CN111004855A - 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒 - Google Patents

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CN111004855A CN202010005496.7A CN202010005496A CN111004855A CN 111004855 A CN111004855 A CN 111004855A CN 202010005496 A CN202010005496 A CN 202010005496A CN 111004855 A CN111004855 A CN 111004855A
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隋国栋
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Abstract

本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒，属于生物检测技术领域，引物组合包括内部引物组和外部引物组；内部引物组包括上游内部引物和下游内部引物，上游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、7、12或17所示，下游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4、8、13或18所述；外部引物组包括上游外部引物和下游外部引物，上游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、5、10或15所示，下游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2、6、11或16所示。本发明的引物组合对金黄色葡萄球菌具有高度的特异性，结合等温扩增方法能够缩短检测的时间，仅需45min就能够得出检测结果。

Description

一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测技术领域，尤其涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种非常重要的致病微生物，隶属于葡萄球菌属，是一种革兰氏阳性菌，能够引起非常严重的感染，更甚者则可能导致死亡。金黄色葡萄球菌可通过多种媒介传播，既可通过空气传播，又可以通过水、食物等方式传播，因而可以导致多种方式的感染。此外，金黄色葡萄球菌产生了多种突变体，可对多种抗生素(例如甲氧西林和万古霉素)产生抗药性，因此其传播不易被控制。目前，对金黄色葡萄球菌的检测方法主要采用的是培养法，通常需要48-72小时的培养，能够判定样本中是否含有金黄色葡萄球菌。感染性疾病是近年来临床常见的疾病之一，上感染、肺炎等疾病若不能作出及时诊断并及时用药，极易危及生命。目前对金黄色葡萄球菌的检测远不能达到时效需求，因此，对其快速、准确地检测具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒，本发明提供的引物组合对金黄色葡萄球菌具有高度的特异性，结合等温扩增方法能够缩短检测的时间。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合，所述引物组合包括内部引物组和外部引物组；
所述内部引物组包括上游内部引物和下游内部引物，所述上游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、7、12或17所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4、8、13或18所示；
所述外部引物组包括上游外部引物和下游外部引物，所述上游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、5、10或15所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2、6、11或16所示。
优选的，所述引物组合还包括环引物，所述环引物包括上游环引物和下游环引物，所述上游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9或19所示，所述下游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14或20所示。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组合、核酸扩增反应酶、核酸扩增缓冲液和扩增显色剂。
优选的，所述核酸扩增反应酶包括Bst DNA聚合酶。
优选的，所述Bst DNA聚合酶的酶活为5U～15U。
优选的，所述核酸扩增缓冲液包括20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、24mMMgSO4、0.1％Tween 20、1mM dNTP，所述核酸扩增缓冲液的pH值为8.8。
优选的，所述扩增显色剂包括SYBR Green I。
优选的，还包括阳性对照、阴性对照和芯片。
优选的，所述阳性对照包括感染金黄色葡萄球菌的阳性质粒。
优选的，所述阴性对照包括无核糖核酸酶和/或无脱氧核糖核酸酶的去离子水。
本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合，所述引物组合包括内部引物组和外部引物组；所述内部引物组包括上游内部引物和下游内部引物，所述上游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、7、12或17所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如SEQID No.4、8、13或18所述；所述外部引物组包括上游外部引物和下游外部引物，所述上游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、5、10或15所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2、6、11或16所示。本发明提供的引物组合对金黄色葡萄球菌具有高度的特异性，结合等温扩增方法能够缩短检测的时间，仅需45min就能够得出检测结果。
附图说明
图1为四条引物扩增检测实际样本核酸反应；
图2为四条引物扩增检测实际样本核酸灵敏度；
图3为第一组五条核酸扩增检测实际样本核酸反应；
图4为第一组五条引物扩增检测实际样本核酸灵敏度；
图5为六条核酸扩增检测实际样本核酸反应；
图6为六条引物扩增检测实际样本核酸灵敏度。
图7为第二组五条核酸扩增检测实际样本核酸反应；
图8为第二组五条引物扩增检测实际样本核酸灵敏度。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合，所述引物组合包括内部引物组和外部引物组；所述内部引物组包括上游内部引物和下游内部引物，所述上游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、7、12或17所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如SEQID No.4、8、13或18所述；所述外部引物组包括上游外部引物和下游外部引物，所述上游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、5、10或15所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2、6、11或16所示。
在本发明中，所述内部引物、外部引物和环引物针对金黄色葡萄球菌nuc基因进行设计，基因号是CP029080.1。
SEQ ID No.3：
5’-gctttgtttcaggtgtatcaaccaaattaatgtacaaaggtcaaccaatg-3’；
SEQ ID No.7：
5’-cgccgttacctgtttgtgatactttagttgtagcttcaagtc-3’；
SEQ ID No.12：
5’-atgtcattggttgacctttgtacatttttaaattacataaagaacctgcga-3’；
SEQ ID No.17：
5’-agggactatctttaccatgaacctttaagtggtgttacaaatactgaa-3’；
SEQ ID No.4：
5’-aaggtgtagagaaatatggtcctgattctttgcattttctaccatct-3’；
SEQ ID No.8：
5’-agatccaacagtatacagtgcaactcgtatcaccatcaatcgctt-3’；
SEQ ID No.13：
5’-gttgatacacctgaaacaaagcatcttttatctttttcgtaaatgcacttg-3’；
SEQ ID No.18：
5’-attggccaaagttcgataaaaaacattgagttagctgatgacgaatt-3’。
在本发明中，所述上游内部引物由F2区和F1c区域组成，F2区与金黄色葡萄球菌的特异性序列3’端的F2c区域互补，F1c区与金黄色葡萄球菌的特异性序列5'端的Flc区域序列相同；所述下游内部引物由B1c和B2区域组成，B2区与金黄色葡萄球菌的特异性序列3'端的B2c区域互补，B1C域与金黄色葡萄球菌的特异性序列5'端的Blc区域序列相同。
SEQ ID No.1：5’-gcgacattaattaaagcgattg-3’；
SEQ ID No.5：5’-cgctactagttgcttagtgtt-3’；
SEQ ID No.10：5’-aacagtatatagtgcaacttcaa-3’；
SEQ ID No.15：5’-aaggaacttggattcatttcc-3’；
SEQ ID No.2：5’-ctttgtcaaactcgacttcaa-3’；
SEQ ID No.6：5’-tgtcattgtttgacctttgt-3’；
SEQ ID No.11：5’-ctttgtcaaactcgacttcaa-3’；
SEQ ID No.16：5’-gcttgaacgatataatccatgt-3’。
在本发明中，所述引物组合还优选包括环引物，所述环引物包括上游环引物和下游环引物，所述上游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9或19所示，所述下游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14或20所示。在本发明中，所述环引物组可以加快扩增反应的进行，从而使得反应速率大幅提升。
SEQ ID No.9：5’-aaaaattacataaagaacctgcg-3’；
SEQ ID No.19：5’-aggtagttctattggagtaggtaattt-3’；
SEQ ID No.14：5’-ggtgtagagaaatatggtcctgaag-3’；
SEQ ID No.20：5’-gctatatcaactttagactttga-3’。
在本发明中，所述内部引物、外部引物和环引物的设计思路为：外部引物组的Tm值在55～63℃，碱基长度在15～25个。内部引物组5’端20个碱基左右的Tm值要高于其他引物组Tm值，控制在60～68℃，内部引物组3’端20个碱基左右的Tm值在55～63℃，整个引物碱基长度30～42个。环引物组的Tm值在60～66℃，碱基长度15～25个。所有引物的GC含量控制在30％～65％，需要保证引物的5’端和3’端稳定性，需要避免引物自身和引物之间形成二聚体。引物锚定在靶序列上的位置有着严格的要求，外部引物组之间的碱基长度控制在160～220，相对应的内部引物和外部引物之间的碱基控制在20个以内，内部引物组之间的碱基长度控制在120～180个。这4～6条引物能够锚定在核酸的6～8个位置，依赖外部引物组的链置换作用和内部引物组5’端和模板互补的序列特征形成可放大信号的扩增元件，形成一系列不同长度的扩增产物。
本发明还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组合、核酸扩增反应酶、核酸扩增缓冲液和扩增显色剂。
在本发明中，所述核酸扩增反应酶优选包括Bst DNA聚合酶，所述Bst DNA聚合酶可以是常规的Bst DNA聚合酶，也可以是热启动(hot start)型Bst DNA聚合酶，所述BstDNA聚合酶的酶活优选为5U～15U，更优选为8U。本发明对所述Bst DNA聚合酶的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
在本发明中，所述核酸扩增缓冲液包括20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、24mM MgSO4、0.1％Tween 20、1mM dNTP，所述核酸扩增缓冲液的pH值为8.8。
在本发明中，所述扩增显色剂优选包括SYBR Green I。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括阳性对照、阴性对照和芯片。在本发明中，所述阳性对照优选包括感染金黄色葡萄球菌的阳性质粒。在本发明中，所述阴性对照优选包括无核糖核酸酶和/或无脱氧核糖核酸酶的去离子水。在本发明中，所述芯片针对上述系列试剂进行反应微流体控制芯片即可。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括：提取样品基因组DNA，以所述样品基因组DNA为模板，使将试剂盒中的组分混合，得到反应体系，将所述反应体系加入芯片、封装后进行等温扩增，根据得到的Ct值，判断样品中是否含有金黄色葡萄球菌，当Ct值≤40时，判断为含有金黄色葡萄球菌。在本本发明中，所述等温扩增的温度优选为63℃，所述等温扩增的时间优选为45min。
在本发明中，当所述引物组合优选中优选含有4条引物时，四条引物内部上游引物(SEQ ID No.3)、内部下游引物(SEQ ID No.4)、外部上游引物(SEQ ID No.1)和外部下游引物(SEQ ID No.2)，反应体系每25μl中含有核酸扩增反应酶4μl，引物组合8μl，核酸扩增缓冲液4μl，扩增显色剂0.5μl，去离子水6.5μl，样品基因组DNA2μl。在本发明中，引物组合中，所述上游外部引物和下游外部引物的浓度独立的优选为0.1～0.5μM，更优选为0.2μM。在本发明中，所述引物组合中，所述下游内部引物和上游内部引物的浓度独立的优选为1～2μM，更优选为1.5μM。
在本发明中，当所述引物组合优选为5条引物时，5条引物为内部上游引物(SEQ IDNo.7)、内部下游引物(SEQ ID No.8)、外部上游引物(SEQ IDNo.5)、外部下游引物(SEQ IDNo.6)和上游环引物(SEQ ID No.9)，或5条引物为内部上游引物(SEQ ID No.12)、内部下游引物(SEQ ID No.13)、外部上游引物(SEQ ID No.10)、外部下游引物(SEQ ID No.11)和上游环引物(SEQ ID No.14)。在本发明中，反应体系每25μl中含有核酸扩增反应酶4μl，引物组合10μl，核酸扩增缓冲液4μl，扩增显色剂0.5μl，去离子水4.5μl，样品基因组DNA2μl。在本发明中，引物组合中，所述上游外部引物和下游外部引物的浓度独立的优选为0.1～0.5μM，更优选为0.2μM。在本发明中，所述引物组合中，所述下游内部引物和上游内部引物的浓度独立的优选为1～2μM，更优选为1.5μM。在本发明中，所述引物组合中，所述环引物的浓度独立的优选为1.5～2.5μM，更优选为2.2μM。
在本发明中，当所述引物组合优选为6条引物时，6条引物为内部上游引物(SEQ IDNo.17)、内部下游引物(SEQ ID No.18)、外部上游引物(SEQ IDNo.15)、外部下游引物(SEQID No.16)、上游环引物(SEQ ID No.19)和下游环引物(SEQ IDNo.20)，所述反应体系每25μl中含有核酸扩增反应酶4μl，引物组合12μl，核酸扩增缓冲液4μl，扩增显色剂0.5μl，去离子水2.5μl，样品基因组DNA2μl。在本发明中，引物组合中，所述上游外部引物和下游外部引物的浓度独立的优选为0.1～0.5μM，更优选为0.2μM。在本发明中，所述引物组合中，所述下游内部引物和上游内部引物的浓度独立的优选为1～2μM，更优选为1.5μM。在本发明中，所述引物组合中，所述环引物的浓度独立的优选为1.5～2.5μM，更优选为2.2μM。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例用到的试剂耗材：
实施例1
采用等温扩增技术对金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒(4条引物：SEQ ID No.1～4)
1)样本采集
采集患者的食品样本标本，标本置于采样管中保存。
2)采用检测试剂盒的样本提取核酸
取100μL食品样本置于1.5ml离心管中，加入100μL裂解液(0.5％w/v SDS,0.5％w/v月桂酰肌氨酸钠，TE缓冲液,pH 7.5)，混匀待检测样本和裂解液。室温裂解半小时，用酚氯仿(1:1)进行抽提，乙醇沉淀核酸。
3)核酸扩增反应检测
将核酸扩增反应酶、扩增引物、核酸扩增缓冲液、扩增显色剂和去离子水以及混合好的待测样本加入检测芯片中。将检测芯片置于相应检测仪器ABI7500中63℃45min，每30s检测一次荧光，荧光通道为FAM通道，反应结束后观察等温扩增过程的荧光强度变化，在反应后通过判定荧光强度变化率，判定检验结果，结果如图1～2。其中核酸扩增反应酶为BstDNA聚合酶，酶活为8U/μl；核酸扩增缓冲液为20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、24mM MgSO4、0.1％Tween 20、1mM dNTP，所述核酸扩增缓冲液的pH值为8.8；扩增显色剂为SYBR Green I，内部扩增引物SEQ ID No.3和No.4，使用浓度为1.5μM，外部扩增引物SEQ IDNo.1和No.2，使用浓度为0.2μM。
表1反应体系
Figure BDA0002355120500000071
Figure BDA0002355120500000081
从图1～2中可以得出，该样本的出峰时间在20min，通过稀释该样本10倍、100倍、250倍、500倍和1000倍做荧光曲线，得出，该样本可以稀释100倍，初始样本的核酸经分光光度法检测为2ng/μl，该引物组和恒温扩增方法灵敏度达到20pg/μl。
实施例2
采用等温扩增技术对金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒(5条引物)
1)样本采集
采集患者的食品样本标本，标本置于采样管中保存。
2)采用检测试剂盒的样本提取核酸
取100μL食品样本置于1.5ml离心管中，加入100μL裂解液(同实施例1)，混匀待检测样本和裂解液。
3)核酸扩增反应检测
将核酸扩增反应酶、扩增引物、核酸扩增缓冲液、扩增显色剂和去离子水以及混合好的待测样本加入检测芯片中。将检测芯片置于相应检测仪器(同实施例1)中45分钟，反应结束后观察等温扩增过程的荧光强度变化，在反应后通过判定荧光强度变化率，判定检验结果，结果如图3～4。其中核酸扩增反应酶和核酸扩增缓冲液同实施例1；扩增显色剂为SYBR Green I，内部扩增引物SEQ ID No.7和No.8使用浓度为1.5μM，外部扩增引物SEQ IDNo.5和No.6，使用浓度为0.2μM，环引物SEQ ID No.9，使用浓度为2.2μM。
表2反应体系
Figure BDA0002355120500000082
Figure BDA0002355120500000091
从图3和4中可以得出，该样本的出峰时间在15min，通过稀释该样本10倍，100倍，250倍，500倍，1000倍做荧光曲线，得出，该样本可以稀释250倍，初始样本的核酸经分光光度法检测为2ng/μl，该引物组和恒温扩增方法灵敏度达到8pg/μl。
实施例3
采用等温扩增技术对金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒(6条引物：内部扩增引物SEQ ID No.17和No.18，使用浓度为1.5μM，外部扩增引物SEQ ID No.15和No.16，使用浓度为0.2μM，环引物SEQ ID No.19和No.20，使用浓度为2.2μM)。
1)样本采集
采集患者的食品样本标本，标本置于采样管中保存。
2)采用检测试剂盒的样本提取核酸
取100μL食品样本置于1.5ml离心管中，加入100μL裂解液(0.5％w/v SDS，0.5％w/v月桂酰肌氨酸钠，TE缓冲液，pH 7.5)，混匀待检测样本和裂解液，室温裂解半小时，用酚氯仿(1:1)进行抽提，乙醇沉淀核酸。
3)核酸扩增反应检测
将核酸扩增反应酶、扩增引物、核酸扩增缓冲液、扩增显色剂和去离子水以及混合好的待测样本加入检测芯片中。将检测芯片置于相应检测仪器(同实施例1)中45分钟，反应结束后观察等温扩增过程的荧光强度变化，在反应后通过判定荧光强度变化率，判定检验结果，结果如图5～6。其中核酸扩增反应酶和核酸扩增缓冲液同实施例1；扩增显色剂为SYBR Green I。
表3反应体系
扩增引物(6条) 12μL
DNA聚合酶 4μL
核酸扩增缓冲液 4μL
扩增显色剂 0.5μL
去离子水 2.5μL
待测样本 2μL
总体积为25μL
从图5和6中可以得出，该样本的出峰时间在12min，通过稀释该样本做荧光曲线，得出，该样本可以稀释500倍，初始样本的核酸经分光光度法检测为2ng/μl，该引物组和恒温扩增方法灵敏度达到4pg/μl。
实施例4
采用等温扩增技术对金黄色葡萄球菌快速检测的试剂盒(5条引物)
1)样本采集
采集患者的食品样本标本，标本置于采样管中保存。
2)采用检测试剂盒的样本提取核酸
取100μL食品样本置于1.5ml离心管中，加入100μL裂解液(0.5％w/v SDS，0.5％w/v月桂酰肌氨酸钠，TE缓冲液，pH 7.5)，混匀待检测样本和裂解液，室温裂解半小时，用酚氯仿(1:1)进行抽提，乙醇沉淀核酸。
3)核酸扩增反应检测
将核酸扩增反应酶、扩增引物、核酸扩增缓冲液、扩增显色剂和去离子水以及混合好的待测样本加入检测芯片中。将检测芯片置于ABI 7500，63℃45min，每30s检测一次荧光，荧光通道为FAM通道。检测仪器中45min，反应结束后观察等温扩增过程的荧光强度变化，在反应后通过判定荧光强度变化率，判定检验结果，结果如图7～8。其中核酸扩增反应酶和核酸扩增缓冲液同实施例1；扩增显色剂为SYBR Green I，内部扩增引物SEQ ID No.12和No.13，使用浓度为1.5μM，外部扩增引物SEQ ID No.10和No.11，使用浓度为0.2μM，环引物SEQ ID No.14，使用浓度为2.2μM。
表4反应体系
扩增引物(5条) 10μL
DNA聚合酶 4μL
核酸扩增缓冲液 4μL
扩增显色剂 0.5μL
去离子水 4.5μL
待测样本 2μL
总体积为25μL
图7为该核酸样本用五条引物进行反应，有阴性对照，阳性对照，和样本，图8将该样本进行稀释，根据Ct值判断该样本可以稀释的倍数。该样本的出峰时间在15min，通过稀释该样本10倍，100倍，250倍，500倍，1000倍做荧光曲线，得出，该样本可以稀释250倍，初始样本的核酸经分光光度法检测为2ng/μl，该引物组和恒温扩增方法灵敏度达到8pg/μl。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合和试剂盒
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgacattaa ttaaagcgat tg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttgtcaaa ctcgacttca a 21
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctttgtttc aggtgtatca accaaattaa tgtacaaagg tcaaccaatg 50
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggtgtaga gaaatatggt cctgattctt tgcattttct accatct 47
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgctactagt tgcttagtgt t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtcattgtt tgacctttgt 20
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgccgttacc tgtttgtgat actttagttg tagcttcaag tc 42
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatccaaca gtatacagtg caactcgtat caccatcaat cgctt 45
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaattaca taaagaacct gcg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacagtatat agtgcaactt caa 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctttgtcaaa ctcgacttca a 21
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgtcattgg ttgacctttg tacattttta aattacataa agaacctgcg a 51
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttgatacac ctgaaacaaa gcatctttta tctttttcgt aaatgcactt g 51
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtgtagaga aatatggtcc tgaag 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaggaacttg gattcatttc c 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcttgaacga tataatccat gt 22
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agggactatc tttaccatga acctttaagt ggtgttacaa atactgaa 48
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attggccaaa gttcgataaa aaacattgag ttagctgatg acgaatt 47
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aggtagttct attggagtag gtaattt 27
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctatatcaa ctttagactt tga 23

Claims (10)

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括内部引物组和外部引物组；
所述内部引物组包括上游内部引物和下游内部引物，所述上游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3、7、12或17所示，所述下游内部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4、8、13或18所示；
所述外部引物组包括上游外部引物和下游外部引物，所述上游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1、5、10或15所示，所述下游外部引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2、6、11或16所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括环引物，所述环引物包括上游环引物和下游环引物，所述上游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9或19所示，所述下游环引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14或20所示。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合、核酸扩增反应酶、核酸扩增缓冲液和扩增显色剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增反应酶包括Bst DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶的酶活为5U～15U。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增缓冲液包括20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、24mM MgSO4、0.1％Tween 20、1mM dNTP，所述核酸扩增缓冲液的pH值为8.8。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增显色剂包括SYBR GreenI。
8.根据权利要求3～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照、阴性对照和芯片。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括感染金黄色葡萄球菌的阳性质粒。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括无核糖核酸酶和/或无脱氧核糖核酸酶的去离子水。
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