CN103333903A - 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明通过对幽门螺杆菌基因测序和对比，提供了用于检测幽门螺杆菌的遗传标记的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示。本发明还提供了对幽门螺杆菌进行定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测幽门螺杆菌的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行幽门螺杆菌检测的方法和试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP），能够引起慢性胃炎、胃溃疡等消化道相关疾病，是WHO癌症协会规定的细菌中唯一的I类致癌因子。全世界有超过半数的人感染HP，而在我国的感染率为59%。HP的感染给患者造成极大的痛苦，加重医疗负担。由于HP的分离培养技术十分复杂，不宜在实际检测中推广。目前主要用于HP的诊断有¹³C（或¹⁴C）尿素呼气法、快速尿素酶法和血清法。其中¹³C（或¹⁴C）尿素呼气法受到了广泛的应用，但其存在一定的假阳性，因为其他分解尿素的细菌也呈阳性反应。快速尿素酶法的缺点也是存在假阳性。血清学检测的缺点是不能反应患者当时感染的状态。

荧光PCR作为一种新的检测方法，其在病原微生物检测中得到了广泛的应用。国外最早有人将这种方法运用在HP的检测中，主要靶基因为尿素酶A（ureA）和HP的cag毒力岛A（cagA）。然而，这两种检测方法都未能应用到实际中，原因是这两个基因在不同的HP菌株间保守性不够强，或者由于保守序列太短而不能得到灵敏度高的引物和探针。另一个最主要的问题是HP菌株相互之间存在地域性差异，因此依据国外的菌株所设计出的引物和探针不能应用到我国HP感染的检测中。目前，NCBI数据库中，尚缺乏大量的中国来源HP菌株的序列，因此不能通过对比找到适合中国菌株的特异保守的序列。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测幽门螺杆菌的特异性靶序列；本发明还在于提供上述靶序列的用途，以提高对中国流行的幽门螺杆菌的检测能力。

为实现上述目的，通过对本实验室收集的来自中国不同地区（分别为北京、陕西、浙江和云南）的74株HP菌株的cag毒力岛的全长（约40kb）进行了测序，通过vector6软件对比，找到了cag毒力岛第六段基因，即位于cagH的一段完全保守序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶序列是检测幽门螺杆菌的遗传标记物。根据报道中国HP菌株99%以上含有cag毒力岛。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测幽门螺杆菌的遗传标记物。

本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。可以使用诸如Primer Express Version3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物适用于国内幽门螺杆菌扩增检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

HPcagH-FP:5’-TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’，

HPcagH-RP:5’-CGCTTC TCA AATGATACTTAATCAATC-3’。

探针序列为：

(FAM)5’-AGGTGCTAGTAGCTAATC-3’(BHQ1)。

本发明提供一种幽门螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立物模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于38的标本为阳性结果；

Ct值大于40的标本为阴性性结果；

Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：

本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，55～65℃退火30s，45个循环。

本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。

本发明每次检测标本时必须设立NTC对照（无模板对照）和POS对照（阳性对照），两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：NTC（－）和POS（+）

无效扩增：NTC（+）和POS（+）提示体系污染

无效扩增：NTC（－）和POS（－）提示体系错误或者试剂失效。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。

在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于38的标本为阳性结果；

Ct值大于40的标本为阴性结果；

Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明提供了一种用于幽门螺杆菌检测的试剂盒，其包括上述遗传标记物或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。

本发明试剂盒的引物序列为：

HPcagH-FP:5’-TTA TGT TAG AAA TCG CTT GAG TGT CA-3’，

HPcagH-RP:5’-CGC TTC TCA AAT GAT ACT TAA TCA ATC-3’。

探针序列为：FAM-AGG TGC TAG TAG CTA ATC-BHQ1。

本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为4.05fg/μl～40.5ng/μl的幽门螺杆菌基因组DNA。例如浓度为8.1ng/μL的幽门螺杆菌基因组DNA。

目前，国内市场上虽然有HP检测的商品化试剂盒，但主要为血清抗体检测，临床用于HP现症感染检测的主要还是¹³C/¹⁴C尿素呼气试验，目前在国内外作为幽门螺杆菌检测的金标准方法；另外一个金标准是HP的分离培养（其培养阳性可作为阳性金标准）。所以本发明在实施例中与这两种方法分别进行了灵敏度和特异性的比较。本发明试剂盒检测灵敏度高于HP分离培养的方法，与¹³C尿素呼气试验无显著性差异；特异性与HP分离培养的方法无显著性差异，高于¹³C尿素呼气试验；其检测通量高于目前所用的两种方法。

本发明提供了用于检测幽门螺杆菌的cagH基因保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物和探针，具有较强的特异性，利用该引物和探针进行幽门螺杆菌的荧光定量PCR检测方法进一步简化幽门螺杆菌的检测的程序，提高检测通量，可用于检测国内分离的幽门螺杆菌，并可作为检测临床标本的手段，提高幽门螺杆菌感染诊断的水平。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地诊断幽门螺杆菌的感染情况。

附图说明

图1为荧光定量PCR检测体系优化结果，图1a为不同镁离子浓度体系优化检测结果，其中1～8分别代表镁离子浓度为2.0mM、1.5mM、2.5mM、3.0mM、1.0mM、3.5mM、0.5mM、4.0mM；图1b为不同退火温度体系优化检测结果，其中1～8分别代表温度为58.2℃、56.6℃、55.5℃、55.0℃、60.1℃、61.7℃、62.6℃、63.0℃。

图2为HPcagH体系标准曲线图，其中横坐标为阳性模板浓度的对数值，纵坐标为HPcagH体系检测不同浓度阳性模板的Ct值，R²＝0.999。

图3为HPcagH体系real-time PCR的特异度检测，除阳性模板对照外，其余非幽门螺杆菌模板均无扩增。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1幽门螺杆菌cag毒力岛靶基因的确定与引物、探针的设计

74株中国不同地区来源的幽门螺杆菌cag毒力岛靶基因的确定。

幽门螺杆菌的cag毒力岛大小约为40Kb，根据基因结构划分为若干小片段，进行测序，然后拼接，并用vector6进行比对。

扩增产物由华大基因公司（BGI）测序及序列拼接，将拼接并经人工校对后的74条cag毒力岛基因序列Vector NTI Suite6软件序列比对，寻找出保守区域。Cag毒力岛是幽门螺杆菌本身特有的功能性基因序列，通过对74株国内幽门螺杆菌cag毒力岛基因序列比对，找到了cag毒力岛第六段基因，即位于cagH的一段完全保守序列，发现了核苷酸完全保守区域，作为检测幽门螺杆菌的靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

使用Primer Express Version3软件在保守序列区域设计探针及引物:引物序列为：

HPcagH-FP:5’-TTA TGT TAG AAA TCG CTT GAG TGT CA-3’，

HPcagH-RP:5’-CGC TTC TCA AAT GAT ACT TAA TCA ATC-3’。

探针序列为：FAM-AGG TGC TAG TAG CTA ATC-BHQ1。

虽然引物和探针与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补（尤其是引物的5’端）的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的靶序列或其片段。

实施例2实时荧光定量PCR实验参数的优化

（1）体系镁离子浓度优化：将体系中MgCl₂从0.5mM依次递增为4mM，每次增幅0.5mM，每个浓度梯度做3个平行样。结果MgCl₂终浓度为2mM时体系扩增效果最好（图1a）。

（2）体系退火温度优化：体系退火温度从55℃-63℃改变，结果显示58℃左右体系扩增效果最好（图1b）。

（3）HPcagH实时荧光定量PCR扩增体系及扩增条件的优化

扩增条件：

实施例3体系标准曲线的制作

以标准浓度模板的log值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制HPcagH体系的real-time PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在40.5fg-40.5ng这个范围内时，其的对数值与Ct值具有非常好的相关性（R²=0.999）。见图2。

实施例4HPcagH荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

灵敏度，又称真阳性率，即实际上是幽门螺杆菌并按照该检测方法的标准被正确地判为幽门螺杆菌的百分比。用优化了的幽门螺杆菌HPcagH检测体系的real-time PCR检测体系检测1株ATCC标准株和实验室保存的300株幽门螺杆菌临床分离株DNA。结果，除NTC对照外，所有301株幽门螺杆菌HPcagH体系检测结果呈阳性。

2.特异度评价

特异度，又称真阴性率，即实际上不是幽门螺杆菌而按照该检测方法的标准被正确地判为幽门螺杆菌的百分比。用优化了的real-time PCR检测28中胃粘膜除HP外可能出现的细菌、15种肠道致病菌及人类染色体(表1)，以幽门螺杆菌为阳性对照。结果除阳性对照外，其余44种非幽门螺杆菌模板均为阴性（图3）。

表1用于检测HPcagH荧光PCR体系特异性模板

ATCC,美国模式培养物集存库

3.检测下限的评价

检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。

以幽门螺杆菌标准菌株ATCC26695模板系列浓度梯度40.5ng/ul～4.05fg/ul为模板，每个浓度梯度取2μl检测，使用阳性模板量对应为40.5ng～4.05fg。按照优化的反应体系和反应条件进行real-time PCR，每个浓度梯度做3个平行样。

当体系标准模板量为40.5ng～40.5fg时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，模板浓度为4.05fg时，此浓度梯度的3个平行样只有1个样本出现扩增。所以，幽门螺杆菌cagH体系real-time PCR检测体系的检测下限为40.5fg，约15CFU。

实施例5HP cagH real-time PCR方法与HP分离培养方法对临床标本的实际应用评价比较

HP分离培养是诊断HP感染的金标准，灵敏度虽稍低，但是其特异性非常高。用本发明建立的方法和HP分离培养的方法分别检测来自全国各地十三家三甲医院的胃黏膜标本1791份（¹³C尿素呼气试验阳性），以及300份¹³C尿素呼气试验阴性标本。检测结果见表2。

HPcagH体系对¹³C尿素呼气试验阳性临床标本检测率为84.81%，高于HP分离培养的62.37%，经统计学计算存在显著性差异(P＜0.05,卡方检验)，说明HPcagH体系对于阳性标本的检测优于HP分离培养。所有HP分离培养阳性的标本，HPcagH体系检测均为阳性。HPcagH体系与HP分离培养方法对于阴性标本检测率均为100%和100%，两者无统计学差异。

表2使用HPcagH体系和HP分离培养方法对¹³C尿素呼气试验阳性临床标本检测结果

实施例6HPcagH检测体系与¹³C尿素呼气试验的对比

由于HPcagH检测临床标本为粘膜标本，长途运送和冷冻保存状态对试验结果有不可忽视的影响。因此，为了真实的对比两种试验方法，本实施例中选择253份¹³C尿素呼气试验阳性的胃黏膜标本，不经运送直接提取DNA进行HPcagH检测。同样方法，选择100例¹³C尿素呼气试验阴性的标本进行对比。

结果显示，¹³C尿素呼气试验阳性组，HPcagH体系阳性率为99%，与¹³C尿素呼气试验相比无统计学差异（P＞0.05）；¹³C尿素呼气试验阴性组，HPcagH体系阳性率为100%，两种方法无统计学差异（P＞0.05）。结果见表3。

表3使用HPcagH体系和¹³C尿素呼气试验对临床标本检测结果

通过对HPcagH和¹³C尿素呼气试验的对比，两种方法对临床标本的检测无显著性差异。而HPcagH方法为检测胃黏膜中的HP染色体DNA，所以极大的保证了其特异性。

Claims (10)

1.一种用于检测幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的遗传标记物，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。

2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其核苷酸序列为：

HPcagH-FP:5’-TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’，

HPcagH-RP:5’-CGCTTC TCA AATGATACTTAATCAATC-3’。

4.与权利要求2或3所述引物配合使用的荧光探针。

5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为：

(FAM)5’-AGGTGCTAGTAGCTAATC-3’(BHQ1)。

6.一种幽门螺杆菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以权利要求1所述的遗传标记物为靶序列，利用权利要求书2或3所述的引物和权利要求4或5所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。

7.如权利要求6所述的幽门螺杆菌的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。

9.含有权利要求2或3所述引物和/或权利要求4或5所述探针的试剂盒。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其还包括：荧光定量反应液、阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为4.05fg/μl～40.5ng/μl的幽门螺杆菌基因组DNA。

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