CN102154506B - 快速检测ndm-1基因的专用引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用。本发明提供了辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的专用引物，由序列表的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示DNA组成；NDM-1蛋白是由序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。应用所述专用引物检测，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简便、安全等特点，其广泛应用将大大提高低仪器配置地区的病原微生物检测能力，对病原微生物的早期、准确诊断有着重大意义。本发明不仅可指导临床合理用药，以免延误病情和增加治疗费用，而且有利于控制其传播，防止暴发流行，这对提高治疗效果和控制医院内感染均有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用。
背景技术
早在人类诞生之前，细菌便开启了自己的生命历程，二战期间细菌严重威胁了人类的生命。1929年，弗莱明偶然间发现了青霉素(Penicillin)，随着抗生素药物的问世，细菌的耐药性在一些国家得到一定的控制。1961年，后英国学者Jevons首次发现了耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Methicillin-resitant Staphylococcusaureus，MRSA)，MRSA能分泌一种酚可溶性调控蛋白(Phenol-soluble modulin，PSM)破坏人类的嗜中性粒细胞，形成严重感染——第一任“超级细菌”就此诞生。近年来抗生素滥用及抗生素累积的双重因素，使得细菌中的耐药基因不断积累，从而产生了多重抗药性。
据2010年8月11日出版的英国《The Lancet Infectious Diseases》期刊报道，目前有一种新的耐药基因在一些国家流行，一些西方医学家称其为NDM-1基因。NDM-1基因编码的蛋白被命名为“新德里金属-β-内酰胺酶1(New Metallo-β-Lactamase-1)。新德里金属-β-内酰胺酶1由269个氨基酸残基组成，与现有的其它金属-β-内酰胺酶(Metallo-β-Lactamase)的一致性不足33％，且在酶活性位点附近经常有其独特的氨基酸残基及插入序列，并能与碳青霉烯类抗生素紧密结合。NDM-1基因目前已发现于克雷伯式杆菌的180kb的质粒和大肠杆菌的140kb的质粒上。在NDM-1基因上游的2个区域中还存在能够抵抗链霉素、红霉素、氯霉素、利福平等抗生素的基因以及消毒剂和磺胺药物的多种耐药基因。由于含有NDM-1基因的质粒即能在菌株之间穿梭传递，又可以在转移中发生重组，且通过携带NDM-1基因的质粒的传递，还可使对抗生素敏感的细菌获得多重耐药性，大大增加临床抗生素使用的困难。
目前，携带有NDM-1基因的超级细菌正在全球蔓延，印度、美国、英国、澳大利亚、加拿大、法国、荷兰等多个国家已经出现了疑似病例。面对“超级细菌”的跨国传播趋势，寻找一种简便、快速、准确的耐药基因检测方法成为许多科研工作者的重大课题，也是临床实践检验中急切解决的问题。建立快速、简便、可靠的检测方法对NDM-1基因进行检测，对于指导临床的早期治疗和有效的控制超级细菌的传播具有重大意义。
LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109-1010个拷贝数量级。整个反应仅需1小时，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。LAMP技术具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。目前，国内外尚未见LAMP方法检测NDM-1基因的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测NDM-1基因的专用引物及其应用。
本发明提供的辅助检测NDM-1蛋白(新德里金属-β-内酰胺酶1)的编码基因的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成。
本发明还保护一种辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒，包括所述的专用引物。
所述专用引物可用于制备辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒。
所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助检测NDM-1蛋白的编码基因。
所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定含有NDM-1蛋白的编码基因的生物样本。
所述NDM-1蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列7的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列7衍生的蛋白质。
所述NDM-1蛋白的编码基因为如下(1)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列8所示的DNA分子；
(2)序列表的序列8自5’末端第14至826位核苷酸所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。
本发明还保护一种辅助鉴定待测生物样本是否含有NDM-1蛋白的编码基因的方法，包括如下步骤：
(1)提取所述待测生物样本的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，用所述的专用引物进行环介导恒温扩增；
(3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有所述NDM-1蛋白的编码基因。
所述环介导恒温扩增的反应程序可为：65℃1小时，80℃5分钟。
所述环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA的浓度均可为0.2μmol/L，序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均可为1.6μmol/L，序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA的浓度均可为0.8μmol/L。
所述待测生物样本可为大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。
所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌DH5α、所述金黄色葡萄球菌具体可为金黄色葡萄球菌ATCC25923、所述肺炎克雷伯氏菌具体可为肺炎克雷伯氏菌EL-2株、所述肺炎链球菌具体可为肺炎链球菌R6。
所述环介导恒温扩增的反应体系中含有钙黄绿素时，可通过荧光显色进行结果判读：如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测生物样本中含有所述NDM-1蛋白的编码基因；如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测生物样本中不含有所述NDM-1蛋白的编码基因。
还可通过观察沉淀进行结果判读：如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测生物样本中含有所述NDM-1蛋白的编码基因；如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测生物样本中不含有所述NDM-1蛋白的编码基因。
还可通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判读：如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测生物样本中含有所述NDM-1蛋白的编码基因；如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测生物样本中不含有所述NDM-1蛋白的编码基因。
还可通过浊度仪进行结果判读，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪检测反应液，如果生成浊度变化曲线待测生物样本中含有所述NDM-1蛋白的编码基因，如果没有生成浊度变化曲线待测生物样本中不含有所述NDM-1蛋白的编码基因。
应用所述专用引物可以通过LAMP(环介导恒温扩增)技术从分子水平上直接快速、准确检测NDM-1耐药基因，具有如下优点：(1)在恒温条件下即可发生反应，摆脱了了对于仪器的依赖；(2)反应时间短；在1h内即可完成；(3)灵敏度高；比传统PCR扩增技术提高了三个数量级，最低检测限为6copies/反应；(4)特异性强；应用6个靶基因位点，内引物及外引物在6个区域特异性结合方可进行扩增；(5)鉴定简便；在核酸大量合成时，从dNTP解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀；如果在反应体系中加入结合了Mn2+的钙黄绿素，Mg2+则替换掉钙黄绿素中结合的Mn2+，是钙黄绿素发出黄绿色荧光；以上两种方法均不需要借助其他仪器便可肉眼观察实验结果，实现了结果可视化；也可通过Loopamp浊度仪检测的方式进行结果判读；(6)步骤简单；先将DNA模板在96℃，预变性3min。再将所有配制在一起的试剂，一步添加进去，实现一步核酸扩增，免开盖操作，可保证临床检验人员自身安全，进而亦避免了“超级细菌”的传播。
应用本发明提供的专用引物检测NDM-1蛋白的编码基因，解决了其他检测技术对于临床实际应用需求的针对性不强的技术弊端，并且解决了其他检测技术耗时长、操作复杂、检测仪器昂贵、灵敏度及特异性差等技术问题，具有灵敏度高、速度快、特异性强、简便、安全等特点，为快速、准确的检测NDM-1耐药基因打下坚实的基础，其广泛应用将大大提高低仪器配置地区的病原微生物检测能力，对病原微生物的早期、准确诊断有着重大意义。本发明不仅可指导临床合理用药，以免延误病情和增加治疗费用，而且有利于控制其传播，防止暴发流行，这对提高治疗效果和控制医院内感染均有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中通过观察荧光颜色变化判读结果；A：以NDM-1基因为模板；B：空白对照。
图2为实施例2中通过观察白色沉淀判读结果；A：以NDM-1基因为模板；B：空白对照。
图3为实施例2中通过检测浊度变化判读结果。
图4为实施例2中通过琼脂糖凝胶电泳判读结果。
图5为实施例3中通过琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度的结果。
图6为实施例4中NDM-1基因与同源序列的BLAST比对结果。
图7为实施例4中通过琼脂糖凝胶电泳检测特异性的结果。
图8为对比例中的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。分子量标准采用Marker DL 2000。
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：韩俊，陈岚，段淑敏等，金属催化剂有效快速裂解SARS冠状病毒和其他微生物，中国实验动物学报，2006年9月，第14卷，第3期，199-212页。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：王坚，吴梅，陆炜方等，48株金黄色葡萄球菌检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及药敏分析，中国煤炭工业医学杂志，2009年1月第12卷第1期，93-94。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)EL-2株：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：孔庆娟，刘马峰，白建等，大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的药敏试验，畜禽业，2005年第1期总第177期，64-66。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：张巧，林科雄，马千里等，肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价，重庆医科大学学报，2010年第35卷第5期。
实施例1、专用引物的设计和制备
设计并合成表1所示的各条引物(FOP、BOP、FIP、BIP、FLP和BLP)。
表1所示的六条引物组成专用引物，用于实施例2。
表1引物的核苷酸序列
| 引物序列(5′-3′) | 引物长度 | |
| FOP(序列表的序列1) | CTCGACATGCCGGGTTTC | 18bp |
| BOP(序列表的序列2) | GCCCATCTTGTCCTGATGC | 19bp |
| FIP(序列表的序列3) | TATCGACCACCAGCACGCGGGGGGCAGTCGCTTCCA | 36bp |
| BIP(序列表的序列4) | ACCGATGACCAGACCGCCCATGAGTCACCACCGCCAG | 37bp |
| FLP(序列表的序列5) | TCCCTGACGATCAAACCGT | 19bp |
| BLP(序列表的序列6) | GATCCTCAACTGGATCAAGCAG | 22bp |
NDM-1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列7所示，其编码基因如序列表的序列8所示，开放阅读框为序列表的序列8自5’末端第14至826位核苷酸。
实施例2、应用专用引物检测NDM-1基因
一、模板的制备
合成序列表的序列11所示的DNA(模板)，为了使靶序列的核苷酸序列不能翻译成为具有活性的功能蛋白，将所述靶序列中的个别核苷酸进行了替换，为了便于与其它模板区分，将序列11所示的DNA也称为NDM-1基因。
二、应用专用引物检测NDM-1基因
1、通过观察荧光颜色变化判读结果(荧光显色法)
采用步骤一合成的模板(浓度为2.9ng/μl)进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表2。
表2LAMP反应体系(25μL)
| 组分 | 在反应体系中的终浓度 |
| FIP | 1.6μmol/L |
| BIP | 1.6μmol/L |
| FOP | 0.2μmol/L |
| BOP | 0.2μmol/L |
| FLP | 0.8μmol/L |
| BLP | 0.8μmol/L |
| dNTPS | 1.4mmol/L |
| 甜菜碱(Betaine) | 0.8mmol/L |
| Tris-HCl(pH8.8) | 20mmol/L |
| KCl | 10mmol/L |
| (NH4)2SO4 | 10mmol/L |
| MgSO4 | 8mmol/L |
| Tween20 | 0.1％(体积百分含量) |
| Bst DNA Polymerase | 8U |
| 模板 | 2μL |
| 钙黄绿素 | 1μl |
| 双蒸水 | 定容 |
以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
将表2中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：65℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。
反应完成后观察反应溶液的颜色变化(反应前溶液均显示浅橙色荧光，如果反应结果为阳性，反应后溶液应显示绿色荧光)。结果见图1。以NDM-1基因为模板，反应后的反应液显示绿色荧光。空白对照中，反应后的反应液显示浅橙色荧光。
进行三次重复实验，结果一致。
2、通过观察白色沉淀判读结果
采用步骤一合成的模板(浓度为2.9ng/μl)进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3。
表3LAMP反应体系(25μL)
| FIP | 1.6μmol/L |
| BIP | 1.6μmol/L |
| FOP | 0.2μmol/L |
| BOP | 0.2μmol/L |
| FLP | 0.8μmol/L |
| BLP | 0.8μmol/L |
| dNTPS | 1.4mmol/L |
| 甜菜碱(Betaine) | 0.8mmol/L |
| Tris-HCl(pH8.8) | 20mmol/L |
| KCl | 10mmol/L |
| (NH4)2SO4 | 10mmol/L |
| MgSO4 | 8mmol/L |
| Tween20 | 0.1％(体积百分含量) |
| Bst DNA Polymerase | 8U |
| 模板 | 2μL |
| 双蒸水 | 定容 |
以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：65℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。
反应完成后肉眼直接观察反应液。结果见图2。以NDM-1基因为模板，反应后的反应液中出现白色浑浊沉淀物(焦磷酸镁)。空白对照中，反应后的反应液仍为无色透明状态。
进行三次重复实验，结果一致。
3、通过检测浊度变化判读结果
采用步骤一合成的模板(浓度为2.9ng/μl)进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3。
以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
反应温度为65℃，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测60分钟。
扩增曲线见图3A(1表示阳性反应，2表示空白对照)，LAMP浊度仪检测检测界面图见图3B(横坐标4为加入NDM-1模板的反应管；横坐标5为阴性对照管；当反应为阳性扩增时候模块的颜色转变为红色，如果未发生扩增，则模块的颜色仍旧为绿色)。以NDM-1基因为模板可以得到扩增曲线(模块4)。空白对照中，没有发生扩增曲线(模块5)。
进行三次重复实验，结果一致。
4、通过琼脂糖凝胶电泳判读结果
采用步骤一合成的模板(浓度为2.9ng/μl)进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3。
以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：65℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。
将反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果见图4(泳道1至4为加入NDM-1模板的反应液，泳道5为空白对照)。以NDM-1基因为模板，反应后反应液电泳显示LAMP扩增特异带型(连续的梯状条带)。空白对照中，反应后反应液未显示有扩增条带。
进行三次重复实验，结果一致。
实施例3、专用引物的灵敏性测定
一、制备模板
合成序列表的序列11所示的NDM-1基因，进行梯度稀释后作为模板。模板的浓度分别如下：2.9×10-6ng/μl、2.9×10-7ng/μl、2.9×10-8ng/μl、2.9×10-9ng/μl。
二、Loopamp浊度仪检测的灵敏度
分别采用步骤一合成的模板进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3。
以2μL双蒸水作为模板的空白对照，以2μL肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA(82.8ng/μl)为阴性对照1，以2μL大肠埃希氏菌的基因组DNA(52.4ng/μl)为阴性对照2。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
反应温度为65℃，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测120分钟。最低检测灵敏度为2.9×10-9ng/μl(6copies/反应)。
三、电泳检测的灵敏度
分别采用步骤一合成的模板进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3。
以2μL双蒸水作为模板的空白对照，以2μL肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA(82.8ng/μl)为阴性对照1，以2μL大肠埃希氏菌的基因组DNA(52.4ng/μl)为阴性对照2。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：65℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。
反应结束后取反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果见图5(泳道1为浓度为2.9×10-6ng/μl的NDM-1基因作为模板，泳道2为浓度为2.9×10-7ng/μl的NDM-1基因作为模板，泳道3为浓度为2.9×10-8ng/μl的NDM-1基因作为模板，泳道4为浓度为2.9×10-9ng/μl的NDM-1基因作为模板，泳道5为空白对照，泳道6为阴性对照1作为模板，泳道7为阴性对照2作为模板)。空白对照、阴性对照1和阴性对照2均不显示LAMP扩增特异带型(连续的梯状条带)，NDM-1基因作为模板反应后的反应液均显示LAMP扩增特异带型(连续的梯状条带)，NDM-1基因的最低检测灵敏度为2.9×10-9ng/μl(6copies/反应)。
进行三次重复实验，结果一致。
实施例4、专用引物的特异性测定
一、序列比对分析
将NDM-1基因在NCBI中进行BLAST比对分析，未发现与其有同源性很高的序列。
其中同源性较高的序列(gb|CP000157.1，HTCC2594，全基因组长度为3052398bp，部分序列见序列表的序列9，编码序列表的序列10所示的蛋白)与NDM-1基因序列的BLAST比对(Query Coverage 72％，Max ident 67％)见图6。
二、特异性测定
分别将如下材料作为模板进行进行LAMP(环介导恒温扩增)，LAMP反应体系见表3：序列表的序列11所示的NDM-1基因(浓度为2.9ng/μl)、大肠杆菌DH5α的基因组DNA(浓度为52.4ng/μl)、金黄色葡萄球菌ATCC25923的基因组DNA(浓度为20.6ng/μl)、肺炎克雷伯氏菌EL-2株的基因组DNA(浓度为82.8ng/μl)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6的基因组DNA(浓度为0.8ng/μl)、肠道菌群元基因组DNA(浓度为46.6ng/μl)、土壤菌群元基因组DNA(浓度为4.1ng/μl)。以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
将表3中除模板以外的试剂混匀备用；将模板在96℃预变性3min；然后将模板与混匀好的其它试剂混合，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：65℃1小时，80℃5分钟，4℃保存。
反应结束后取反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果见图7(1：NDM-1基因；2：大肠埃希氏菌的基因组DNA；3：肠道菌群元基因组DNA；4：土壤菌群元基因组DNA；5：肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA；6：金黄色葡萄球菌的基因组DNA；7：肺炎链球菌的基因组DNA；8：空白对照；M：DL 2000Marker)。结果表明，只有NDM-1基因作模板电泳显示连续梯状条带，为阳性结果，其它模板均显示阴性结果。
进行三次重复实验，结果一致。
对比例、
合成序列表的序列11所示的NDM-1基因，进行梯度稀释后作为模板。取(2.9×10-1ng/μl到2.9×10-9ng/μl)9个不同梯度的模板。
上游引物：5’-TGGACCGATGACCAGACCG-3’；
下游引物：5’-GATCAGGCAGCCACCAAAA-3’。
PCR反应体系：10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、2.5mM dNTPs 2μl、5U/μl TaKaRa EX HS酶0.125μl、10×buffer 2.5μl、模板2μl、双蒸水定容至25μl体系。以2μL双蒸水作为模板的空白对照。
PCR反应条件：预变性94℃5min、循环94℃1min、58℃1min、72℃1min30s、30个循环后、72℃延伸10min。
结果见图8(泳道1为浓度为2.9×10-1ng/μl的模板，泳道2为浓度为2.9×10-2ng/μl的模板，泳道3为浓度为2.9×10-3ng/μl的模板，泳道4为浓度为2.9×10-4ng/μl的模板，泳道5为浓度为2.9×10-5ng/μl的模板，泳道6为浓度为2.9×10-6ng/μl的模板，泳道7为浓度为2.9×10-7ng/μl的模板，泳道8为浓度为2.9×10-8ng/μl的模板，泳道9为浓度为2.9×10-9ng/μl的模板，泳道10为阴性对照)。靶序列为353bp。PCR方法的检测灵敏度为2.9×10-6(6×103copies/反应)，比实施例3的方法低三个数量级。
Claims (3)
1.辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA、序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成；
所述NDM-1蛋白是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.一种辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物；
所述NDM-1蛋白是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.权利要求1所述专用引物在制备辅助检测NDM-1蛋白的编码基因的试剂盒中的应用；
所述NDM-1蛋白是由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
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