JP6944873B2 - 細菌性膣症を診断するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
Cartwrightら、上記は、BVの診断用Atopobium vaginae、BVAB−2およびMegasphaera−1を検出するためにマルチプレックスアッセイを使用した。彼らは、323人の女性の集団(93%アフリカ系アメリカ人、7%非ヒスパニック系白人)におけるNugentおよびAmselの結果の組合せに対するこのアッセイの性能を測定した。彼らは、この試験が、NugentスコアおよびAmselスコアの組合せと比較したとき、96.9%の感度および92.6%の特異性であったことを報告した。彼らは、Nugentスコア単独に対するこのアッセイの結果を報告しなかった。
(i)前記試料を、
(A)配列番号1内の標的配列に特異的にハイブリダイズするEggerthella特異的プライマー、および
(B)配列番号2内の標的配列に特異的にハイブリダイズするPrevotella特異的プライマー
と接触させるステップであって、
Eggerthella標的16S rRNAまたはPrevotella標的16S rRNAが存在する場合、該Eggerthella標的16S rRNAまたはPrevotella標的16S rRNA内のそのそれぞれの16S rRNA標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(ii)それぞれのハイブリダイズしたプライマーの3’末端が伸長され、それによって該EggerthellaまたはPrevotella標的16S rRNAの領域に相補的な配列を有する一本鎖cDNAを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の5’に位置する、ステップと、
(iii)ステップ(ii)からの任意のEggerthella cDNAまたはPrevotella cDNAを
(A)該Eggerthella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Eggerthella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(B)該Prevotella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Prevotella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、
(C)該Eggerthella cDNA内の、第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のEggerthella cDNA標的配列は、該第1のEggerthella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
(D)該Prevotella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のPrevotella cDNA標的配列は、該第1のPrevotella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Eggerthella cDNAが存在する場合、該第1および第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドは、Eggerthellaの線状の二重鎖切断構造を形成するように該Eggerthella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Prevotella cDNAが存在する場合、該第1および第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドは、Prevotellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Prevotella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(iv)該試料を
該Eggerthellaの切断構造が存在する場合、該Eggerthellaの切断構造の切断が起きて、該第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むEggerthellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
該Prevotellaの切断構造が存在する場合、該Prevotellaの切断構造の切断が起きて、該第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むPrevotellaの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ(iii)からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
(v)該Eggerthellaの切断生成物およびPrevotellaの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む。
前記Eggerthella特異的プライマーが、配列番号6に示した配列を含む;
前記Prevotella特異的プライマーが、配列番号9に示した配列を含む;
前記第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの前記3’部分が、配列番号4の残基11〜27に示した配列を含む;
前記第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの前記3’部分が、配列番号7の残基11〜25に示した配列を含む;
前記第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号5の残基1〜20に示した配列を含む;および/または
前記第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号8の残基1〜24に示した配列を含む。
(i)前記試料を、
(A)配列番号1内の標的配列に特異的にハイブリダイズするEggerthella特異的プライマー、
(B)配列番号2内の標的配列に特異的にハイブリダイズするPrevotella特異的プライマー、および
(C)配列番号3内の標的配列に特異的にハイブリダイズするLactobacillus特異的プライマー
と接触させるステップであって、Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNAが存在する場合、該Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNA内のそのそれぞれの16S rRNA標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(ii)それぞれのハイブリダイズしたプライマーの3’末端が伸長され、それによって該Eggerthella、Prevotella、またはLactobacillus標的16S rRNAの領域に相補的な配列を有する一本鎖cDNAを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の5’に位置する、ステップと、
(iii)ステップ(ii)からの任意のEggerthella cDNA、Prevotella cDNA、またはLactobacillus cDNAを
(A)該Eggerthella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Eggerthella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(B)該Prevotella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Prevotella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、
(C)該Lactobacillus cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Lactobacillus cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有するLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド、
(D)該Eggerthella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のEggerthella cDNA標的配列は、該第1のEggerthella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(E)該Prevotella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のPrevotella cDNA標的配列は、該第1のPrevotella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
(F)該Lactobacillus cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のLactobacillus cDNA標的配列は、該第1のLactobacillus cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Eggerthella cDNAが存在する場合、該第1および第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドは、Eggerthellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Eggerthella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、
該Prevotella cDNAが存在する場合、該第1および第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドは、Prevotellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Prevotella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Lactobacillus cDNAが存在する場合、該第1および第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドは、Lactobacillusの線状二重鎖切断構造を形成するように該Lactobacillus cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(iv)該試料を、
前記Eggerthellaの切断構造が存在する場合、該Eggerthellaの切断構造の切断が起きて、該第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むEggerthellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Prevotellaの切断構造が存在する場合、該Prevotellaの切断構造の切断が起きて、該第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むPrevotellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Lactobacillusの切断構造が存在する場合、該Lactobacillusの切断構造の切断が起きて、該第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むLactobacillusの切断生成物を生成する
反応条件下で、ステップ(iii)からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
(v)該Eggerthellaの切断生成物、Prevotellaの切断生成物、またはLactobacillusの切断生成物の存在または非存在を検出するステップ。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される:
(項目1)
被験体における細菌性膣症(BV)を診断するための方法であって、
(a)BVを有すると疑われる被験体から試料を得るステップと、
(b)該試料中のEggerthella属およびPrevotella属のそれぞれにおける選ばれた細菌種を検出するためのアッセイを実施するステップと
を含み、
該アッセイは、配列番号1に示した配列と少なくとも98%同一である核酸塩基配列を有する16S rRNA遺伝子の存在によって特徴付けられるEggerthella種を検出するが、他のEggerthella種を検出せず、
該アッセイは、P.amnii、P.disiens、およびP.biviaを検出するが、他のPrevotella種を検出せず、
EggerthellaおよびPrevotellaのうちの少なくとも一方の検出が、該被験体におけるBVを示す、方法。
(項目2)
前記アッセイが、前記被験体において選ばれたLactobacillus種をさらに検出するが、L.inersを検出せず、
Lactobacillusが検出されない場合、EggerthellaおよびPrevotellaのうちの少なくとも一方の検出が、該被験体におけるBVを示し、Lactobacillusが検出される場合、そのときは、EggerthellaおよびPrevotellaの両方の検出が、該被験体におけるBVを示す、項目1に記載の方法。
(項目3)
EggerthellaおよびPrevotellaを検出するための前記アッセイが、核酸に基づく検出アッセイである、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記核酸に基づく検出アッセイが、EggerthellaおよびPrevotellaの16S rRNAを標的とする、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)配列番号1のヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域、および/または
(ii)配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域
を標的とする、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づかないアッセイである、項目3から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記増幅に基づかないアッセイが、切断に基づくアッセイである、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記切断に基づくアッセイが、RNA標的核酸を検出し、RNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記切断に基づくアッセイが、DNA標的核酸を検出し、DNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、項目7に記載の方法。
(項目10)
EggerthellaおよびPrevotellaの検出が、ホモジニアス検出反応を使用して実施される、項目3から9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
EggerthellaおよびPrevotellaの検出が、リアルタイムで実施される、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)前記試料を、
(A)配列番号1内の標的配列に特異的にハイブリダイズするEggerthella特異的プライマー、および
(B)配列番号2内の標的配列に特異的にハイブリダイズするPrevotella特異的プライマー
と接触させるステップであって、
Eggerthella標的16S rRNAまたはPrevotella標的16S
rRNAが存在する場合、該Eggerthella標的16S rRNAまたはPrevotella標的16S rRNA内のそのそれぞれの16S rRNA標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(ii)それぞれのハイブリダイズしたプライマーの3’末端が伸長され、それによって該EggerthellaまたはPrevotella標的16S rRNAの領域に相補的な配列を有する一本鎖cDNAを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の5’に位置する、ステップと、
(iii)ステップ(ii)からの任意のEggerthella cDNAまたはPrevotella cDNAを
(A)該Eggerthella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Eggerthella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(B)該Prevotella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Prevotella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、
(C)該Eggerthella cDNA内の、第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のEggerthella cDNA標的配列は、該第1のEggerthella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
(D)該Prevotella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のPrevotella cDNA標的配列は、該第1のPrevotella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Eggerthella cDNAが存在する場合、該第1および第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドは、Eggerthellaの線状の二重鎖切断構造を形成するように該Eggerthella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Prevotella cDNAが存在する場合、該第1および第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドは、Prevotellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Prevotella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(iv)該試料を
該Eggerthellaの切断構造が存在する場合、該Eggerthellaの切断構造の切断が起きて、該第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むEggerthellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
該Prevotellaの切断構造が存在する場合、該Prevotellaの切断構造の切断が起きて、該第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むPrevotellaの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ(iii)からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
(v)該Eggerthellaの切断生成物およびPrevotellaの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む切断に基づくアッセイである、項目4に記載の方法。
(項目13)
前記Eggerthella特異的プライマーが、配列番号6に示した配列を含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記Prevotella特異的プライマーが、配列番号9に示した配列を含む、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
前記第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの前記3’部分が、配列番号4の残基11〜27に示した配列を含む、項目12から14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの前記3’部分が、配列番号7の残基11〜25に示した配列を含む、項目12から15のいずれかに記載の方法。
(項目17)
前記第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号5の残基1〜20に示した配列を含む、項目12から16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号8の残基1〜24に示した配列を含む、項目12から17のいずれかに記載の方法。
(項目19)
前記Eggerthellaの切断生成物およびPrevotellaの切断生成物を検出するステップが、
該Eggerthellaの切断生成物を第1の蛍光標識および第1のクエンチャーを含む第1のFRETカセットと接触させ、該Prevotellaの切断生成物を第2の蛍光標識および第2のクエンチャーを含む第2のFRETカセットと接触させることであって、
それぞれのFRETカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第2のEggerthellaの切断構造またはPrevotellaの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズし、
該Eggerthellaの切断生成物が存在する場合、該第1の蛍光標識が、該第1のクエンチャーを含む該第1のFRETカセットから放出され、
該Prevotellaの切断生成物が存在する場合、該第2の蛍光標識が、該第2のクエンチャーを含む該第2のFRETカセットから放出されることと、
該放出された第1または第2の蛍光標識を検出することと
を含む、項目12から18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
前記第1のクエンチャーおよび前記第2のクエンチャーが同じである、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記Eggerthellaの切断生成物が、配列番号4の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号4の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記第1のFRETカセットが、配列番号14に示した配列を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記Prevotellaの切断生成物が、配列番号7の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号7の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、項目19から22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記第2のFRETカセットが、配列番号15に示した配列を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusを検出するためのアッセイが、核酸に基づく検出アッセイである、項目2に記載の方法。
(項目26)
前記核酸に基づく検出アッセイが、Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの16S rRNAを標的とする、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)配列番号1のヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域、
(ii)配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域、および/または
(iii)配列番号3のヌクレオチド位置837〜944に対応するLactobacillus 16S rRNA領域
を標的とする、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記核酸に基づく検出アッセイが、増幅に基づかないアッセイである、項目25から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記増幅に基づかないアッセイが、切断に基づくアッセイである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記切断に基づくアッセイが、RNA標的核酸を検出し、RNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記切断に基づくアッセイが、DNA標的核酸を検出し、DNA:DNA線状二重鎖構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼを利用する、項目29に記載の方法。
(項目32)
Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの検出が、ホモジニアス検出反応を使用して実施される、項目25から31のいずれか
に記載の方法。
(項目33)
Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの検出が、リアルタイムで実施される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)前記試料を、
(A)配列番号1内の標的配列に特異的にハイブリダイズするEggerthella特異的プライマー、
(B)配列番号2内の標的配列に特異的にハイブリダイズするPrevotella特異的プライマー、および
(C)配列番号3内の標的配列に特異的にハイブリダイズするLactobacillus特異的プライマー
と接触させるステップであって、Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNAが存在する場合、該Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNA内のそのそれぞれの16S rRNA標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(ii)それぞれのハイブリダイズしたプライマーの3’末端が伸長され、それによって該Eggerthella、Prevotella、またはLactobacillus標的16S rRNAの領域に相補的な配列を有する一本鎖cDNAを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の5’に位置する、ステップと、
(iii)ステップ(ii)からの任意のEggerthella cDNA、Prevotella cDNA、またはLactobacillus cDNAを
(A)該Eggerthella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Eggerthella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(B)該Prevotella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Prevotella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、
(C)該Lactobacillus cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Lactobacillus cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド、
(D)該Eggerthella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のEggerthella cDNA標的配列は、該第1のEggerthella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(E)該Prevotella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のPrevotella cDNA標的配列は、該第1のPrevotella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
(F)該Lactobacillus cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のLactobacillus cDNA標的配列は、該第1のLactobacillus cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Eggerthella cDNAが存在する場合、該第1および第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドは、Eggerthellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Eggerthella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、
該Prevotella cDNAが存在する場合、該第1および第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドは、Prevotellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Prevotella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Lactobacillus cDNAが存在する場合、該第1および第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドは、Lactobacillusの線状二重鎖切断構造を形成するように該Lactobacillus cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(iv)該試料を、
前記Eggerthellaの切断構造が存在する場合、該Eggerthellaの切断構造の切断が起きて、該第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むEggerthellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Prevotellaの切断構造が存在する場合、該Prevotellaの切断構造の切断が起きて、該第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むPrevotellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Lactobacillusの切断構造が存在する場合、該Lactobacillusの切断構造の切断が起きて、該第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むLactobacillusの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ(iii)からの任意の切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
(v)該Eggerthellaの切断生成物、Prevotellaの切断生成物、およびLactobacillusの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む切断に基づくアッセイである、項目2に記載の方法。
(項目35)
前記Eggerthella特異的プライマーが、配列番号6に示した配列を含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記Prevotella特異的プライマーが、配列番号9に示した配列を含む、項目34または35に記載の方法。
(項目37)
前記Lactobacillus特異的プライマーが、配列番号13に示した配列を含む、項目34から36のいずれかに記載の方法。
(項目38)
前記第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの3’部分が、配列番号4の残基11〜27に示した配列を含む、項目34から37のいずれかに記載の方法。
(項目39)
前記第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの3’部分が、配列番号7の残基11〜25に示した配列を含む、項目34から38のいずれかに記載の方法。
(項目40)
前記第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの3’部分が、配列番号10の残基11〜27に示した配列を含む、項目34から39のいずれかに記載の方法。
(項目41)
前記第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号5の残基1〜20に示した配列を含む、項目34から40のいずれかに記載の方法。
(項目42)
前記第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、配列番号8の残基1〜24に示した配列を含む、項目34から41のいずれかに記載の方法。
(項目43)
前記第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの前記5’部分が、(1)配列番号11の残基1〜27に示した配列および(2)配列番号12の残基1〜32に示した配列からなる群から選択される配列を含む、項目34から42のいずれかに記載の方法。
(項目44)
前記Eggerthellaの切断生成物、Prevotellaの切断生成物、およびLactobacillusの切断生成物を検出するステップが、
該Eggerthellaの切断生成物を第1の蛍光標識および第1のクエンチャーを含む第1のFRETカセットと接触させること、該Prevotellaの切断生成物を第2の蛍光標識および第2のクエンチャーを含む第2のFRETカセットと接触させること、および該Lactobacillusの切断生成物を第3の蛍光標識および第3のクエンチャーを含む第3の(thirs)FRETカセットと接触させることであって、
それぞれのFRETカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第2のEggerthellaの切断構造、Prevotellaの切断構造、またはLactobacillusの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズし、
該Eggerthellaの切断生成物が存在する場合、該第1の蛍光標識が、該第1のクエンチャーを含む該第1のFRETカセットから放出され、
該Prevotellaの切断生成物が存在する場合、該第2の蛍光標識が、該第2のクエンチャーを含む該第2のFRETカセットから放出され、
前記Lactobacillusの切断生成物が存在する場合、前記第3の蛍光標識が、該第3のクエンチャーを含む該第3のFRETカセットから放出されることと、
該放出された第1、第2、または第3の蛍光標識を検出することと
を含む、項目34から43のいずれかに記載の方法。
(項目45)
前記第1、第2、および第3のクエンチャーが同じである、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記Eggerthellaの切断生成物が、配列番号4の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号4の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、項目44または45に記載の方法。
(項目47)
前記第1のFRETカセットが、配列番号14に示した配列を含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記Prevotellaの切断生成物が、配列番号7の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号7の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、項目44から47のいずれかに記載の方法。
(項目49)
前記第2のFRETカセットが、配列番号15に示した配列を含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記Lactobacillusの切断生成物が、配列番号10の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号10の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、項目44から49のいずれかに記載の方法。
(項目51)
前記第3のFRETカセットが、配列番号16に示した配列を含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
BVに関連した10種以下の細菌属の検出を含む、項目1から51のいずれかに記載の方法。
(項目53)
BVに関連した5種以下の細菌属の検出を含む、項目1から51のいずれかに記載の方法。
(項目54)
Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillus以外のBVに関連した細菌属の検出を含まない、項目1から51のいずれかに記載の方法。
(項目55)
BVが前記被験体において示される場合、該被験体にBVの処置レジメンを施すステップをさらに含む、項目1から54のいずれかに記載の方法。
(項目56)
前記被験体におけるBVを監視するための方法であり、該被験体が、ステップ(a)の前にBVの処置レジメンを受けている、項目1から54のいずれかに記載の方法。
(項目57)
BVが前記被験体において示される場合、(i)該被験体にBVの前記処置レジメンを施すステップ、または(ii)該被験体にBVの異なる処置レジメンを施すステップのいずれかをさらに含む、項目56に記載の方法。
(項目58)
EggerthellaおよびPrevotellaの検出が、前記標的のそれぞれについて、検出シグナルを該標的の所定の検出閾値と比較することを含む、項目1および3から24のいずれかに記載の方法。
(項目59)
Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの検出が、前記標的のそれぞれについて、検出シグナルを該標的の所定の検出閾値と比較することを含む、項目2および25から51のいずれかに記載の方法。
(項目60)
Eggerthellaの標的核酸およびPrevotellaの標的核酸を検出するための反応混合物であって、
配列番号1に示した配列と少なくとも98%同一である核酸塩基配列を有する16S rRNA遺伝子の存在によって特徴付けられるEggerthella種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のEggerthella種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしないEggerthella特異的オリゴヌクレオチド、および
P.amnii、P.disiens、およびP.biviaの標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、他のPrevotella種由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Prevotella特異的なオリゴヌクレオチド
を含む反応混合物。
(項目61)
Lactobacillus種の標的核酸内の標的配列に特異的にハイブリダイズするが、L.iners由来の核酸内の配列に特異的にハイブリダイズしない、Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドをさらに含む、項目60に記載の反応混合物。
(項目62)
前記Eggerthellaの標的核酸およびPrevotellaの標的核酸が、それぞれEggerthellaおよびPrevotellaの16S rRNAである、項目60に記載の反応混合物。
(項目63)
(i)前記Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域内の配列を標的とし、かつ/または
(ii)前記Prevotella特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域内の配列を標的とする、
項目62に記載の反応混合物。
(項目64)
前記Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号6に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号4の残基11〜27に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号5の残基1〜20に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、項目63に記載の反応混合物。
(項目65)
前記Prevotella特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号9に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号7の残基11〜25に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号8の残基1〜24に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、項目63または64に記載の反応混合物。
(項目65)
前記Eggerthellaの標的核酸内の2つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、および/または前記Prevotellaの標的核酸内の2つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む、項目60から65のいずれかに記載の反応混合物。
(項目66)
前記Eggerthellaの標的核酸、Prevotellaの標的核酸、およびLactobacillusの標的核酸が、それぞれEggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの16S rRNAである、項目61に記載の反応混合物。
(項目67)
(i)前記Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域内の配列を標的とし、
(ii)前記Prevotella特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域内の配列を標的とし、かつ/または
(iii)前記Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号3のヌクレオチド位置837〜944に対応するLactobacillus 16S rRNA領域内の配列を標的とする、
項目66に記載の反応混合物。
(項目68)
前記Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号6に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号4の残基11〜27に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号5の残基1〜20に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、項目67に記載の反応混合物。
(項目69)
前記Prevotella特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号9に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号7の残基11〜25に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号8の残基1〜24に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群から選択される、項目67または68に記載の反応混合物。
(項目70)
前記Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドが、
配列番号13に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号10の残基11〜27に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号11の残基1〜27に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、および
配列番号12の残基1〜32に示した配列に実質的に対応する標的にハイブリダイズする配列を含むオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択される、項目67から69のいずれかに記載の反応混合物。
(項目71)
前記Eggerthellaの標的核酸内の2つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、前記Prevotellaの標的核酸内の2つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、および/または前記Lactobacillusの標的核酸内の2つの異なる標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む、項目60および66から70のいずれかに記載の反応混合物。
別段に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、記載した方法および組成物に関係する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、別段に指定されていない限り、それらに帰される意味を有する。
本発明は、被験体における細菌性膣症(BV)を診断するための方法および組成物を提供する。これらの方法は、Eggerthella属およびPrevotella属に属する、特異性の高い、低い存在量の嫌気性細菌を活用するものである。これらの方法は一般に、BVを有することが疑われる被験体由来の試料中に、これらの属のそれぞれのうちの選択された細菌種の有無を検出するステップを含む。特に、アッセイを実施して、Eggerthellaの未培養種の、試料中の特異的検出を行うが、他のEggerthella種は検出せず、Eggerthellaの未培養種は、配列番号1に示す配列と少なくとも98%同一である核酸塩基配列を有する16S rRNAの遺伝子の存在により特徴付けられ;アッセイを実施して、P.amnii、P.disiensおよびP biviaの、試料中の特異的検出を行うが、他のPrevotella種は検出しない。これらの種特異的アッセイを利用すると、試料中にEggerthellaおよびPrevotellaのうちの少なくとも一方の検出は、一般に、いくつかの現存する検査よりも高い感度および特異性で、被験体におけるBVを示す。
この実施例は、選ばれたEggerthella、PrevotellaおよびLactobacillusの種の検出を組み合わせて、(Nugentスコアと比較して)95.6%の感度、97.3%の特異性がある検査を生み出した研究について記載する。
試料の収集および参加者の人口統計学
本明細書で解析する試料は、より大きな収集研究の一部として収集した試料のサブセットからなった。この実施例に記載する研究のために、試料を利用可能な収集場所のそれぞれから入手し、200個のサブセットを選んだ。200個の試料は、Cartwrightら(Journal of Clinical Microbiology 51巻:3694〜3699頁、2013年)において使用された判定基準に従って、BVについて陽性である99個の試料および陰性である101個の試料からなった。
特異的な細菌のリボソームRNAを、Panther(登録商標)系上で、Invader(登録商標)化学反応を使用して、cDNAに変換してから検出した。Invader(登録商標)反応は、Hologicが製造し、他の箇所で記載されているCleavase(登録商標)酵素による特異的な核酸構造の切断に依拠する。例えば、Hallら Proc. Natl. Acad. Sci. 97巻:8272〜8277頁、1999年;Kaiserら、J. Biol. Chem. 274巻:21387〜21394頁、1999年を参照されたい。手短に述べると、Cleavase(登録商標)酵素は、5’オーバーハングを切断するFENエンドヌクレアーゼに由来する。Invader検出化学反応では、2つの反応が生じる。一次反応において、プローブが切断されて、フラップと呼ばれる5’断片を放出し、二次反応において、切断されたフラップが、FRET分子にハイブリダイズして、オーバーハングを生じ、このオーバーハングが、結合しているフルオロフォアを含有するFRET用オリゴの5’末端の切断を可能にする。FRET用オリゴはまた、未切断のFRETからの蛍光の放出を抑制するクエンチャーも含有する。一次反応および二次反応は、BVアッセイのためにPanther(登録商標)装置上で実施する場合、異なる温度で連続的に生じる。さらに、蛍光は、二次反応が生じる間にのみ収集される。正味の結果は蛍光の蓄積であり、蛍光の蓄積は、Cleavase(登録商標)酵素の反応速度(reaction kinetics)に直接関係する。このことにより、標的のレベルを、標準的な酵素の動態、または初期速度として一般に公知である動態を使用して推定することが可能になる。
オリゴミックスは、緩衝液(SD PN:TN7294−108)中、0.5μMのプローブのオリゴ、0.25μMのInvaderオリゴ、0.2μMのRT−プライマー、0.25μMのFRETからなった。酵素ミックスは、緩衝液(SD PN: TN7294−109)中、Cleavase X、700UおよびMMLV、1500U、MgCl、18mMからなった。濃度は全て、最終の反応濃度で示した。標的捕捉用の試薬は、APTIMA(登録商標)緩衝液中、265mg/mLの磁性ビーズおよび0.4μMの捕捉用のオリゴ(ゆらぎプローブ(wobble probe);5’−K18T3A30−3’;例えば、WO2008/016988(A9)を参照されたい)からなった。
細菌性膣症を決定するために、それぞれの属内の最も関連する種のみを標的とするように、オリゴをデザインした。Lactobacillus属中の種を標的とするオリゴは、L.iners種を検出しなかった。同様に、EggerthellaおよびPrevotellaを標的とするオリゴも、同様に、これらの属の選択されたメンバーのみを標的とするようにデザインした。図4、図5および図6の系統樹は、それぞれの属内の標的とした種、および近縁種に対する関係を示す。
Panther装置により、処理中、43℃のステップの間に、4色についての蛍光の読取りをおおよそ24秒の間隔で収集した。発生したシグナルは、以前に得た較正値を使用して、ブリードスルー、検出器ゲインおよび検出器のオフセットの効果について補正した。較正値は、制御した量の蛍光色素およびブランクを使用して得た。色素の較正を必要としない代替の補正も探索し、これらが等しく有効であることを見出した。次いで、反応の初期速度を、曲線の初期の線状部分から計算した。便宜上、この速度(rate)を、1,000,000で乗算した。この値を、速度(Velocity)(V)と呼んでいる。
それぞれの標的についての閾値を、研究集団全体を使用して決定した。3つの標的のそれぞれについて、速度において、おおよそ0.5ログの範囲(a range of roughly 0.5 logs)が、最もNugent陽性の試料と最もNugent陰性の試料との間で観察された分離であった。この研究のために、以下の閾値を使用した。Prevotellaについては、閾値をVの対数値2.67に設定し(図8を参照されたい);Eggerthellaについては、閾値をVの対数値2.58に設定し(図9を参照されたい);Lactobacillusについては、閾値をVの対数値3.44に設定した(図10を参照されたい)。
女性におけるBVの状況を決定する、受け入れられている2つの方法は、NugentスコアおよびAmsel基準である。しばしば、それぞれをそれだけで使用して、細菌性膣症に対して女性を処置すべきであるか否かを決定しており、このことは、これらが同じ状態を検出する2つの異なる方法であることを示唆する。Amsel基準の結果とNugentスコアの決定結果との比較から、他方に対するそれぞれの検査の性能が比較的不良であることが示された。表2を参照されたい。これらの結果は、以前の観察結果に類似した。Schwebkeら、Obstetrics & Gynecology 88巻:573〜576頁、1996年;Mastrobattistaら、Obstetrics & Gynecology 96巻:504〜506頁、2000年を参照されたい。検査室の目的では、Nugentスコアは、至適基準であるとみなされている。残念なことに、有意なパーセンテージの女性が、診断を困難にする中間の範囲に入るNugentスコアを有する。この実施例の研究群において、全被験体のうちの16%が、中間の範囲のNugentスコアを有した。
Eggerthellaについての結果から、Eggerthella単独を利用する検査は、Nugentスコアと比較する場合、この現在市販されている、FDAが承認している唯一の検査に有意に優っていることが示される。さらに、Eggerthellaのアッセイは、BVの診断のために通常標的とされる細菌の間で、特異的であり、適度に高感度であることが見出され、その一方Nugent陽性試料とNugent陰性試料との間で非常に明らかな分離も維持する(図9を参照されたい)。対照的に、高い存在量の標的、例として、Gardnerella vaginalisは、Nugent陽性試料とNugent陰性試料との間でアッセイの連続した読取り(Vの対数)を示す傾向があった(図11を参照されたい)。Megasphaeraの1型等の標的の場合、高い特異性は可能であるが、感度が大きく失われてしまう(図12を参照されたい)。
Claims (14)
- Lactobacillus、EggerthellaおよびPrevotellaの存在を、被験体における細菌性膣症(BV)の指標とする核酸に基づく検出方法であって、Lactobacillus、EggerthellaおよびPrevotellaの存在は、
BVを有すると疑われる被験体からの試料中のLactobacillus属、Eggerthella属およびPrevotella属のそれぞれにおける選ばれた細菌種を検出するためのアッセイを実施することによって決定され、
該アッセイは、核酸に基づく検出アッセイであって、以下:
(i)該試料を、
(a)配列番号6に示した配列を含むEggerthella特異的プライマー;配列番号4の残基11〜27に示した配列を含む第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの3’部分;および配列番号5の残基1〜20に示した配列を含む第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの5’部分;
(b)配列番号9に示した配列を含むPrevotella特異的プライマー;配列番号7の残基11〜25に示した配列を含む第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの3’部分;および配列番号8の残基1〜24に示した配列を含む第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの5’部分;
(c)配列番号13に示した配列を含むLactobacillus特異的プライマー;配列番号10の残基11〜27に示した配列を含む第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの3’部分;および、(1)配列番号11の残基1〜27に示した配列および(2)配列番号12の残基1〜32に示した配列からなる群より選択される配列を含む第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの5’部分
と接触させるステップと;
(ii)Eggerthella切断生成物、Prevotella切断生成物、およびLactobacillus切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む、方法。 - 前記核酸に基づくアッセイが、切断に基づくアッセイである、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸に基づく検出アッセイが、Eggerthella、Prevotella、およびLactobacillusの16S rRNAを標的とする、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)配列番号1のヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域、
(ii)配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域、および
(iii)配列番号3のヌクレオチド位置837〜944に対応するLactobacillus 16S rRNA領域
を標的とする、請求項3に記載の方法。 - 前記核酸に基づく検出アッセイが、
(i)前記試料を、
(A)配列番号1内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、前記Eggerthella特異的プライマー、
(B)配列番号2内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、前記Prevotella特異的プライマー、および
(C)配列番号3内の標的配列に特異的にハイブリダイズする、前記Lactobacillus特異的プライマー
と接触させるステップであって、Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNAが存在する場合、該Eggerthella標的16S rRNA、Prevotella標的16S rRNA、またはLactobacillus標的16S rRNA内のそのそれぞれの16S rRNA標的配列にそれぞれのプライマーが特異的にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(ii)それぞれのハイブリダイズしたプライマーの3’末端が伸長され、それによって該Eggerthella、Prevotella、またはLactobacillus標的16S rRNAの領域に相補的な配列を有する一本鎖cDNAを生成する反応条件を提供するステップであって、該領域は、該それぞれのプライマー標的配列の5’である核酸配列を含む、ステップと、
(iii)ステップ(ii)からの任意のEggerthella cDNA、Prevotella cDNA、またはLactobacillus cDNAを
(A)該Eggerthella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Eggerthella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する前記第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(B)該Prevotella cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Prevotella cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する前記第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、
(C)該Lactobacillus cDNA内の第1の標的配列に特異的にハイブリダイズする3’部分および該Lactobacillus cDNAに特異的にハイブリダイズしない5’部分を有する前記第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド、
(D)該Eggerthella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のEggerthella cDNA標的配列は、該第1のEggerthella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、前記第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチド、
(E)該Prevotella cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のPrevotella cDNA標的配列は、該第1のPrevotella cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、前記第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチド、ならびに
(F)該Lactobacillus cDNA内の第2の標的配列に特異的にハイブリダイズする5’部分を有する第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドであって、該第2のLactobacillus cDNA標的配列は、該第1のLactobacillus cDNA標的配列の3’に位置し、それに隣接する、前記第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチド
と接触させるステップであって、
該Eggerthella cDNAが存在する場合、該第1および第2のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドは、Eggerthellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Eggerthella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、
該Prevotella cDNAが存在する場合、該第1および第2のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドは、Prevotellaの線状二重鎖切断構造を形成するように該Prevotella cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で、および
該Lactobacillus cDNAが存在する場合、該第1および第2のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドは、Lactobacillusの線状二重鎖切断構造を形成するように該Lactobacillus cDNAに安定にハイブリダイズする反応条件下で実施される、ステップと、
(iv)該試料を、
前記Eggerthellaの切断構造が存在する場合、該Eggerthellaの切断構造の切断が起きて、該第1のEggerthellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むEggerthellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Prevotellaの切断構造が存在する場合、該Prevotellaの切断構造の切断が起きて、該第1のPrevotellaプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むPrevotellaの切断生成物を生成する反応条件下で、
前記Lactobacillusの切断構造が存在する場合、該Lactobacillusの切断構造の切断が起きて、該第1のLactobacillusプローブオリゴヌクレオチドの該5’部分を含むLactobacillusの切断生成物を生成する反応条件下で、ステップ(iii)からの前記線状二重鎖切断構造を切断することができるフラップエンドヌクレアーゼと接触させるステップと、
(v)該Eggerthellaの切断生成物、Prevotellaの切断生成物、およびLactobacillusの切断生成物の存在または非存在を検出するステップと
を含む切断に基づくアッセイである、請求項1に記載の方法。 - 前記Eggerthellaの切断生成物、Prevotellaの切断生成物、およびLactobacillusの切断生成物を検出するステップが、
該Eggerthellaの切断生成物を第1の蛍光標識および第1のクエンチャーを含む第1のFRETカセットと接触させること、該Prevotellaの切断生成物を第2の蛍光標識および第2のクエンチャーを含む第2のFRETカセットと接触させること、および該Lactobacillusの切断生成物を第3の蛍光標識および第3のクエンチャーを含む第3のFRETカセットと接触させることであって、
それぞれのFRETカセットが、前記フラップエンドヌクレアーゼによって切断され得る第2のEggerthellaの切断構造、Prevotellaの切断構造、またはLactobacillusの切断構造を形成するように該それぞれの切断生成物とハイブリダイズし、
該Eggerthellaの切断生成物が存在する場合、該第1の蛍光標識が、該第1のクエンチャーを含む該第1のFRETカセットから放出され、
該Prevotellaの切断生成物が存在する場合、該第2の蛍光標識が、該第2のクエンチャーを含む該第2のFRETカセットから放出され、
前記Lactobacillusの切断生成物が存在する場合、前記第3の蛍光標識が、該第3のクエンチャーを含む該第3のFRETカセットから放出されることと、
該放出された第1、第2、または第3の蛍光標識を検出することと
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記第1、第2、および第3のクエンチャーが同じである;ならびに/あるいは
前記Eggerthellaの切断生成物が、配列番号4の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号4の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、
請求項6に記載の方法。 - 前記第1のFRETカセットが、配列番号14に示した配列を含む、請求項6または7に記載の方法。
- 前記Prevotellaの切断生成物が、配列番号7の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号7の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のFRETカセットが、配列番号15に示した配列を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記Lactobacillusの切断生成物が、配列番号10の残基1〜11に示した配列を含み、配列番号10の残基11が、該切断生成物の3’終末端に対応する、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3のFRETカセットが、配列番号16に示した配列を含む、請求項11に記載の方法。
- Lactobacillusの標的核酸、Eggerthellaの標的核酸およびPrevotellaの標的核酸を検出するための反応混合物であって、
配列番号6に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;
配列番号4の残基11〜27に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;および
配列番号5の残基1〜20に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されるEggerthella特異的オリゴヌクレオチド、
配列番号9に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;
配列番号7の残基11〜25に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;および
配列番号8の残基1〜24に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されるPrevotella特異的オリゴヌクレオチド、
配列番号13に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;
配列番号10の残基11〜27に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;
配列番号11の残基1〜27に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド;および
配列番号12の残基1〜32に示した配列に対応する標的ハイブリッド形成配列を含むオリゴヌクレオチド
からなる群より選択されるLactobacillus特異的オリゴヌクレオチド
を含む反応混合物。 - (i)前記Eggerthella特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド位置615〜679に対応するEggerthella 16S rRNA領域内の配列を標的とし、
(ii)前記Prevotella特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号2のヌクレオチド位置954〜1037に対応するPrevotella 16S rRNA領域内の配列を標的とし;かつ/または
(iii)前記Lactobacillus特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号3のヌクレオチド位置837〜944に対応するLactobacillus 16S rRNA領域内の配列を標的とする、請求項13に記載の反応混合物。
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