 통해 이루어질 수 있으며 어느 하나의 방법에 제한되지는 않는다.
상기 (b)단계의 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 전방향 프라이머(forward primer), 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머(reverse primer)일 수 있다.
용어 “프라이머(primer)”는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 표적 핵산에 인접해 있는 5’말단 서열 및 3’말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 용어 “전방향 프라이머(forward primer)” 및 “역방향 프라이머(reverse primer)”는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3’말단 및 5’말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 프라이머는 마이코플라즈마 게놈서열중에서 종(species) 보존적인 16S ribosomal RNA gene을 토대로 하였기 때문에 다양한 종(species)의 마이코플라즈마를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 “프로브”는 마이코플라즈마에 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것으로서, 5’ 말단에는 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고, 3’ 말단에는 소광제(quencher)가 표지된다.
상기 형광발색제는 carboxyfluorescein (FAM), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein (JOE), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), indocarbocyanine-3 (Cy3), indocarbocyanine-5 (Cy5), 또는 6-Carboxy-X-rhodamine (Rox)을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 바람직하게는 carboxyfluorescein (FAM)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3 (BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), 또는 deep dark Quencher 2 (DDQ2)을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면 바람직하게는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응액은 상기 (a) 단계에서 시료로부터 추출한 유전체 DNA (genomic DNA)를 PCR의 주형 DNA로서 포함한다. 중합효소연쇄반응액은 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 실시간 중합효소연쇄반응액은 염화마그네슘(MgCl2)을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 실시간 중합효소연쇄반응액의 최종 농도가 1 mM 내지 10 mM이 되도록 MgCl2를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 결합(annealing) 단계 및/또는 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 상기 변성, 결합, 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 이에 한정되지는 않으나, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 결합 온도는 60℃로 선택할 수 있다.
나아가 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트, 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 마이코플라즈마 오염 유무 확인용 키트를 제공한다.
상기 “키트”는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 마이코플라스마 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 용기, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있고, 상기 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
본 발명의 방법 또는 키트에 의해 검출 가능한 마이코플라즈마는 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae), 및 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
마이코플라즈마 검출용 프라이머 및 프로브의 설계
<1-1> 사용균주 및 배양
본 실시예에서 사용된 균주는 하기 표 1에 나타난 바와 같으며, 7종의 마이코플라즈마(mycoplasma) 표준균주의 배양은 American Type Culture Collection (ATCC)에 기재된 배지(medium)를 사용하였다. 즉, 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii)는 ATCC #243 medium에서 배양하였으며, 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae)는 마이코플라즈마 부정시험용 ATCC #988 Spiroplasma medium sp-4 medium에서 배양하였다. 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)는 ATCC #486 Modified Chalquist's anigen medium에서 배양하였다. 배양조건은 하기 표 1에 기재된 바와 같으며, 배양물의 증균 농도를 확인하기 위하여 새로운 배지로 10-fold로 희석하여 각 희석단계별 배양물 100 L를 한천배지에 접종한 다음 동일조건에서 배양하고 균증식성을 colony forming unit (CFU) 단위로 계수함으로써 평균치를 산출하였다.
Species Source Condition Media
A. laidlawii ATCCa 23206 Plates : 37℃, 5% CO2
Broth : Aerobic		 #243 mediab
M. gallisepticum ATCCa 19610 Plates : 37℃, 5% CO2
Broth : Aerobic		 #243 mediab
M. fermentans ATCCa 19989 37℃, Anaerobic #243 mediab
M. hyorhinis ATCCa 17981 Plates : 37℃, 5% CO2
Broth : Aerobic		 #243 mediab
M. orale ATCCa 23714 37℃, Anaerobic #243 mediab
M. pneumoniae ATCCa 15531 Plates : 37℃, 5% CO2
Broth : Aerobic		 #988 mediab
M. synoviae ATCCa 25204 Plates : 37℃, 5% CO2
Broth : Aerobic		 #486 mediab
aATCC, American Type Culture Collection.
bATCC medium.
<1-2> 프라이머 및 프로브 설계
7종의 마이코플라즈마 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고 핵산 프라이머 염기서열은 NCBI 데이터베이스에 등록된 마이코플라즈마의 16S ribosomal RNA gene을 기초로 Primer 3 Software를 이용하여 유전자 변이가 거의 없는 것으로 알려진 16S ribosomal RNA gene을 기초로 하는 공통 프라이머(universal primer)를 도 1에 나타난 바와 같이 설계하였고, 마이코플라즈마 검출을 위한 프라이머를 설계하였다. 설계된 공통 프라이머는 7종의 마이코플라즈마(아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스, 마이코플라즈마 오레일, 마이코플라즈마 뉴모니아, 마이코플라즈마 시노비에)의 DNA 서열과 alignment에서 높은 정도의 최소 mismatches을 가지는 homology를 나타냈다. 또한, 선별된 프라이머의 산물을 토대로 도 2에 나타낸 바와 같이, TaqMan 프로브를 설계하였는데, 프로브는 프라이머보다 Tm (Melting temperature) 값이 8~10℃ 정도 높게 하고, 5` 말단에는 염기서열 중 구아니딘(guanidine)이 오지 않게 하였으며, 같은 염기서열이 4번 이상 이어지지 않도록 하였다. 프로브 서열 5` 말단에는 형광발색제(fluorescent reporter dye)인 carboxyfluorescein (FAM)을 3` 말단에는 소광제(quencher)인 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1)가 오도록 설계하였다. 설계된 프로브는 상기 7종의 마이코플라즈마 DNA 서열의 alignment에서 mismatches을 가지는 부분을 모두 포함하기 위해 mixed base로 구성되었고, 하기 표 2에 설계된 프라이머 세트 및 프로브의 염기서열을 기재하였다.
프라이머 세트 Sequences 서열번호
공통프라이머 Forward GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG 1
Reverse CGG ATA ACG CTT GCG ACC TAT G 2
M-16 프라이머 Forward TTT TGG TGG ATG CCT TGG 3
Reverse TTT CCC CAT TCG GAA ATC 4
MGSO 프라이머 Forward GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC T 5
Reverse TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 6
M. genus 프라이머 Forward ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT A 7
Reverse TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC 8
마이코플라즈마 프로브* FAM- YGR CWA ACT ATG TGC CAG CAG YCG CG -BHQ1 9
*Mixed base를 포함하는 IUB Code
Y: C, T R: A, G W: A, T
마이코플라즈마 유전체 DNA ( Genomic DNA )의 추출
마이코플라즈마의 Genomic DNA 추출은 Exgene™ Blood SV mini Kit (GeneALL, Korea)를 사용하여 제조 회사의 방법에 따라 분리하였다.
PCR 수행을 통한 최적화 조건의 수립
<3-1> 일반 PCR 반응조건
상기 실시예 1에서 설계한 프라이머 세트의 검출 유효성을 비교하기 위해, Kyratec사(Australia)의 Super cycler Gradient Cycler 기기를 이용하여 일반 PCR (conventional PCR) 및 TD-PCR (Touch Down PCR) 방법으로 검출 유효성을 비교하였다. 일반 PCR의 결합 온도(Annealing temperature)를 조절하기 위해 마이코플라즈마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans)를 이용하여 genomic DNA 2 μL, 2 × GoTaq® Green Master Mix (Promega, USA) 10 μL, 10 pmol forward primer 0.5 μL, 10 pmol reverse primer 0.5 μL 혼합액에 MgCl2 (25 mM) 1.6 μL, Nuclease-Free Water 5.4 μL를 첨가하고 최종부피를 20 μL과 최종 MgCl2 농도를 4 mM로 맞추었다. 핵산증폭 반응은 94℃에서 90초 동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 94℃에서 30초, 결합(annealing) 각각 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃에서 30초, 신장(extention) 72℃에서 40초의 조건으로 하여 40 cycle 수행하고, 마지막 cycle 수행 뒤 72℃에서 4분 반응시켰다. PCR 수행 후 2% agarose (Sigma Co., USA) gel을 이용하여 100V 전압으로 30분 정도 전기영동하고 ethidium bromide(EtBr)로 염색함으로써 PCR 반응산물을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 마이코플라즈마 페르멘탄스 DNA를 주형(template)으로 하였을 때, 공통 프라이머(universal primer)는 400-500 bp 사이에서 DNA band가 확인되었고, M16 프라이머는 100-200 bp 사이에서 DNA band가 확인되었다. MGSO 프라이머는 300-400 bp 사이에서 DNA band가 확인되었으며, M. genus 프라이머는 600-700 bp 사이에서 DNA band가 확인되었다. 또한, 결합 온도에 따른 반응성을 확인한 결과 모두 60℃에서 53℃까지 반응성을 나타내었으며, 낮은 온도로 갈수록 DNA band가 더 진해지는 것을 관찰할 수 있었다.
<3-2> Touch Down PCR 반응조건
상기 실시예 <3-1>의 결과에 따라 결합 온도를 56℃로 설정하고 TD-PCR을 수행하였으며, 마이코플라즈마 7종에 대한 각각 프라이머들의 검출 유효성을 비교하였다. Genomic DNA 2 μL, 2 × GoTaq® Green Master Mix (Promega, USA) 10 μL, 10 pmol forward primer 0.5 μL, 10 pmol reverse primer 0.5 μL 혼합액에 MgCl2 (25 mM) 1.6 μL, Nuclease-Free Water 5.4 μL를 첨가하여 최종부피를 20 μL로 하고, 최종 MgCl2 농도를 4 mM로 맞추었다. 핵산증폭 반응은 94℃에서 90초 동안 전-배양한 다음, 변성 94℃에서 30초, 결합 66-56℃ 30초, 신장 72℃에서 40초의 조건으로 40 cycle을 수행하고, 마지막 cycle 수행 뒤 72℃에서 4분 반응시켰다. 결합 온도는 66℃에서 시작하여 두 cycle 마다 1℃씩 낮추어 56℃까지 20 cycle을 반응 시켰으며, 마지막으로 56℃에서 20 cycle을 반응시켰다. PCR 수행 후 2% agarose (Sigma Co., USA) gel을 사용하여 100V 전압으로 30분 정도 전기영동한 후 EtBr로 염색함으로써 PCR 반응산물을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 공통 프라이머를 이용하여 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스, 마이코플라즈마 오레일, 마이코플라즈마 뉴모니아, 마이코플라즈마 시노비에, 및 음성대조군에 대해 TD-PCR을 실시하였을 때는 음성대조군을 제외한 모든 마이코플라즈마에 대하여 400-500 bp 사이에서 특이적인 band가 관찰되었다. 반면, M16 프라이머를 이용했을 때는, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 아코레플라즈마 라이드로우이에 대하여 100-200 bp사이에서 특이적인 band가 관찰되었다. 그리고 MGSO 프라이머를 이용하였을 때는, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스, 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 시노비에를 관찰할 수 있었으며, 증폭산물의 크기는 균종에 따라 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스에 대하여 200-300 bp사이에서 특이적인 band를 나타냈고, 마이코플라즈마 시노비에는 100-200bp 사이에서 특이적 band가 관찰되었지만, 아코레플라즈마 라이드로우이는 200-300 bp사이 및 400-500 bp사이에서 비-특이적인 band를 관찰할 수 있었다. M. genus 프라이머를 이용하였을 때는, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 오레일을 관찰할 수 있었다. 증폭산물의 크기는 균종에 따라 마이코플라즈마 페르멘탄스, 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 오레일은 600-700 bp사이에서 특이적인 band를 관찰할 수 있었고, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰은 500-600 bp사이 및 700-800 bp사이에서 비-특이적인 band를 관찰할 수 있었다.
상기로부터, 공통 프라이머에서 7종의 마이크로플라즈마 모두 검출 특이적 증폭산물이 확인되므로 광범위한 마이코플라즈마 검출에 사용 가능하다는 것을 알 수 있다.
<3-3> 프라이머 세트 및 프로브의 민감성 측정을 위한 real - time PCR 최적화
프라이머 세트 및 프로브의 민감도(sensitivity)를 측정하기 위해, CFU로 측정된 마이코플라즈마 페르멘탄스(Mycoplasma fermentans)를 이용한 일반 PCR을 통하여 확립된 PCR 조건을 기초로 Realtime PCR master Mix (TOYOBO, Japan)을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR, qPCR) 조건을 확립하였다. 결합 온도와 MgCl2 농도를 변화시켜 real-time PCR 조건을 최적화 시켰는데, 마이코플라즈마 페르멘탄스를 순차적으로 1×104 CFU/mL, 1×102 CFU/mL, 1×100 CFU/mL로 희석한 후 결합 온도는 각각 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃의 조건에서 실험 하였으며, MgCl2 농도는 각각 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM의 조건에서 실험을 수행하였다. 민감도 측정에는 Applied Biosystems(USA)사의 StepOnePlus Real-Time PCR System를 사용하였으며, PCR 반응을 위해 Realtime PCR master Mix (TOYOBO, Japan) 10 μL, 10 pmol 공통 프라이머의 forward primer 1.5 μL, 10 pmol 공통 프라이머의 reverse primer 1.5 μL, 10 pmol specific probe 0.5 μL 및 template DNA 5 μL를 혼합한 용액에 MgCl2 (25mM) 0.8 μL, Nuclease-Free 정제수 0.7 μL를 첨가하여 최종부피를 20 μL로 맞추고, 최종 MgCl2 농도를 4 mM로 맞추었다. 핵산증폭은 94℃에서 90초 동안 전-배양한 다음, 변성 94℃에서 30초, 결합 60℃에서 40초의 조건으로 45 cycle을 수행하였다.
CFU/mL Annealing temperature
50℃ 52℃ 54℃ 56℃ 58℃ 60℃
1 x 104 19.82* 20.55 20.42 20.24 20.53 19.87 20.09 20.25 20.42 19.93 20.39 20.67
1 x 102 28.51 28.38 28.39 27.99 27.78 27.61 27.69 27.78 27.45 27.57 27.72 27.51
1 x 100 35.66 37.10 34.63 35.79 35.09 34.64 35.79 35.59 34.82 34.18 33.91 33.97
Buffer control N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
*Values indicate crossing point (Cp) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
CFU/mL MgCl2 concentration
3 mM 4 mM 5 mM 6 mM
1 x 104 18.95* 19.48 19.68 19.51 19.65 19.41 20.05 19.79
1 x 102 26.73 26.46 27.34 27.06 28.48 27.11 27.44 27.57
1 x 100 N/A 29.82 30.22 30.46 31.75 31.04 N/A N/A
Buffer control N/A 29.75 N/A N/A 31.96 31.88 N/A N/A
*Values indicate crossing point (Cp) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
결합 온도의 반응성을 비교한 결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 모든 온도에서 견고성을 나타내어 어떠한 변수에 의한 영향이 미미한 것을 알 수 있었으며, 최적의 결합 온도를 60℃로 선택하였다.
또한 MgCl2 농도 최적화 실험한 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 모든 농도에서 견고성을 나타내어 어떠한 변수에 의한 영향이 미미하다는 것을 알 수 있었으며, 최적의 MgCl2 농도를 4 mM로 선택하였다.
상기 최적화 된 조건에 맞춰 CFU가 1×107 CFU/mL인 마이코플라즈마 페르멘탄스를 순차적으로 1×106 CFU/mL, 1×105 CFU/mL, 1×104 CFU/mL, 1×103 CFU/mL, 1×102 CFU/mL, 1×101 CFU/mL, 1×100 CFU/mL, 1×10-1 CFU/mL로 희석한 후 Real-Time PCR을 수행하여 표준곡선을 작성하였다. 표준곡선은 genomic DNA의 농도에 따라 Real-Time PCR에 의해 검출되는 crossing point 값을 CFU/mL로 전환하여 작성하였다. Crossing point는 PCR cycle이 대수기(exponential phase)로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 마이코플라즈마 페르멘탄스의 log CFU (CFU/mL; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 결정 계수(r2)는 0.9948로 마이코플라즈마 페르멘탄스의 log CFU와 crossing point 값 간의 회귀성이 높았다.
유전체 DNA ( Genomic DNA ) 추출방법 비교실험
최적화된 DNA 추출방법 필터 방법인 제조회사가 다른 4종류의 DNA prep kit 대한 비교실험을 하였다. 비교실험에 사용한 DNA prep kit는 Exgene™ Blood SV mini Kit (GeneALL, Korea), QIAamp® DNA mini kit (QIAGEN, German), Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea), I-genomic BYF DNA Extraction min kit (INtRON, Korea)이다. CFU가 1×105 CFU/mL인 마이코플라즈마 페르멘탄스를 각 제조 회사의 방법에 따라 DNA 추출하였으며, 추출된 DNA 원액을 가지고 StepOne Plus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) 기기를 이용하여 상기 <실시예 3>의 최적화된 방법으로 실험을 하였다. 선정된 필터방식의 DNA prep kit 및 magnetic particles 방식인 PrepSEQ™ Nucleic Acid Extraction Kit를 동일한 방법으로 실험하였다.
DNA 추출방법을 비교한 결과. 도 7에 나타난 바와 같이, Exgene™ Blood SV mini Kit (GeneALL, Korea)의 DNA 추출 능력이 가장 좋다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 선정된 Exgene™ Blood SV mini Kit와 magnetic particles 방식인 PrepSEQ™ Nucleic Acid Extraction Kit를 이용하여 CFU가 1×106 CFU/mL인 마이코플라즈마 히오르히니스를 각 제조 회사의 메뉴얼에 따라 DNA 추출한 결과, PrepSEQ™ Nucleic Acid Extraction Kit의 DNA 추출 능력이 더 우수한 것으로 나타났다.
최적화된 방법을 이용한 마이코플라즈마의 반응성 실험
최적화된 real-time PCR 방법을 이용하여 마이코플라즈마의 반응성을 알아보기 위해, CFU가 각각 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii)는 1×104 CFU/mL, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum)은 1×105 CFU/mL, 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans)는1×105 CFU/mL, 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis)는 1×106 CFU/mL, 마이코플라즈마 오레일(M. orale)는 1×104 CFU/mL, 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae)는 1×104 CFU/mL, 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)는 1×104 CFU/mL인 마이코플라즈마를 1×10-1 CFU/mL까지 희석하여 PCR을 수행하였다. 검출된 crossing point 값을 CFU/mL로 전환하여 작성하였으며, Crossing point는 PCR cycle이 대수기로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.
Mycoplasma
species		 CFU/ml Regression curve
Y = -aX + b		 r2
105 104 103 102 101 100 10-1
A. laidlawii · · 24.94* 28.63 32.70 35.85 N/A Y = -3.680X + 36.053 0.998
M. gallisepticum · 22.94 26.28 29.58 33.32 35.72 N/A Y = -3.259X + 36.085 0.996
M. fermentans · 22.81 26.50 29.57 32.95 36.46 N/A Y = -3.374X + 36.406 0.999
M. hyorhinis 17.79 21.08 24.84 28.25 31.65 34.97 N/A Y = -3.458X + 35.076 1.000
M. orale · · 25.46 29.12 32.82 35.50 N/A Y = -3.382X + 35.798 0.995
M. pneumoniae · · 24.88 28.40 31.94 35.04 N/A Y = -3.402X + 35.17 0.999
M. synoviae · · 26.36 29.67 32.87 36.45 N/A Y = -3.346X + 39.702 0.999
r2: 결정계수
*Values indicate crossing point (Cp) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 7종의 마이코플라즈마 모두에 대하여 1×100 CFU/mL까지 반응성을 확인하였다.
최적화된 방법을 이용한 검출한계 실험
최적화된 real-time PCR 방법을 이용하여, 각 마이코플라즈마에서 검출 가능한 핵산의 최소량을 의미하는 검출한계를 알아보았다. 본 실시예에서는 배양하여 CFU/mL로 정량한 마이코플라즈마를 표준물질로 사용하였으며, 최소한 3개의 연속 희석한 패널을 독립적으로 준비하여 각 희석 배수 당 24회 반복 검사를 실시하여 결과를 얻고 확보된 결과에 대하여 통계 분석을 실시하였다. 실험에 사용한 마이코플라즈마 7종은 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스, 마이코플라즈마 오레일, 마이코플라즈마 뉴모니아, 마이코플라즈마 시노비에로서, 각각 1×104 CFU/mL, 1×103 CFU/mL, 1×102 CFU/mL, 1×101 CFU/mL, 1×100 CFU/mL, 1×10-1 CFU/mL로 연속적으로 희석하여 최적화된 real-time PCR 방법을 수행하였다.
Run CFU/mL (A. laidlawii) Limit of detection
103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + + + + - + 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + + - - + 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + - + - - - - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. gallisepticum) Limit of detection
104 103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + + - + + - - - 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. fermentans) Limit of detection
104 103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + + + + + - - + 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + + + - - + - - - 101 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + + - - - - - - 101 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. hyorhinis) Limit of detection
104 103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + + + + + + + - + - 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + + + + - + + - - - 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. orale) Limit of detection
103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + - + + - - + 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + - - + - - - 101 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + - - - - - - 101 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + - - - - - 101 CFU/mL
6 + + + + + + + + + - - - - - - 101 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. pneumoniae) Limit of detection
103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + - + - - - - 101 CFU/mL
2 + + + + + + + + + - + + - - - 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + - - - - - - 101 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + - - - - 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + - + - + - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Run CFU/mL (M. synoviae) Limit of detection
103 102 101 100 10-1
1 + + + + + + + + + + + + - - + 100 CFU/mL
2 + + + + + + + + + + + + - - + 100 CFU/mL
3 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
4 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
5 + + + + + + + + + + - + - - - 100 CFU/mL
6 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
7 + + + + + + + + + + + + - - - 100 CFU/mL
8 + + + + + + + + + + + + - - + 100 CFU/mL
+, positive; -, negative
Mycoplasma species Limit of detection
CFU/ml (or DNA Copies)
A. laidlawii 10 CFU/ml
M. gallisepticum 10 CFU/ml
M. fermentans 10 CFU/ml
M. hyorhinis 10 CFU/ml
M. orale 10 CFU/ml
M. pneumoniae 10 CFU/ml
M. synoviae 1 CFU/ml
그 결과, 상기 표 6 내지 표 13에 나타난 바와 같이, 각각의 검출한계는 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae) 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 뉴모니아의 경우 1×101 CFU/mL, 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)의 경우 1×100 CFU/mL임을 알 수 있다.
프라이머 세트 및 프로브의 특이성 실험
다른 이물질이 존재하는 조건에서도 마이코플라즈마 핵산만을 선택적으로 정확하게 검출해 낼 수 있는지 알아보기 위해, 특이성(Specificity) 실험을 수행하였다. 본 실시예에서는 사람 T-cell에서 유래된 C8166 세포주, chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 유래된 CHO DG-44 세포주에 대하여 특이성 실험을 수행하였다. 이때, C8166 세포주와 CHO DG-44 세포주는 1×106 cell/mL로, 10-fold로 연속하여 1×104 cell/mL, 1×103 cell/mL, 1×102 cell/mL, 1×101 cell/mL까지 희석하고 real-time PCR을 수행하였다. 결과분석을 위해 검출된 crossing point 값을 CFU/mL로 전환하여 작성하였으며, Crossing point는 PCR cycle이 대수기로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.
Species CFU/mL or Cell/mL Specificity
104 103 102 101
Human keratinocyte N/A N/A N/A N/A Y
Human mesenchymal stem cell N/A N/A N/A N/A Y
Negative control N/A N/A N/A N/A ·
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
그 결과, 상기 표 14에 나타난 바와 같이, C8166 세포주 및 CHO DG-44 세포주에서는 마이코플라스마가 검출 되지 않는 것으로 나타났다.
이에 더하여, CHO cell 유래의 CHO-K1, CHO-DG44 와 그 밖의 세포주인 A9, FRhk-4, C8166, Vero, MA104, MPK, EBtr 등 총 9종의 세포주를 1×106 cell/mL DNA로 준비하여 최적화된 real-time PCR 방법을 수행하였다.
Species Cell/mL Specificity
106
CHO - K1 N/A Y
CHO-DG44 N/A Y
A9 N/A Y
FRhK-4 N/A Y
C8166 N/A Y
Vero N/A Y
MA104 N/A Y
MPK N/A Y
EBtr N/A Y
Negative control N/A ·
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected.
그 결과, 표 15, 도 9, 및 도 10에 나타난 바와 같이, 총 9종의 세포주 모두가 프로브에 반응하지 않는 것으로 나타났다.
상기로부터, 사람 세포주, CHO 세포주 및 CHO 세포 배양액에서 마이코플라즈마 부정시험용으로 본 발명의 프라이머세트 및 프로브를 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 만약 PCR 양성일 경우 PCR 결과물의 서열분석을 통해 오염균주를 동정(identity)하는 과정이 필수적이므로 본 발명의 PCR 시험법을 실제공정에 적용할 수 있음을 알 수 있다.
TaqMan Real - Time PCR 방법의 직선성 및 재현성 실험
최적화된 real-time PCR 방법의 직선성과 재현성을 알아보기 위해, 마이코플라즈마 7종인 아코레플라즈마 라이드로우이, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 마이코플라즈마 페르멘탄스, 마이코플라즈마 히오르히니스, 마이코플라즈마 오레일, 마이코플라즈마 뉴모니아, 마이코플라즈마 시노비에를 각각 1×104 CFU/mL, 1×103 CFU/mL, 1×102 CFU/mL, 1×101 CFU/mL, 1×100 CFU/mL, 1×10-1 CFU/mL로 연속 희석하여 triplicate로 수행하였다. 결과분석을 위해 검출된 crossing point 값을 CFU/mL로 전환하여 작성하였으며, Crossing point는 PCR cycle이 대수기로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.
Mycoplasma
species		 CFU/ml Regression curve
Y = -aX + b		 r2
104 103 102 101 100 10-1
A. laidlawii · 20.56* 23.61 27.05 30.17 N/A Y = -3.178X + 30.007 0.997
· 20.63 23.56 26.77 29.50 N/A
· 20.28 23.59 26.90 30.27 35.06
CV (%) · 0.90 0.10 0.52 1.39 ·
M. gallisepticum 19.12 22.64 26.07 29.11 N/A N/A Y = -3.319X + 32.634 0.999
19.21 22.70 26.11 29.43 32.39 N/A
19.57 22.69 26.05 29.65 32.57 N/A
CV (%) · 0.65 0.27 0.20 0.41 ·
M. hyorhinis 18.71 21.88 25.49 28.77 N/A N/A Y = -3.346X + 32.343 0.997
19.03 21.90 25.00 28.66 32.65 N/A
18.67 21.72 25.33 28.86 32.60 34.78
CV (%) 1.04 0.45 0.98 0.34 0.10 ·
M. fermentans 21.74 25.28 28.72 32.31 34.86 N/A Y = -3.35X + 32.074 0.996
21.78 25.17 28.61 32.22 34.90 N/A
21.92 25.45 28.98 32.51 35.31 N/A
CV (%) 0.43 0.55 0.66 0.45 0.71 ·
M. gallisepticum 19.12 22.64 26.07 29.11 N/A N/A Y = -3.458X + 35.729 0.99
19.21 22.70 26.11 29.43 32.39 N/A
19.57 22.69 26.05 29.65 32.57 N/A
CV (%) 1.23 0.14 0.11 0.92 0.39 ·
M. pneoumoniae · 25.43 28.47 31.99 N/A N/A Y = -3.495X + 35.656 0.998
· 25.30 28.76 32.34 35.85 N/A
· 25.01 28.46 32.06 35.62 N/A
CV (%) · 0.85 0.59 0.57 0.45 ·
M. orale · 25.44 29.19 32.29 35.41 N/A Y = -3.291X + 32.669 0.999
· 25.49 28.66 31.74 36.6 N/A
· 25.33 28.77 31.87 N/A N/A
CV (%) · 0.32 0.96 0.89 2.33 ·
r2 : 결정계수
*Values indicate crossing point (Cp) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
직선성 및 재현성 실험결과, 마이코플라즈마 7종인 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fementans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae), 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae) 모두 log CFU (CFU/mL; x)에 대한 crossing point 값(y) 간의 결정 계수(r2)는 0.99 이상으로 log CFU와 crossing point 값 간의 회귀성이 높은 것을 알 수 있으며, 변동계수(CV)가 변화 없이 일정하다는 것을 알 수 있다.
상기로부터 본 발명의 최적화된 real-time taqman PCR 방법이 직선성 및 재현성이 우수하다는 것을 알 수 있다.
TaqMan Real - Time PCR 방법의 견고성 실험
본 발명의 최적화된 real-time PCR 검사법이 어떠한 변수(method parameters)에 의해 영향을 받는지 알아보기 위해, 견고성 실험을 수행하였다. 이에 따라, 작은 변화에도 결과에 영향을 미칠 수 있는 MgCl2 농도 변화와 프라이머 제작회사에 따른 영향이 있는지를 알아보았다. 이를 위해, 마이코플라즈마 히오르히니스를 1×103 CFU/mL, 1×102 CFU/mL, 1×101 CFU/mL로 연속 희석하여 triplicate로 수행하였다. 결과 분석을 위해, 검출된 crossing point 값을 CFU/mL로 전환하여 작성하였으며, Crossing point는 PCR cycle이 대수기로 들어가는 cycle 수를 나타낸다.
CFU/ml Cp values obtained with different MgCl2 concentrations
Below optimal
concentration		 Optimal concentration Above optimal
concentration		 Mean of Cp SD of Cp CV(%)
1 x 103 22.47 22.24 22.37 22.41 21.76 22.08 21.88 21.65 21.80 22.07 0.31 1.41
1 x 102 25.87 25.60 25.68 25.55 25.59 25.71 25.24 25.40 25.30 25.55 0.20 0.79
1 x 101 29.38 31.07 28.93 29.05 29.04 29.06 29.14 28.89 28.87 29.27 0.69 2.36
Negative Control N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
CFU/ml Cp values obtained with different primer sets
Vendor A Vendor B Vendor C Mean of Cp SD of Cp CV(%)
1 x 103 21.82 21.93 21.66 22.19 21.91 21.70 22.41 21.76 22.08 21.94 0.24 1.12
1 x 102 25.19 25.18 25.16 25.28 25.29 25.39 25.55 25.59 25.71 25.37 0.20 0.79
1 x 101 28.73 28.91 28.46 29.06 28.93 29.02 29.05 29.04 29.06 28.92 0.20 0.70
Negative Control N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
견고성 실험 결과, 상기 표 17 및 표 18에 나타난 바와 같이, MgCl2 및 프라이머 제조회사에 대한 변수에 별다른 영향을 받지 않는 것을 알 수 있다.
상기로부터 본 발명의 최적화된 real-time PCR 방법은 높은 견고성을 나타내므로 최적화된 real-time PCR 방법으로부터 얻은 결과의 신뢰도가 높음을 알 수 있다.
Prototype 의 마이코플라즈마 검출 키트 ( MycoSure TM ) 제조
<10-1> 시험법 정도관리를 위한 DNA positive control ( Plasmid DNA ) 제작
정도관리를 위해 마이크로플라즈마 DNA positive control(Plasmid DNA)를 다음과 같이 제작하였다. 즉, 마이크로플라즈마 플라스미드 DNA positive control은 마이크로플라즈마 공통 프라이머(mycoplasma universal primer) 부위를 포함하고, 16S ribosomal RNA small subunit gene의 50번 염기에서 698번 염기까지를 포함하는 부위(Acholeplasma laidlawii를 기준, GenBank : M23932.1)를 TA vector에 cloning하여 제작하였다. 마이크로플라즈마 플라스미드 DNA positive control을 대장균 DH5α에 transformation 한 후 대장균을 배양하고, 대장균 배양액으로부터 QIAfilter™ Plasmid Midi kit를 이용하여 분리하여 분리된 마이크로플라즈마 플라스미드 DNA positive control의 농도를 UV spectrophotometer로 정량 한 후 분자량에 기초하여 copy수로 환산하였다.
<10-2> 마이코플라즈마 검출 키트의 제형 구성
본 실시예에서는 2가지 box 형태(box 1 및 box 2)로 마이코플라즈마 검출 키트 제형을 구성하였으며, 구체적인 제형 구성은 하기의 표 19에 나타내었다.
Package Description Cap color Stroage
Inside box 1: Mycoplasma Taqman Probe Real-time PCR Reagent Mycoplasma Real-time PCR Primer Mix(10x) Red -15 to -25℃
Mycoplasma Real-time PCR TaqMan probe (10x) Blue -15 to -25℃
Real-time PCR Master Mix(2x) Black -15 to -25℃
Negative control White -15 to -25℃
Inside box 2: Mycoplasma Taqman Probe Real-time PCR DNA control Mycoplasma Real-time PCR DNA Positive Control Yellow -15 to -25℃
Mycoplasma Real-time PCR DNA Spiking Positive Control Green -15 to -25℃
Mycoplasma Real-time PCR External Control(M. pneumoniae) Purple -15 to -25℃
즉, box 1은 TaqMan probe real-time PCR 관련 시약을 포함하도록 구성하였는데, 보다 구체적으로 Real-time PCR primer mix (10x), Real-time PCR TaqMan probe (10x), Real-tme PCR master mix (2x) 및 Negative control을 포함하며, 각 구성물들의 구별을 위해 cap color를 각각 다른 색으로 구별하였다(도 11a 참조). 또한, box 2는 상기 실시에 <10-2>에서 제작한 마이코플라스마 DNA positive control 포함하도록 구성하였으며, 이외에 Spiking control과 Inhibition control 목적의 DNA spiking positive control(plasmid DNA)을 포함하며, 필요할 경우 사용 가능한 M. pneumoniae 표준 균주 external control을 포함할 수 있다. box 2도 각 구성물들의 구별을 위해 cap color를 각각 다른 색으로 구별하였다(도 11b 참조).
Prototype의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure TM )의 검출 성능 확인
<11-1> 마이크로플라즈마 부정시험 시료 준비
Good PCR Practice에 기반하여 하기의 표 20에 기재된 순서로 시료를 준비하였다.
Sample Preparation
Negative control ·15μL of premix solution
·5μL of Negative control
Unknown sample
(Test sample)		 ·15μL of premix solution
·5μL of DNA extracted from test sample
Spiking control ·15μL of premix solution
·5μL of DNA extracted from test sample plus DNA positive control
Inhibition control ·15μL of premix solution
·5μL of DNA extracted from test sample
·0.5μL of DNA positive control (103copy/L)
Mycoplasma DNA positive control ·15μL of premix solution
·5μL of DNA positive control (102copy/L)
Mycoplasma external control ·15μL of premix solution
·5μL of DNA extracted from Mycoplasma species
Spiking control은 측정 시료로부터 마이코플라스마 DNA가 정상적으로 추출되었는지를 확인하기 위한 control로서, 특정양의 마이코플라즈마 DNA positive control을 측정 시료에 첨가하여 DNA를 추출한 후 real-time PCR 수행하였다.
Inhibition control은 측정 시료에 존재하는 물질로 인해 real-time PCR이 저해받는지를 확인하기 위한 control로서, 측정 시료로부터 DNA를 추출한 후 특정양의 마이코플라즈마 DNA positive control을 첨가한 후 real-time PCR 수행하였다.
<11-2> 마이크로플라즈마 부정시험 판정 기준
하기의 표 21에 기재된 것과 같이, 마이크로플라즈마 부정시험 판정 기준을 정하였다.
Criteria Sample Cp value
Criteria for test samples
 Negative sample N/A
Positive sample Cp≤38
Criteria for controls Negative sample N/A
Spiking control Cp≤38
Inhibition control Cp≤38
Mycoplasma DNA positive control Cp≤38
Mycoplasma external control Cp≤38
Spiking control △Cp<2
Inhibition control △Cp<2
<11-3> 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트와 종래의 마이코플라즈마 검출 키트 간의 검출 성능 비교
본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)의 검출 성능을 확인하기 위해, 하기와 같이 실험을 수행하였다.
즉, 바이오의약품생산공정 시료 A, B, C를 대상으로 종래의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSEQ™)와 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)의 민감도 비교 실험을 수행하였고, 그 결과를 표 22, 도 13 내지 18에 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 13 내지 도 15는 각각 종래의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSEQ™)를 이용한 샘플 A, B 및 C의 마이코플라스마 검출 결과를 나타낸 것이고, 도 16 내지 도 18은 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure)를 이용한 샘플 A, B 및 C의 마이코플라스마 검출 결과를 나타낸 것이다. 이때, 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트의 워크플로우(workflow)는 도 12에 나타내었다.
Test article 결과 판정
종래의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSEQ™) 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)
A Negative Negative
B Negative Negative
C Negative Positive
표 22에 나타낸 바와 같이, 종래의 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSEQ™)에서는 시료 A, B, C 모두 음성으로 판정된 반면, 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)에서는 시료 A, B는 음성, 시료 C는 양성으로 판정됨을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 마이코플라즈마 검출 키트(MycoSure™)의 민감도가 종래의 검출 키트보다 더 우수함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation <120> Primer set, TaqMan probe, and real-time PCR method for the detection of mycoplasma and real-time PCR method <130> PB13-11335 <150> 10-2012-0052168 <151> 2012-05-16 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer forward <400> 1 ggcgaatggg tgagtaacac g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer reverse <400> 2 cggataacgc ttgcgaccta tg 22 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-16 primer forward <400> 3 ttttggtgga tgccttgg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-16 primer reverse <400> 4 tttccccatt cggaaatc 18 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGSO primer forward <400> 5 gggagcaaac aggattagat accct 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGSO primer reverse <400> 6 tgcaccatct gtcactctgt taacctc 27 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. genus primer forward <400> 7 actcctacgg gaggcagcag ta 22 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. genus primer reverse <400> 8 tgcaccatct gtcactctgt taacctc 27 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma probe <400> 9 ygrcwaacta tgtgccagca gycgcg 26

Claims (8)

  1. 하기 단계를 포함하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 오염 유무 확인 방법:
    (a) 시료(sample)로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출된 유전체 DNA, 프라이머 세트(Primer set), 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe)를 포함하는 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)액을 제조하는 단계; 및
    (c) 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 실시간 중합효소연쇄반응액은 염화마그네슘(MgCl2)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 전방향 프라이머(forward primer), 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는 5` 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지된 마이코플라즈마에 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광발색제는 carboxyfluorescein (FAM), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein (JOE), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), indocarbocyanine-3 (Cy3), indocarbocyanine-5 (Cy5), 및 6-Carboxy-X-rhodamine (Rox) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 소광제는 Black Hole Quencher 1 (BHQ-1), Black Hole Quencher 2 (BHQ-2), Black Hole Quencher 3 (BHQ-3), 5-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), deep dark Quencher 1 (DDQ1), 및 deep dark Quencher 2 (DDQ2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 마이코플라즈마는 아코레플라즈마 라이드로우이(A. laidlawii), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(M. gallisepticum), 마이코플라즈마 페르멘탄스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumoniae), 및 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 프로브(Probe); 또는 상기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 마이코플라즈마 오염 유무 확인용 키트.
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