CN102181543A - 用于检测blaNDM-1基因的引物、探针、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测bla_NDM-1基因的引物、探针、试剂盒及其检测方法，其中的引物包括扩增bla_NDM-1基因的正向引物、反向引物；探针为bla_NDM-1基因的探针；该试剂盒包括PCR反应酶(热启动Taq酶)、PCR反应液，其中PCR反应液包括DEPC处理水、dNTPs、Taq Buffer、扩增bla_NDM-1基因的正向引物、反向引物及其探针；阴性质控品为DEPC处理水；阳性质控品采用包含扩增片段序列的克隆质粒。本发明采用实时荧光定量PCR技术检测bla_NDM-1基因的方法，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

Description

用于检测blaNDM-1基因的引物、探针、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于检测bla_NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌的引物、探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

细菌产生能水解β-内酰胺类抗菌药物的β-内酰胺酶，是细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。临床分离的细菌大多能产生β-内酰胺酶，已经确定的β-内酰胺酶有数百种。各种酶的分子结构和对β-内酰胺类水解能力存在较大差异，一般根据分子结构分为A、B、C、D四大类，其中B类酶在其活性部位结合有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物的广泛耐药性。金属β-内酰胺酶首先在铜绿假单胞菌、不动杆菌中发现。近年来，在肠杆菌科细菌，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等中也有发现。近期一种产生NDM-1的可抗绝大多数抗生素的耐药性超级细菌在英美印度等国家小规模爆发，NDM-1的全称为New Delhi metallo-β-lactamase-1，即新德里金属β-内酰胺酶1，NDM-1是ndm基因编码的产物，能水解几乎所有的β内酰胺类抗菌药物，从而导致其广泛的耐药性。采用bla_NDM-1基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，即可确定菌株是否携带bla_NDM-1基因。

实时荧光定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

现有技术中对耐药基因的检测主要采用宿主耐药实验，时间长、操作复杂繁琐。而bla_NDM-1基因作为新发的耐药基因，目前还没有一种合适的检测方法，也没有利用荧光定量PCR技术检测bla_NDM-1基因的检测方法或试剂盒。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种用于检测bla_NDM-1基因的扩增引物、探针、试剂盒及其检测方法，通过采用实时荧光定量PCR技术及专用探针和引物检测bla_NDM-1基因的核酸，具有特异性检测、灵敏度高、操作简便的优点。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：提供用于检测产NDM-1的泛耐药肠杆菌

科细菌的引物和探针，包括以下序列：

扩增bla_NDM-1基因的正向引物，其序列为序列表中的SEQ ID NO.1；

扩增bla_NDM-1基因的正向引物，其序列为序列表中的SEQ ID NO.2；

bla_NDM-1基因的探针，其序列为序列表中的SEQ ID NO.3。

本发明还提供用于检测NDM-1泛耐药肠杆菌科细菌的试剂盒，该试剂盒含有：

(1)PCR反应酶，为热启动Taq酶；

(2)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、Taq Buffer、扩增bla_NDM-1基因的正向引物、扩增bla_NDM-1基因的反向引物、bla_NDM-1基因的探针；其中

扩增bla_NDM-1基因的正向引物序列为：SEQ ID NO.1，

扩增bla_NDM-1基因的反向引物序列为：SEQ ID NO.2，

bla_NDM-1基因的探针序列为：SEQ ID NO.3；

(3)阴性质控品，为DEPC处理水；

(4)阳性质控品，采用包含扩增片段序列的克隆质粒。

所述探针5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。

本发明又一技术方案是：一种利用所述的试剂盒检测bla_NDM-1基因的检测方法，包括下列步骤：

(1)DNA提取：采用商业化提取试剂进行待测样本的DNA提取；

(2)PCR Mix配制及分装：按22μL∶1μL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，室温融化并振荡混匀后，12,000rpm离心10s，配制成PCR Mix，取出PCR反应管，给每个PCR反应管中加入23μL上述配制的PCR Mix；

(3)加样：向上述的PCR反应管中分别加入提取的样本DNA，阳性质控品及阴性质控品2μL，12,000rpm离心10s；

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

第一步，42℃45min；

第二步，95℃2min；

第三步，95℃10s，60℃30s；(40个循环)在反应程序的第三步的结束读取荧光值；

(5)分析判断：Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35-37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明试剂盒的研制成功，极大提高临床对bla_NMD-1病原体的甄别与诊断能力，对指导公共卫生部门的干预和临床决策，控制耐药菌暴发流行发挥巨大的作用。本发明通过采用实时荧光定量PCR技术及专用探针和引物检测bla_NDM-1基因的核酸，向医院、疾病预防控制中心等机构提供快速简便的诊断方法。本发明的方法具有特异性检测、灵敏度高、操作简便的优点。

附图说明

图1是本发明实施例1中提供的实验结果图；

图2是本发明实施例2中提供的实验结果图。

图1和图2中的横坐标为“循环数”，纵坐标为“荧光强度”。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明提供了用于检测产NDM-1的泛耐药肠杆菌科细菌的试剂盒，该试剂盒含有：PCR反应酶，为热启动Taq酶；PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、Taq Buffer、扩增bla_NDM-1基因的正向引物、扩增bla_NDM-1基因的反向引物、bla_NDM-1基因的探针；阴性质控品，为DEPC处理水；阳性质控品，采用包含靶序列的克隆质粒。

试剂盒的制造：

1.试剂

本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司(Takara)，TE Buffer，1×(pH 7.9-8.1)购自普洛麦格公司，材料及仪器通过市售均可以购买。

2.PCR反应液制备：

(1)引物及探针设计与合成：

从Genbank上下载bla_NDM-1基因组序列，通过生物学软件Align X进行多序列比对，在基因区选择一段保守序列，如序列表中的SEQ ID NO.4所示。

依据引物和探针设计原则，采用Primer Express软件设计特异性引物及探针。设计结果如下表所示：

表中：F：forward，正向；NDM-F表示扩增bla_NDM-1基因的正向引物。

R：reverse，反向；NDM-R表示扩增bla_NDM-1基因的反向引物。

P：probe，探针；NDM-P表示bla_NDM-1基因的探针。

FAM：荧光报告基团。

ECLIPSE：荧光淬灭基团。

按照上表的设计结果，分别委托Invitrogen公司和Takara公司合成引物和探针。

(2)引物、探针的溶解

取冻存的bla_NDM-1基因扩增引物(NDM-F和NDM-R)、探针(NDM-P)干粉管，用离心机12,000g离心30s，按照引物探针溶解说明书加入TE Buffer将干粉溶解，使探针浓度为10μM，两种引物浓度各为20μM，等量取两种引物溶液到1.5mL EP管中混合，配制成10μM引物混合溶液，振荡混匀离心，备用。

(3)PCR反应液配制

按下述比例：DEPC处理水16μL、2.5mM dNTPs 2μL(含2.5mM浓度的dATP，dDTP，dCTP，dGTP)、10×EX Taq Buffer2.5μL、10μM引物混合溶液1μL和10μM探针0.5μL，配制成PCR反应液。

3.PCR反应酶制备：

浓度为5U/μL的热启动Taq酶1μL。

4.阴性对照品制备

阴性对照品的作用是用来防止因污染而产生的假阳性。本发明采用DEPC处理水作为阴性对照品，对整个实验过程进行监控。

5.阳性对照品制备

阳性对照品的作用是监控试剂是否失效及性能是否下降。

采用包含扩增片段序列的克隆质粒，在检测时作为阳性对照品以监控其假阴性。

阳性对照品的制备方法：采用pUC57(EcoRV)载体，构建包含bla_NDM-1基因靶序列的重组质粒(P_NDM-1)，所说的靶序列如序列表中的SEQ ID NO.5所示，其中包含了扩增片段序列，具体如下：

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提取上述重组质粒(P_NDM-1)的DNA用作阳性对照品。

实施例1

用本发明的试剂盒在ABI 7300荧光定量PCR仪上检测bla_NDM-1基因的方法

(1)DNA提取：采用商业化提取试剂进行DNA提取；样本类型为尿液或感染部位的棉拭子样本。

(2)PCR Mix配制：

按22μL∶1μL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，室温融化并振荡混匀后，12,000rpm离心10s，配制成PCR Mix。实际配制时，每3个反应管的PCR Mix量按3.5个反应管的量配制，配制方法如下表所示：

取出PCR反应管，其中一个为阳性质控品反应管，一个为阴性质控品反应管，另一个为被测样品反应管，每个反应管中加入23μL上述配制的PCR Mix；

(3)加样：向3个反应管中分别加入提取的样本DNA 2μL，阳性质控品(浓度为10⁵基因拷贝/μL)2μL及阴性质控品2μL，最终使每个反应管的反应体系为25μL，混匀后12,000rpm离心10s；

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置未知标本、阳性质控品品和阴性质控品，并设置样品名称、标记荧光基团种类(报告基团FAM、淬灭基团ECLIPSE))，按下表设置反应程序进行PCR扩增。

注：报告基团设为FAM，淬灭基团设为none，Passive Reference设为none；在反应程序的第三步的结束读取荧光值。

(5)质控标准：

阴性质控品：阴性，即无Ct值且无明显的扩增曲线；

阳性质控品：阳性且Ct值小于35，扩增曲线呈标准S型。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

(6)分析判断：

Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35-37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。本发明实施例1的试验结果如图1所示，检测结果为阳性，Ct值为19.5。

本发明实施例所用的试剂及材料分别如下：

(1)试剂

QIAamp Viral RNAMini Kit，购自德国QIAGEN公司；

bla_NDM-1基因检测试剂盒，本发明产品。

(2)材料

滤芯枪头：10μL、200μL、1000μL，购自AXYGEN公司；

PCR反应管：0.2mL薄壁管，购自AXYGEN公司。

(3)仪器

ABI 7300荧光定量PCR仪，购自AB公司。

实施例2

用本发明的试剂盒按照实施例1的方法检测未知样本。未知样本来源××医院病人待测定的样品，本发明实施例2的试验结果如图2所示，检测结果为阳性，Ct值为24.4。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.用于检测bla_NDM-1基因的引物和探针，其序列如下：

(1)扩增bla_NDM-1基因的正向引物，其序列为SEQ ID NO.1；

(2)扩增bla_NDM-1基因的反向引物，其序列为SEQ ID NO.2；

(3)bla_NDM-1基因的探针，其序列为SEQ ID NO.3。

2.用于检测bla_NDM-1基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：

(1)PCR反应酶，为热启动Taq酶；

(2)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、dNTPs、Taq Buffer、扩增bla_NDM-1基因的正向引物、扩增bla_NDM-1基因的反向引物、bla_NDM-1基因的探针；其中

扩增bla_NDM-1基因的正向引物序列为：SEQ ID NO.1，

扩增bla_NDM-1基因的反向引物序列为：SEQ ID NO.2，

bla_NDM-1基因的探针序列为：SEQ ID NO.3；

(3)阴性质控品，为DEPC处理水；

(4)阳性质控品，采用包含靶序列的克隆质粒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。

4.一种利用权利要求2或3所述的试剂盒检测bla_NDM-1基因的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)DNA提取：采用商业化提取试剂进行待测样本的DNA提取；

(2)PCR Mix配制及分装：按22μL∶1μL的比例，分别吸取PCR反应液和PCR反应酶，室温融化并振荡混匀后，12,000rpm离心10s，配制成PCR Mix，取出PCR反应管，在每个PCR反应管中加入23μL上述配制的PCR Mix；

(3)加样：向上述的PCR反应管中分别加入提取的样本DNA，阳性质控品及阴性质控品2μL，12,000rpm离心10s；

(4)PCR扩增：将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样本名称及类型，按下列条件进行PCR扩增；

第一步，42℃45min；

第二步，95℃2min；

第三步，95℃10s，60℃30s；(40个循环)在反应程序的第三步的结束读取荧光值；

(5)分析判断：Ct值小于等于35的为阳性；Ct值大于37的为阴性；Ct值在35-37之间的为灰区，需要进行重复试验，如果Ct值仍然在35-37之间则判断为阳性，否则为阴性。

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