CN103695559B - 检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法 - Google Patents

检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法。该方法包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析；根据高分辨率熔解曲线的比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的一致，待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与突变型标准菌株的一致，待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株。

Description

检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法
技术领域
本发明涉及一种检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法。
背景技术
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)又称空肠弯曲杆菌，是引起人急性胃肠炎的最重要的食源性致病菌之一，临床上95%以上的弯曲菌性肠炎都是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起。空肠弯曲菌可通过食物链传播给人，污染的禽肉、牛奶和饮用水都是主要的传播途径。喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲菌引起的肠炎中使用最普遍的药，同时也是临床上针对弯曲菌感染的一线治疗药物。耐药空肠弯曲菌的出现导致临床上空肠弯曲菌病病程迁延不愈和治疗失败，极大的威胁人类健康，同时耐药菌株也导致治疗成本增加等问题，造成巨大的经济损失。空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药性是由其DNA促旋酶A亚基的编码基因（gyrA基因）上的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的点突变所引起。gyrA的野生型基因如序列表的序列3所示，其读码框（编码序列）为序列3第287至2878位核苷酸所示（2592个核苷酸）。gyrA基因读码框（编码序列）第257位（序列3的第543位）核苷酸由C突变为T（因此又称C257T突变），造成其编码的蛋白质的第86位氨基酸残基由苏氨酸（由aca编码）突变为异亮氨酸（由ata编码），引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素表现出高水平耐药（最小抑菌浓度均≥64mg/μL）。因此，gyrA基因读码框的第257位核苷酸被称为257突变位点，又被称为喹诺酮类抗生素耐药突变位点。为了确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素，有必要建立一种快速准确的分子生物学检测方法。
目前用于检测空肠弯曲菌耐药的方法主要有传统的药物敏感性试验法和基因型突变检测法。传统的基因型突变检测法主要有聚合酶链式反应-线性探针法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法、错配扩增突变聚合酶链反应法及荧光定量聚合酶链式反应法等方法，上述几种以聚合酶链式反应为基础的基因型突变检测方法成本较高，不适宜对大量样品进行检测，而且仅是定性试验，无法进行点突变基因突变方向判定的定性试验。传统的药物敏感性试验需要进行空肠弯曲菌培养，要求较高的培养条件，需要花费大量的时间，不满足急性传染病紧急疫情防治工作的需要。
高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴技术。高分辨率熔解曲线技术基于有序列变化的基因片段之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快捷、准确率高、可进行批量检测的检测引起高水平耐受喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌点突变的方法。
本发明所提供的检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法，是一种快速检测由于核苷酸点突变引起对喹诺酮类抗生素耐药的空肠弯曲杆菌gryA突变位点的分子生物学方法，具体是辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；
所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同；
所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物满足如下条件：扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR扩增采用的扩增引物是PgyrA131，PgyrA131由上游引物和下游引物组成，所述上游引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述下游引物是SEQ ID No.2所示的单链DNA。
在本发明的一个具体实施例方式中，所述野生型标准菌株为空肠弯曲菌NCTC11168株（标准株，获自NCTC，编号为11168）。所述突变型标准菌株为空肠弯曲杆菌ZP11。
上述方法中，所述高分辨率熔解曲线分析中，每20微升PCR反应体系中含有10微升PCR扩增缓冲液，2.0mM镁离子缓冲液，0.4μM所述上游引物，0.4μM所述下游引物，所述模板100pg，其余为水；所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液和水均来自LightCycler 480 High Resolution Melting Master。
所述LightCycler 480 High Resolution Melting Master为罗氏（Roche）试剂，货号为04909631001。
上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为60℃退火30s。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序如下：先95℃预变性10min；然后进行如下30个循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s。
在本发明的一个具体实施方式中，所述高分辨率熔解曲线分析采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统（该系统包括罗氏480荧光定量PCR仪器和罗氏的基因扫描程序模块）。
上述方法中涉及的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的引物PgyrA131也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了可利用高分辨率熔解曲线分析技术辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的成套产品。
本发明所提供的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的成套产品，包括扩增引物、LightCycler480High Resolution Melting Master和罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统；所述扩增引物满足如下条件：扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位。
上述成套产品中，所述扩增引物具体可为上述PgyrA131。
本发明的方法能快速、大批量（如采用384孔PCR反应板，可以同时检查一百多个待测空肠弯曲菌）确定待检空肠弯曲菌是否耐受喹诺酮类抗生素，从而简化了以药敏试验为代表的传统检测方法的复杂程序，具有良好的特异性和灵敏度，比其他检测方法操作简便、准确快速，而且PCR产物无需开管二次处理，也不需要凝胶电泳检测目的条带。非常适合临床大批量快速筛查高水平耐药菌，继而提供准确的用药指导。
附图说明
图1为五个镁离子浓度PCR反应体系的高分辨率熔解曲线-标化平移曲线。
1为1.5mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线，2为2.0mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线，3为2.5mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线，4为3.0mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线，5为3.5mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的野生型标准菌株为空肠弯曲菌NCTC11168株（NationalCollection of Type Cultures（简称NCTC）菌种，编号为11168）。
下述实施例中所用的突变型标准菌株为空肠弯曲杆菌ZP11（Xia Chen,Gao-WaNaren,Congming Wu,Yang Wang,Lei Dai,Li-Ning Xia,Peng-jie Luo,QingjingZhang,Jian-Zhong Shen.Prevalence and antimicrobial resistance ofCampylobacter isolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139；陈霞.山东省肉鸡源耐药弯曲菌流行病学调查及其对喹诺酮和氨基糖苷类耐药机制研究.[博士学位论文].北京.中国农业大学.2011）公众可从中国农业大学获得，该菌株只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的待测空肠弯曲菌：喹诺酮类药物敏感（不耐药）的空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560（American type culture collection（简称ATCC）菌种，编号为33560）、耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121、空肠弯曲杆菌ZP74（参考文献：Xia Chen,Gao-Wa Naren,Congming Wu,Yang Wang,LeiDai,Li-Ning Xia,Peng-jie Luo,Qingjing Zhang,Jian-Zhong Shen.Prevalenceand antimicrobial resistance of Campylobacter isolates in broilers from China.Vet Microbiol.2010.144:133-139；陈霞.山东省肉鸡源耐药弯曲菌流行病学调查及其对喹诺酮和氨基糖苷类耐药机制研究.[博士学位论文].北京.中国农业大学.2011）公众可从中国农业大学获得，这些菌株只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、利用高分辨率熔解曲线分析辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T
本实施例中采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统（该系统包括罗氏480荧光定量PCR仪器和罗氏的基因扫描程序（Gene Scanning）模块）进行高分辨率熔解曲线分析建立辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法。具体如下：
1、高分辨率熔解曲线分析中PCR扩增引物的设计
通过对空肠弯曲菌NCTC11168株、空肠弯曲杆菌ZP11、空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560、耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74的gyrA基因进行比对，设计扩增包含gyrA基因读码框的第257位核苷酸在内的多对引物，对每一对引物进行验证，结果得到特异PCR引物PgyrA131，PgyrA131由如下上游引物和下游引物组成：
上游引物：5’CCCGTATAGTGGGTGCTGTT3’（SEQ ID No.1）；
下游引物：5’TCCAAAGTTGCCTTGTCCTG3’（SEQ ID No.2）。
实验验证结果表明，PgyrA131对空肠弯曲菌NCTC11168株、空肠弯曲杆菌ZP11、空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560、耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74的基因组DNA进行PCR扩增得到的目的片段长度均为131bp。PgyrA131对空肠弯曲菌NCTC11168株和空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560的基因组DNA进行PCR扩增得到的目的片段的序列均为SEQ ID No.3的第495-625位。PgyrA131对空肠弯曲杆菌ZP11、耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74的基因组DNA进行PCR扩增得到的目的片段的序列均为gyrA基因的第495-625位核苷酸，除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同。说明PgyrA131对空肠弯曲杆菌具有特异性。
2、野生型标准菌株和突变型标准菌株的确立
以空肠弯曲菌NCTC11168株为野生型标准菌株，以空肠弯曲杆菌ZP11为突变型标准菌株。
空肠弯曲菌NCTC11168株为喹诺酮类抗生素敏感空肠弯曲菌，为标准阴性未突变菌株。空肠弯曲菌NCTC11168株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495-625位相同。
空肠弯曲杆菌ZP11为耐喹诺酮类抗生素菌株。空肠弯曲杆菌ZP11的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同。
3、PCR反应体系中镁离子浓度的优化
1）设置5个PCR反应体系，分别为1.5mM镁离子PCR反应体系、2.0mM镁离子PCR反应体系、2.5mM镁离子PCR反应体系、3.0mM镁离子PCR反应体系和3.5mM镁离子PCR反应体系。每20微升PCR反应体系中含有10微升PCR扩增缓冲液，镁离子缓冲液，PgyrA131上游引物各0.4μM，模板100pg，其余为水。1.5mM镁离子PCR反应体系中的镁离子缓冲液为1.5mM镁离子缓冲液，2.0mM镁离子PCR反应体系中的镁离子缓冲液为2.0mM镁离子缓冲液，2.5mM镁离子PCR反应体系中的镁离子缓冲液为2.5mM镁离子缓冲液，3.0mM镁离子PCR反应体系中的镁离子缓冲液为3.0mM镁离子缓冲液，3.5mM镁离子PCR反应体系中的镁离子缓冲液为3.5mM镁离子缓冲液。
各个PCR反应体系中的所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液和水均来自罗氏（Roche）的LightCycler 480 High Resolution Melting Master（货号为04909631001）。所述PCR扩增缓冲液包含新型饱和DNA染料（Resolight）。
空肠弯曲杆菌ZP11和空肠弯曲菌NCTC11168株均分别设置上述1.5mM镁离子PCR反应体系、2.0mM镁离子PCR反应体系、2.5mM镁离子PCR反应体系、3.0mM镁离子PCR反应体系和3.5mM镁离子PCR反应体系，每个菌株的每个反应体系重复3次（即一张PCR反应板上每个菌株的每个反应体系点3个孔，每孔20微升）。其中，空肠弯曲菌NCTC11168的每个反应体系中的模板均为空肠弯曲菌NCTC11168株的基因组DNA，空肠弯曲杆菌ZP11的每个反应体系中的模板均为空肠弯曲杆菌ZP11的基因组DNA。空肠弯曲菌的基因组DNA均按照TIANamp Bacteria DNA Kit方法制备。
2）PCR反应温度条件
上述1）的各个PCR反应体系均采用如下PCR反应温度程序进行PCR扩增：先95℃预变性10min；然后进行如下30个循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s。
3）升温采集荧光信号
PCR结束后，上述1）的各个PCR反应体系均进行如下操作：仪器在1min以内升温到95℃，之后在1min以内冷却至40℃。从40℃开始以0.02℃/s升温速率升温到95℃，每度采集25次荧光信号。然后进入基因扫描软件模块分析结果，通过标阴、信号归一化处理、温度坐标平移和差异化作图四个步骤，得到结果图像。
以空肠弯曲菌NCTC11168株为野生型标准菌株，以空肠弯曲杆菌ZP11为突变型标准菌株在1.5mM镁离子PCR反应体系、2.0mM镁离子PCR反应体系、2.5mM镁离子PCR反应体系、3.0mM镁离子PCR反应体系和3.5mM镁离子PCR反应体系这5个PCR体系下进行上述高分辨率熔解曲线分析的结果如图1所示，表明2.0mM镁离子PCR反应体系的高分辨率熔解曲线（图1中标号为2的那组曲线）显示为两条曲线，左侧的为突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线，右侧的为野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线，突变组和野生组三次重复平行实验得到的曲线重合度高，且突变与野生两种类型的区分度最好，适合用来作为判定待测临床菌株为野生型还是突变型的标准，说明2.0mM镁离子PCR反应体系满足特异性和灵敏性和重复性的要求。
4、本发明的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法
根据上述实验结果，采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统（该系统包括罗氏480荧光定量PCR仪器、96孔PCR反应板和384孔PCR反应板和罗氏的基因扫描程序（Gene Scanning）模块）进行高分辨率熔解曲线分析建立了如下辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:
以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌NCTC11168株作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲杆菌ZP11作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；
所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同；
所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物是PgyrA131，PgyrA131由上游引物和下游引物组成，所述上游引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述下游引物是SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM；
所述高分辨率熔解曲线分析中，各个菌株的PCR反应体系中，每20微升PCR反应体系中含有10微升PCR扩增缓冲液，2.0mM镁离子缓冲液，PgyrA131上游引物各0.4μM，模板100pg，其余为水；野生型标准菌株的PCR反应体系中的模板为野生型标准菌株的基因组DNA，突变型标准菌株的PCR反应体系中的模板为突变型标准菌株的基因组DNA，待测空肠弯曲菌的PCR反应体系中的模板为待测空肠弯曲菌的基因组DNA；
各个菌株的PCR反应体系中的所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液和水均来自罗氏（Roche）的LightCycler 480 High Resolution Melting Master（货号为04909631001）。所述PCR扩增缓冲液包含新型饱和DNA染料（Resolight）；各个菌株的PCR反应体系重复3次（即一张PCR反应板上每个菌株的每个反应体系点3个孔，每孔20微升）。
各个菌株的PCR反应体系均采用如下PCR反应温度程序进行PCR扩增：先95℃预变性10min；然后进行如下30个循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s；
PCR结束后，上述各个菌株的PCR反应体系均进行如下操作：仪器在1min以内升温到95℃，之后在1min以内冷却至40℃。从40℃开始以0.02℃/s升温速率升温到95℃，每度采集25次荧光信号。然后进入基因扫描软件模块分析结果，通过标阴、信号归一化处理、温度坐标平移和差异化作图四个步骤，得到结果图像-各个菌株的高分辨率熔解曲线，将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株。
按照该步骤的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，分别以空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560、耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74这8个菌株中的每个菌株作为待测空肠弯曲菌，检测该8个待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T。结果表明，空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株；耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74这7个菌株的高分辨率熔解曲线均与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述耐喹诺酮类抗生素的空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74这7个菌株均候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株。
测序结果表明，空肠弯曲杆菌标准质控菌株ATCC33560的gyrA基因编码序列的第257位是C，空肠弯曲杆菌HT8、空肠弯曲杆菌LY10、空肠弯曲杆菌LY17、空肠弯曲杆菌SX4、空肠弯曲杆菌PL66S、空肠弯曲杆菌LY121和空肠弯曲杆菌ZP74的gyrA基因编码序列的第257位均是T。说明本发明辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法准确可靠。

Claims (7)

1.非疾病诊断和治疗的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:
以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；
所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495-625位相同；
所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物对满足如下条件：扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM；
所述PCR扩增采用的扩增引物对是PgyrA131，PgyrA131由上游引物和下游引物组成，所述上游引物是SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述下游引物是SEQ ID No.2所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高分辨率熔解曲线分析中，每20微升PCR反应体系中含有10微升PCR扩增缓冲液，2.0mM镁离子缓冲液，0.4μM所述上游引物，0.4μM所述下游引物，所述模板100pg，其余为水；所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液和水均来自LightCycler 480High Resolution Melting Master。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物退火条件为60℃退火30s。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序如下：先95℃预变性10min；然后进行如下30个循环：95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述高分辨率熔解曲线分析采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统。
6.辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的引物对PgyrA131，是由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的一个引物对。
7.辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的成套产品，包括扩增引物对、LightCycler 480High Resolution Melting Master和罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统；所述扩增引物对满足如下条件：扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述扩增引物对为权利要求6所述的PgyrA131。
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