JP2017538418A - 抗生物質耐性細菌を検出する方法および組成物 - Google Patents

抗生物質耐性細菌を検出する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

腸内細菌科菌群の細菌に耐性を生じるKPC（Klebsiella pneumoniae カルバペネマーゼ）、NDM−1（New Delhi Metallo−ベータ−ラクタマーゼ）、VIM（Verona Integron−Mediated Metallo−β−ラクタマーゼ）、IMP−型カルバペネマーゼおよびOXA 48（オキサシリナーゼ）を含むカルバペネム−耐性腸内細菌科菌群（CRE）をコードする遺伝子に対して特異的であるプライマーおよびプローブを、これらのプライマーおよびプローブを用いてターゲット核酸を検出するための方法およびキットと共にここに記載する。記載する方法において、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子を含むことが疑われる生物試料または組織から得た臨床または試験試料中に存在する核酸を増幅し、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子に対応する配列を検出する。増幅した核酸は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、放射性同位元素標識、酵素標識などを含む当該分野の種々の技術水準の方法によって検出することができる。

Description

本願は、出典明示して本明細書の一部とみなす、「Methods and Compositions for Detecting antibiotic resistant Bacteria」なる発明の名称で2014年12月12日に出願された米国仮特許出願62/091,007に基づく優先権を主張する。
本開示は、細菌診断、詳細には細菌にカルバペネマーゼ−耐性を生じるカルバペネマーゼ耐性遺伝子の検出に関する。
鋳型
β−ラクタム抗生物質（ベータ−ラクタム抗生物質）は、その分子構造にβ−ラクタム環を含むすべての抗生物質剤からなる広いクラスの抗生物質である。これには、ペニシリン誘導体（ペナム）、セファロスポリン（セフェム）、モノバクタム、およびカルバペネムが含まれる(Holten KB，Onusko EM（2000年8月））。大部分のβ−ラクタム抗生物質は細菌生物における細胞壁生合成を阻害することにより作用し、最も広く使用されているグループの抗生物質である。β−ラクタム抗生物質は感受性の生物によって引き起こされる細菌感染の予防および治療について示されている。最初は、β−ラクタム抗生物質はグラム陽性細菌のみに対して主に有効であったが、現在では種々のグラム陰性生物に対して有効な広いスペクトルのβ−ラクタム抗生物質が開発されたことによりその有用性が増大している。
過去20年間にわたって抗生物質薬剤に対する細菌の耐性が絶え間なく高まってきている。これには、以下のヒト身体の一般的に存在する菌が含まれる：Staphylococcus aureus（メチシリン耐性またはMRSA）、Enteroccus faecalisおよびE. faecium（バンコマイシン耐性またはVRE）：腸内細菌科菌群（多剤耐性、カルバペネムが含まれるまたはCRE）。それには、環境的、日和見的だが本質的に多剤耐性の菌種：Pseudomonas aeruginosaおよびAcinetobacter baumanniiも含まれる（Georgopapadakou（2014））。
カルバペネム−耐性腸内細菌科菌群を表すCREは、抗生物質に対する高レベルの耐性を有するために、治療が困難である細菌のファミリーである。Klebsiella種およびEscherichia coli（E. coli）は、カルバペネム−耐性になり得るヒト腸内細菌の通常の部分である腸内細菌科菌群の例である。CREの型はKPC（Klebsiella pneumoniae カルバペネマーゼ）およびNDM−1（New Delhi Metallo−ベータ−ラクタマーゼ）として知られている場合もある。KPCおよびNDM−1は、カルバペネムを破壊し、それを無効にする酵素である。これらの酵素の両方、ならびに酵素VIM（Verona Integron−Mediated Metallo−β−ラクタマーゼ）はPseudomonasでも報告されている。最も一般的なCREはKPC、VIM、NDM、IMP（IMP−型カルバペネマーゼ）およびOXA 48である。blaOXA−48−like型の世界的な伝播、ならびにblaNDM−1およびblaOXA−181が単一のK. pneumoniae菌株に共存することが記録されている。
プライマーおよびプローブは、NDM1（US20120129180A1、WO2012023054A2）、KPC（US 7968292、US20120129180A1、US20110190170A1およびWO 2013/078565）、IMP（US20120129180A1、US 20090163382およびUS20090317807）、VIM（US 20090163382、US20120129180およびUS20090317807）およびOXA（US20090163382A1、US20120129180A1およびUS 6905848）について以前に記載されている。単一の色素を用いた融解曲線分析による多重解析が米国特許出願番号：20120129180A1で報告されている。米国特許第8124382には、tem、shv、ctx−m−1、ctx−m−9、mox、cit、dha、ebcおよびfoxの多重PCRが開示されている。増幅ターゲットは、アレイ様式でユニバーサル−標識TAMRA色素を用いて検出された。米国特許出願番号20090163382には、複数の増幅ターゲットとマイクロアレイ上の固定化した捕捉プローブとを多重化することが開示されており、マイクロアレイから発せられる蛍光を測定している。
高い臨床普及割合を有するNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子の抗生物質耐性カルバペネム−耐性腸内細菌科菌群のキャリアの迅速な検出に対する臨床的な要望が存在する。
本開示は、腸内細菌科菌群の細菌に耐性を生じるKPC（Klebsiella pneumoniaeカルバペネマーゼ）、NDM−1（New Delhi Metallo−ベータ−ラクタマーゼ）、VIM（Verona Integron−Mediated Metallo−β−ラクタマーゼ）、IMP−型カルバペネマーゼおよびOXA 48（オキサシリナーゼ）を含むCREをコードする遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブに関する。
より詳細には、本開示は、生物試料（例えば、直腸スワブ）を含む試料中のある種のCREをコードする遺伝子を検出するためのプライマーおよびプローブを開示する。本開示は、好ましくはグラム陰性細菌の臨床単離株において抗生物質耐性遺伝子マーカーを運搬する特定のベータ−ラクタマーゼ産生菌のファミリーを同定するプライマーおよびプローブを開示する。NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子を増幅および検出する特定のプライマーおよびプローブは本明細書中のプライマーおよびプローブ配列に開示する。記載した方法において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA遺伝子を含むことが疑われる生物試料または組織から得た臨床または試験試料に存在する核酸を増幅し、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXAに対応する配列を検出する。増幅した核酸は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、放射性同位元素標識、酵素標識などを含む、当該技術分野の水準の種々の方法によって検出することができる。増幅した核酸は、ハイブリダイゼーション検出プローブを含んでいてもよいいずれの検出技術の組合せによっても検出することができる。
1の実施形態は、個体からの生物試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXAを検出する方法に関する。他の実施形態は、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子配列に特徴的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。この方法には、増幅およびハイブリダイゼーションの少なくとも1のサイクリング工程を行うことが含まれる。増幅工程には、試料核酸と1またはそれを超えるプライマーの対とを接触させて、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸のいずれかが存在する場合には、増幅生成物を生成することが含まれる。好ましいプライマーは、耐性生物のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子の特異的領域を標的とする。オリゴヌクレオチドプローブは、増幅したターゲットを直接的または間接的に検出する。最も好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、その相補的な増幅したターゲットに対するハイブリダイゼーションで蛍光する、5'−副溝バインダー−フルオロフォア−オリゴヌクレオチド−クエンチャー−3'コンジュゲートである（米国特許第7,381,818号および第7,759,126号を参照されたい）。もう1の実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、5'−エンドヌクレアーゼ活性によって切断された場合にその相補的な増幅したターゲットに対するハイブリダイゼーションで蛍光する、3’−副溝バインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォア−3’コンジュゲートである（Kutyavinら，(2000）を参照されたい）。
1の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子は、蛍光検出を用いる単一リアル−タイム増幅反応で増幅し、検出する。好ましい方法において、CRE遺伝子ターゲットは内部対照の存在下で検出する。
さらなる実施形態において、IMP、VIMおよびNDM1遺伝子に特異的なプローブは同一のフルオロフォアで標識する一方、KPC、OXAおよび内部対照ターゲットに特異的なプローブは3の異なるフルオロフォアで各々標識する。
NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA配列の増幅に特異的な少なくとも1のアニーリングオリゴヌクレオチドプライマー試薬を含み、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA配列の検出に特異的な少なくとも1のオリゴヌクレオチドプローブを含む、生物試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子を検出するためのキットも提供する。
方法には、さらに、本発明のハイブリダイゼーションプローブの蛍光シグナル（例えば、FRETから生じるシグナル）の存在または不存在を検出することが含まれる。蛍光シグナルの存在は、通常、生物試料中にNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA遺伝子配列が存在することを示す一方、シグナルの不存在は、通常、生物試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA遺伝子配列の不存在を示す。1の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子配列を検出するプローブは、1を超える異なる蛍光色素で標識する。
さらに、方法は、プローブと増幅生成物との間の融解温度プロフィールを決定することを含むことができる。融解曲線は、さらにプローブ配列領域にミスマッチ（単数または複数）を有する遺伝子配列の存在または不存在を確認する。さらなる実施形態において、プローブと増幅生成物との間の融解温度プロフィールは、1を超える蛍光発光波長で測定する。
本発明のプライマーおよびプローブは、高い臨床的有病率を有するNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子配列の特異的、高感度および迅速な検出を許容する。
図1は、（a）単独および複数での配列番号：26を有するTaqManプローブを用いたOXA48および181ターゲットのリアル−タイムPCR検出、(b）単独および複数での内部対照（IC）を用いた配列番号：27を有するPleiadesプローブを用いたOXA48および181ターゲットのリアル−タイムPCR検出、および（c）OXA48および181ターゲットを含むおよび含まない2000コピーのICのリアル−タイムPCR検出を示す。
図2はTaqManプローブを用いたKPC遺伝子ターゲットのリアル−タイムPCR検出を示す。
図3は、KPC、VIM、OXA、NDMおよびNTCターゲットの存在下および不存在下でのTaqManプローブを用いたIMP遺伝子ターゲットのリアル−タイムPCR検出を示す。
図4は、KPC、IMP、OXA、NDMおよびNTC遺伝子ターゲットの存在下および不存在下でのTaqManプローブを用いたVIM遺伝子ターゲットのリアル−タイムPCR検出を示す。
図5は、KPC、IMP、OXA、VIMおよびNTC遺伝子ターゲットの存在下および不存在下でのTaqManプローブを用いたNDM−1遺伝子ターゲットのリアル−タイムPCR検出を示す。
図6は、（a）FAM標識TaqManプローブを用いた、IMP、VIM、NDMおよびOXAターゲット存在下で増幅したKPCターゲットの検出；(b）Qzr705−標識プローブを用いた、KPC、IMP、VIM、およびNDMターゲットの存在下で増幅したOXAターゲットの検出；(c）−AP593−標識プローブを用いた、KPCおよびOXAターゲットの存在下でのIMP、VIMおよびNDMターゲットの検出；および（d）AP525−標識プローブを用いた、KPC、IMP、VIM、OXAおよびNDMターゲットの存在下での、単独または多重のICターゲットの検出を示す。
図7は、（a）各単離物と会合したCtsを用いたリアル−タイムPCRにおける、IMPプローブ（配列番号：4〜7）およびプライマー(配列番号：9〜12）を用いた7の細菌単離物についての増幅したターゲットの検出；および（b）各細菌菌株についてのPCR画分のゲル分析を示す。
図8は、（a）各単離物と会合したCtsを用いた、VIMプローブ（配列番号：13）およびプライマー(配列番号：14〜16）を用いた8の細菌単離物についての増幅したターゲットの検出；および（b）各細菌菌株についてのPCR画分のゲル分析を示す。
図9は、KPC配列内の3のロケーションにおける、KPCプライマー(配列番号：2、3、34〜36、39、および40）およびプローブ（配列番号：1、37、38、42、および43）を用いた増幅したターゲットの検出を示す。
図10は、NDM配列内の3のロケーションにおける、NDMプライマー(配列番号：18、19、66、67、69、および70）およびプローブ（配列番号：17、68、および71）を用いた増幅したターゲットの検出を示す。
図11は、OXA−48配列内の3のロケーションにおける、OXA−48プライマー(配列番号：21、22、72、73、75、および76）およびプローブ（配列番号：20、74、77、および78）を用いた増幅したターゲットの検出を示す。
図12は、OXA−48プライマー(配列番号：21および22）と、異なる色素、(a）〜（e）配列番号：79〜83で標識したPleiadesおよびTaqManプローブとを用いた増幅したターゲットの検出を示す。
I．一般
本開示は、ある種の酵素、すなわちKPC（Klebsiella pneumoniaeカルバペネマーゼ）、NDM−1（New Delhi Metallo−ベータ−ラクタマーゼ）、VIM（Verona Integron−Mediated Metallo−β−ラクタマーゼ）、IMP−型カルバペネマーゼおよびOXA（オキサシリナーゼ）をコードする核酸遺伝子配列の特異的な増幅および／または検出の方法に使用するためのプライマーおよびプローブを提供する。
II.定義
本明細書中で用いる「CRE」なる語は、抗生物質に高レベルの耐性を有するために治療することが困難である細菌のファミリーである、カルバペネム−耐性腸内細菌科菌群をいう。腸内細菌科菌群の細菌には、カルバペネム−耐性になることができるKlebsiella、PseudomonasおよびEscherichia coli（E. coli）種が含まれる。
本明細書中で用いる「KPC」、「NDM−1」、「VIM」、「IMP」および「OXA」、CRE遺伝子ターゲット、なる語は、各々、KPC（Klebsiella pneumoniae耐性カルバペネマーゼ）、NDM−1（New Delhi Metallo−ベータ−ラクタマーゼ）、VIM（Verona Integron−Mediated Metallo−β−ラクタマーゼ）、IMP−型カルバペネマーゼおよびOXA 48（オキサシリナーゼ）をいう。また、「OXA」なる語は、blaOXA−48およびその誘導体blaOXA181遺伝子ターゲットをいう。
本明細書中で用いる「試料」とは、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を含むことが疑われるいずれかの起源の試料をいう。これらの試料は、本明細書に記載する方法によって試験することができる。試料は研究室起源または非−研究室起源からのものとすることができる。試料は緩衝液、抽出液、溶媒などの液体材料に懸濁または溶解してもよい。また、試料には、動物およびヒトの組織または全血、血液画分、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、乳、尿、呼吸器、腸および泌尿生殖器の管の種々の外分泌物、涙、ならびに唾液のような流体；ならびに細胞抽出物、細胞培養上清のような生物流体、固定化組織標本、および固定化細胞標本のような生物試料も含まれる。試料には、鼻咽頭または咽喉のスワブ、便、または直腸スワブが含まれる。生物試料は、生検および組織学的目的のために採取した解剖試料または冷凍切片のような組織の画分も含んでもよい。生物試料は、例えばヒトを含むいずれの哺乳動物からも得られる。
「フラップ・プライマー」または「オーバーハング・プライマー」なる用語は、ターゲット核酸配列（例えば、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸配列）に相補的でない5'配列セグメントおよびターゲット核酸配列（例えば、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸配列）に相補的である3'配列セグメントを含むプライマーをいう。本発明のフラップ・プライマーは、プライマー伸長またはターゲット核酸配列（例えば、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸配列）の増幅に好適である。
「オーバーハング配列」なる語は、プライマー中の相補的でないアダプター、フラップ、またはオーバーハング配列をいう。「相補的でない」配列は、増幅条件下でターゲット配列に結合しない。フラップ・プライマーのフラップ部分は、ターゲット配列に相補的であるが、フラップの部分の5'側の直近の3ヌクレオチドがターゲット配列に相補的でないヌクレオチドを含むことができる。
「蛍光発生プローブ」なる語は、a）結合した副溝バインダー、フルオロフォア、およびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド、またはb）DNA結合試薬のいずれかをいう。プローブは、例えば、5'末端を含むいずれかのポジションに1またはそれを超える相補的でないまたは修飾ヌクレオチド（例えば、本明細書中で以下に記載するピラゾロピリミジン）を含むことができる。幾つかの実施形態において、フルオロフォアは、修飾ヌクレオチドに結合する。
「修飾塩基」なる語は、1またはそれを超える官能基の付加または欠失、複素環構造の差（すなわち、ヘテロ原子への炭素の置換、またはその逆）、および／または塩基に対する1またはそれを超えるリンカーアーム構造の結合によって天然に存在する塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシル）とは異なる塩基をいう。好ましい修飾ヌクレオチドは、ピリミジン構造系またはプリン構造系のものであるが、後者では好ましくは7 デアザプリンおよびその誘導体ならびにピラゾロピリミジン（米国特許第7,045,610号に記載されている）であり；米国特許第6,127,121号にも記載されている。好ましい修飾塩基は、5−置換型ピリミジンおよび3−置換型ピラゾロピリミジンである。好ましい修飾塩基の例は、6−アミノ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4(5H)−オン（PPGまたはSuper G（登録商標））、4−アミノ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、1H−ピラゾロ[5,4−d]ピリミジン−4(5H）−6(7H）−ジオン、6−アミノ−3−プロプ−1−イニル−5−ヒドロピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−オン、6−アミノ−3−(3−ヒドロキシプロプ−1−イニル）−5−ヒドロピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−オン、6−アミノ−3−(3−アミノプロプ−1−イニル）−5−ヒドロピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−オン、4−アミノ−3−(プロプ−1−イニル）ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、4−アミノ−3−(3−ヒドロキシプロプ−1−イニル）ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、4−アミノ−3−(3−アミノプロプ−1−イニル）ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、3−プロプ−1−イニル−4,6−ジアミノピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、2−(4,6−ジアミノピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル）エチン−1−オール、3−(2−アミノエチニル）ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミン、5−プロプ−1−イニル−1,3−ジヒドロピリミジン−2,4−ジオン、5−(3−ヒドロキシプロプ−1−イニル）−1,3−ジヒドロピリミジン−2,4−ジオン、6−アミノ−5−プロプ−1−イニル−3−ジヒドロピリミジン−2−オン、6−アミノ−5−(3−ヒドロキシプロプ−1−イニル）−l,3−ジヒドロピリミジン−2−オン、6−アミノ−5−(3−アミノプロプ−1−イニル）−1,3−ジヒドロピリミジン−2−オン、5−[4−アミノ−3−(3−メトキシプロプ−1−イニル）ピラゾール[3,4−d]ピリミジニル]−2−(ヒドロキシメチル）オキソラン−3−オール、6−アミノ−1−[4−ヒドロキシ−5−(ヒドロキシメチル）オキソラン−2−イル]−3−(3−メトキシプロプ−1−イニル）−5−ヒドロピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−オン、4−(4,6−ジアミノ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル）−ブト−3−イン−1−オール（Super A（登録商標））、6−アミノ−3−(4−ヒドロキシ−ブト−1−イニル）−1,5−ジヒドロ−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−オン、5−(4−ヒドロキシ−ブト−1−イニル）−1H−ピリミジン−2,4−ジオン（Super T（登録商標））、3−ヨード−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミン、3−ブロモ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミン、3−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4,6−ジアミン、3−ヨード−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−イルアミン、3−ブロモ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−イルアミンおよび3−クロロ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−イルアミンである。ユニバーサル塩基の例は、同時−所有の米国特許出願公開（出典明示して本明細書の一部とみなす）US2013/0261014に見出すことができる。
「蛍光標識」または「フルオロフォア」なる語は、約400〜約900nmの間に最大蛍光発光を有する化合物をいう。これらの化合物には、括弧内のnmで最大発光を有し、Cy2（商標）（506）、GFP（Red Shifted）（507）、YO−PRO（商標）−1（509）、YOYO（商標）−1（509）、Calcein（517）、FITC（518）、FluorX（商標）（519）、Alexa（商標）（520）、Rhodamine 110（520）、5−FAM（522）、Oregon Green（商標）500（522）、Oregon Green（商標）488（524）、RiboGreen（商標）（525）、Rhodamine Green（商標）（527）、Rhodamine 123（529）、Magnesium Green（商標）（531）、Calcium Green（商標）（533）、TO−PRO（商標）−1（533）、TOTO（登録商標）−1（533）、JOE（548）、BODIPY（登録商標）530/550（550）、Dil（565）、BODIPY（登録商標）558/568（568）、BODIPY（登録商標）564/570（570）、Cy3（商標）（570）、Alexa（商標）546（570）、TRITC（572）、Magnesium Orange（商標）（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、Calcium Orange（商標）（576）、Pyronin Y（580）、Rhodamine B（580）、TAMRA（582）、Rhodamine Red（商標）（590）、Cy3.5（商標）（596）、ROX（608）、Calcium Crimson（商標）（615）、Alexa（商標）594（615）、Texas Red（登録商標）（615）、Nile Red（628）、YO−PRO（商標）−3（631）、YOYO（商標）−3（631）、R−フィコシアニン（642）、C−フィコシアニン（648）、TO−PRO（商標）−3（660）、TOTO（登録商標）−3（660）、DiD DilC(5）（665）、Cy5（商標）（670）、チアジカルボシアニン（671）、およびCy5.5（694）が含まれる。さらなるフルオロフォアは、PCT国際公開番号WO 03/023357および米国特許第7,671,218号に開示されている。これらおよび他の好適な色素クラスの例は、Hauglandら，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals、第6版，Molecular Probes、 Eugene、Ore.（1996）;米国特許第3,194,805号；第3,128,179号；第5,187,288号；第5,188,934号；第5,227,487号、第5,248,782号；第5,304,645号；第5,433,896号；第5,442,045号；第5,556,959号；第5,583,236号；第5,808,044号；第5,852,191号；第5,986,086号；第6,020,481号；第6,162,931号；第6,180,295号；および第6,221,604号；欧州特許第1408366；に見出すことができ、いまだ他の色素はzeiss.com.のようなオンラインサイトを介して提供されている。ホスホネート色素は、同時−所有の米国特許第7,671,218号、第7,767,834号および第8,163,910号に開示されている。
クエンチャーおよびフルオロフォア対を選択することおよびオリゴヌクレオチドに対するそれらのアタッチメントについては当該技術分野に広範なガイダンスが存在する（Haugland，1996;米国特許第3,996,345号、第4,351,760号および第8,410,255号など）。
好ましいクエンチャーは、同時−所有の米国特許第6,727,356号および第7,662,942号に記載されている。
本明細書の記載において、M、FL、Q、CPG、およびODNなる略語は、各々明細書中の文脈から明らかである様式では、「副溝バインダー」、「蛍光標識」または「フルオロフォア」、「クエンチャー」、「制御型有孔ガラス」（固体支持体の例として）、および「オリゴヌクレオチド」基または分子をいう、「プローブ」および「コンジュゲート」なる用語は相互交換して用いられ、好ましくは結合した副溝バインダー、フルオロフォア、およびクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドをいう。
「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」なる語は、本明細書中で相互交換して用いる。これらの用語は、核酸、ヌクレオチド、または一本鎖または二本鎖形態でのそのポリマー、例えば、DNA、RNA、天然ヌクレオチドのアナログ、およびそれらのハイブリッドを含む化合物をいう。これらの用語には、修飾または天然に存在しないヌクレオチドを含むポリマー、または限定するものではないが、Nielsenら，Science，254：1497−1500（1991）に記載のペプチド核酸、Bolliら，Nucleic Acids Res.，24：4660−4667（1996）に記載のビシクロDNAオリゴマー、および関連する構造を含む、DNAまたはRNAに対して安定に塩基対合することができるいずれかの他の型のポリマーが包含される。別段限定しない限り、その用語には、天然に存在するヌクレオチドと同様にして核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの公知のアナログが包含される。かかるアナログの例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（PNA）およびそれらのいずれかの組合せが含まれる「サブ配列」または「セグメント」とは、ヌクレオチドのより長い配列の部分を含むヌクレオチドの配列をいう。
「内部対照」なる用語は、1またはそれを超える試薬の不調に起因するターゲットの偽陰性増幅、サーマルサイクリングに起因する増幅の不調、増幅の阻害、または反応の報告の不調をモニターする対照増幅反応をいう。バクテリオファージMS2（Dreierら，J Clin Microbiol. 43(9）：4551−7(2005））および内部対照としての精製Bacillus atrophaeus subsp. globigiiの胞子（Picardら，(2009））の使用が報告されている。競合的および非−競合的内部対照の設計における実際的な考察も当該技術分野で報告されている（Hoorfarら，(2004））。
本明細書に記載する方法の実施は、別段断らない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成および修飾、バイオコンジュゲート法、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えDNA、および関連分野における慣用技術を用い、それらは当業者の範囲内である。これらの技術は文献に十分に説明されている（例えば、Sambrook，Fritsch & Maniatis，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）；Ausubelら，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons（1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995、1996）；Gait（編），OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press（1984）；ならびにEckstein（編），OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press（1991）を参照されたい）。
III.記載
本明細書における好ましい実施形態は、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA遺伝子核酸を特異的に増幅および／または検出する方法に使用するプライマーおよびプローブに指向される。本発明のプライマーおよびプローブは、単一の反応または別の反応のいずれかにおいて同時にNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA配列を検出する本発明の方法において使用するのに好適である。典型的に、増幅法はNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸に対して行う。1のかかる増幅法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である（例えば、米国特許第4,683,195号および第4,965,188号；Mullisら，(1986）を参照されたい）。
増幅手順はターゲット核酸配列の多くのコピーが、一連の重合および／または連結反応によって、通常は指数関数様式で生成するものである。以下に論じるより伝統的な増幅反応に加えて、本発明の方法は、スリーウェイ・ジャンクチャー（three−way juncture）（例えば、WO 99/37085を参照されたい）、シグナル増幅（例えば、Capaldiら，(2000）を参照されたい）、T7ポリメラーゼ、逆転写酵素、RNase H、RT−PCR、ローリング・サークル（Rolling Circles）、クリアバーゼなどを含む増幅において有用である。等温増幅法は論じられている（Niemz，A.（2011））。「プローブ領域に近接するオリゴヌクレオチドプライマー」なる句は、0または1またはそれを超える塩基がプライマーおよびプローブを分離する場合にいう。「該プローブ領域とオーバーラップする」なる語は、米国特許第7,319,022号に開示されているように定義される。「Ct」なる語は、レポーター発酵が閾値よりも大きいところの画分PCRサイクル数をいう。
したがって、第1の態様において、本発明は試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を検出する方法を提供し、それには：
(a）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を含有することが疑われる試料と、以下の式を有する少なくとも1のフラップ・プライマーとを接触させ：
5'−[X]n−Y−3' （I）、
［式中、XはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に相補的でないフラップ・プライマーの5'部分を表し、YはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、Xは約3〜30ヌクレオチド長であり、n=0または1であり］;
(b）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（a）の混合物をインキュベートし、それによって増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を生成し；ついで
(c）増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を検出する
ことが含まれる。
幾つかの実施形態において、少なくとも1のフラップ・プライマーには、1を超えるプライマー配列が含まれる。幾つかの実施形態において、蛍光発生プローブを用いて増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を検出する。いくつかの実施形態において、蛍光発生プローブには1を超える配列が含まれる。1を超えるプローブ配列は、異なる蛍光発生色素で標識してもよい。プローブは副溝バインダーを含んでいてもよい。
幾つかの実施形態において、1を超える蛍光発生プローブは、同じ蛍光発光色素で標識してもよい。好ましい実施形態において、1を超えるプローブは、1を超える異なる蛍光発光色素で標識してもよい。
好ましい方法の実施において、反応混合物は典型的に少なくとも2のフラップ・プライマー：フォワードフラップ・プライマーおよびリバースフラップ・プライマー、を含む。フォワードフラップ・プライマーおよびリバースフラップ・プライマーは、必ずしも必要でないが、等しい長さである。
1の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分は、約1〜15ヌクレオチド長、通常約4〜14または約4〜13ヌクレオチド長であり、およびより一般的には約4〜12ヌクレオチド長である。NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチド長とすることができる。好ましい実施形態において、プライマーは全体で約30ヌクレオチド長である。相補的配列が30ヌクレオチド未満である場合は、フラップを用いて30−merプライマーを生成してもよい。
ある種の例において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（Y）に相補的であるフラップ・プライマーの3'配列部分には、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分よりも大きい数のヌクレオチドが含まれる。例えば、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（Y）に相補的であるフラップ・プライマーの3'配列部分は、フラップ・プライマーの全長の約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、または90%を含むことができる。
ある種の他の例において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分には、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（Y）に相補的であるフラップ・プライマーの3'配列部分とほぼ同数のヌクレオチドが含まれる。例えば、XおよびY部分は、各々、約4〜30、6〜25、8〜20、または10〜15ヌクレオチド長、一般的には約10〜14または11〜13ヌクレオチド長、およびより一般的には約12ヌクレオチド長とすることができる。XおよびY部分は、各々、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長とすることができる。
もう1の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分には、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、90%、または95%のアデニンまたはチミンヌクレオチド塩基、またはそれらの修飾塩基が含まれる。
幾つかの実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸（X）に相補的でないフラップ・プライマーの5'配列部分には、以下の配列：aataaatcataa（配列番号：28）またはその一部分が含まれる。配列番号：29〜32のようなより短いバージョンも用いることができる。配列番号：28の相補的でないフラップ配列は、さらなるオリゴヌクレオチド配列を含んで、例えば、配列番号：3、18または19において見出される。フラップ・プライマーの他の実施形態において、第1のフラップ・プライマーのY部分には、KPC核酸の少なくとも一部分に実質的に相補的な配列、すなわち配列番号：2または3のプライマー；IMP核酸、すなわち配列番号：8、9、10、11または12のプライマー；VIM核酸、すなわち配列番号：14、15または16のプライマー；NDM核酸、すなわち配列番号18または19のプライマーおよびOXA核酸、すなわち配列番号：21または22のプライマーが含まれる。配列を以下の表1に示す。「〜の少なくとも一部分に実質的に相補的」とは、その配列がNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA配列にハイブリダイズし、増幅を生じる、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA配列に十分に相補的であるということを意味する。「実質的同一性」とは、より詳細には約85%相補的であることを意味する。
Figure 2017538418
Figure 2017538418
さらなる実施形態において、プライマーおよびプローブは、異なるロケーション、すなわち、表2に示す945〜997のロケーション2、および565〜627のロケーション3（Yigitら）で2の異なるKPC配列の部分をターゲットとするよう設計する。
Figure 2017538418
さらなる実施形態において、プライマーおよびプローブは、異なるロケーション、すなわち、表3に示す945〜997のロケーション2、および565〜627のロケーション3（Yigitら）でさらなる異なるIMP配列の部分をターゲットとするよう設計する。
Figure 2017538418
さらなる実施形態において、プライマーおよびプローブは、異なるロケーション、すなわち、表4に示す172〜541のロケーション2、および、562〜636のロケーション3（Papagiannitsisら）でさらなる異なるVIM配列の部分をターゲットとするよう設計する。
Figure 2017538418
さらなる実施形態において、プライマーおよびプローブは、異なるロケーション、すなわち、表5に示す213〜292のロケーション2、および453〜573のロケーション3（Yongら）でさらなる異なるNDM1配列の部分をターゲットとするように設計する。
Figure 2017538418
さらなる実施形態において、プライマーおよびプローブは、異なるロケーション、すなわち、表6に示す179〜299のロケーション2、および、599〜631のロケーション3（Poirelら）でさらなる異なるOXA−48配列の部分をターゲットとするように設計する。これらのプライマーおよびプローブは、OXA−181にも特異的である（Potronら）。
Figure 2017538418
試料は、典型的には、潜在的なNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA抗生物質耐性の併発を有する細菌感染症を有することが疑われる哺乳動物から得られる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の方法に使用するのに好適な試料の例には、限定するものではないが、直腸スワブが含まれる。
一般的に、方法は、プローブが増幅したターゲットにハイブリダイズした場合に検出可能なシグナルを生成する（米国特許第7,381,818号および第7,759,126号）。また、この方法により増幅後の融解曲線分析も提供される。あるいは、5'−3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いることによって蛍光プローブを切断して、蛍光シグナルを得る（第5,538,848号）。さらに、方法は検出可能なシグナルの連続モニタリングに特に適する（「リアル−タイム検出」）。ある種の実施形態において、同時の増幅は、蛍光発生プローブ、例えば、ハイブリダイゼーション−系蛍光プローブまたは核酸結合蛍光化合物を用いて検出する。
増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸は、当該技術分野で知られているいずれの検出方法を用いても検出することができる。例えば、検出は、増幅反応が完了した後に（例えば、アガロースゲル中で臭化エチジウムを用いて）または増幅反応と同時に（「リアル−タイム検出」）（McPhersonら，2000；およびWittwerら，(2004））行うことができる。好ましくは、増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸は、増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に特異的に結合するプローブへのハイブリダイゼーションによって検出する。ある種の例において、増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸は、1またはそれを超える蛍光発生プローブを用いて検出する。蛍光発生プローブには、切断して蛍光を放出するプローブ（例えば、米国特許第5,538,848号、第7,790,385号ほか）、核酸結合化合物（例えば、米国特許第5,994,056号；Bengtssonら，2003）、ハイブリダイゼーション−系プローブ（例えば、米国特許第5,925,517号、第7,205,105号、第7,381,818号ほか）などのプローブが含まれる。ある種の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸は、1またはそれを超える核酸結合蛍光化合物（例えば、SYBR（登録商標）Green 1（Molecular Probes；Eugene，OR）、またはBOXTOX、BEBO（TATAA Biocenter；Gotenborg，Sweeden）など）を用いて検出する。
1の実施形態において、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸は、表1に開示する、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸および少なくとも1のフラップ・プライマー配列の1またはそれを超えるヌクレオチド塩基（典型的に、相補的部分、Y）にハイブリダイズする蛍光発生プローブを用いて検出する。例えば、蛍光発生プローブは、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸およびフォワードフラップ・プライマー配列の1またはそれを超えるヌクレオチド塩基、リバースフラップ・プライマー配列の1またはそれを超えるヌクレオチド塩基、またはフォワードおよびリバースフラップ・プライマー配列の両方の1またはそれを超えるヌクレオチド塩基に同時にハイブリダイズする。蛍光発生プローブは、所望により、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸におよび少なくとも1のフラップ・プライマー配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド塩基に、特にフラップ・プライマーの相補的部分（Y）にハイブリダイズしてもよい。
好ましい実施形態において、本発明の蛍光発生プローブには以下の配列の少なくとも1が含まれる：
Ra1−G*CAGGTTCCGGTTTTG−Rb1（配列番号：1）
Ra2−G*GI*CACACTCCAGATAAC−Rb1（配列番号：4）
Ra2−G*GI*CACACTCAAGATAAC−Rb1（配列番号：5）
Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAGC−Rb1（配列番号：6）
Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAAC−Rb1（配列番号：7）
Ra2−G*TGCGCTTCGGTCC−Rb1（配列番号：13）
Ra2−G*ACATGCCGGGTTTC−Rb1（配列番号：17）
Ra3−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb1（配列番号：20）
Ra5−G*GTGGCATCGATTATC−Rb2（配列番号：26）
Ra6−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb3（配列番号：27）
ここに、G*=Super G；A*=Super A、I*=3−アミノブチニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4(5H）−オン；Ra1=FAM；Ra2=AP593；Ra3=AP662；Ra4= AP525；Ra5=Quasar 705（Biosearch Technology，Petaluma，CA）；Ra6=MGB−Ra3;Rb1= Eclipse（登録商標）Dark クエンチャー−MGB；Rb2=クエンチャー575−MGBおよびRb3=Eclipse（登録商標）Dark クエンチャー。クエンチャー575=（E）−4−((4−((2−クロロ−4−ニトロフェニル）ジアゼニル）−2,5−ジメトキシフェニル）(エチル）アミノ）酪酸。AP=記録した発光波長（IW）を有するAquaPhlour色素−IW。
好ましい実施形態において、フルオロフォアはFAM、525nmの励起波長を有するAquaPhluor（登録商標）525、593nmの励起波長を有するAquaPhluor 593、662nmの励起波長を有するAquaPhluor 662（(ELITechgroup Molecular Diagnostics，Bothell，WA）およびQuazar 705（Biosearch Technologies）である。
さらなる好ましい実施形態において、本発明の蛍光発生プローブは、表1〜6に示した以下の配列：配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、または83の少なくとも1を含む。
プライマーは、プライマーの検出または固定化は許容するが、プライマーの基本特性は変化しないさらなる特徴、例えば、核酸合成の開始点として作用することを取り込むことができる。幾つかの例において、プライマーには、プライマーの相補的および相補的でない配列領域のいずれかまたは両方に、1またはそれを超える非−天然塩基または修飾塩基が含まれる。
ある種の例において、増幅はポリメラーゼを用いて行う。ポリメラーゼは、必ずしも必要ではないが、5'ヌクレアーゼ活性を有することができる。ある種の他の例において、プライマー伸長は逆転写酵素を用いて行い、増幅はポリメラーゼを用いて行う。
もう1の実施形態において、プライマー配列は重複し、ここに重複配列二本鎖の安定性は、個々のプライマーターゲット二本鎖の安定性未満である。
好ましい実施形態において、フォワードおよびリバースフラップ・プライマーの両方を含む本発明のプライマーには、以下の配列の少なくとも1が含まれる：表1〜6に示した配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、または76。
もう1の態様において、本発明は、試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXAからの核酸を同時に検出する方法を提供し、それには：
(a）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を含むことが疑われる試料と：
（i）以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のフォワードフラップ・プライマー：
aataaatcataaGCAGACTGGGCAGTCGG（配列番号：3）、
aataaatAGGCAACCAAACCACTACGTTATCT（配列番号：11）、
aataaatAGGCAGCCAAACTACTAGGTTATCT（配列番号：12）、
aataaatcaCGAATGCGCAGCACCI*GGATAGA（配列番号：16）、
aataaatcataaCGCCATCCCTGACGATCAAAC（配列番号：19）、および
aataaatcatTCTTGCCATTCCTTTGCTACCG（配列番号：22）、
ここに、小文字のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に対して相補的でない；および
（ii）以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のリバースフラップ・プライマー：
aataaatcatGTCATTTGCCGTGCCATAC（配列番号：2）、
aataaatcatGGAATA*GAGTGGCTTAATTCTC（配列番号：8）、
aataaatcatGGAATA*GGGTGGCTTAATTCTC（配列番号：9）、
aataaatcatGGAATA*GAATGGCTTAACTCTC（配列番号：10）、
aataaCGCATTCTCTAGAAGGACTCTCATC（配列番号：14）、
aataaCGCACTCTCTAAAAGCGCTCTCCTC（配列番号：15）、
aataaatcataaGTCTGGCAGCACACTTCCTA（配列番号：18）、および
aataaatcaATGCGTGTATTAGCCTTATCGGC（配列番号：21）、
ここに、小文字のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に相補的でない、
とを接触させ;
(b）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（ａ）の反応混合物をインキュベートし、それによって、抗生物質耐性を運搬するNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA遺伝子を含む細菌から増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を生成し；ついで
(c）増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を検出する、ことが含まれる。
幾つかの実施形態は、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の非対照増幅を許容するプライマー比を含む。
試料は、典型的には、カルバペネム−耐性腸内細菌科菌群、(CRE）を運搬する生物の感染を有することが疑われる哺乳動物から得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明の方法に使用するのに好適な典型的な試料は、CRE含有生物、好ましくは直腸スワブを含む。
幾つかの実施形態において、検出可能なシグナル（「リアル−タイム検出」）の連続モニタリングを用いて、シグナルを検出する。ある種の実施形態において、同時増幅は、蛍光発生プローブ、例えば、ハイブリダイゼーション−系蛍光プローブ、切断部位を有するプローブまたは核酸結合蛍光化合物を用いて検出する。幾つかの実施形態において、解離曲線解析を用いるエンド−ポイント蛍光測定を用いてシグナルを検出する。
なおもう1の態様において、試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を検出するためのキットを提供し、それには：
以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のフォワードフラップ・プライマー：
aataaatcataaGCAGACTGGGCAGTCGG（配列番号：3）、
aataaatAGGCAACCAAACCACTACGTTATCT（配列番号：11）、
aataaatAGGCAGCCAAACTACTAGGTTATCT（配列番号：12）、
aataaatcaCGAATGCGCAGCACCI*GGATAGA（配列番号：16）、
aataaatcataaCGCCATCCCTGACGATCAAAC（配列番号：19）、および
aataaatcatTCTTGCCATTCCTTTGCTACCG（配列番号：22）、
ここに、下線のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に相補的でない；および
以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のリバースフラップ・プライマー：
aataaatcatGTCATTTGCCGTGCCATAC（配列番号：2）、
aataaatcatGGAATA*GAGTGGCTTAATTCTC（配列番号：8）、
aataaatcatGGAATA*GGGTGGCTTAATTCTC（配列番号：9）、
aataaatcatGGAATA*GAATGGCTTAACTCTC（配列番号：10）、
aataaCGCATTCTCTAGAAGGACTCTCATC（配列番号：14）、
aataaCGCACTCTCTAAAAGCGCTCTCCTC（配列番号：15）、
`aataaatcataaGTCTGGCAGCACACTTCCTA（配列番号：18）、および
aataaatcaATGCGTGTATTAGCCTTATCGGC（配列番号：21）、
ここに、下線のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に相補的でない、が含まれる。
ある種の例において、キットは、さらに、核酸結合蛍光化合物を含むNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXAを検出するためのハイブリダイゼーション−系蛍光プローブのような蛍光発生プローブを含む。好ましい実施形態において、蛍光発生プローブは以下の配列の少なくとも1を含む：
Ra1−G*CAGGTTCCGGTTTTG−Rb1（配列番号：1）、
Ra2−G*GI*CACACTCCAGATAAC−Rb1（配列番号：4）、
Ra2−G*GI*CACACTCAAGATAAC−Rb1（配列番号：5）、
Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAGC−Rb1（配列番号：6）、
Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAAC−Rb1（配列番号：7）、
Ra2−G*TGCGCTTCGGTCC−Rb1（配列番号：13）、
Ra2−G*ACATGCCGGGTTTC−Rb1(配列番号：17）、
Ra3−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb1(配列番号：20）、
Ra5−G*GTGGCATCGATTATC−Rb2(配列番号：26）、および
Ra6−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb3(配列番号：27）、
ここに、G*=Super G；A*=Super A、I*=3−アミノブチニル−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4(5H）−オン；Ra1=FAM；Ra2=AP593；Ra3=AP662；Ra4= AP525；Ra5=Quasar 705（Biosearch Technology，Petaluma，CA）；Ra6=MGB−Ra3;Rb1= Eclipse（登録商標）Darkクエンチャー−MGB；Rb2=クエンチャー575−MGBおよびRb3=Eclipse（登録商標）Darkクエンチャー。クエンチャー575=（E）−4−((4−((2−クロロ−4−ニトロフェニル）ジアゼニル）−2,5−ジメトキシフェニル）(エチル）アミノ）酪酸。AP=記載の発光波長（IW）を有するAquaPhlour Dye−IW。
好ましい実施形態において、フルオロフォアはFAM、525nmの励起波長を有するAquaPhluor（登録商標）525、593nmの励起波長を有するAquaPhluor 593、662nmの励起波長を有するAquaPhluor 662（(ELITechgroup Molecular Diagnostics、Bothell、WA）およびQuazar 705である。
さらなる好ましい実施形態において、蛍光発生プローブは以下の配列の少なくとも1を含む：表1〜6に上記に示す配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、または83。
ある種の他の例において、キットは、さらに内部対照として使用するのに好適である対照核酸を含む。非−限定的な例として、対照核酸は、配列番号：33の少なくとも一部分を含む核酸配列を含むことができる。好ましくは、対照核酸は以下の配列を含む：
5’−CTGCACGGACCAGTTACTTTACGGACCACGTACCGCATTGGTACAAGATCTCCGGTAGAAAAAATGAG−3’(配列番号：33）。
本発明のキットは、対照核酸に対して指向されたプライマーおよびプローブも含むことができる。非-限定的な例として、対照プローブ（例えば、蛍光発生プローブ）および核酸配列配列番号：33に対して設計された一連の対照プライマーもキットに含めることができる。好ましくは、対照プローブおよびプライマーは以下の配列を有する：
(i）プローブ：Ra−G*ACCACGTACCGCATTG−Rb（配列番号：25）、
ここに、G*はグアニン・アナログ6−アミノ−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4(5H）−オンであり、Raは独立して（M）a−Flおよび（M）a−Qから選択され、Rbは独立して（M）a−Flおよび（M）a−Qから選択され、およびMは副溝バインダーであり、aは0または1であり、Flは約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、およびQは非−蛍光クエンチャーであるが、但し、RaおよびRbの置換はプローブがハイブリダイズしなかった場合に蛍光のクエンチングを許容し；フルオロフォアはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXAからの核酸を検出するためのプローブの発光波長とは異なる発光波長を有し；および
(ii）プライマー：CTGCACGGACCAGTTACTTTACG（配列番号：23）、および
CTCATTTTTTCTACCGGAGATCTTGT（配列番号：24）。
好ましい実施形態において、Flは525nmの励起波長を有するAquaPhluor 525（ELITechgroup Molecular Diagnostics，Bothell，WA）であり、「M」は例えばDPI3のような副溝バインダーであり、「G*」はPPGであり、および「Q」はEclipse（登録商標）Darkクエンチャーである。
1の態様において、本発明は、NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXAを含む伸長したベータ−ラクタマーゼ耐性遺伝子の特異的な検出および増幅に好適なターゲット配列を提供する。
本発明の方法は、最も一般的に5'−(X）p−Y−3'プライマー、ここに、p=0または1、XはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に相補的でないプライマーの配列部分を表し、およびYはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に対して相補的であるプライマーの配列部分を表す、として記載されるオリゴヌクレオチド・プライマー(「オーバーハング・プライマー」、「フラップ・プライマー」または「アダプター・プライマー」）を提供する。
したがって、実施形態の1群において、プライマーは式：
5'−(X）p−Y−3'（I）、
［式中、XはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に対して相補的でないなプライマーの5'配列を表し、Yはプライマーの相補的な3'配列を表し、pは0または1であり、およびX−Yは核酸オリゴマープライマーを表す］を有する。ある種のさらなる実施形態において、Xは[A−B]mであってYは[A−B]nであり、ここにAは核酸調製に使用する場合のいずれかの組合せの糖−リン酸主鎖、修飾糖−リン酸主鎖、ロックド核酸主鎖、またはそれらの変異型を表し；Bは核酸塩基または塩基の修飾塩基を表し；下付のmおよびnは約4〜30または5〜25、7〜20、または9〜15の整数であり、および一般的には約12である。ある種の実施形態において、下付文字mおよびnの値は等しく、例えば、mおよびnは両方とも同時に約5〜25、7〜20、または9〜15の整数、およびより一般的には約12となることができる。
プライマーおよびプローブは、移行可能なプラスミドに位置するNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA遺伝子の領域、より詳細には各々のグループのメンバー間で実質的または絶対的なホモロジーを有するNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を増幅および検出するように設計した。幾つかの実施形態において、プライマーは以下の式を含むフラップ・プライマーである：
5'−(X）p−Y−3'（I）、
［式中、XはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に相補的でないであるフラップ・プライマーの5'部分を表し、YはNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸に相補的であるフラップ・プライマーの3'部分を表し、およびpは約3〜30、5〜25、7〜20、または9〜15である］。
本発明のプライマーの5'−相補的でない配列は、米国特許出願2007/0048758に教示されているように修飾することができる。
本発明のプライマーおよびプローブは、一般的に、当業者に公知である固相法を用いて調製する。一般的に、出発材料は市販されているか、または例えば、Marchら，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY-Reactions，Mechanisms and Structures，第4版，John Wiley & Sons，New York，NY（1992）に記載されている好適な官能基操作を用いて市販の出発物質から素直な様式で調製することができる。
1の実施形態において、本発明のプライマーおよびプローブは、当該技術分野で知られているいずれの天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドを含むことができる（例えば、米国特許出願公開20050118623；および米国特許第6,949,367号、米国特許出願公開20120244535を参照されたい）。
熱力学特性に基づく修飾塩基、副溝バインダー、フルオロフォア、および/またはクエンチャーの使用または取り込みを指示することができるアルゴリズムを用いた予測可能な様式でプローブおよびプライマーを設計する可能性は、例えば、米国特許第6,683,173号に記載されている。したがって、通常の塩基、非置換型ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン塩基（例えば、PPGおよびPPA）、3−置換型ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、5−置換型ピリミジン、ユニバーサル塩基、糖質修飾、主鎖修飾、および／または副溝バインダーのいずれかの組合せを使用して修飾核酸とハイブリダイズした生成物とのTm（例えば、約5〜8℃内）のバランスをとり、G−G自己会合を減小し、またはプライマーまたはプローブにおけるミスマッチを適合することが本発明によって意図される。同時−所有の米国特許出願2012/0244535（出典明示して本明細書の一部とみなす）は、プライマー中に5ほども多いミスマッチを有するプライマーおよびプローブをどのように取扱うかのさらなる説明を提供している。
ホスホロアミダイト法によるオリゴヌクレオチドの合成に用いた方法の詳細な記載は、米国特許第4,458,066号および第4,415,732号；Caruthersら，Genetic Engineering，4：1−17（1982）；およびUsers Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers，6−1頁ないし6−22頁，Applied Biosystems，Part No. 901237（1991）に提供されている。標識オリゴヌクレオチドは、化学合成、例えば、ホスホロアミダイト法、亜リン酸−トリエステル法など(例えば、Gait,Oligonucleotide Synthesis,IRL Press（1990）を参照されたい）によって合成することができる。標識は、例えば標識ヌクレオシド三リン酸モノマーを利用ｓるう酵素合成の間に導入することができ、または標識非−ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホロアミダイトを用いる化学合成の間に導入することができ、あるいは合成につづいて導入してもよい。
オリゴヌクレオチドの5'または3'末端にフルオロフォア、クエンチャー、および副溝バインダーを結合するための種々の結合基および結合法は当業者に知られている（例えば、Eckstein（編），Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press，Oxford（1991）；Zuckermanら，Nuc. Acids Res.，15：5305−5321（1987）；Sharmaら，Nuc. Acids Res.，19：3019（1991）；Giustiら，PCR Methods and Applications，2：223−227（1993）、米国特許第4,757,141号および第4,739,044号；Agrawalら，Tetrahedron Letters，31：1543−1546（1990）；Sproatら，Nuc. Acids Res.，15：4837（1987）；Nelsonら，Nuc. Acids Res.，17：7187−7194（1989）；などを参照されたい）。合成の間にオリゴヌクレオチドに結合することができるいまだ他の市販されている結合基を用いることができ、それは例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto、CA.）から入手可能である。フルオロフォアをオリゴヌクレオチド部分に結合する他の方法には、 involve the use of ホスホロアミダイト基で誘導化した色素による固相合成の終わりにホスホロアミダイト法を用いることが含まれる（例えば、米国特許第5,231,191号；第4,997,928号；第6,653,473号；第6,790,945号；および第6,972,339号；ならびにPCT国際公開WO 01/42505を参照されたい）。
IV. さらなる増幅反応成分
緩衝液
利用してもよい緩衝液は、ホウ酸、リン酸、炭酸、バルビタール、Trisほかをベースとする緩衝液である（例えば、米国特許第5,508,178号を参照されたい）。反応物のpHは約4.5〜約9.5の範囲に維持すべきである（例えば、米国特許第5,508,178号を参照されたい）。増幅反応に用いる標準的な緩衝液は10〜50mM、8.3〜8.8付近のpHを有するTris系緩衝液である（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。
当業者であれば、緩衝液の条件を、関心のあるすべての反応が機能するように設計すべきであることを認識している。したがって、緩衝液の条件は、増幅反応ならびにいずれかの続く制限酵素反応を指示するように設計することができる。特定の反応緩衝液は、個別におよび組合せての両方で反応を試験することによって種々の反応を指示するその能力につき試験することができる。
塩濃度
反応に存在する塩の濃度は、ターゲット核酸にアニールするプライマーの能力に影響することができる（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。塩化カリウムを約50mMの濃度まで反応混合物に添加して、プライマーアニーリングを促進することができる。塩化ナトリウムを添加しても、プライマーアニーリングを促進することができる（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。
マグネシウムイオン濃度
反応物中のマグネシウムイオンの濃度は、ターゲット核酸配列の増幅に影響し得る（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。プライマーアニーリング、鎖変性、増幅特異性、プライマー−ダイマー形成、および酵素活性は、マグネシウム濃度によって影響を受けるパラメータのすべての例である（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。増幅反応は、dNTPの濃度を超えて約0.5〜6.0mMマグネシウム濃度過剰に含むべきある。反応物中にマグネシウムキレ−ターが存在すると、最適マグネシウム濃度に影響し得る。一連の増幅反応は、一定範囲のマグネシウム濃度にわたって行って最適マグネシウム濃度を決定することができる。最適のマグネシウム濃度は、数あるパラメータの中でも、ターゲットNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸および使用するプライマーの性質に依存して変化することができる。
デオキシヌクレオチド三リン酸濃度
デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を反応物に添加して最終濃度約20μM〜約300μMとする。典型的に、4の各dNTP（G、A、C、T）は等濃度で存在する（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。幾つかの実施形態において、ウラシル N−グリコシダーゼをdUTPとともに（TTPの代わりに）PCR反応に用いる。
核酸ポリメラーゼ
本発明の方法および組成物を用いて機能する種々のDNA依存性ポリメラーゼが市販されている。例えば、Taq DNAポリメラーゼを用いてターゲットDNA配列を増幅してもよい。PCRアッセイは、Thermus aquaticusから精製した天然の酵素および/または該酵素の遺伝子工学的に設計された形態としてもよいTaq DNAポリメラーゼを好適に含む耐熱性DNAポリメラーゼの源を酵素成分として用いて行ってもよい。他の市販のポリメラーゼ酵素には、例えば、Qiagen，New England Biolabs，Applied Biosystems，PromegaまたはPharmaciaによって市販されているTaqポリメラーゼが含まれる。本発明に使用することができる耐熱性DNAポリメラーゼの他の例には、例えば、ThermusおよびPyrococcus種から得られたDNAポリメラーゼが含まれる。ポリメラーゼの濃度範囲は、反応混合物当たり1〜5単位とすることができる。反応混合物は典型的には約5μl〜約100μlである。
他の剤
さらなる剤を反応物に添加して望ましい結果を達成する場合もある。例えば、DMSOは反応物に添加することができるが、Taq DNAポリメラーゼの活性を阻害することが報告されている。それにも関わらず、DMSOは同一反応物中の複数のターゲット配列の増幅について推奨されている（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。ゼラチン、ウシ血清アルブミンおよび非−イオン性界面活性剤（例えば、Tween−20）のような安定化剤は増幅反応に通常は添加する（例えば、Innisら，前掲を参照されたい）。また、ベタイン（Sigma−Aldrich；St. Louis、MO）、イソ安定化剤を添加して核酸二本鎖の安定性に対するGC−およびAT−塩基対形成の寄与を等しくすることができる。
副溝バインダー
副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲート（または「プローブ」）は、例えば、米国特許第6,312,894号に記載されている。これらのコンジュゲートは相補的DNAと超−安定化した二本鎖を形成する。特に、短い副溝バインダープローブの配列特異性は、PCRのような高温適用に最適である。本発明のプローブ/コンジュゲートは、所望により共有結合した副溝バインダーを有していてもよい。種々の好適な副溝バインダーは文献に記載されている（例えば、米国特許第5,801,155号；Wemmerら，Curr. Opin. Struct. Biol.，7：355−361（1997）；Walkerら，Biopolymers，44：323−334（1997）；Zimmerら，U. Prog. Biophys. Molec. Bio.，47：31−112（1986）；およびReddyら，J. W., Pharmacol. Therap., 84：1−111（1999）を参照されたい）。
副溝バインダー−クエンチャー−オリゴヌクレオチド−フルオロフォアコンジュゲートは、直鎖状の配置（式5'−M−Q−ODN−Fl−3'または5'−M−Fl−ODN−Q−3'によって示唆されるような）または分枝鎖状の配置（ここにクエンチャー（Q）および副溝バインダー（MまたはMGB）はODN、QおよびM（またはMGB）を加えるよう作用する結合基に結合する）とすることができる。また、クエンチャーは、副溝バインダー（例えば、5'−Q−M−ODN−Fl−3'）の遠位（ODNに対する結合に対して）で結合することができる。各配置は、直鎖状の省略（M−Q−ODN−Fl）を用いる場合に含まれることを意味する。また、副溝バインダーおよびクエンチャー部分は、各々、かかる結合がコンジュゲートのクエンチング機構を妨害しない限りにおいて、オリゴヌクレオチドの3'または5'末端のいずれかに、またはオリゴヌクレオチドの内部ポジションに結合することができる。一般的に、このことは、好適な結合基の使用を介して行うことができる（例えば、米国特許第7,205,105号および第7,381,818号を参照されたい）。
リンカーを介して副溝バインダー（ならびに以下に記載するフルオロフォアおよびクエンチャーのようなレポーター基）をオリゴヌクレオチドに結合する好適な方法は、例えば、米国特許第5,512,677号；第5,419,966号；第5,696,251号；第5,585,481号；第5,942,610号；および第5,736,626号に記載されている。
副溝バインダーは、一般的に、好適な結合基を介してオリゴヌクレオチド部分の3'または5'ポジションに結合する。5'末端における結合は、オリゴヌクレオチドデュプレックスの融解は末端で開始するため、ハイブリッド安定性の利益を提供するのみならず、増幅反応の間のプローブのヌクレアーゼ消化を減小および/または防ぎもする。
副溝バインダー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート内の副溝バインダーのロケーションも、かかるコンジュゲートの識別特性に影響することができる。デュプレックス内の非対合領域は、誤対合塩基（複数の塩基を含む）付近の副溝の形状に変化を生じる。副溝バインダーは完全に対合したDNAデュプレックスの副溝内で最良にフィットするため、副溝中の形状の変化を生じる誤対合は、誤対合を含む領域への副溝バインダーの結合強度を低下する。したがって、かかるハイブリッドを安定化させる副溝バインダーの能力は低下し、それによって完全に都合したデュプレックスから誤対合を識別する副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの能力を増大する。一方、誤対合が副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートに相補的な領域の外側に存在する場合、等しい長さの非コンジュゲートおよび副溝バインダー−コンジュゲートオリゴヌクレオチドの識別能力は、ほぼ同一であると予想される。単一塩基誤対合を識別するオリゴヌクレオチドプローブの能力は単一塩基誤対合の長さに依存するため、より短いオリゴヌクレオチドは誤対合を識別することにおいてより有効である。この章における副溝バインダーオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用の主な利点は、先行技術において使用されていたものと比較して遙かに短いオリゴヌクレオチド（すなわち、20 mer以下）を、より大きな識別力を有し、副溝バインダーコンジュゲーションの顕著な安定化効果に起因して、用いることができるという事実である。
副溝バインダーおよび入手可能な副溝バインダーの選択は、米国特許第5,801,155号、第6,312,894号および第7,582,739号に開示されている。
最近開発された検出法は、蛍光強度の直接検出よりも、プローブハイブリダイゼーションの検出に蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）のプロセスを用いる。このタイプのアッセイでは、クエンチャー分子の吸収スペクトルが供与体フルオロフォアの発光スペクトルと重複し、かつ2の分子が近接している場合にFRETが供与体フルオロフォア（レポーター）とアクセプター分子（クエンチャー）との間に発生する。供与体フルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴双極子−誘導双極子相互作用によって近隣のアクセプターに移行し、それが供与体蛍光のクエンチングを生じる。アクセプター分子がフルオロフォアである場合、その蛍光が増大する場合がある。供与体とアクセプター分子との間のエネルギー移動の効率は、分子間の距離に非常に依存する。この関係を説明する等式は知られている。Forster距離（Ro）は、エネルギー移動が50%効率である場合の供与体およびアクセプター分子間の距離として記載される。衝突および電荷移行クエンチングのような蛍光クエンチングの他の機構も知られている。クエンチャーおよびフルオロフォア対およびオリゴヌクレオチドに対するそれらの結合を選択する先行技術の広範なガイダンスが存在する（例えば、Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，第9版，Molecular Probes，Eugene，OR（2002）およびwww.probe.com/handbookのWeb版；および米国特許第3,996,345号および第4,351,760号を参照されたい）。好ましいクエンチャーは、米国特許第6,727,356号および第6,790,945号に記載されている。さらなるモノ−およびビス−アゾ色素は、Berry and Associates（Dexter，MI）およびGlen Research（Sterling，VA）から市販されている。
フルオロフォア
本発明において有用なフルオロフォアは、一般的に、オリゴヌクレオチドプローブの末端3'または5'炭素に、好ましくは結合基を介して結合するために誘導化された蛍光有機色素である。当業者であれば、好適なフルオロフォアが、典型的に有機色素でもあり、蛍光であってもなくてもよいクエンチャーと組合せて選択されることを理解する。これらのおよび他の好適な色素のクラスの例は、Hauglandら，Handbook of fluorescent probe and Research Chemicals，第6版，Molecular Probes，Eugene，Ore.（1996）;米国特許第3,194,805号；第3,128,179号；第5,187,288号；第5,188,934号；第5,227,487号；第5,248,782号；第5,304,645号；第5,433,896号；第5,442,045号；第5,556,959号；第5,583,236号；第5,808,044号；第5,852,191号；第5,986,086号；第6,020,481号；第6,162,931号；第6,180,295号；および第6,221,604号；欧州特許第1408366に見出すことができ；いまだ他の色素は、http：//www.zeiss.com.のようなオンライン・サイトを介して提供される。好ましいホスホネート色素は、同時−所有の米国特許第7,671,218号、米国特許第7,767,834号および米国特許第8,163,910号に開示されている。
特定のプローブに対して適当なフルオロフォア−クエンチャーの対を選択するために、文献で利用可能な多量の実践的ガイダンスが存在する（Haugland，前掲およびwww.probes.com/handbookのWeb版）。これらおよび他の好適な色素のクラスの例は、Hauglandら，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，第6版，Molecular Probes，Eugene，Ore.（1996）;米国特許第3,194,805号；第3,128,179号；第5,187,288号；第5,188,934号；第5,227,487号、第5,248,782号；第5,304,645号；第5,433,896号；第5,442,045号；第5,556,959号；第5,583,236号；第5,808,044号；第5,852,191号；第5,986,086号；第6,020,481号；第6,162,931号；第6,180,295号；および第6,221,604号；EP特許第1408366に見出すことができ；いまだ他の色素は、http：//www.zeiss.comのようなオンラインサイトを介して提供されている。共通の反応性基を介した共有結合のためにフルオロフォアおよびクエンチャーを誘導化する方法は、よく知られている。例えば、Haugland，前掲；ならびに米国特許第3,996,345号および米国特許第4,351,760号を参照されたい。
好ましいフルオロフォアはキサンテン色素に基づくものであって、その種々のものはいずれかの結合基の結合またはオリゴヌクレオチドへの直接結合のために有用な置換基とともに市販されている。最も好ましいホスホネート色素は、同時−所有の米国特許第7,671,218号、米国特許第7,767,834号および第8,163,910号に開示されている。
以下の実施例は説明目的に提供するものであって、本明細書に記載する内容を限定するものではない。
オリゴヌクレオチド
プライマーは、標準的なホスホロアミダイト法を用いて合成した。5'−M−Fl−ODN−QおよびFl−ODN−Q−Mプローブは、各々、各々5’→3または3'→5'の向きでのオリゴヌクレオチド・セグメントの合成用に設計された5−β−シアノエチル−または3'−β−シアノエチルホスホロアミダイト（Glen Research；Sterling，VA）を用いて、M−FL−またはM−Q−修飾ポリスチレン固体支持体上の自動DNA合成によって調製した。オリゴヌクレオチドの合成は、0.02Mヨウ素溶液を用いて製造業者により提供されたプロトコルに従ってABI 394合成機で行った。修飾およびユニバーサル塩基は、米国特許第6,949,367号、第6,127,121号および米国特許出願公開20120244535に開示されている方法に基づいて合成した。フルオロフォアのレポート色素またはクエンチャーは、必要により対応するホスホロアミダイトを用いて合成の最終工程で導入した。すべてのオリゴヌクレオチドは、逆相HPLCによって精製した。
PCR
リアル−タイムPCRは、ESBL DNAを検出する診断アッセイにおいて、QIAsymphony SP/AS DNA抽出システム（QIAGEN Inc.，Valencia，CA）で抽出した症候性および無症候性の患者材料からのヒト直腸スワブからの試料に対してRGQ MDxリアル−タイムPCR増幅機を用いて行った。アッセイ混合物には、以下の成分が含まれる：
Master Solution A：CRE Master A：KPC−、IMP−、VIM−、NDM−、Oxa−48−、およびOxa−181−特異的および内部対照プローブおよびプライマー、PCR緩衝液、HotStartTaq QR2 DNAポリメラーゼ、ウラシルN−グリコシラーゼ、およびデオキシヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、およびdUTP）を含む。23μLのCRE Master A試薬混合物を各40μLのPCR反応に用いる。CRE Master Aの処方は、以下の表7に示すように選択した。
Figure 2017538418
Figure 2017538418
Master Solution B：80mM MgCl2溶液。2μLのMaster B試薬混合物を4mMの最終濃度について各40μLのPCR反応に用いる。
試料：15μLの抽出した試料
PCRサイクリングプロフィールを図3に示し、以下の表8に記載する。
Figure 2017538418
 実施例1
本実施例は、増幅プライマー番号：21および22を用い、各々、図1（a）および図1（b）のTaqMan MGB（配列番号：26）またはPleiades（配列番号：27）プローブを検出する、103〜106コピーからの10倍力価を用いたOxa48/Oxa181遺伝子ターゲットの特異的増幅および検出を説明する。
アッセイは、前記したプライマー番号：23および24ならびにプローブ配列番号：25を利用して2000コピーの内部対照（IC）を用いて、2回、単数回（singleplex）および複数回行い、各々、プローブ番号：26および27を用いて増幅したOxa48/Oxa181遺伝子ターゲットを検出する。結果を図1（c）に示す。
実施例2
本実施例は、TaqMan MGBプローブを用いた103〜106コピーの10倍力価を用いたKPC遺伝子ターゲットの特異的増幅および検出を説明する。
アッセイは、実施例1に記載したように2000コピーの内部対照（IC）を用いて2回、単数回（singleplex）および複数回行った。KPC遺伝子ターゲットは、NTC、IMP、VIM、OXAおよびNDM遺伝子ターゲット存在下、配列番号：2および3を有するプライマーを用いて増幅し、増幅したKPCターゲットは配列番号：1を有するプローブを用いて特異的に検出した。結果を図2に示す。
実施例3
本実施例は、NTC、KPC、VIM、OXAおよびNDM遺伝子ターゲットの存在下、TaqMan MGBプローブを用いて103〜106コピーの10倍力価を用いたIMP遺伝子ターゲットの特異的増幅および検出を示す。
アッセイは、前記したように2000コピーの内部対照（IC）を用いて2回、単数回（singleplex）および複数回行った。IMP遺伝子ターゲットは、配列番号：8〜12を有するプライマーを用いて増幅し、増幅したIMPターゲットは配列番号：4〜7を有するプローブで検出した。結果を図3に示す。図3に示すように、検出色素の間に色素の流出は見られない。
実施例4
本実施例は、NTC、KPC、IMP、OXAおよびNDM遺伝子ターゲットの存在下、TaqMan MGBプローブを用いた103〜106コピーの10倍力価を用いたVIM遺伝子ターゲットの特異的増幅および検出を示す。アッセイは、前記したように2回、単数回（singleplex）および複数回行った。VIM遺伝子ターゲットは、配列番号：14〜16を有するプライマーを用いて増幅し、増幅したVIMターゲットは配列番号：13を有するプローブで検出した。結果を図4に示す。
実施例5
本実施例は、NTC、KPC、VIM、OXAおよびVIM遺伝子ターゲットの存在下、TaqMan MGBプローブを用いた103〜106コピーの10倍力価を用いたNDM1遺伝子ターゲットの特異的増幅および検出を示す。アッセイは、前記したように2回、単数回（singleplex）および複数回行った。NDM1遺伝子ターゲットは、配列番号：18および19を有するプライマーを用いて増幅し、増幅したNDM1遺伝子ターゲットは配列番号：17を有するプローブで検出した。結果を図5に示す。
実施例6
本実施例は、4の異なる色素で標識したKPC、IMP、VIM、NDM、OXAおよびICターゲットの多重検出を示す。
個々のターゲットは、反応当たり106コピーおよび2000コピーの内部対照で存在した。KPC、ICおよびOXAの増幅ターゲットは、各々、FAM、AP525およびQuazer705で標識したプローブを用いて検出した。増幅したIMP、VIMおよびNDMターゲットは、AP593−標識プローブで検出した。多重リアル−タイム増幅および検出の結果を図6に示す。
図6（a）〜6（d）の結果は、4の異なる波長の検出チャネルでの増幅ターゲットの検出に用いた4の異なる色素のいずれも、異なる検出蛍光チャネル間の蛍光波及（fluorescence bleed−over）を示さないことを明らかに示している。
実施例7
本実施例は、IMPプローブ（配列番号：4〜6）およびプライマー（配列番号：7〜12）を用いた7の細菌単離株（National Collection of Type Cultures [NCTC]、Public Health England）から抽出したDNAの検出のアッセイの結果を示す。各単離株の10 ngのDNAを用いた。リアル−タイム増幅および検出結果を図7（a）に、1のアッセイのアガロースゲル分析の結果を図7（b）に示す。結果は、プライマーおよびプローブがリアルタイムで細菌単離株を含む7の一般的に存在するIMPを首尾よく検出することを明らかに示している。図7（a）のリアル−タイム曲線は、掲載したCtのポジションから同定することができる。図7（b）のゲルは、7の菌株の特異的PCR増幅が同じ長さを有するアンプリコンを与えることを確認している。
実施例8
本実施例は、VIMプローブ（配列番号：13）およびプライマー（配列番号：14〜16）を用いた8の細菌単離株（National Collection of Type Cultures [NCTC]、Public Health England）から抽出したDNAの検出のアッセイの結果を示す。各単離株の10ngのDNAを用いた。リアル−タイム増幅および検出の結果を図8（a）に示し、1のアッセイのアガロースゲル分析の結果を図8（b）に示す。結果は、プライマーおよびプローブがリアルタイムで8の一般的に存在するVIMを含む細菌単離株を首尾よく検出したことを明らかに示している。図8（a）のリアル−タイム曲線は、掲載したCtのポジションから同定することができる。図8（b）のゲルは、8のVIM菌株の特異的PCR増幅が同じ長さを有するアンプリコンを与えることを確認している。
実施例9
PCR反応物は、以下の表9に掲載した条件とともにELITe InGenius（登録商標）機器（ElitechGroup Molecular Diagnostics,Bothell,WA）を用いて調合し、実行し、分析した。機器の操作は、ELITechGroup 「ELITe InGenius Instructions for Use」（INT030）に従った。すべてのモノ試薬は、プライマー、プローブ、および試薬を用いて表10に掲載する最終濃度に調製した。モノ試薬はInGenius機器のコールドブロックに保存した。試料は、InGenius機器溶出物ポジション#1に設置した。必要なチップをInGenius機器に載置した。InGenius機器のソフトウェアを用いて、実行は表9に記載したパラメータを含む保存アッセイを用いるグラフィカル・ユーザーインターフェースにモノ試薬および試料ポジションを指示することによって行った。ついで、InGenius機器をそのロボットピペッターを用いるPCR反応に設定し、アッセイが完了したら自動的に分析した。
Figure 2017538418
すべての単一試薬は、以下の表10に掲載するプライマー、プローブおよび試薬を用いて調製した。
Figure 2017538418
Figure 2017538418
リアル−タイムPCR曲線を、Pleiadesプローブ（配列番号：79〜82）について図12（a）〜（d）に、TaqManプローブ（配列番号：83）について図12（e）に示す。これは、PleiadesおよびTaqManの両方のプローブを用いてOXAターゲットを首尾良く検出できたことを示している。同様の検出は、異なる色素で標識したPleiadesプローブについても示す。

引用した参考文献
以下の書面および刊行物は、出典明示して本明細書の一部とみなす。
米国U.S.および外国特許文書
欧州特許番号1408366

PCT国際公開番号
WO 1999/37085
WO 2012023054A2
WO 2013/078565

米国特許出願公開番号
2005−0118623
2007−0048758
2012−0244535
2009−0163382
2009−031780
2011−0190170
2012−0129180
2012−0244535
2012−0245219

米国特許番号
3,128,179
3,194,805
3,996,345
4,351,760
4,415,732
4,458,066
4,683,195
4,739,044
4,757,141
4,965,188
4,997,928
5,187,288
5,188,934
5,227,487
5,231,191
5,248,782
5,304,645
5,433,896
5,442,045
5,508,178
5,512,677
5,538,848
5,419,966
5,556,959
5,583,236
5,585,481
5,696,251
5,736,626
5,801,155
5,808,044
5,852,191
5,925,517
5,942,610
5,986,086
5,994,056
6,020,481
6,162,931
6,127,121
6,180,295
6,221,604
6,312,894
6,653,473
6,683,173
6,727,356
6,790,945
6,905,848
6,949,367
6,972,339
7,045,610
7,205,105
7,319,022
7,381,818
7,582,739
7,662,942
7,671,218
7,759,126
7,767,834
7,790,385
7,968,292
8,163,910
8,410,255
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Claims (36)

  1. 試料中の1またはそれを超えるNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子を検出する方法であって：
    （a）NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の少なくとも1を含むことが疑われる試料と、配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、および76から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む少なくとも1のプライマーとを接触させて混合物を生成し;
    （b）NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（a）の混合物をインキュベートし、それによって増幅した核酸を生成し；ついで
    （c）増幅した核酸を検出する
    ことを含む方法。
  2. 増幅した核酸がNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の少なくとも1の少なくとも一部分を含む、請求項1記載の方法。
  3. 増幅した核酸がNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の1を超えるものの少なくとも一部分を含む、請求項1記載の方法。
  4. 増幅したNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を検出する工程が配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む蛍光発生プローブを用いることを含み、ここにRaが発光波長400〜900nmを有するフルオロフォアであり、Rbが非−蛍光クエンチャーであり、ここにRaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する、請求項1記載の方法。
  5. 蛍光発生プローブがさらに副溝バインダーを含む、請求項4記載の方法。
  6. 副溝バインダーが蛍光発生プローブの3’末端に結合する、請求項5記載の方法。
  7. 副溝バインダーが蛍光発生プローブの5’末端に結合する、請求項5記載の方法。
  8. 蛍光発生プローブが配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83から選択される1を超える配列に対して実質的同一性を有する配列を含む、請求項4記載の方法。
  9. プライマーがNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸の一部分を超える部分に対して相補的である配列を含む、請求項1記載の方法。
  10. さらに、配列番号：33の配列を有する対照核酸を増幅する工程を含む、請求項1記載の方法。
  11. 対照核酸を増幅する工程が、配列番号：25に対して実質的同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここにRaが約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbが非−蛍光クエンチャーであり、およびRaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する、請求項10記載の方法。
  12. 対照核酸を増幅する工程が、配列番号：23または24である配列に対して実質的同一性を有する1またはそれを超えるプライマーを用いることを含む、請求項10記載の方法。
  13. pが1である請求項1記載の方法。
  14. 試料中の1またはそれを超えるNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子を検出する方法であって：
    （a）NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の少なくとも1を含むことが疑われる試料と、式：
    5'−[X]p−Y−3' （I）
    ［式中、XはNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子に対して相補的でないプライマーの5'部分であり、YはNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の少なくとも一部分に実質的に相補的であるプライマーの3'部分であり、pは0または1である］を有する少なくとも1のプライマーとを接触させて混合物を生成し;
    （b）NDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を増幅するのに十分な条件下で、工程（a）の混合物をインキュベートし、それによって増幅した核酸を生成し；ついで
    （c）配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む蛍光発生プローブを用いて増幅した核酸を検出し、ここにRaは約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbは非−蛍光クエンチャーであり、およびRaおよびRbの置換はプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する、
    ことを含む、方法。
  15. 増幅した核酸がNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の少なくとも1の少なくとも一部分を含む、請求項14記載の方法。
  16. 増幅した核酸がNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子の1を超えるものの少なくとも一部分を含む、請求項14記載の方法。
  17. プライマーが、配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、および76から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む、請求項14記載の方法。
  18. プライマーが、配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、および76から選択される1を超える配列に対して実質的同一性を有する配列を含む、請求項14記載の方法。
  19. 蛍光発生プローブが、さらに副溝バインダーを含む、請求項14記載の方法。
  20. 蛍光発生プローブが、配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83から選択される1を超える配列に対して実質的同一性を有する配列を含む、請求項14記載の方法。
  21. 式中、Xが[A−B]mであり、Yが[A−B]nであり、ここにAが糖−リン酸主鎖、修飾糖−リン酸主鎖、ロックド核酸主鎖、またはいずれかの組合せのそれらの変異型を表し、Bが核酸塩基または修飾塩基を表し、mおよびnが約4〜約30の整数である、請求項14記載の方法。
  22. さらに、配列番号：33の配列を有する対照核酸を増幅する工程を含む、請求項14記載の方法。
  23. 対照核酸を増幅する工程が、配列番号：25に対して実質的同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含み、ここにRaが約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbが非−蛍光クエンチャーであり、ここにRaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する、請求項22記載の方法。
  24. 対照核酸を増幅する工程が、配列番号：23または24である配列に対して実質的同一性を有する1またはそれを超えるプライマーを用いることを含む、請求項22記載の方法。
  25. pが1である請求項14記載の方法。
  26. 試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA核酸を同時に検出する方法であって：
    （a）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を含むことが疑われる試料と：
    （i）以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のフォワード・フラッププライマー：
    aataaatcataaGCAGACTGGGCAGTCGG（配列番号：3）、
    aataaatAGGCAACCAAACCACTACGTTATCT（配列番号：11）、
    aataaatAGGCAGCCAAACTACTAGGTTATCT（配列番号：12）、
    aataaatcaCGAATGCGCAGCACCI*GGATAGA（配列番号：16）、
    aataaatcataaCGCCATCCCTGACGATCAAAC（配列番号：19）、および
    aataaatcatTCTTGCCATTCCTTTGCTACCG（配列番号：22）、
    ［式中、小文字のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に対して相補的でない］；および
    （ii）以下の配列の少なくとも1を含む少なくとも1のリバースフラップ・プライマー：
    aataaatcatGTCATTTGCCGTGCCATAC（配列番号：2）、
    aataaatcatGGAATA*GAGTGGCTTAATTCTC（配列番号：8）、
    aataaatcatGGAATA*GGGTGGCTTAATTCTC（配列番号：9）、
    aataaatcatGGAATA*GAATGGCTTAACTCTC（配列番号：10）、
    aataaCGCATTCTCTAGAAGGACTCTCATC（配列番号：14）、
    aataaCGCACTCTCTAAAAGCGCTCTCCTC（配列番号：15）、
    aataaatcataaGTCTGGCAGCACACTTCCTA（配列番号：18）、および
    aataaatcaATGCGTGTATTAGCCTTATCGGC（配列番号：21）、
    ［式中、小文字のヌクレオチド配列はNDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸の配列に対して相補的でない］とを接触させて反応混合物を生成し;
    （b）NDM1、KPC、IMP、VIMまたはOXA核酸を増幅するのに十分な条件下で工程（a）の反応混合物をインキュベートし、それによって増幅した核酸を生成し；ついで
    （c）増幅した核酸を検出する
    ことを含む方法。
  27. 増幅した核酸を検出する工程が、以下の配列：
    Ra1−G*CAGGTTCCGGTTTTG−Rb1（配列番号：1）
    Ra2−G*GI*CACACTCCAGATAAC−Rb1（配列番号：4）
    Ra2−G*GI*CACACTCAAGATAAC−Rb1（配列番号：5）
    Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAGC−Rb1（配列番号：6）
    Ra2−G*CTGA*A*TTAA*CI*AATGAAC−Rb1（配列番号：7）
    Ra2−G*TGCGCTTCGGTCC−Rb1（配列番号：13）
    Ra2−G*ACATGCCGGGTTTC−Rb1（配列番号：17）
    Ra3−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb1（配列番号：20）
    Ra5−G*GTGGCATCGATTATC−Rb2（配列番号：26）
    Ra6−G*TGTTTTTGGTGGCATCG−Rb3（配列番号：27）
    ［式中、Ra1、Ra2、Ra3、Ra5、およびRa6は400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rb1、Rb2、およびRb3は非−蛍光クエンチャーであり、およびRaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する］
    の少なくとも1を含む蛍光発生プローブを用いることを含む、請求項26記載の方法。
  28. さらに、配列番号：33の配列を有する対照核酸を増幅する工程を含む、請求項26記載の方法。
  29. 対照核酸を増幅する工程が配列番号：25［式中、Raは400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbは非−蛍光クエンチャーであり、およびRaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する］に対して実質的同一性を有する蛍光発生プローブを用いることを含む、請求項28記載の方法。.
  30. 対照核酸を増幅する工程が配列番号：23または24である配列に対して実質的同一性を有する1またはそれを超えるプライマーを用いることを含む、請求項28記載の方法。
  31. 配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、および76から選択される配列に対して実質的同一性を有する配列を有する1またはそれを超えるプライマーを含む、試料中のNDM1、KPC、IMP、VIMおよびOXA耐性−コード遺伝子を検出するキット。
  32. さらに、配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83［式中、Raは約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbは非−蛍光クエンチャーであり、RaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する］から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む1またはそれを超える蛍光発生プローブを含む、請求項31記載のキット。
  33. さらに、配列番号：23、24、または25、またはそれらの組合せである配列に対して実質的同一性を有する配列を有する対照核酸を増幅するための1またはそれを超えるプライマーまたはプローブを含む、請求項31記載のキット。
  34. 配列番号：1、4、5、6、7、13、17、20、26、27、37、38、41、42、43、48、49、54、55、60、61、64、65、68、71、74、77、78、79、80、81、82、および83［式中、Raは約400〜900nmの発光波長を有するフルオロフォアであり、Rbは非−蛍光クエンチャーであり、RaおよびRbの置換がプローブがハイブリダイズしない場合に蛍光のクエンチングを許容する］から選択される少なくとも1の配列に対して実質的同一性を有する配列を含む1またはそれを超える蛍光発生プローブを含む、試料中のCTX−M核酸を検出するキット。
  35. さらに、配列番号：2、3、8、9、10、11、12、14、15、16、18、19、21、22、34、35、36、39、40、44、45、46、47、50、51、52、53、56、57、58、59、62、63、66、67、69、70、72、73、75、および76から選択される配列に対して実質的同一性を有する配列を含む1またはそれを超えるプライマーを含む、請求項34記載のキット。
  36. さらに、配列番号：23、24、または25である配列に対して実質的同一性を有する配列またはそれらの組合せを有する対象核酸を増幅するための1またはそれを超えるプライマーまたはプローブを含む、請求項34記載のキット。
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