CN102534014B - 一种ndm-1泛耐药基因pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明试剂盒采用实时荧光PCR技术，针对NDM-1泛耐药基因的保守区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测NDM-1泛耐药基因片段。本发明的技术方案为提供一种NDM-1泛耐药基因PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：如SEQ ID NO.1所示的上游引物；如SEQ ID NO.2所示的下游引物：如SEQ ID NO.3所示的荧光探针。本试剂盒的灵敏度与特异性强，结果判断客观准确，为检测临床样本中的NDM-1泛耐药基因的存在提供了有力的工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种含有NDM-1泛耐药基因的细菌的PCR检测试剂盒。
背景技术
2010年来国际上陆续报道在印度、巴基斯坦、英国等地发现产NDM-1(I型新德里金属细菌β-内酰胺酶)泛耐药肠杆菌科细菌，引发社会广泛关注。此类细菌能够产生可水解β-内酰胺类抗菌药物的酶，对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类药物广泛耐药。最早报道的产NDM-1细菌为肺炎克雷伯菌，于2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现，对所有β-内酰胺类抗生素耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感，深入研究发现这株细菌携带一种新型金属β-内酰胺酶，根据患者可能感染地点命名这种酶为NDM-1。据上述研究结果，研究人员在印度、巴基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-1肠杆菌科细菌占所监测细菌的1.2％-13％，主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等。这些细菌主要引起尿路、血流、伤口、肺部和导管相关感染等。在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我国香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。
根据患者感染情况及细菌本身特点，专家认为产NDM-1细菌可能主要通过密切接触感染。易感人群包括疾病危重、入住重症监护室、长期使用抗菌药物、插管、机械通气等患者。感染后患者临床表现与敏感细菌没有差别，但对一般抗菌治疗无效。
现有技术存在的问题：由于产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难。对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能。目前对产NDM-1细菌的诊断诊断主要依据实验室检查结果，检查分为三步：表型筛查-表型确认-基因确证。并要求各医院对阳性结果须加以复核，同时将菌株送有条件的参考实验室进一步检测确证。
我国卫生部门高度重视，卫生部会同总后卫生部和国家中医药管理局共同组织专家制定下发了《产NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌感染诊疗指南(试行版)》，提出产NDM-1细菌的实验室诊断包括表型筛查、表型确认和基因确证三个步骤。
(一)表型筛查：在细茵药物敏感性测定中，以美罗培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，如果达到以下标准，需要进行表型确认。厄他培南特异性较低，不推荐用于筛查试验。
1.K-B法：美罗培南(10μg纸片)或亚胺培南(10μg纸片)抑菌圈直径≤22mm。
2.MIC测定法：美罗培南MIC≥2mg/L；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC≥2mg/L。
(二)表型确认：双纸片协同试验：采用亚胺培南(10μg)、EDTA(1500μg)两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。
采用亚胺培南(美罗培南)/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值≥5mm；亚胺培南(美罗培南)/EDTA复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值≥8，即可判定产金属酶。
(三)基因确证：采用NDM-1泛耐药基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1泛耐药基因。
发明内容
本发明的目的是针对上述第三步基因确认中的采用NDM-1泛耐药基因特异引物进行PCR扩增及产物测序这一步骤，改进为采用荧光PCR的手段来取代传统的PCR及产物测序。
本发明的技术方案为提供一种NDM-1泛耐药基因PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
上游引物：5’-GCAGGTTGATCTCCTGCTTGAT-3’；
下游引物：5’-GCGTGCTGGTGGTCGATAC-3’；
荧光探针：5’-CAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGG-3’；
所述探针5’端用荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
优选的，上述试剂盒所述荧光染料选自FAM、JOE和HEX，所述淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。
优选的，上述试剂盒所述荧光探针5’端标记FAM，3’端标记TAMARA。
优选的，上述试剂盒所述上游引物的浓度为10μM，所述下游引物的浓度为10μM，所述荧光探针的浓度为10μM。
优选的，上述试剂盒所述PCR反应试剂还包括纯水、10×PCRbuffer、25mM MgCl2，20mM dUTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP。
优选的，上述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品，所述阳性质控品为导入了如SEQ ID NO.4所述序列的质粒。
本发明的有益效果为使用本发明的试剂盒与传统的诊疗相比免去了后续的测序步骤，使得检测时间从传统的2-3天，缩短到2-3个小时。本试剂盒的灵敏度与特异性强，结果判断客观准确，为检测临床样本中的NDM-1泛耐药基因的存在提供了有力的工具。
附图说明
图1为阳性质控品的扩增曲线；
图2为阴性质控品的扩增曲线。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
实施例1本试剂盒组成
主要组成成份如表1所示。
表1
采用荧光PCR水解探针法，如配单人份，在一管0.2mL的PCR反应管中中依次加入如表2所示组分。
表2
| 试剂 | 体积(μL) |
| 纯化水 | 27 |
| 10×PCR buffer | 5 |
| 25mM MgCl2 | 8 |
| dN(U)TP(10、20mM) | 1 |
| 10μM 上游引物 | 1 |
| 10μM 上游引物 | 1 |
| 10μM 荧光探针 | 1 |
| Taq酶/UNG酶系 | 1 |
| 总量 | 45 |
其中引物和探针的序列如下：
上游引物序列如SEQ ID NO.1：5’-GCAGGTTGATCTCCTGCTTGAT-3’
下游引物序列如SEQ ID NO.2：5’-GCGTGCTGGTGGTCGATAC-3’
荧光探针序列如SEQ ID NO.3：
FAM-5’-CAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGG-3’-TAMRA；
上述基因序列交由上海生工合成。
NDM-1阴性质控品为超纯水。
NDM-1阳性质控品为人工合成的序列，克隆至pUC19的质粒中。合成的一部分NDM-1泛耐药基因序列如SEQ ID NO.4所示：
TTCGACCCAGCCATTGGCGGCGAAAGTCAGGCTGTGTTGCGCCGCAACCATCCCCTCTTGCGGGGCAAGCTGGTTCGACAACGCATTGGCATAAGTCGCAATCCCCGCCGCATGCAGCGCGTCCATACCGCCCATCTTGTCCTGATGCGCGTGAGTCACCACCGCCAGCGCGACCGGCAGGTTGATCTCCTGCTTGATCCAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGGTCATCGGTCCAGGCGGT
实施例2本试剂盒的使用
1、标本处理
采用市售的细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA。提取的DNA的纯度A260/A280在1.8左右。
2、PCR扩增
(1)取NDM-1PCR反应液，分别加入样本DNA提取液或质控品提取液上清5ul。
(2)PCR扩增。PCR反应管液6,000rpm瞬时离心，放入PCR仪，按
下列表3所示程序条件扩增：
表3
荧光素设置：NDM-FAM，TAMRA；
荧光信号收集：Stage3：60℃---45sec；
反应体积：50ul。
(3)结果分析：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在1～5、End值可设在15左右，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
3、质量控制
(1)阴性质控：无典型S型扩增曲线或无Ct值显示；
(2)阳性质控：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1；
(3)以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4、试验结果的判定
(1)如果检测样本无典型S型扩增曲线或Ct值＞35.1，则判样本为本试剂盒指定检测的NDM基因阴性；
(2)如果检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1，则判样本为本试剂盒指定检测的NDM基因阳性。
请参阅图1、图2，图1为阳性质控品的扩增曲线，以10倍梯度稀释；图2为阴性性质控品的扩增曲线。
5、优点和效果：本发明试剂盒采用实时荧光PCR技术，针对NDM-1泛耐药基因的保守区，设计特异性引物和荧光标记探针，特异扩增和检测NDM-1泛耐药基因片段。实时荧光PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质。随着PCR反应的进行，荧光探针不断地被水解，荧光信号强度也随之增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。这种方法具有以下几种优点：
1)高灵敏：度荧光PCR灵敏度显著高于传统的PCR电泳的方法。
2)高特异性：通过特异性的荧光探针对模板进行杂交，比一般的PCR具有更好的特异性。
3)防污染：与电泳法等不同，该试剂盒无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，同时采用了dUTP-UNG系统，有效地防范了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果，提高临床诊断依据的可靠性。
4)操作简单、耗时短：试剂盒在特定的荧光PCR检测仪上进行扩增和检测，不需要进行电泳或杂交的操作，只需0.5-1.5小时(针对不同机型)即可完成PCR过程，有利于提高报告出具的速度。
5)结果客观可靠无需人为判断，仪器自动收集和分析数据。
6)经济：市面上最廉价的NDM-1泛耐药基因检测方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种NDM-1泛耐药基因PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
上游引物：5’-GCAGGTTGATCTCCTGCTTGAT-3’；
下游引物：5’-GCGTGCTGGTGGTCGATAC-3’；
荧光探针：5’-CAGTTGAGGATCTGGGCGGTCTGG-3’；
所述荧光探针5’端用荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMARA标记；
所述PCR反应液还包括纯水、10×PCR buffer、25mM MgCl2、20mMdNTP、Taq酶、UNG酶，所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP；
所述试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品，所述阳性质控品为导入了如SEQ ID NO.4所述序列的质粒。
2.按权利要求1所述的NDM-1泛耐药基因PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为10μM，所述下游引物的浓度为10μM，所述荧光探针的浓度为10μM。
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