CN101948920A - 耐药基因pcr检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒，所述耐药基因为NDM-1，NDM-1基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列。一种阳性模板的制备方法包括如下步骤：a)对NDM-1基因序列进行点突变，获取突变基因，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：3所示的序列；b)将所述突变基因合成并克隆入质粒；c)将所述质粒线性化，得到所述阳性模板。通过设置阳性模板，可以快速准确的进行NDM-1检测；通过对NDM-1基因进行点突变，可以保证阳性模板不被正确转录和翻译，只能作为阳性对照的序列，从而能够保证生物安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒。
背景技术
随着抗生素的普遍应用，细菌耐药问题也日渐严重，随着2010年8月TheLancet Infectious Diseases杂志发表了一篇由印度、英国、瑞典、巴基斯坦和澳大利亚科学家联合研究报告，报道了抗生素抗性的一种新机制及其在印度、英国和巴基斯坦的播散情况，耐药性问题再一次惊醒世人抗生素滥用会终结我们依赖抗生素与细菌感染斗争的威力。
早在青霉素尚未临床应用的1940年，科学家就分离出了水解青霉素的酶，当时称为青霉素酶，在解析了青霉素为一种β-内酰胺结构的抗生素后，此酶也就重新命名为β-内酰胺酶。该酶按照功能和分子结构进行分类。根据功能特征分成群1～4，其中群2又分成亚群2a～2e、2f，2b进一步分成2be和2br两个亚群。根据该酶的核酸与蛋白序列进行分子分型，分为A～D 4个类型，分子型A、C和D是以丝氨酸为基础的作用机制，而B型或金属-β-内酰胺酶以锌指结构为基础的作用机制。群1是头孢菌素酶，分子型C，不被棒酸抑制；群2包括青霉素酶、头孢菌素酶或二者均有，均被棒酸抑制，属于分子型A和D，对应原始的TEM和巯基变异(sulfhydryl variable，SHV)基因；群3是金属酶，分子型B，不被棒酸抑制；群4是青霉素酶，没有分子型与之对应，不被棒酸抑制。新发现的NDM-1是金属蛋白酶，是一类新型具有广谱抗生素水解作用的β-内酰胺酶。
新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)基因介导的抗性是一种新报道的耐药新机制，NDM-1是一种新鉴定的对β-内酰胺抗生素具有广谱水解作用的一种酶，是编码碳青霉烯类酶(Carbapenamase)基因家族成员之一。NDM-1可以水解碳(杂)青霉烯类抗生素，以及头孢菌素和青霉素。携带该基因的细菌对几乎所有一线治疗重症感染的广谱抗生素都具有抗性，因此，被媒体称为“超级细菌”。该酶是质粒上blaNDM-1基因编码的，容易通过基因水平转移在细菌间传播。该抗性细菌虽然发现时间不到1年，但其已经扩散到英国、美国、比利时、巴基斯坦等国家，并且从肺炎克雷伯菌扩散到大肠杆菌和鲍曼不动杆菌。由于从其他国家分离的携带NDM-1的耐药菌株，患者都有到印度就医的历史，因此，推测表达NDM-1菌株是从印度起源的。国际旅行和患者享受多国医疗服务可能会导致NDM-1的快速扩散，且可能导致潜在的严重后果。
鉴于我国目前还没有关于携带NDM-1菌株的报道，所以需要加强监测。因为我国目前对外交往频繁，尤其是在一些印度和巴基斯坦人聚集的地区，更应密切监测；对于往来印度和巴基斯坦的人员也要监测，尤其是在当地有住院或就医历史的人员更要密切监测。
最简便的检测方法就是基于核酸体外扩增的聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)，虽然NDM-1基因序列网上已经公布，在没有阳性对照模板的情况，会使得检测结果难以判定，而且，如果直接合成公布的基因，会造成合成基因对无抗性菌株的污染。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够保证生物安全的耐药基因PCR检测阳性对照模板、制备方法及试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，所述耐药基因为NDM-1，所述序列含有SEQ ID NO：3所示的序列。所述序列可以含有SEQ ID NO：2所示的序列。
一种耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，所述耐药基因为NDM-1，NDM-1基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列，包括如下步骤：
a)对NDM-1基因序列进行点突变，获取突变基因，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：3所示的序列；
b)将所述突变基因合成并克隆入质粒；
c)将所述质粒线性化，得到所述阳性模板。
进一步的，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：2所示的序列。
进一步的，所述步骤a)中，插入一段多克隆位点。
进一步的，所述多克隆位点包括多个内切酶酶切位点，所述酶切位点选自：BamHI、EcoRI、HindIII。
进一步的，所述步骤c)中，将所述质粒线性化后，再将所述质粒去磷酸化。
一种由所述制备方法制备的阳性对照模板。
一种阳性对照模板在NDM-1检测上的应用。
一种耐药基因PCR检测试剂盒，包括所述的阳性对照模板。
一种所述的试剂盒在NDM-1检测上的应用。
一种引物，所述引物用于检测一种耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，所述引物含有下述至少一组：
A：NDM-P1-L：CGACAACGCATTGGCATAAG SEQ ID NO：7
NDM-P1-R：CTGGCAGCACACTTCCTATC SEQ ID NO：8
B：NDM-P2-L：GGCGGAATGGCTCATCAC SEQ ID NO：9
NDM-P2-R：GGCAGCACACTTCCTATCTC SEQ ID NO：10
C：NDM-P3-L：GATTGCCGAGCGACTTGG SEQ ID NO：11
NDM-P3-R：CTGAGCACCGCATTAGCC SEQ ID NO：12
本发明的有益效果是：通过设置阳性模板，可以快速准确的进行NDM-1检测；通过对NDM-1基因进行点突变，可以保证阳性模板不被正确转录和翻译，只能作为阳性对照的序列，从而能够保证生物安全。
附图说明
图1是电泳图，其中，Lane 1：DL2000 marker；Lane 2：NDM-P1鉴定产物；Lane 3：NDM-P2鉴定产物；Lane 4：NDM-P3鉴定产物；Lane 5：阴性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明所提供的阳性对照模板制备方法是从网上获得NDM-1基因序列(FN396876)，将其编码密码子进行27处点突变(突变成终止密码子)并插入一段多克隆位点(便于对突变序列进行酶切分析)，然后将突变基因合成并克隆入质粒中，再将重组质粒线性化后作为阳性对照模板。这样，可以保证阳性模板不能被正确转录和翻译，只能作为阳性对照的序列，可以绝对保证生物安全。
本发明所提供的阳性对照模板制备方法，包括以下步骤：
1)从网上获得NDM-1基因序列(FN396876)并根据NDM-1基因序列设计三对PCR鉴定引物：
NDM-1基因序列：
ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCCGGTCGCGAAGCTGAGCACCG
CATTAGCCGCTGCATTGATGCTGAGCGGGTGCATGCCCGGTGAAAT
CCGCCCGACGATTGGCCAGCAAATGGAAACTGGCGACCAACGGTT
TGGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCACCGAATGT
GTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGC
CTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGGATCAAGCAG
GAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATC
AGGACAAGATGGGCGGTATGGACGCGCTGCATGCGGCGGGGATTG
CGA
AACCAGCTTGCCCCGCAAGAGGG
GATGGTTGCGGCGCAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTGG
GTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCTCAAGGTATTTT
ACCCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACCGTTGGGATCGA
CGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGCCTGATCAAGGACAGCAAG
GCCAAGTCGCTCGGCAATCTCGGTGATGCCGACACTGAGCACTACG
CCGCGTCAGCGCGCGCGTTTGGTGCGGCGTTCCCCAAGGCCAGCAT
GATC
CCCGATAGCCGCGCCGCAATCACTC
ATACGGCCCGCATGGCCGACAAGCTGCGCTGA(813bp，与SEQ ID
NO：1所示序列一致，其中下划线和着重号标注序列为鉴定引物)。相应的氨基酸序列为：
MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFG
DLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWT
DDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYA
NALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPG
HTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDADTEHYAASARAF
GAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR(270aa，即SEQ ID
NO：5所示序列)。
NDM-1基因PCR鉴定引物序列如表1所示：
表1NDM-1基因PCR鉴定引物
2)对NDM-1基因序列进行27处点突变(突变成终止密码子)并插入一段多克隆位点：
突变后的NDM-1基因序列：
TAGGAATTGCCCAATATTATGCACCCGGTCGCGTAGCTGAGCACCG
CATTAGCCGCTGCATAGATGCTGAGCGGGTGAATGCCCGGTGAAAT
CCGCCCGACGATTGGCCAGCAAATGTAAACTGGCGACCAACGGTTT
GGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCATAGAATGT
TTAGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCC
TAGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGA
GATCAAGCAGGAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGTAGGTGGTGACT
CACGCGCATCAGGACAAGATGGGCGGTTAGGACGCGCTGCATGCG
GCGGGGATTGCGAAACCAGCTTGCCC
CGCAATAGGGGATGGTTGCGGCGTAACACAGCCTGACTTTCGCCG
CCAATGGCTAGGTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCT
CAAGGTATTTTAACCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACC
GTTTGAATCGACGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGACTGATCA
AGGACAGCAAGGCCAAGTCGCTCGGCAATCTCGGTGATGCCGACA
CTGAGCACTAAGCCGCGTAAGCGCGCGCGTTTGGTGCGGCGTTCCC
CTAGGCCAGCATGATCCCCGATAGCCGC
GCCGCAATCACTCATACGGCCCGCATGGCCGACAAGCTGCGCTGA(8
73bp，与SEQ ID NO：2所示序列一致，其中，斜体是插入的多克隆位点)
插入的多克隆位点中包含BamHI、EcoRI、HindIII等常见内切酶酶切位点，且这些酶切位点在天然NDM-1基因序列中均不存在。
突变后的NDM-1基因编码的氨基酸序列为：
*ELPNIMHPVA*LSTALAAA*MLSG*MPGEIRPTIGQQM*TGDQRFGDL
VFRQLA*NVWQHTSYLD*PGFGAVASNG*IVRDGGRVLVVDTA*TDDQ
TAQILN*PWLISDPNSSSVDKLAAALEIKQEINLPVAL*VVTHAHQDKM
GG*DALHAAGIATYANALSNQLAPQ*GMVAA*HSLTFAANG*VEPATA
PNFGPLKVF*PGPGHTSDNITV*IDGTDIAFGG*LIKDSKAKSLGNLGDA
DTEH*AA*ARAFGAAFP*ASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR(*
表示突变后的密码子导致翻译提前终止，即SEQ ID NO：6所示序列)。可以看出突变后的NDM-1基因序列不能被正确转录和翻译。
当然，突变后的NDM-1基因序列也可以为如下序列：
TAGGAATTGCCCAATATTATGCACCCGGTCGCGTAGCTGAGCACCG
CATTAGCCGCTGCATAGATGCTGAGCGGGTGAATGCCCGGTGAAAT
CCGCCCGACGATTGGCCAGCAAATGTAAACTGGCGACCAACGGTTT
GGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCATAGAATGT
TTAGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGCC
TAGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGA
ATCAAGCAG
GAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGTAGGTGGTGACTCACGCGCATC
AGGACAAGATGGGCGGTTAGGACGCGCTGCATGCGGCGGGGATTG
CGA
AACCAGCTTGCCCCGCAATAGGG
GATGGTTGCGGCGTAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTAG
GTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCTCAAGGTATTTT
AACCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACCGTTTGAATCGA
CGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGACTGATCAAGGACAGCAAG
GCCAAGTCGCTCGGCAATCTCGGTGATGCCGACACTGAGCACTAAG
CCGCGTAAGCGCGCGCGTTTGGTGCGGCGTTCCCCTAGGCCAGCAT
GATC
CCCGATAGCCGCGCCGCAATCACTC
ATACGGCCCGCATGGCCGACAAGCTGCGCTGA(与SEQ ID NO：3所示序列一致)
所述X表示0-100bp的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有多克隆位点，所述多克隆位点可以包含BamHI、EcoRI、HindIII等常见内切酶酶切位点，
优选的，所述X表示序列：
CCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGC
GGCCGCACTCGAG(与SEQ ID NO：4所示序列一致)。
3)将步骤2)获得的突变NDM-1基因序列合成并克隆至pGEM-T EasyVector上，测序结果表明突变基因被正确合成并成功克隆至载体。
4)将步骤3)获得的重组质粒用限制性内切酶双酶切使其线性化，再用磷酸酶作用使其去磷酸化以防止自连接，作为PCR模板，用步骤1)获得的三对特异引物进行PCR鉴定。
突变后的NDM-1基因PCR产物大小如表2所示：
表2突变后的NDM-1基因PCR产物大小
| Primer ID | Product size(bp) |
| NDM-P1 | 322 |
| NDM-P2 | 641 |
| NDM-P3 | 685 |
NDM-1基因PCR检测阳性对照模板效果评价
1.重组质粒的双酶切：将获得的重组质粒分别用Apa I和Nde I进行双酶切，Apa I酶切体系如表3所示：
表3质粒酶切体系1
| Apa I | 1μl |
| 10×buffer | 2μl |
| 重组质粒 | ＜1μg |
| 无菌去离子水 | up to 20μl |
37℃反应3小时。用乙醇沉淀法纯化：加2.5倍无水乙醇，充分混匀。冻存(2小时以上)，4℃12000rpm离心20分钟后倒掉上清，晾干，用40μl无菌去离子水溶。然后用Nde I酶切，37℃反应3小时，65℃20分钟热失活。用切胶回收试剂盒回收酶切产物，并用20μL无菌去离子水洗两遍。
Nde I酶切体系如表4所示：
表4质粒酶切体系2
| Nde I | 1μl |
| 10×buffer | 2μl |
| 上步所得产物 | ＜1μg |
| 无菌去离子水 | up to 20μl |
2.双酶切后的重组质粒的去磷酸化
去磷化体系如表5所示：
表5质粒去磷酸化体系
| 热敏磷酸酶 | 1μl |
| 10×buffer | 2μl |
| 上步所得产物 | ＜1μg |
| 无菌去离子水 | up to 20μl |
37℃反应15分钟，65℃5分钟热失活。用产物纯化回收试剂盒回收，并用20μL无菌去离子水洗两遍。作为PCR鉴定用模板。
3.PCR反应体系：
Mix配制如表6所示：
表6Mix配制
| 10×buffer(本室配制) | 100μl |
| 上游引物(100uM) | 1μl |
| 下游引物(100uM) | 1μl |
| dNTP Mix(20mmol/l) | 5μl |
PCR鉴定：首先95℃变性5分钟，然后按下面循环扩增，循环参数为95℃30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，30个循环，最后一步72℃延伸5分钟。反应体系如表7所示：
表7PCR鉴定反应体系
| Mix | 3.0μl |
| 模板 | 20ng |
| Taq(5U/μl) | 0.2μl |
| 无菌去离子水 | up to 30μl |
取PCR产物7μl，经1.5％琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液)分析扩增片段大小，如图1所示。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，所述耐药基因为NDM-1，所述序列含有SEQ ID NO：3所示的序列。
2.如权利要求1所述的耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，其特征在于：所述序列含有SEQ ID NO：2所示的序列。
3.一种耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，所述耐药基因为NDM-1，NDM-1基因序列为SEQ ID NO：1所示的序列，其特征在于：包括如下步骤：
a)对NDM-1基因序列进行点突变，获取突变基因，所述突变基因序列含有SEQ ID NO：3所示的序列；
b)将所述突变基因合成并克隆入质粒；
c)将所述质粒线性化，得到所述阳性模板。
4.如权利要求3所述的耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，其特征在于：所述步骤a)中，插入一段多克隆位点。
5.如权利要求4所述的耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，其特征在于：所述多克隆位点包括多个内切酶酶切位点，所述酶切位点选自：BamHI、EcoRI、HindIII。
6.如权利要求3-5中任意一项所述的耐药基因PCR检测阳性对照模板的制备方法，其特征在于：所述步骤c)中，将所述质粒线性化后，再将所述质粒去磷酸化。
7.一种权利要求1或2所述的阳性对照模板在NDM-1检测上的应用。
8.一种耐药基因PCR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的阳性对照模板。
9.一种权利要求7所述的试剂盒在NDM-1检测上的应用。
10.一种引物，所述引物用于检测一种耐药基因PCR检测阳性对照模板序列，所述引物含有下述至少一组：
A：NDM-P1-L：CGACAACGCATTGGCATAAG SEQ ID NO：7
NDM-P1-R：CTGGCAGCACACTTCCTATC SEQ ID NO：8
B：NDM-P2-L：GGCGGAATGGCTCATCAC SEQ ID NO：9
NDM-P2-R：GGCAGCACACTTCCTATCTC SEQ ID NO：10
C：NDM-P3-L：GATTGCCGAGCGACTTGG SEQ ID NO：11
NDM-P3-R：CTGAGCACCGCATTAGCC SEQ ID NO：12
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