CN115867653A - 用于检测靶核酸的环状引物和loop-de-loop方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了使用经生物传感器标记的寡核苷酸检测靶核酸的新的loop‑de‑loop方法。本文中还提供了用于在所述方法中使用的环状引物和试剂盒。
Description
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月13日提交的美国临时专利申请No.62/989,140的优先权,其通过引用整体并入。
2.序列表
本申请包含具有XXX序列的序列表,该序列表已通过EFS-Web提交并且在此通过引用整体并入本文。在XXXX创建的所述ASCII拷贝被命名为48397WO_sequencelisting.txt,并且大小为XXX字节。
3.背景技术
迄今为止,使用核酸序列的互补性检测靶核酸的方法已经由传统的Southern杂交进行了多种改进或修改。特别地,建立的多种体外核酸扩增方法,例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)和环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)能够检测到更少量的靶核酸。这些方法已用于样品中靶核酸的序列特异性检测和定量,以用于感染的医学诊断、突变体基因型的确定、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和点突变的检测,等等。核酸扩增方法由于其高特异性和灵敏度而已经是用于测试的金标准。
然而,当前的核酸扩增方法具有局限性,因为扩增反应和信号检测需要受控的环境和使用昂贵仪器的精确测量。因此,对于在即时(point-of-care)情况下的使用,这些方法通常成本过高。另外,这些方法未针对单个患者样品中多重靶标的检测进行优化。多重靶标的检测可通过以下来实现:单锅反应中的信号多重化(signal multiplexing)(荧光光谱多重化、电化学检测器阵列)、将多个反应物理分离到独特的反应容器中、或其组合。然而,在CLIA豁免测试(CLIA waived test)的情况下,用户必需要求不超过三个简单步骤就使用单个患者样品同时查询一组核酸靶标。因此,对于CLIA豁免测试,将样品物理分离到离散室很快变得不可行,除非复杂的装置或一次性用品(disposable)能够自动地处理加工。利用荧光的谱多重化可降低靶向一组核酸靶标所需的独特反应的数目,但谱多重化LAMP反应需要在测定速度或信号强度方面做出巨大牺牲,这抑制了成功应用于POC测试的前景。
因此,需要开发能够容易地扩增和检测靶核酸,特别是多重靶标,并且在低成本下具有高灵敏度和特异性的新方法。
4.发明内容
本公开内容提供了新的扩增方法,其能够在封闭系统中容易地检测靶核酸。该方法允许通过使用具有生物传感器对的环状引物(looped primer)以高特异性和灵敏度检测少量靶核酸。生物传感器对允许通过检测该环状引物的构象变化来确定靶序列的loop-de-loop(“LDL”)扩增,所述检测例如通过使用荧光/猝灭剂FRET技术进行。另外,使用多个生物传感器能够在单个管中检测多重靶标。环状引物不仅可与环介导等温扩增(LAMP)组合使用,而且可与任何其他利用链置换聚合酶的核酸扩增方法组合使用。
本申请人已表明,与先前已知的涉及抑制性荧光探针例如DARQ(通过释放猝灭来检测扩增)和OSD(一步置换)探针的方法相比,loop-de-loop扩增方法允许以更快的周转时间以改善的灵敏度和特异性对靶核酸分子进行序列特异性扩增。此外,与QUASR(未并入的扩增信号报道基因的猝灭)不同,loop-de-loop扩增方法允许实时检测扩增信号。由于loop-de-loop方法即使使用粗制样品仍能提供强信号,因此该方法可通过低成本仪器进行。
因此,本发明提供了用于使用环状引物(例如,经荧光团标记的引物)检测样品中存在的一种或更多种靶核酸的方法。经荧光团标记的引物是这样的经荧光团标记寡核苷酸,其与靶核酸具有互补性并且具有连续环序列,所述连续环序列是在未经修饰的引物序列的5’末端处或附近用生物传感器对(例如,荧光团或猝灭剂分子)进行内部标记的。经荧光团标记的引物是在添加的环序列的5’末端处或附近分别用猝灭剂或荧光团进行标记的,以使FRET能够具有前述点中描述的内部标记。在一些实施方案中,经荧光团标记的引物是在添加的环序列的5’末端处或附近用荧光团进行标记以及在内部位点用猝灭剂进行标记的。经荧光团标记的引物还包含在环序列的3’末端(与未经修饰的引物序列的交叉处)的第一夹序列(first clamping sequence)。该序列可与未经修饰的引物序列重叠、与未经修饰的引物序列直接相邻、或与未经修饰的引物序列间隔开。该序列可包含dNTP、锁核酸或任何其他形式的核酸修饰或替换。
所述夹序列的解链温度优选比使用链置换聚合酶进行的测定的延伸温度高约10℃,但也可比该测定的延伸温度低、与其相等、或比其高任何量。
在夹序列的解链温度比反应的延伸温度低的情况下,该方法中的实时检测可被终点检测(将反应冷却至接近或低于夹序列的Tm)替代。在这种情况下,即使当使用全强度的环状引物(用环状引物类似物100%替换未经修饰的引物)时,也不抑制反应。
在夹序列的解链温度等于反应的延伸温度的情况下,实时检测仍然是可行的,但可存在更高的背景荧光直至冷却反应以确定终点。
在夹序列的解链温度比反应的延伸温度高的情况下,实时检测是主要的操作模式,并且将存在最小的背景荧光。
经荧光团标记的引物还包含将内部缀合的荧光团或猝灭剂与5’末端猝灭剂或荧光团分隔开适当距离的间隔序列,以在引物为线性(延伸)构象时抑制FRET,并且由此提高荧光。间隔序列在序列和长度方面是任意的,并且可包含脱氧核糖核苷酸、锁核酸等。长度可以是25个核苷酸,但也可以更短或更长。
经荧光团标记的引物还包含在环序列的5’末端处或附近的第二夹序列,即第一夹序列的反向互补物。经荧光团标记的引物还可包含进一步位于loop-de-loop寡核苷酸的5’末端的另外的DNA条码、探针或序列。该序列可包含dNTP、锁核酸或任何其他形式的核酸修饰或替换。
与第一夹序列配对的第二夹序列的解链温度优选比使用链置换聚合酶进行的测定的延伸温度高10℃,但也可比该测定的延伸温度低、与其相等、或比其高任何量。
环状的经荧光团标记的引物还可在5’末端包含另外的序列、分子、纯化标签、珠或其他部分,以实现进一步的应用,例如:核酸捕获、分子条码化、磁分离、柱纯化、电泳分离。图案化(pattern)到底物上的探针捕获寡核苷酸可用于捕获扩增产物,从而产生荧光、色度、发光或其他的带或区。
环状引物可不同程度地滴定到测定中以使成本最小化或提高灵敏度和特异性。
如本文中所述的环状引物可被设计成具有除了荧光团之外的传感器分子,例如,在紧密接近或当充分移开时提供发光、颜色变化或其他可测量信号的报道分子。在一些情况下,可使用生物传感器,例如NanoLuc、Nanobit、NonoBRET。
在使用发光蛋白的情况下,信号的降低可以是阳性反应的关键指示。在一些实施方案中,可通过生物发光进行终点分析。
能够进行链置换的酶可用于扩增靶序列。还可使用所选核酸扩增方法所需的其他试剂。
本文中提供的方法可降低假阳性和非特异性扩增检测,因为其允许在具有高浓度非靶RNA或DNA的高背景条件下特异性检测荧光信号。荧光检测仅允许特异性检测那些并入了经标记引物的扩增子和产物。这允许即使当使用粗制或未经处理的样品例如生殖器拭子、粪便、唾液、尿、血液、植物材料、土壤、环境样品等时也进行特异性检测。
在一些实施方案中,该方法可用于检测多于一种的独特的核酸靶标。在这样的双重、三重或更高阶多重LAMP测定中,可对靶标进行差异标记。例如,一种靶标用FAM标记,并且另一种用Cy5标记。在一些情况下,对检测进行谱多重化以用多种经标记引物检测单核酸靶标,以进一步降低区分真阳性与假阳性的能力。在一些情况下,检测使用单一标记(例如FAM)用于多种靶标,并且各靶标的身份可基于对实时或终点信号的分析来确定,所述信号取决于测定的特定背景(例如,相对信号强度、产生结果的时间等)。在一些情况下,多重化可通过在物理反应室中进行反应来实现。在一些情况下,多重化可在单个反应室中实现。
与其他实时LAMP置换探针技术相比,本文中提供的方法使抑制最小化,使得该方法高度灵敏。滴定到测定中表明,对于至少50%的环引物替换,维持了全反应速度。滴定到测定中表明,对于至少25%的内引物替换,维持了全反应速度。
本文中提供的环状引物可用于环介导扩增(LAMP),其利用链置换聚合酶,例如从嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacilus stearothermophilus,以前为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))分离或分出的聚合酶。在这种情况下,环状引物可与用于LAMP的其他引物一起使用,所述其他引物包括正向内引物、反向内引物、环正向引物、环反向引物、F3引物和B3引物。
在一些实施方案中,使用包括但不限于冻干过程的过程来干燥引物和可能的其他反应组分。经干燥的引物可包含在诊断试剂盒中。在一些优选实施方案中,冻干过程不影响LAMP引物组的灵敏度。
在一个方面中,本公开内容提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增(LdL)的环状引物,其从5’至3’包含:第一传感器分子;第一夹寡核苷酸(first clampingoligonucleotide);间隔寡核苷酸(spacing oligonucleotide);第二夹寡核苷酸,其中第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;第二传感器分子,其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对;以及第一引物序列,其与靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中,第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸互补。
在一些实施方案中,第一生物传感器对是能量供体和接受体对。在一些实施方案中,第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer,FRET)或生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energytransfer,BRET)的能量供体和接受体对。在一些实施方案中,第一传感器分子是FRET荧光团并且第二传感器分子是FRET猝灭剂。在一些实施方案中,第一传感器分子是FRET猝灭剂并且第二传感器分子是FRET荧光团。在一些实施方案中,第一传感器分子是BRET能量供体并且第二传感器分子是BRET能量接受体。在一些实施方案中,第一传感器分子是BRET能量接受体并且第二传感器分子是BRET能量供体。在一些实施方案中,第一传感器分子和第二传感器分子可形成产生可检出光信号的复合物。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于60℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于65℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于70℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于80℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为70℃至80℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为72.5℃至77.5℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约75℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为3至10个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为3至7个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为6个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为5至35个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为10至20个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为13至18个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为13个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起的长度为15至35个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起的长度为20至30个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸一起的长度为23至28个核苷酸。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基,(ii)锁核酸,(iii)2”O-甲基RNA碱基,(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基,(v)硫代磷酸酯化RNA碱基,(vi)硫代磷酸酯化2”-O-甲基RNA碱基,或(vii)其组合。
在一些实施方案中,环状引物还包含在环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。在一些实施方案中,环状引物还包含在第一传感器分子与第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。
在一些实施方案中,第一另外的寡核苷酸或第二另外的寡核苷酸是条码序列。
在一些实施方案中,靶序列对病原体基因组具有特异性。在一些实施方案中,靶序列对沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)具有特异性。在一些实施方案中,靶序列来自orf8或cds2。在一些实施方案中,环状引物包含SEQ ID NO:15的寡核苷酸。
在一些实施方案中,靶序列对淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)具有特异性。在一些实施方案中,靶序列来自porA或glnA。在一些实施方案中,环状引物包含SEQ ID NO:5或7的寡核苷酸。
在一些实施方案中,靶序列对病毒具有特异性。在一些实施方案中,病毒是SARS-CoV-2。
在一些实施方案中,靶序列对智人(Homo sapiens)具有特异性。在一些实施方案中,靶序列来自tbc1d3。在一些实施方案中,环状引物包含SEQ ID NO:22的寡核苷酸。
在另一个方面中,本公开内容提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增的引物混合物,其包含本文中提供的环状引物。
在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)正向内引物(forward inner primer,FIP)、(ii)反向内引物(backward inner primer,BIP)、(iii)正向引物(forward primer,F3)和反向引物(backward primer,B3),其中FIP、BIP、F3和B3与靶序列上的六个不同的结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物包含(i)正向环引物(loop forward primer,LF)和(ii)反向环引物(loop backward primer,LB),其中LF和LB与靶序列上的两个不同的结合位点结合。在一些实施方案中,FIP、BIP、F3、B3、LF或LB与靶序列上的第一结合位点结合。在一些实施方案中,FIP与第一结合位点结合,并且引物混合物中FIP与环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。在一些实施方案中,BIP与第一结合位点结合,并且引物混合物中BIP与环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。在一些实施方案中,LF与第一结合位点结合,并且引物混合物中LF与环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。52.在一些实施方案中,LB与第一结合位点结合,并且引物混合物中LB与环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸,LF包含SEQ IDNO:6的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸,LF包含SEQ IDNO:6的寡核苷酸,并且LB包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,LF包含SEQ IDNO:13的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,LF包含SEQ IDNO:13的寡核苷酸,并且LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,LF包含SEQID NO:20的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。
在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,LF包含SEQID NO:20的寡核苷酸,并且LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。
在一些实施方案中,引物混合物还包含第二环状引物,其中第二环状引物包含:第三传感器分子;第三夹寡核苷酸;第二间隔寡核苷酸;第四夹寡核苷酸,其中第三夹寡核苷酸、第二间隔寡核苷酸和第四夹寡核苷酸可在低于第三夹寡核苷酸和第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;第四传感器分子,其中第三传感器分子和第四传感器分子是第二生物传感器对,并且第二生物传感器对与第一生物传感器对不同;以及第二引物序列,其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中,第三夹寡核苷酸与第四夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中,靶序列和第二靶序列是相同的。在一些实施方案中,靶序列和第二靶序列是不同的。
在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第二正向内引物(second forwardinner primer,SFIP)、(ii)第二反向内引物(second backward inner primer,SBIP)、(iii)第二正向引物(second forward primer,SF3)和(iv)第二反向引物(secondbackward primer,SB3),其中SFIP、SBIP、SF3和SB3与第二靶序列上的六个不同的结合位点结合。
在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第二正向环引物(second loopforward primer,SLF)和(ii)第二反向环引物(second loop backward primer,SLB),其中SLF和SLB与第二靶序列上的两个不同的结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物还包含第三环状引物,其中第三环状引物包含:第五传感器分子;第五夹寡核苷酸;第三间隔寡核苷酸;第六夹寡核苷酸,其中第五夹寡核苷酸、第三间隔寡核苷酸和第六夹寡核苷酸可在低于第五夹寡核苷酸和第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;第六传感器分子,其中第五传感器分子和第六传感器分子是第三生物传感器对,并且第三生物传感器对与第一生物传感器对和第二生物传感器对不同;以及第二引物序列,其与第三靶序列上的第一结合位点互补。在一些实施方案中,第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中,靶序列、第二靶序列和第三靶序列是相同的。在一些实施方案中,靶序列、第二靶序列和第三靶序列是不同的。在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第三正向内引物(third forward inner primer,TFIP)、(ii)第三反向内引物(third backward innerprimer,TBIP)、(iii)第三正向引物(third forward primer,TF3)和(iv)第三反向引物(third backward primer,TB3),其中TFIP、TBIP、TF3和TB3与第三靶序列上的六个不同的结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第三正向环引物(third loopforward primer,TLF)和(ii)第三反向环引物(third loop backward primer,TLB),其中TLF和TLB与第三靶序列上的两个不同的结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物还包含第四环状引物。在一些实施方案中,引物混合物还包含第五环状引物。
在又一个方面中,本公开内容提供了经干燥引物混合物,其通过对本文中提供的环状引物或引物混合物进行冻干而获得。
在一个方面中,本公开内容提供了用于靶序列的loop-de-loop扩增的试剂盒,其包含本文中提供的环状引物、引物混合物或经干燥引物混合物。在一些实施方案中,试剂盒还包含聚合酶,其中聚合酶任选地是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒还包含dNTP、MgSO4和缓冲剂。在一些实施方案中,试剂盒还包含逆转录酶。在一些实施方案中,试剂盒还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中,RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
在另一个方面中,本公开内容提供了检测样品中靶序列的方法,其包括以下步骤:提供样品;将以下以及聚合酶添加至该样品,从而产生反应混合物:(i)引物、(ii)引物混合物、或(iii)通过使如本文中所述的经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物;以及在50℃至85℃下孵育该反应混合物。在一些实施方案中,孵育在50℃至70℃下进行。在一些实施方案中,孵育在60℃至65℃下进行。在一些实施方案中,孵育在62℃至65℃下进行。在一些实施方案中,聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。在一些实施方案中,所述方法还包括检测来自反应混合物的信号的步骤。在一些实施方案中,信号是荧光信号。在一些实施方案中,检测步骤在孵育步骤期间进行。在一些实施方案中,所述方法还包括确定样品中存在或不存在靶序列的步骤。
在一些实施方案中,所述方法还包括制备样品的在先步骤。在一些实施方案中,制备样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用,从而产生包含DNA分子的样品。在一些实施方案中,制备样品的步骤还包括在与逆转录酶相互作用之前或期间对RNA分子进行预热。在一些实施方案中,反应混合物还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中,RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA抑制剂。
在一些实施方案中,样品包含经纯化RNA、经纯化DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。在一些实施方案中,样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
5.附图说明
图1示出了环状引物的结构以及DNA扩增如何在Loop-de-Loop方法中进行。
图2A提供了沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)和淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,NG)的LAMP测定结果,其用嵌入染料(SYTO)可视化。对于CT而言,扩增在至少5log的[DNA]内是快速的(<30分钟),并且对于NG而言,扩增在至少6log内是快速的(<30分钟)。通过PROBIT分析,NG测定分析灵敏度(LOD50)为35cp/10μL反应物。
图2B提供了使用新的环状引物的靶标扩增的读出。结果显示出对靶标的非常明亮的实时检测,其与SYTO染料相比具有增强的特异性并且具有最小的抑制作用。
图2C提供了用新的环状引物检测淋病奈瑟菌。结果显示,所述方法具有可重复性,并产生了快速、稳健、高信噪比的扩增。探针消除了假阳性。
图3是实时荧光信号随时间变化的图,显示了使用Loop-de-Loop方法在50%替换下用经FAM标记LF引物对沙眼衣原体的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图4是实时荧光信号随时间变化的图,显示了使用Loop-de-Loop方法在50%替换下用经FAM标记LF引物对淋病奈瑟菌的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图5是实时荧光信号随时间变化的图,显示了使用Loop-de-Loop方法在50%替换下用经FAM标记LF引物对智人的靶核酸的扩增。如右表所示测试阳性和阴性样品二者。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图6提供了含有具有Loop-de-Loop引物的4个阳性(左)和4个阴性(右)反应物的管的图像。荧光用蓝色LED激发,照射(shine)以通过蓝色凝胶滤光片,且发射用固定在照相手机上的琥珀色塑料滤光片进行可视化。
图7提供了包含通过在PCR管中进行冻干而制备的经干燥(冻干)混合物的管的图像,所述经干燥(冻干)混合物用于沙眼衣原体(顶部)、淋病奈瑟菌(中部)和智人(底部)的环状引物测定。
图8提供了显示在使用图7的经干燥混合物的Loop-de-Loop反应中沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和智人的靶核酸的扩增的实时荧光信号,所述经干燥混合物在使用之前进行重构。结果显示出经干燥并随后重构的引物的维持的测定活性和灵敏度。
图9A(第一测试)和9B(第二测试)绘制了在不同温度下获得使用POP7b(智人(H.sapiens)RNA转录物)或ORF1ab(SARS-CoV-2基因组RNA)引物组的Loop-de-Loop LAMP反应的结果所需的时间。
图10提供了靶向来自智人、沙眼衣原体(C.Trachomatis)和淋病奈瑟菌(N.Gonorrhoeae)的DNA或SARS-CoV-2的loop-de-loop引物的解链曲线。该loop-de-loop引物被设计为在高于反应温度65℃约10℃时解折叠(unfold)。该曲线表明loop-de-loop引物的茎环序列导致荧光信号。
图11提供了来自使用25%、50%或100%强度的引物的loop-de-loop反应的实时荧光信号。在这种情况下,“强度”是指对于Loop-de-Loop方法,引物被环状形式替换的程度。数据显示,越强的引物倾向于提供越大的信号,以换取产生结果的时间放缓1至2分钟。100%强度的Loop-de-Loop引物使测定减慢,但不会接近达到其他实时LAMP置换探针方法的程度。y轴上的每个“周期”均表示在65摄氏度下经过的30秒的时间。
图12提供了来自loop-de-loop反应物的相对荧光信号,所述loop-de-loop反应物包含0.4μM的loop-de-loop引物和2μM SYTO嵌入染料。2-通道荧光数据显示嵌入染料(SYTO)和loop-de-loop信号显现的时机相同。loop-de-loop与嵌入染料相比没有信号延迟,且loop-de-loop反应比SYTO提供更大的信号。
图13A和13B示出了来自使用Loop-de-Loop反应扩增沙眼衣原体的靶序列的实时荧光信号。图13A是来自新鲜混合的反应混合物的结果,并且图13B是来自经冷冻干燥反应混合物的结果。经冷冻干燥测定混合物稳定持续超过3个月,并提供了良好的读出。测定以14次重复运行,各自在该测定的LoD95(低阳性,20.7拷贝/μL)下的Ct E BOUR(一种沙眼衣原体菌株),加2个无模板对照(NTC)。新鲜和冷冻干燥的反应混合物之间在灵敏度(12/14,各自在LoD95下)或产生结果的平均时间(16分钟,T检验,P值=0.66)方面没有变化。
图14A、14B和14C示出了来自在单管反应(单锅)中SARS-CoV-2和人靶序列的loop-de-loop扩增的谱双重荧光信号。虚线信号来自SARS-CoV-2(FAM),且实线信号来自人内部对照(Cy5)。使用了三种类型的样品—没有靶序列的对照样品(图14A)、粗制人鼻拭子(图14B)和与热灭活的SARS-CoV-2(具有基因组RNA靶序列的完整病毒)组合的粗制人鼻拭子(图14C)。数据显示出仅在靶序列存在时的特异性扩增信号。数据进一步表明了在单个反应容器中使用loop-de-loop方法时反应的谱多重化。
图15A示出了在不同浓度的POP7b引物下来自loop-de-loop扩增的实时荧光信号。随着POP7b引物浓度的降低,信号强度也降低(箭头)。在单个反应体积中使用超过一个引物组的多重化应用中,与100%的引物属于单个组的反应相比,任何给定引物组的浓度都将降低。图15B绘制了在不同浓度的POP7b引物下产生结果的时间(分钟)。当引物浓度降至40%以下时,产生结果的时间会受到影响,这对于许多应用(其中在单个管中对超过2个靶标进行多重化的优势超过临床的或基于市场的对速度的需求)来说是可以接受的。在反应中,10-4gBlock DNA用于21μL反应体积。
图16示出了在从冠状病毒阳性对象获得的未经处理的鼻拭子中来自对SARS-CoV-2具有特异性的RNA靶序列(ORF1ab)、对智人具有特异性的RNA靶序列(POP7b)、或对两种靶标具有特异性的靶序列、或对两种靶标都不具有特异性的靶序列的loop-de-loop RT-LAMP扩增的实时荧光信号。将该鼻拭子直接洗脱到loop-de-loop RT-LAMP试剂中,并稀释至4个浓度到反应混合物中。1×拭子表示该测试配置中使用的样品的标准浓度,以每单位体积洗脱的拭子为单位。在这种情况下,SARS-CoV-2和人RNA引物组在单个管中被双重化(duplexed)。每个引物组均包含1个环状引物,每个均标记有相同的荧光团和猝灭剂对(单荧光通道)。结果是检出SARS-CoV-2和人RNA二者的反应,其特征为双扩增信号。导致检出两个靶标的稀释液被标记为“双阳性”;导致检出任一靶标的稀释液被标记为“单阳性”;导致两个靶标都未检出的稀释液被标记为“双阴性”。该数据表明,对于这名冠状病毒阳性志愿者的拭子样品,实时Loop-de-Loop RT-LAMP测定的灵敏度是在反应中检测两个靶标所需的灵敏度的至少370倍。
图17示出了来自从阴性对象获得的鼻拭子中对SARS-CoV-2具有特异性的靶序列的loop-de-loop扩增的实时荧光信号。
图18示出了来自SARS-CoV-2和人靶序列的多重化Loop-de-Loop扩增的荧光信号,并表明了loop-de-loop反应的特异性。使用FAM标记引物针对loop-de-loop对SARS-CoV-2和人引物组二者进行修饰,因此双阳性对照显示2个扩增事件。RPPOS是呼吸系统病原体组阳性物质(Exact Diagnostics LLC),包含来自22种非靶标呼吸系统病原体的遗传物质。PRNEG是不含核酸的RPPOS产品的背景基质对照。数据显示,检测SARS-CoV-2和人靶标的loop-de-loop RT-LAMP反应不会扩增脱靶核酸。
图19示出了来自含有高的沙眼衣原体(Ct)(每个反应10,000拷贝当量)和高的淋病奈瑟菌(Ng)(每个反应10,000拷贝当量)的样品的loop-de-loop扩增的荧光信号。
图20示出了来自阴性对照—仅拭子对照(左侧两个小图)或仅缓冲液对照(右侧两个小图)的loop-de-loop扩增的荧光信号。
附图仅出于举例说明的目的而描绘了本发明的多个实施方案。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到,在不背离本文所述的本发明的原理的情况下,可以采用本文所示的结构和方法的替代实施方案。
6.发明详述
6.1.定义
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用,以下术语具有以下赋予它们的含义。
本文中使用的术语“生物传感器对”是指一对传感器分子,其可以在这两个传感器分子之间的某些物理相互作用之后产生可检出信号。例如,生物传感器对可以是供体分子和接受体分子对,其用于福斯特共振能量转移(resonance energy transfer),例如荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。在这种情况下,可以通过从供体分子到接受体分子的距离依赖性能量转移来产生荧光信号。在另一些实施方案中,生物传感器对是用于生物发光共振能量转移(bioluminescence resonanceenergy transfer,BRET)的传感器分子对。在这种情况下,可以通过从供体分子到接受体分子的距离依赖性能量转移来产生生物发光信号。本领域已知的其他生物传感器对也可用于本公开内容的多个实施方案中。
本文中使用的术语“loop-de-loop扩增”或“LdL扩增”是指使用可通过距离依赖性能量转移而产生荧光信号的环状引物来扩增靶核酸。
本文中使用的术语“LOD”是指检测限。例如,LOD95是检测限,第95个百分位。这是目标浓度,在该浓度下,在统计学上预期测定在95%时候检测到阳性结果。
6.2.其他解释性约定
本文所列举的范围被理解为该范围内的所有值的简写,包括所列举的端点。例如,1至50的范围被理解为包括来自以下的任何数字、数字的组合、或子范围:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
除非另有说明,否则提及具有一个或更多个立构中心的化合物意指其每个立体异构体以及立体异构体的所有组合。
6.3.环状引物
在一个方面中,本发明提供了用于Loop-de-Loop扩增的环状引物。环状引物从5’至3’包含:
第一传感器分子;
第一夹寡核苷酸;
间隔寡核苷酸;
第二夹寡核苷酸,
其中第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第二传感器分子,
其中第一传感器分子和第二传感器分子是第一生物传感器对;以及
第一引物序列,其与靶序列上的第一结合位点互补。
在一些实施方案中,第二夹寡核苷酸与第一夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中,第二夹寡核苷酸可以与第一夹寡核苷酸结合,但与第一夹寡核苷酸不完全互补。
本领域已知的多种生物传感器可用于本文提供的方法。例如,可以使用在极为接近或处于足够距离内时改变颜色或产生可测量信号的分子对(例如基于发光蛋白的NanoLuc、Nanobit、NonoBRET技术)。
在一些实施方案中,第一生物传感器对是能量供体和接受体对。在一些实施方案中,第一生物传感器对是用于福斯特共振能量转移的能量供体和接受体对。在一些实施方案中,第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)的能量供体和接受体对。在一些实施方案中,第一传感器分子是FRET荧光团并且第二传感器分子是FRET猝灭剂。在一些实施方案中,第一传感器分子是FRET猝灭剂并且第二传感器分子是FRET荧光团。在一些实施方案中,第一传感器分子是BRET能量供体,并且第二传感器分子是BRET能量接受体。在一些实施方案中,第一传感器分子是BRET能量接受体,并且第二传感器分子是BRET能量供体。
在一些实施方案中,FRET猝灭剂是5IABkFQ,其可从Integrated DNAtechnologies以商品名5’IowaFQ获得。5’IowaFQ是FRET猝灭剂,其具有范围为420nm至620nm的宽吸收谱,在531nm处具有峰值吸光度。这种猝灭剂可与在绿色到粉红色的谱范围内发射的荧光素和其他荧光染料一起使用。在一些实施方案中,猝灭剂是任一种Black Hole (可从Biosearch Technologies获得)、任一种Iowa猝灭剂(可从Integrated DNA technologies获得)、猝灭剂(可从Integrated DNATechnologies获得)、任何淬火剂(可从Millipore-Sigma获得),或任何淬火剂(可从ATTO-TEC GmbH获得)。
在一些实施方案中,FRET荧光团是i6-FAMK(FAM(荧光素)叠氮化物),其可从Integrated DNA technologies以Int 6-FAM(叠氮化物)的名称获得。这种形式的FAM可以使用点击化学而连接到寡核苷酸上。这种修饰的内部形式通过dT碱基而与寡核苷酸连接。可以在修饰的位置处添加dT核苷酸。或者,为了避免添加额外的核苷酸,可以用所需的修饰替代序列中现有的T核苷酸。在一些实施方案中,荧光团是Cy3、Cy5、TAMRA或Yakima(可从Integrated DNATechnologies获得)。
在一些实施方案中,第一传感器分子和第二传感器分子可以形成产生可检测光信号的复合物。
第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸彼此互补,因此它们可以彼此结合。第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸可以在低于第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于60℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于65℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于70℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于80℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为70℃至80℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为72.5℃至77.5℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约75℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)比使用链置换聚合酶的测定的延伸温度高10℃。在一些实施方案中,该解链温度低于、等于该测定的延伸温度或比其高任意量。
当Tm低于反应的延伸温度时,可以用终点检测(将反应冷却到接近或低于夹序列的Tm)代替实时检测,并且可以不存在反应抑制,即使在全强度使用Loop-de-Loop引物(100%替换)时。
在Tm等于反应的延伸温度的情况下,实时检测仍然可行,但可存在更高的背景荧光,直到冷却反应以确定终点。
当Tm大于反应的延伸温度时,实时检测可以是主要的操作模式,并且将有最小的背景荧光。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为3至10个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为3至7个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度为6个核苷酸。在一些典型的实施方案中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸具有相同的长度。
在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为5至35个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为10至20个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为13至18个核苷酸。在一些实施方案中,间隔寡核苷酸的长度为13个核苷酸。
在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度一起为15至35个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度一起为20至30个核苷酸。在一些实施方案中,第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸的长度一起为23至28个核苷酸。
环状引物可以包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基,(ii)锁核酸,(iii)2’O-甲基RNA碱基,(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基,(v)硫代磷酸酯化RNA碱基,(vi)硫代磷酸酯化2’-O-甲基RNA碱基,或(vii)其组合。第一夹寡核苷酸、间隔寡核苷酸和第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基,(ii)锁核酸,(iii)2’O-甲基RNA碱基,(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基,(v)硫代磷酸酯化RNA碱基,(vi)硫代磷酸酯化2’-O-甲基RNA碱基,或(vii)其组合。
在一些实施方案中,环状引物在环状引物的5’端还包含第一另外的寡核苷酸。在一些实施方案中,环状引物还包含在第一传感器分子和第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。在一些实施方案中,第一另外的寡核苷酸或第二另外的寡核苷酸是条码序列。
在一些实施方案中,环状引物还在环状引物的5’端包含另外的条码序列、探针序列或其他序列。另外的序列可包含核碱基或其修饰。
在一些实施方案中,靶序列是对病原体基因组具有特异性的。在一些实施方案中,靶序列是对沙眼衣原体具有特异性的。在一些实施方案中,靶序列来自orf8或cds2。具体地,靶结合位点可以具有SEQ ID NO:15的序列。
在一些实施方案中,靶序列是对淋病奈瑟菌具有特异性的。在一些实施方案中,靶序列来自porA或glnA。具体地,靶结合位点可以具有SEQ ID NO:5或7的序列。
在一些实施方案中,靶序列是对智人具有特异性的。在一些实施方案中,靶序列来自tbc1d3。具体地,靶结合位点可以具有SEQ ID NO:22的序列。
6.4.用于Loop-de-Loop扩增的引物混合物
在另一方面中,本发明提供了用于Loop-de-Loop扩增的引物混合物。引物混合物包含本文提供的环状引物。
在一些实施方案中,引物混合物包含一种环状引物。在一些实施方案中,引物混合物包含超过一种环状引物。当其包含超过一种环状引物时,混合物中的引物可以与单个靶序列或多个靶序列结合。在一些实施方案中,设计多个环状引物以检测来自多个来源的靶序列。例如,混合物可以包含设计用于检测来自多种病原体的靶序列的多个环状引物。
引物混合物还可以包含用于扩增反应的另外的引物。例如,引物混合物还可包含(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3),其中FIP、BIP、F3和B3与靶序列上的六个不同结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB),其中LF和LB与靶序列上的两个不同结合位点结合。在一些实施方案中,另外的引物之一(例如FIP、BIP、F3、B3、LF或LB)与第一结合位点结合,即靶序列上与环状引物相同的结合位点。
在一些实施方案中,引物混合物包含一个引物组。在一些实施方案中,引物组包含本文提供的用于Loop-de-Loop扩增的环状引物、(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和(iv)反向引物(B3)。在一些实施方案中,引物组还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)。
在一些实施方案中,引物组包含本文提供的用于Loop-de-Loop扩增的环引物和选自以下的三个引物:(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)、和(iv)反向引物(B3)。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、BIP、F3和B3。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、F3和B3。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP和B3。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP和F3。
在一些实施方案中,引物组包含本文提供的用于Loop-de-Loop扩增的环状引物和选自以下的五个引物:(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)、(iv)反向引物(B3)、(v)正向环引物(LF)和(vi)反向环引物(LB)。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、BIP、F3、B3、LF和LB。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、F3、B3、LF和LB。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP、B3、LF和LB。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、LF和LB。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、B3和LF。在一些实施方案中,引物组包含环状引物、FIP、BIP、F3、B3和LB。
在一些实施方案中,引物混合物包含两个引物组。在一些实施方案中,引物混合物包含三个引物组。在一些实施方案中,引物混合物包含四个或五个引物组。
在一些实施方案中,每个引物组用于扩增独特的靶序列。在一些实施方案中,引物混合物包含用于扩增同一靶序列的两个或更多个引物组。在一些实施方案中,引物混合物包含与同一靶序列上同一结合位点结合的两个或更多个环状引物。
环状引物可以与另外的引物以针对扩增反应优化的任何比率混合。在一些实施方案中,FIP与第一结合位点结合,并且引物混合物中FIP与环状引物的量之比为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。在一些实施方案中,BIP与第一结合位点结合,并且引物混合物中BIP与环状引物的量之比为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。在一些实施方案中,LF与第一结合位点结合,并且引物混合物中LF与环状引物的量之比为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。在一些实施方案中,LB与第一结合位点结合,并且引物混合物中LB与环状引物的量之比为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
在一些实施方案中,引物混合物被设计用于检测对淋病奈瑟菌具有特异性的靶序列。在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸。在一个实施方案中,F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,BIP包含SEQ IDNO:4的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸,以及LB包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸。在一些实施方案中,环状引物是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的寡核苷酸。
在一些实施方案中,引物混合物被设计用于检测对沙眼衣原体具有特异性的靶序列。在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:13的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。在一个实施方案中,F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:13的寡核苷酸,以及LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。在一些实施方案中,环状引物是SEQ ID NO:15的寡核苷酸。
在一些实施方案中,引物混合物被设计用于检测对智人具有特异性的靶序列。在一些实施方案中,F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸,或LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。在一个实施方案中,F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,LF包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸,以及LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。在一些实施方案中,环状引物是SEQ ID NO:22的寡核苷酸。
在一些实施方案中,引物混合物被设计用于检测对病毒具有特异性的靶序列。在一些实施方案中,病毒是SARS-CoV-2。
在一些实施方案中,本文提供的引物混合物还组合用于检测多个靶序列。在一些实施方案中,多个靶序列是对不同的生物体具有特异性的。例如,多个靶序列是对不同的病原体具有特异性的。
因此,在一些实施方案中,引物混合物还包含第二环状引物,其中第二环状引物包含:
第三传感器分子;
第三夹寡核苷酸;
第二间隔寡核苷酸;
第四夹寡核苷酸,
其中第三夹寡核苷酸、第二间隔寡核苷酸和第四夹寡核苷酸可在低于第三夹寡核苷酸和第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第四传感器分子,
其中第三传感器分子和第四传感器分子是第二生物传感器对,并且第二生物传感器对不同于第一生物传感器对;以及
与第二靶序列上的第一结合位点互补的第二引物序列。
在一些实施方案中,第三夹寡核苷酸与第四夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中,第三夹寡核苷酸可以与第四夹寡核苷酸结合但不与第四夹寡核苷酸完全互补。
在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第二正向内引物(SFIP)、(ii)第二反向内引物(SBIP)、(iii)第二正向引物(SF3)和第二反向引物(SB3),其中SFIP、SBIP、SF3和SB3与第二靶序列上的六个不同结合位点结合。在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第二正向环引物(SLF)和(ii)第二反向环引物(SLB),其中SLF和SLB与第二靶序列上的两个不同结合位点结合。
在一些实施方案中,引物混合物还包含第三环状引物,其中第三环状引物包含:
第五传感器分子;
第五夹寡核苷酸;
第三间隔寡核苷酸;
第六夹寡核苷酸,
其中第五夹寡核苷酸、第三间隔寡核苷酸和第六夹寡核苷酸可在低于第五夹寡核苷酸和第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第六传感器分子,
其中,第五传感器分子和第六传感器分子是第三生物传感器对,并且第三生物传感器对不同于第一生物传感器对和第二生物传感器对;和与第三靶序列上的第一结合位点互补的第二引物序列。
在一些实施方案中,第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸互补。在一些实施方案中,第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸结合,但第五夹寡核苷酸与第六夹寡核苷酸不完全互补。
在一些实施方案中,引物混合物还包含(i)第三正向内部引物(TFIP)、(ii)第三反向内部引物(TBIP)、(iii)第三正向引物(TF3)和第三反向引物(TB3),其中TFIP、TBIP、TF3和TB3与第三靶序列上的六个不同结合位点结合。
在一些实施方案中,引物混合物包含(i)第三环正向引物(TLF)和(ii)第三环反向引物(TLB),其中TLF和TLB与第三靶序列上的两个不同结合位点结合。
在一些实施方案中,引物混合物包含两个、三个、四个、五个或六个环状引物。当引物混合物包含两个或更多个环状引物时,每个环状引物可以包含独特的生物传感器对,每个都提供用于检测的独特信号。在一些实施方案中,每个生物传感器对提供独特的视觉信号(例如,颜色)用于检测。在一些实施方案中,每个生物传感器对包含独特的染料分子。
在一些实施方案中,引物混合物中的两个或更多个环状引物包含相同的生物传感器对。在一些实施方案中,引物混合物中的两个或更多个环状引物用FAM标记。在一些实施方案中,引物混合物中的两个不同的环状引物用FAM标记。
在一些实施方案中,本文提供的引物混合物是冻干的。经干燥的引物混合物可包含本文所述的任何环引物或引物混合物。在一些实施方案中,包含两个或更多个环状引物的引物混合物被冻干。在一些实施方案中,引物混合物是冻干珠的形式。
6.5.用于Loop-de-Loop扩增的试剂盒
在另一方面中,提供了用于Loop-de-Loop扩增的试剂盒。所述试剂盒可包含本文提供的任何环状引物或引物混合物。
在一些实施方案中,试剂盒包含一个引物组。在一些实施方案中,引物组包含本文提供的用于Loop-de-Loop扩增的环状引物、(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3)。在一些实施方案中,引物组还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB)。
在一些实施方案中,试剂盒包含两个引物组。在一些实施方案中,试剂盒包含三个引物组。在一些实施方案中,试剂盒包含四个或五个引物组。
在一些实施方案中,试剂盒包含含有在单个容器中的多个引物组。在一些实施方案中,试剂盒包含多个引物组,其中每个引物组单独包含在单独的容器中。
在一些实施方案中,试剂盒还包含聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶是链置换DNA聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。在一些实施方案中,聚合酶是Bst 2.0DNA聚合酶(可从NEB获得)。在一些实施方案中,试剂盒还包含其他反应酶,例如逆转录酶。在一些实施方案中,逆转录酶是RTx逆转录酶(可从NEB获得)。在一些实施方案中,试剂盒还包含RNA酶抑制剂。在一些实施方案中,RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中,试剂盒还包含用于扩增反应的试剂。在一些实施方案中,试剂包含dNTP、MgSO4和缓冲液。在一些实施方案中,缓冲液包含表面活性剂。在一些实施方案中,缓冲液包含1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的吐温-20。在一些实施方案中,试剂包含海藻糖。在一些实施方案中,试剂包含蔗糖。在一些实施方案中,试剂包含用于稳定化的聚合物。可以根据聚合酶选择和优化扩增试剂。
在一些实施方案中,试剂盒包含混合物,所述混合物包含dNTP、MgSO4、缓冲液、用于Loop-de-Loop扩增的一个或更多个引物组、和聚合酶。在一些实施方案中,试剂盒包含混合物,所述混合物包含dNTP、用于Loop-de-Loop扩增的一个或更多个引物组、聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
在一些实施方案中,混合物是液体形式。在一些实施方案中,混合物为干燥形式。在一些实施方案中,混合物被配制成冻干珠或丸粒。
在一些实施方案中,试剂盒还包含用于扩增反应的装置。在一些实施方案中,试剂盒包含用于环介导等温扩增的装置。
在一些实施方案中,试剂盒还包含用于运行扩增反应的反应管。在一些实施方案中,试剂盒还包含用于在扩增反应之前过滤或纯化样品的组分。
在一些实施方案中,该试剂盒用于诊断感染性疾病。在一些实施方案中,试剂盒用于诊断病原体感染,例如沙眼衣原体和淋病奈瑟菌。在一些实施方案中,试剂盒用于确定单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和点突变。在一些实施方案中,试剂盒用于确定突变基因型。在一些实施方案中,试剂盒用于确定与耐药表型相关的突变基因型。例如,可以检测药物抗性标志物,例如头孢曲松(ceftriaxone)/头孢克肟(cefixime)抗性标志物、喹诺酮(quinolone)(环丙沙星(ciprofloxacin))抗性标志物、大环内酯类抗性标志物(阿奇霉素(azithromycin))。
6.6 loop-de-loop扩增方法
在另一方面,提供了loop-de-loop扩增方法。所述方法可包括以下步骤:
提供样品;
将(i)引物、引物混合物或通过将本文提供的经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物和(ii)聚合酶添加至样品,从而产生反应混合物;以及
将所述反应混合物在50至85℃下孵育。
反应温度可根据聚合酶和靶序列进行调整。在一些实施方案中,孵育在50至70℃下进行。在一些实施方案中,孵育在55至70℃下进行。在一些实施方案中,孵育在60至65℃下进行。在一些实施方案中,孵育在62至65℃下进行。在一些实施方案中,孵育在60、61、62、63、64或65℃下进行。
在一些实施方案中,所述方法还包括检测来自反应混合物的信号的步骤。在一些实施方案中,所述方法包括检测荧光信号的步骤。在一些实施例中,所述方法包括检测颜色或浊度变化的步骤。在一些实施方案中,所述方法包括检测非视觉信号的步骤。在一些实施方案中,所述检测步骤在孵育步骤期间进行。在一些实施方案中,所述检测步骤在完成孵育步骤之后进行。在一些实施方案中,实时检测信号。在一些实施方案中,实时记录信号并在完成孵育步骤后进行分析。
在一些实施方案中,所述方法还包括制备用于loop-de-loop扩增的样品的步骤。在一些实施方案中,制备样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用,从而产生包含DNA分子的样品。在一些实施方案中,制备样品的步骤还包括在与逆转录酶相互作用之前将包含RNA分子的样品或反应混合物预热。
在一些实施方案中,用于loop-de-loop扩增的样品包含纯化的多核苷酸分子。在一些实施方案中,样品包含纯化的RNA、纯化的DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。在一些实施方案中,样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。在一些实施方案中,用于loop-de-loop扩增的样品是粗制样品。在一些实施方案中,用于loop-de-loop扩增的样品是纯化的样品。
在一些实施方案中,检测多于一种类型的信号。在一些实施方案中,检测多个荧光或其他视觉信号。在一些实施方案中,检测多个信号以确定多个靶序列的存在或不存在。在一些实施方案中,检测多个信号以确认单个靶序列的存在或不存在。在一些实施方案中,检测多个信号以向所述方法提供附加的灵敏度和特异性。
对于靶序列的扩增,可使用本领域已知的多种扩增方法。
在一些典型的实施方案中,环介导的等温扩增(“LAMP”)被用于靶核酸的loop-de-loop扩增。LAMP是依赖于称为聚合酶的酶的链置换活性的等温DNA扩增方法,所述酶以碱基特异性方式将核苷酸碱基添加至正延伸的DNA或RNA链以形成具有互补序列的双链核酸。在等温扩增方法中,链置换聚合酶,例如来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)细菌的链置换聚合酶(Bst聚合酶及其变体),当其使互补链聚合时置换双链DNA的一条链,并因此不需要热循环。
LAMP方法可使用4种不同的引物(F3、B3、正向内引物或FIP,以及反向内引物或BIP),这些引物被专门设计为识别靶DNA序列的6个不同区域。可添加2个另外的“环”引物以提高反应速度。反应混合物中的引物浓度可以不同,但通常设置为1.6μM用于FIP和BIP引物,0.8μM用于正向和反向环引物(LF,LB),以及0.2μM用于F3和B3引物。在LAMP方法的一些实施方案中,可使用5种引物(仅使用2种可能的LAMP引物中的1种)。使用链置换反应在恒温(约65℃)下进行LAMP反应。通过在恒温下孵育样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、缓冲液和底物,可一步完成靶标的扩增和检测。用于LAMP的典型混合物组成包含以下试剂:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1%20、1.4mM dNTP、0.32U/μLBst聚合酶、上述浓度的引物,以及水,在20℃下将pH调节至8.8。反应体积通常为5μL至50μL。反应温度针对所使用的特定酶和引物进行优化,并且反应进行5至60分钟。LAMP具有高灵敏度、特异性和有效性。
LAMP依赖于识别6个靶位点的至少4种引物(例如F3、B3、FIP和BIP)以扩增特定的DNA或RNA靶标(RNA靶标首先需要逆转录成DNA)。如果包括环引物(例如,LF和LB),则靶核酸中的总共8个独特位点被6个引物识别。在本文提供的多种实施方案中,总共8个独特位点中的一个可被本文所述的环状引物识别。如果样品中存在靶标,则可发生扩增反应,并提供大量的DNA。
本文所述的新的loop-de-loop方法可应用于除LAMP之外的其他等温扩增方法。已经产生了许多等温扩增方法以解决聚合酶链反应(PCR)的温度循环依赖性。尽管这些方法可变化很大,但其都有一些共同的特征。例如,因为DNA链不热变性,所有等温方法都依赖于替代方法来实现引物结合和开始扩增反应。一旦反应开始,聚合酶还必须将仍退火于目标序列的链置换。等温方法通常使用DNA聚合酶的链置换活性用于分离双链体DNA。具有这种能力的聚合酶包括Klenow片段(3’-5’exo–)、用于中等温度(25至40℃)反应的phi29、和Bsu大片段、以及用于更高温度(50至65℃)反应的Bst DNA聚合酶大片段。为了检测RNA种类,添加了与反应温度相容的逆转录酶,以保持扩增的等温性质。除了分离dsDNA的链置换机制之外,等温方法还可需要酶或引物设计避免初始的起始变性要求。
如上所述,环介导的等温扩增(LAMP)使用识别靶DNA的6至8个不同区域的4至6个引物。链置换DNA聚合酶起始合成,并且2个引物形成环结构以促进随后的几轮扩增。LAMP快速、灵敏并且扩增如此广泛以致LAMP非常适合于现场诊断。loop-de-loop引物可被用于单个或任何组合或内和/或环引物。
链置换扩增(SDA)依赖于链置换DNA聚合酶(通常是Bst DNA聚合酶、大片段或Klenow片段(3’-5’exo–))在由链限制的限制性内切核酸酶或切口酶在包含在引物中的位点处产生的切口处起始。SDA需要1个正向引物和1个反向引物,以及1个碰撞正向引物和1个碰撞反向引物。每个聚合酶置换步骤可再生切口位点,导致指数扩增。SDA通常用于临床诊断。现有的荧光监测技术能够实现SDA(Nadeau et al.,Real-Time,Sequence-specificdetection of nucleic acids during strand displacement amplification,276m 2177-187(1999)),但依赖于限制性内切核酸酶的作用来产生荧光。正向或反向SDA引物均可适用于loop-de-loop方法,所述方法不要求切割位点位于荧光团和猝灭剂对之间。切割位点可存在于loop-de-loop引物的夹序列旁边,朝向引物的3’端,使得在互补链上通过聚合酶使引物的5’端完全延伸、随后通过限制性内切核酸酶切割引物之后产生荧光。
解旋酶依赖性扩增(helicase-dependent amplification,HDA)利用解旋酶的双链DNA解旋活性来分离链,使得通过链置换DNA聚合酶实现引物退火和延伸。与PCR类似,该系统只需要两个引物,1个正向引物和1个反向引物。HDA已用于数种诊断装置和经FDA批准的测试。HDA中的任何引物都可适合用于loop-de-loop方法,以实时地产生反应的实时、闭管监测。在HDA中,解旋酶可打开可通过单链结合蛋白稳定的loop-de-loop引物的环结构,并随后通过DNA聚合酶变成双链荧光扩增子。
切口酶扩增反应(nicking enzyme amplification reaction,NEAR)采用链置换DNA聚合酶在由切口酶产生的切口处起始,由靶序列快速产生许多短的核酸。该过程非常快速和灵敏,使得能够在几分钟内检测小靶标量。NEAR通常用于临床和生物安全应用中的病原体检测。用于NEAR的正向或反向引物可使用loop-de-loop方法通过链置换DNA聚合酶使环延伸来产生实时荧光。
6.7使用方法
本文提供的loop-de-loop扩增方法可用于检测来自多种来源的靶序列。例如,其可用于检测对病毒基因组、细菌基因组、古核生物基因组、植物基因组、动物基因组、原生生物基因组、原核生物基因组或真核生物基因组具有特异性的靶序列。在一些实施方案中,所述方法用于检测RNA(例如,正义RNA、反义RNA)或DNA。在一些实施方案中,所述方法用于检测合成产生的靶序列。
在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于检测对病原体具有特异性的DNA。在一些实施方案中,病原体是病毒、细菌、真菌、原生动物或蠕虫。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于检测与STD相关的病原体。在一些实施方案中,病原体是沙眼衣原体。在一些实施方案中,病原体是淋病奈瑟菌。在一些实施方案中,病原体是SARS-CoV-2。
在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于诊断感染。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于确定突变基因型。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于确定与药物抗性表型相关的突变基因型。例如,可检出药物抗性标志物,例如头孢曲松/头孢克肟抗性标志物、喹诺酮(环丙沙星)抗性标志物、大环内酯类抗性标志物(阿奇霉素)。
在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于确定单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于确定突变。
在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于检测单个靶标。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于检测多于一个的靶标。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于检测2、3、4或5个靶标。
在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于分析或表征样品。在一些实施方案中,loop-de-loop方法用于鉴定样品的来源。例如,loop-de-loop方法用于鉴定人样品。
本文所述的loop-de-loop方法可用于分析多种样品。在一些实施方案中,分析血液、尿液、精液、组织或唾液样品。在一些实施方案中,从动物或人患者收集样品。在一些实施方案中,分析纯化的样品。在一些实施方案中,分析粗制样品。在一些实施方案中,样品包含纯化的RNA、纯化的DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者中鼻甲或鼻咽拭子。在一些实施方案中,样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
实施例
以下实施例通过举例说明而非限制的方式提供。
6.8.1实施例1:使用嵌入染料(SYTO)的针对沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的LAMP测定
制备LAMP反应混合物以单独检测沙眼衣原体基因组DNA和淋病奈瑟菌基因组DNA。反应以10μL的体积制备并且包含以下试剂:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mMMgSO4、0.1%20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0聚合酶、引物(SEQID 1至4、6、8至14)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.8μM的LF和LB、0.2μM的F3和B3)、2.5μM SYTO85嵌入染料、以及水,在20℃下将pH调节至8.8。将靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍。将靶DNA或无DNA缓冲液(对于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物。反应温度为65℃,并通过SYTO85荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图2A中所示出的数据描绘了通过嵌入染料监测的来自沙眼衣原体(绿色)和淋病奈瑟菌(蓝色)的LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间的代表性曲线,对于每个基因组DNA靶标的3个水平是——高(储备浓度)、低(储备DNA的10-5稀释,对于Ct;储备DNA的10-6稀释,对于Ng)以及无模板对照(无DNA(NTC))。
6.8.2实施例2:通过loop-de-loop扩增的沙眼衣原体检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测沙眼衣原体基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1%20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0聚合酶、引物(SEQ ID 9至15)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水,在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物,并在数个对数浓度的范围下,每种浓度多至20次重复被用于查看测定灵敏度。反应温度为65℃,并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图3中所示出的数据描绘了来自针对沙眼衣原体的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析估计测定灵敏度(检测限,50%和95%概率)。
生物体 | 靶标 | 速度(分钟) | LoD95(cp/rxn) | LoD50(cp/rxn) |
沙眼衣原体 | orf8(隐蔽性质粒) | 8至19 | 20.7 | 3.14 |
6.8.3实施例3:通过loop-de-loop扩增的淋病奈瑟菌检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测淋病奈瑟菌基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1%20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst 2.0聚合酶、引物(SEQ ID 1至4、6至8)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水,在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物,在数个对数浓度的范围内,每个浓度多至20次重复被用以查看测定灵敏度。反应温度为65℃,并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图2B至C中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loopLAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间的代表性曲线。图2B比较了来自loop-de-loop测定的信号与如图2A中所示没有用loop-de-loop引物而用SYTO 85染料进行的LAMP测定的信号。在阳性扩增的情况下,loop-de-loop测定提供了大得多的信号。在图2C中,证明了loop-de-loop测定的再现性,以及可忽略的背景荧光和无模板对照中的减少的后期的、伪扩增产物。图4中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析从连续稀释测试结果估计测定灵敏度(检测限,50%和95%概率)。
生物体 | 靶标 | 速度(分钟) | LoD95(cp/rxn) | LoD50(cp/rxn) |
淋病奈瑟菌 | porA伪基因 | 10至20 | 543 | 82.4 |
6.8.4实施例4:通过loop-de-loop扩增的智人检测
制备loop-de-loop LAMP反应混合物以检测智人基因组DNA。反应以10μL体积制备并且包含以下试剂:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1%20、1.4mM dNTP、0.32U/μL Bst2.0聚合酶、引物(SEQ ID 16至22)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、以及水,在20℃下将pH调节至8.8。将定量的靶基因组DNA从购自ATCC的储备溶液在pH 8.0Tris-HCL缓冲液中稀释10倍或2倍(用于更精细的分辨率)。靶DNA稀释液或无DNA缓冲液(用于无模板对照)以1μL添加至每个PCR管内的9μL溶液混合物,并且在数个对数浓度的范围内,每个浓度多至20次重复被用以查看测定灵敏度。反应温度为65℃,并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光。反应运行60分钟。图3中所示出的数据描绘了来自针对智人的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。然后基于测定的终点确定通过PROBIT分析估计测定灵敏度(检测限,50%和95%概率)。
生物体 | 靶标 | 速度(分钟) | LoD95(cp/rxn) | LoD50(cp/rxn) |
智人 | tbc1d3 | 6.5至18 | 112 | 11.5 |
6.8.5实施例5:用于loop-de-loop扩增的经干燥引物混合物
用5步冷冻干燥方案使用内部冻干测试进行冷冻干燥试剂的配制。将被设计用于检测淋病奈瑟菌的loop-de-loop LAMP反应混合物以每管25μL体积进行制备并等分到每个管中。冻干混合物包含以下试剂:1.4mM dNTP、作为无甘油制剂的0.32U/μL Bst 2.0聚合酶、引物(SEQ ID 1至4、6至8)(具有1.6μM的FIP和BIP、0.4μM的LF和LF-LdL、0.8μM的LB、0.2μM的F3和B3)、5%海藻糖、以及水(每个反应补至25μL)。去除管盖以用于冻干。将管条放置在加热的搁板冻干机单元(制药和生物技术行业的标准设备构件)的金属搁板上。冻干机被程序设定为以5个步骤运行。第1步:打开冷凝器,关闭真空,使搁板和试剂冷却至41°F,30分钟。打开冷凝器,关闭真空,使搁板和试剂冷却至23F,30分钟。第3步:打开冷凝器,关闭真空,使搁板和试剂冷却至-23F,2小时。第4步:打开冷凝器,打开真空,使搁板和试剂保持在-23F,10小时。第5步:打开冷凝器,打开真空,使搁板和试剂加热至77F,5小时。一旦该过程完成,就将管移出并盖上盖子,得到图7中所示的产物。在多种环境条件下孵育一段时间之后,测试冷冻-干燥测定的活性。图8示出了再水合反应的代表性实时loop-de-loop LAMP测定活性。再水合方案包括向经干燥的试剂添加24μL的再水合缓冲液、以及1μL的淋病奈瑟菌靶基因组DNA。再水合缓冲液由以下构成:20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、0.1%20、以及水,在20℃下将pH调节至8.8。将缓冲液添加至管,然后将管重新密封并直接放入实时qPCR仪中而无需涡旋或混合。反应温度为65℃,并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。图8中所示出的数据描绘了来自针对淋病奈瑟菌的10倍稀释的基因组DNA靶标的Loop-de-loop LAMP反应的在纵轴上的实时荧光(任意单位)与在横轴上的时间(每个“周期”代表30秒)的代表性曲线。发现冻干loop-de-loop测定速度、灵敏度和特异性与新鲜配制测定速度、灵敏度和特异性没有区别。此外,荧光强度不受干燥和再水合影响,表明loop-de-loop方法可为病原体检测提供储存稳定的体外诊断试剂盒。
6.8.6实施例6:用于loop-de-loop扩增的温度
如上所述制备loop-de-loop LAMP反应混合物,一种包含ORF1ab引物组,另一种包含POP7b引物组。ORF1ab引物组对具有单链正义RNA基因组的SARS-CoV-2病毒具有特异性。POP7b引物组对不是天然作为DNA模板存在的人RNA靶标具有特异性;因此,该引物组可用作样品中人RNA的特异性指示物。在两种情况下,loop-de-loop均被用于修饰用于LAMP的6个组成引物之一,以产生第七环状引物。环状引物利用荧光团和猝灭剂对产生可观察信号。对于本实验,将中等高浓度的合成双链DNA模板(其正义链上包含与用于每个引物组的RNA靶标相对应的序列)用作LAMP反应温度优化的靶标,以使由于逆转录步骤引起的变异或在稀释靶标的情况下遇到的随机噪声最小化。将靶DNA稀释液添加至384孔板内的混合物。将其在范围为55至70℃下的多种温度下孵育,并通过loop-de-loop引物发出的FAM荧光监测反应。实时PCR仪用于加热反应和实时测量荧光二者。反应运行60分钟。该实验针对重叠的温度范围进行了两次(第一测试和第二测试),并且数据在图9A和9B中示出。所述图描绘了获得用于检测的足够信号所需的时间。结果表明,引物组在宽的温度范围内均有活性。例如,对于POP7b和ORF1ab引物组二者,约57至70℃是可接受的范围。在60℃至68℃实现了最佳性能。
6.8.7实施例7:多重化loop-de-loop反应以检测经纯化的靶标和粗制样品中的靶标二者
图14A、14B和14C分别示出了来自用ORF1ab和POP7b LdL引物组对SARS-CoV-2和人靶序列进行loop-de-loop扩增的两个荧光信号。示出了来自SARS-CoV-2ORF1ab(FAM)和POP7b人内部对照(Cy5)的信号。使用了三种类型的样品——无任何靶序列的对照样品(无模板对照)(图14A)、人鼻拭子(图14B)以及与热灭活病毒形式的SARS-CoV-2靶序列组合的人鼻拭子(图14C)。人鼻拭子由志愿者自行收集,并且直接添加至反应而无需样品处理或核酸提取。通过扭转数秒钟将拭子洗脱到反应混合物中。将SARS-CoV-2靶序列作为加入到SARS-CoV-2阳性反应中的完整热灭活病毒(ATCC VR-1986HK)引入到反应中。ORF1ab LdL-FAM和POP7b LdL-Cy5引物组在复制反应体积中以1:1的比例双重化。相对于未经标记的引物类似物,两个引物组均以1:3的比例使用LdL引物(25%强度)。反应包含逆转录酶、链置换聚合酶和RNA酶抑制剂。使用实时PCR仪(Bio-Rad)在55.6摄氏度下孵育反应2.5分钟,并随后在63.5摄氏度下孵育反应60分钟,同时记录FAM和Cy5的荧光测量值。正如所预期的,在60分钟内无模板对照重复显示没有loop-de-loop荧光信号。包含COVID-19阴性鼻拭子样品的反应显示出放大的POP7b信号,如通过Cy5荧光增加证明的,然而ORF1ab信号保持平稳(阴性)。加入热灭活病毒的样品在单个反应容器中显示出两个RNA靶标的谱双重检测。结果表明,loop-de-loop RT-LAMP允许SARS-CoV-2和人靶标的单管谱多重化。
用ORF1ab LdL引物组对SARS-CoV-2进行的多重化loop-de-loop测试与PCR测试一样灵敏,并且不需要提取,因为用粗制样品的反应提供了如下表中所提供的良好结果。POP7b LdL引物组被用作内部对照。将完整的热灭活SARS-CoV-2病毒(ATCC VR-1986HK)的连续稀释液添加至双重化loop-de-loop反应中,并监测实时信号显现。用于测定的检测限估计为LoD95=400cp/拭子=2.7×103cp/mL,针对测试试剂盒的具体格式。
拷贝数/反应或拷贝数/拭子 | 阳性/共计 |
512 | 2/2 |
372 | 7/8 |
256 | 1/2 |
128 | 0/2 |
在单个管中还测试了三重化loop-de-loop反应。其显示出三个靶标的特异性扩增,保持了快速的获得结果时间。使用用FAM荧光团标记的2个loop-de-loop引物组检测SARS-CoV-2病毒RNA的2个单独靶标。用Cy5标记的人内部对照loop-de-loop引物组检测第三RNA靶标。内部Cy5荧光团与5’IowaRQ猝灭剂配对。反应包含粗制鼻拭子洗脱液,并加入有热灭活的SARS-CoV-2。
还测试了另外的环状引物用于POP7b人内部对照的loop-de-loop引物组。在一种情况下,内部TAMRA荧光团(第二传感器分子)与5’Iowa FQ猝灭剂(第一传感器分子)配对。在另一种情况下,5’Yakima (Epoch Biosciences)(第一传感器分子)与内部ZenTM(Integrated DNA Technologies)猝灭剂(第二传感器分子)配对。对于YakimaYellow和Zen构型,产生并测试了环状引物的三种变体。在第一变体中,第一夹寡核苷酸和第二夹寡核苷酸完美互补并且各自都为6个碱基长。间隔寡核苷酸为13个碱基长。在第二变体中,第一夹寡核苷酸的特征在于在其5’端具有另外的碱基,使得第一夹寡核苷酸为7个碱基长并且第二夹寡核苷酸为6个碱基长。第一和第二夹寡核苷酸之间有6个互补碱基。间隔寡核苷酸为13个碱基长。在第三变体中,第一和第二夹寡核苷酸二者都为7个碱基长并且序列完全互补。间隔寡核苷酸为10个碱基长。
这些另外的环状引物被用于LAMP反应。所述反应提供了靶序列的特异性扩增信号。
6.8.8实施例8:通过loop-de-loop扩增的人样品中SARS-CoV-2的检测
制备了loop-de-loop LAMP反应混合物以检测来自未经处理的人唾液中的SARS-CoV-2。在PCR管中通过在pH缓冲盐溶液中用10%vol/vol人唾液混合物将冻干酶、dNTP和寡核苷酸引物混合物再水合制备反应。冻干的引物混合物包含用于SARS-CoV-2的引物组和人内部对照RNA序列。一旦用唾液样品再水合,将反应在预热温度下孵育限定的一段时间以促进病毒裂解、RNA酶抑制和逆转录,并随后在更高的反应温度下孵育以用于LAMP DNA扩增。使用定制仪器收集温度控制和实时荧光数据。
将热灭活的SARS-CoV-2添加至从匿名供体收集的新鲜唾液的合并物中。制备在唾液中的3倍连续稀释液。使用loop-de-loop扩增方法测试20个样品。通过移动app、眼或实时曲线检查的读出总结如下。结果显示,LoD为约2,500cp/mL。
自收集的鼻拭子获自志愿者对象,并通过扭转10次直接添加至反应混合物。图16示出了来自获自有症状的志愿者的鼻拭子的扩增结果,所述志愿者后来通过PCR测试被证实对COVID呈阳性。还提供了来自阳性/阴性对照样品的结果。结果显示,样品(1×拭子)的浓度是在loop-de-loop测定的情况下检出阳性样品所需的365倍高。由于假定LoD为约2,500cp/mL,因此估计特定样品包含约9.1×105cp/mL的SARS-CoV-2病毒RNA。
图17示出了来自获自阴性志愿者的鼻拭子的扩增结果。患者通过loop-de-loop反应和PCR测试二者均检出为阴性的。
将用于检测SARS-CoV-2的反应混合物与用于检测人基因组序列的引物以1:1的比例多重化。多重化扩增结果在图18中提供。结果显示出对两个靶序列的特异性和灵敏性检测而无交叉反应。
6.8.9实施例9:通过loop-de-loop扩增对人样品中沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的检测
使用30秒、1Hz扭转法(Panpradist et al.,2016)将三个阴道拭子(BD BBLCulture Swabs,购自Lee Biosolutions,MO的聚氨酯泡沫尖端拭子,来源于独特的个体供体)洗脱到1,294μL再水合缓冲液(每个拭子431μL)中。在拭子失去一些液体之后,获得了1095μL的合并的阴道拭子洗脱液。流体回收率为85%。将该拭子洗脱液吸移到包含用于loop-de-loop LAMP的冻干反应混合物的注射模制原型一次性用品中(一份用于Ct,一份用于Ng,以及一份用于人工过程控制)。
每个反应用以下试剂再水合:
·18μL的拭子洗脱液(将拭子旋转入再水合缓冲液中);
·1μL的悬于再水合缓冲液中的全Ct病原体
·1μL的悬于再水合缓冲液中的全Ng病原体
Ct和Ng病原体样品位于一次性用品的每个反应室中。因此,例如,Ct测定的任务是在Ng和人靶标同时存在以及拭子样品中存在的任何细菌环境的情况下检出Ct。
扩增结果在图19至22中提供。图19示出了来自包含高Ct(每次反应10,000拷贝当量)和高Ng(每次反应10,000拷贝当量)的样品的荧光信号。图20示出了来自阴性对照的信号——仅拭子对照(左侧两个小图)或仅缓冲液对照(右侧两个小图)。在仅拭子对照中,没有Ct或Ng扩增,但人基因组序列按预期扩增。在仅缓冲液对照中,没有Ct或Ng扩增。在一个仅缓冲液反应(测试20)中较晚检出智人扩增,可能是由于伪扩增导致延迟信号。
这些结果表明,该测定灵敏地以约100个拷贝/反应检出Ct和以约>1,000个拷贝/反应检出Ng。
7.序列
8.通过引用并入
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献在此出于所有目的通过引用其整体并入,其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独地指出出于所有目的通过引用并入。
9.等同方案
本公开内容尤其提供了大麻素组合物和随从组合物。本公开内容还提供了通过施用大麻素和随从组合物来治疗神经退行性疾病的方法。尽管已经说明和描述了多个具体的实施方案,但上述说明书不是限制性的。应当理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种改变。许多变化对于本领域技术人员在阅读本说明书之后将变得显而易见。
Claims (95)
1.用于靶序列的loop-de-loop扩增(LdL)的环状引物,其从5’至3’包含:
第一传感器分子;
第一夹寡核苷酸;
间隔寡核苷酸;
第二夹寡核苷酸,
其中所述第一夹寡核苷酸、所述间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸能够在低于所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第二传感器分子,
其中所述第一传感器分子和所述第二传感器分子是第一生物传感器对;以及
第一引物序列,其与所述靶序列上的第一结合位点互补。
2.权利要求1所述的环状引物,其中所述第二夹寡核苷酸与所述第一夹寡核苷酸互补。
3.权利要求1或2所述的环状引物,其中所述第一生物传感器对是能量供体和接受体对。
4.权利要求3所述的环状引物,其中所述第一生物传感器对是用于荧光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)的能量供体和接受体对。
5.权利要求3所述的环状引物,其中所述第一传感器分子是FRET荧光团并且所述第二传感器分子是FRET猝灭剂。
6.权利要求3所述的环状引物,其中所述第一传感器分子是FRET猝灭剂并且所述第二传感器分子是FRET荧光团。
7.权利要求3所述的环状引物,其中所述第一传感器分子是BRET能量供体并且所述第二传感器分子是BRET能量接受体。
8.权利要求3所述的环状引物,其中所述第一传感器分子是BRET能量接受体并且所述第二传感器分子是BRET能量供体。
9.权利要求1所述的环状引物,其中所述第一传感器分子和所述第二传感器分子能够形成产生可检出光信号的复合物。
10.权利要求1至9中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于60℃。
11.权利要求10所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于65℃。
12.权利要求11所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于70℃。
13.权利要求12所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)高于80℃。
14.权利要求12所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为70℃至80℃。
15.权利要求14所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为72.5℃至77.5℃。
16.权利要求15所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为约75℃。
17.权利要求1至9中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)低于60℃。
18.权利要求1至9中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的解链温度(Tm)为60℃至65℃。
19.权利要求1至18中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的长度为3至10个核苷酸。
20.权利要求19所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的长度为3至7个核苷酸。
21.权利要求20所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸的长度为6个核苷酸。
22.权利要求1至21中任一项所述的环状引物,其中所述间隔寡核苷酸的长度为5至35个核苷酸。
23.权利要求22所述的环状引物,其中所述间隔寡核苷酸的长度为10至20个核苷酸。
24.权利要求23所述的环状引物,其中所述间隔寡核苷酸的长度为13至18个核苷酸。
25.权利要求24所述的环状引物,其中所述间隔寡核苷酸的长度为13个核苷酸。
26.权利要求1至25中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸、所述间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸一起的长度为15至35个核苷酸。
27.权利要求26所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸、所述间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸一起的长度为20至30个核苷酸。
28.权利要求27所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸、所述间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸一起的长度为23至28个核苷酸。
29.权利要求1至28中任一项所述的环状引物,其中所述第一夹寡核苷酸、所述间隔寡核苷酸和所述第二夹寡核苷酸包含(i)选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的核碱基,(ii)锁核酸,(iii)2’O-甲基RNA碱基、(iv)硫代磷酸酯化DNA碱基,(v)硫代磷酸酯化RNA碱基,(vi)硫代磷酸酯化2’-O-甲基RNA碱基,或(vii)其组合。
30.权利要求1至29中任一项所述的环状引物,其还包含在所述环状引物的5’末端处的第一另外的寡核苷酸。
31.权利要求1至30中任一项所述的环状引物,其还包含在所述第一传感器分子与所述第一夹寡核苷酸之间的第二另外的寡核苷酸。
32.权利要求30或31所述的环状引物,其中所述第一另外的寡核苷酸或所述第二另外的寡核苷酸是条码序列。
33.权利要求1至32中任一项所述的环状引物,其中所述靶序列对病原体基因组具有特异性。
34.权利要求33所述的环状引物,其中所述靶序列对沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)具有特异性。
35.权利要求34所述的环状引物,其中所述靶序列来自orf8或cds2。
36.权利要求34所述的环状引物,其包含SEQ ID NO:15的寡核苷酸。
37.权利要求33所述的环状引物,其中所述靶序列对淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)具有特异性。
38.权利要求37所述的环状引物,其中所述靶序列来自porA或glnA。
39.权利要求37所述的环状引物,其包含SEQ ID NO:5或7的寡核苷酸。
40.权利要求33所述的环状引物,其中所述靶序列对病毒具有特异性。
41.权利要求40所述的环状引物,其中所述病毒是SARS-CoV-2。
42.权利要求1至30中任一项所述的环状引物,其中所述靶序列对智人(Homo sapiens)具有特异性。
43.权利要求42所述的环状引物,其中所述靶序列来自tbc1d3。
44.权利要求42所述的环状引物,其包含SEQ ID NO:22的寡核苷酸。
45.用于靶序列的loop-de-loop扩增的引物混合物,其包含权利要求1至44中任一项所述的环状引物。
46.权利要求45所述的引物混合物,其还包含(i)正向内引物(FIP)、(ii)反向内引物(BIP)、(iii)正向引物(F3)和反向引物(B3),其中所述FIP、BIP、F3和B3与所述靶序列上的六个不同的结合位点结合。
47.权利要求46所述的引物混合物,其还包含(i)正向环引物(LF)和(ii)反向环引物(LB),其中所述LF和LB与所述靶序列上的两个不同的结合位点结合。
48.权利要求45至47中任一项所述的引物混合物,其中所述FIP、BIP、F3、B3、LF或LB与所述靶序列上的所述第一结合位点结合。
49.权利要求48所述的引物混合物,其中所述FIP与所述第一结合位点结合,并且所述引物混合物中所述FIP与所述环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
50.权利要求48所述的引物混合物,其中所述BIP与所述第一结合位点结合,并且所述引物混合物中所述BIP与所述环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
51.权利要求48所述的引物混合物,其中所述LF与所述第一结合位点结合,并且所述引物混合物中所述LF与所述环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
52.权利要求48所述的引物混合物,其中所述LB与所述第一结合位点结合,并且所述引物混合物中所述LB与所述环状引物的量的比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
53.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸,或所述LB包含SEQ IDNO:8的寡核苷酸。
54.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:3的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:4的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸,并且所述LB包含SEQID NO:8的寡核苷酸。
55.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:13的寡核苷酸,或所述LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。
56.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:9的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:11的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:12的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:13的寡核苷酸,并且所述LB包含SEQ ID NO:14的寡核苷酸。
57.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸,或所述LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。
58.权利要求46至52中任一项所述的引物混合物,其中所述F3包含SEQ ID NO:16的寡核苷酸,所述B3包含SEQ ID NO:17的寡核苷酸,所述FIP包含SEQ ID NO:18的寡核苷酸,所述BIP包含SEQ ID NO:19的寡核苷酸,所述LF包含SEQ ID NO:20的寡核苷酸,并且所述LB包含SEQ ID NO:21的寡核苷酸。
59.权利要求45至58中任一项所述的引物混合物,其还包含第二环状引物,其中所述第二环状引物包含:
第三传感器分子;
第三夹寡核苷酸;
第二间隔寡核苷酸;
第四夹寡核苷酸,
其中所述第三夹寡核苷酸、所述第二间隔寡核苷酸和所述第四夹寡核苷酸能够在低于所述第三夹寡核苷酸和所述第四夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第四传感器分子,
其中所述第三传感器分子和所述第四传感器分子是第二生物传感器对,并且所述第二生物传感器对与所述第一生物传感器对不同;以及
第二引物序列,其与第二靶序列上的第一结合位点互补。
60.权利要求59所述的引物混合物,其中所述第三夹寡核苷酸与所述第四夹寡核苷酸互补。
61.权利要求59或60所述的引物混合物,其中所述靶序列和所述第二靶序列是相同的。
62.权利要求59或60所述的引物混合物,其中所述靶序列与所述第二靶序列是不同的。
63.权利要求59至62中任一项所述的引物混合物,其还包含(i)第二正向内引物(SFIP)、(ii)第二反向内引物(SBIP)、(iii)第二正向引物(SF3)和(iv)第二反向引物(SB3),其中所述SFIP、所述SBIP、所述SF3和所述SB3与所述第二靶序列上的六个不同的结合位点结合。
64.权利要求59至60中任一项所述的引物混合物,其还包含(i)第二正向环引物(SLF)和(ii)第二反向环引物(SLB),其中所述SLF和SLB与所述第二靶序列上的两个不同的结合位点结合。
65.权利要求45至64中任一项所述的引物混合物,其还包含第三环状引物,其中所述第三环状引物包含:
第五传感器分子;
第五夹寡核苷酸;
第三间隔寡核苷酸;
第六夹寡核苷酸,
其中所述第五夹寡核苷酸、所述第三间隔寡核苷酸和所述第六夹寡核苷酸能够在低于所述第五夹寡核苷酸和所述第六夹寡核苷酸的解链温度(Tm)的温度下形成发夹结构;
第六传感器分子,
其中所述第五传感器分子和所述第六传感器分子是第三生物传感器对,并且所述第三生物传感器对与所述第一生物传感器对和所述第二生物传感器对不同;以及
第二引物序列,其与第三靶序列上的第一结合位点互补。
66.权利要求65所述的引物混合物,其中所述第五夹寡核苷酸与所述第六夹寡核苷酸互补。
67.权利要求65或66所述的引物混合物,其中所述靶序列、所述第二靶序列和所述第三靶序列是相同的。
68.权利要求65或66所述的引物混合物,其中所述靶序列、所述第二靶序列和所述第三靶序列是不同的。
69.权利要求65至68中任一项所述的引物混合物,其还包含(i)第三正向内引物(TFIP)、(ii)第三反向内引物(TBIP)、(iii)第三正向引物(TF3)和(iv)第三反向引物(TB3),其中所述TFIP、所述TBIP、所述TF3和所述TB3与所述第三靶序列上的六个不同的结合位点结合。
70.权利要求65至66中任一项所述的引物混合物,其还包含(i)第三正向环引物(TLF)和(ii)第三反向环引物(TLB),其中所述TLF和所述TLB与所述第三靶序列上的两个不同的结合位点结合。
71.权利要求65至70中任一项所述的引物混合物,其还包含第四环状引物。
72.权利要求71所述的引物混合物,其还包含第五环状引物。
73.经干燥引物混合物,其是通过对权利要求1至44中任一项所述的环状引物或权利要求45至70中任一项所述的引物混合物进行冻干而获得的。
74.用于靶序列的loop-de-loop扩增的试剂盒,其包含:
权利要求1至44中任一项所述的环状引物、权利要求45至70中任一项所述的引物混合物、或权利要求71所述的经干燥引物混合物。
75.权利要求74所述的试剂盒,其还包含聚合酶,其中所述聚合酶任选地是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶。
76.权利要求74至75中任一项所述的试剂盒,其还包含dNTP、MgSO4和缓冲剂。
77.权利要求74至76中任一项所述的试剂盒,其还包含逆转录酶。
78.权利要求74至77中任一项所述的试剂盒,其还包含RNA酶抑制剂。
79.权利要求78所述的试剂盒,其中所述RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA酶抑制剂。
80.检测样品中靶序列的方法,其包括以下步骤:
提供样品;
将以下和聚合酶添加至所述样品,从而产生反应混合物:(i)权利要求1至44中任一项所述的引物、(ii)权利要求45至70中任一项所述的引物混合物、或(iii)通过使权利要求71所述的经干燥引物混合物再水合而获得的重构引物混合物;以及
在50℃至85℃下孵育所述反应混合物。
81.权利要求80所述的方法,其中所述孵育在50℃至70℃下进行。
82.权利要求81所述的方法,其中所述孵育在60℃至65℃下进行。
83.权利要求82所述的方法,其中所述孵育在62℃至65℃下进行。
84.权利要求80至81中任一项所述的方法,其中所述聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌聚合酶。
85.权利要求80至84中任一项所述的方法,其还包括检测来自所述反应混合物的信号的步骤。
86.权利要求85所述的方法,其中所述信号是荧光信号。
87.权利要求85至86中任一项所述的方法,其中检测步骤在孵育步骤期间进行。
88.权利要求80至87中任一项所述的方法,其还包括确定所述样品中存在或不存在所述靶序列的步骤。
89.权利要求80至88中任一项所述的方法,其还包括制备所述样品的在先步骤。
90.权利要求89所述的方法,其中制备所述样品的步骤包括使RNA分子与逆转录酶相互作用,从而产生包含DNA分子的样品。
91.权利要求90所述的方法,其中制备所述样品的步骤还包括在与所述逆转录酶相互作用之前或期间对所述RNA分子进行预热。
92.权利要求80至91中任一项所述的方法,其中所述反应混合物还包含RNA酶抑制剂。
93.权利要求92所述的方法,其中所述RNA酶抑制剂是猪或鼠RNA抑制剂。
94.权利要求80至93中任一项所述的方法,其中所述样品包含经纯化RNA、经纯化DNA、全SARS-CoV-2病毒、全人细胞、唾液或鼻拭子、或者鼻或鼻咽拭子。
95.权利要求80至93中任一项所述的方法,其中所述样品包含来自阴道拭子的全细菌或全人细胞、基因组DNA、合成DNA。
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