CN102373302B - 羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP等温扩增技术快速检测羊痘病毒属病毒用引物、试剂盒及检测方法。该试剂盒根据靶序列上6个区域设计4条引物，2条外引物和2条内引物，还包括2×LAMPbuffer缓冲液、BstDNA聚合酶管、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。利用本试剂盒在63℃左右的温度下经15～45min的反应后，便可以根据肉眼观察反应结果判断是否含有羊痘病毒属病毒。本发明可以在等温条件下快速、高效、特异性地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

Description

羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种羊痘病毒属病毒等温扩散技术快速检测用引物、试剂及其检测方法。

背景技术

羊痘病毒属病毒（Capripoxvirus,CPV）主要包括山羊痘病毒（Goatpox Virus,GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox Virus,SPPV）和牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy Skin Disease Virus,LSDV）三种，能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病。绵羊痘和山羊痘，被我国列为一类传染病，对畜牧业养殖影响重大。据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10%～58%或 75%～100%不等。羔羊致死率可达 100%，妊娠母羊极易流产。同时，因自由贸易受到限制造成了国家税收的下降，致使此病也成为了重要的经济疾病。该病呈世界性分布，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江、甘肃等地也有发生。牛疙瘩皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病，又称牛结节性皮炎或块状皮肤病，是以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病，感染率为5%～85%，病死率为10%；我国目前尚无牛疙瘩皮肤病病毒流行的报导，国内也无检测该病的相关研究，然而本病在公共卫生方面具有一定的意义，印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道。在印度，管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹，继而出现水疱并结痂，但未见有全身性的扩散。张瑞阳等（2003）首次报道了我国人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面颊等部位出现丘疹。携带有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，对于食品安全存在潜在的隐患，因此本发明的试剂盒和检测方法在动物商品及其食品的出入境的快速检验检疫中具有重大的意义。

痘病毒（Capripoxvirus,CPV）在分类上属于痘病毒科（poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒属（Capripoxvirus）。羊痘病毒为砖形病毒，在细胞浆内复制，其基因组为双链 DNA。其大小约为 290nm×270nm，属于较小的痘病毒，病毒粒子由1 个核心、2个侧体和2 层脂质外膜组成，羊痘病毒的衣壳为对称型，有囊膜，囊膜内含有病毒特异性蛋白。 该病毒对干燥有较强的抵抗力，在干燥的痂皮内可存活 3-6 个月，在干燥羊舍内可存活 6-8个月。反复冻融对其没有明显的灭活作用。对直射阳光、常用消毒药（酒精、碘酒等）以及乙醚或氯仿较敏感。放线菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒复制。 

山羊痘、绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。本病毒对上皮细胞有特殊亲和力，因此无论通过哪种途径进入机体的病毒，最终都经血液达到皮肤和粘膜，在上皮细胞内增殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。山羊和绵羊均为易感动物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而感染，也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破溃后可从鼻、口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。被病羊污染的用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物、皮毛和体外寄生虫（如羊虱）都可以成为传播媒介。该病以春秋两季多发，主要在冬季春初流行，常呈地方性或广泛流行。气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。

环介导等温扩增基因技术（loop-mediated isothermal amplication ,简称LAMP）（国际专利公开号 WO 00/28082）是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。

中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用等温扩增基因技术检测羊痘病毒属病毒的试剂盒及检测方法的报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种羊痘病毒等温扩增技术快速检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案： 

一种羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用试剂盒，包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管 管内由以下反应液组成：

序列为SEQ ID NO1的60 mmol/L的羊痘病毒内引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO2的60 mmol/L的羊痘病毒内引物下游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO3的5 mmol/L的羊痘病毒外引物上游1.0 μL；

序列为SEQ ID NO4的5 mmol/L的羊痘病毒外引物下游1.0 μL；

2×LAMP buffer 缓冲液 12.5μL；

5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；

灭菌去离子水 3.7μL；

合计21 μL，为单次反应的用量。

所述阳性对照管，管内为羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL。

所述阴性对照管，管内为无羊痘病毒感染的健康牛上皮组织基因组DNA，体积为20μL。

所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

一种羊痘病毒属等温扩增技术快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1μL钙黄绿素显色剂；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

若上述步骤中不加入钙黄绿素显色剂时，其结果判定为：通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显白色浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

本发明的原理是：针对一段200bp左右的靶序列上6个区域设计4条引物（2条外引物和2条内引物），利用核酸分子在63℃左右的温度下处于自然松散状态，采用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下对目的基因进行高效扩增，经15～45min的反应，模板扩增效率能达到10⁹～10¹⁰倍。由于该反应不需要高温节链、退火等步骤，因此不需要昂贵的PCR仪。在反应的Buffer反应液里加入一种特殊的发光剂钙黄绿素显色剂，钙黄绿素显色剂本身是一种发绿光的荧光，在本反应中采用的钙黄绿素显色剂是被锰离子整合处理过的，不能发绿色荧光，一旦LAMP反应发生，产生的大量焦磷酸根离子可竞争性地结合锰离子，释放出钙黄绿素显色剂，导致反应呈绿色，通过绿色荧光的产生也能判定反应结果。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR 固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

LAMP是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。现有的羊痘病毒检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。

本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备；（2）、高特异性：应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.5%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；（4）、灵敏度高：扩增模板仅需10拷贝或更少，最低检测极限达到1 个TCID₅₀；标本的检出率达到98.9%；（5）、鉴定简便：通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物----焦磷酸镁乳白沉淀，与荧光染料结合，阳性结果显示为绿色，阴性结果为橙色，结果明显可靠，可通过肉眼观察鉴定；（6）、用途广：可广泛用于山羊、绵羊、牛的中羊痘病毒的安全快速检测。

附图说明

图1阴阳性结果图；

图2特异性试验肉眼观察结果；

图3灵敏度试验电泳结果;

图1中：A-白光下肉眼观察，B-波长312nm的紫外光下观察；

图2中：1-牛疙瘩皮肤病毒株Neethling vaccine LW 1959，2-牛疙瘩皮肤病毒株Neethling 2490，3-山羊痘病毒，4-绵羊痘病毒，5-牛布氏杆菌核酸，6-羊流产衣原体，7-肺炎衣原体，8-牛传染性胸膜肺炎放线杆菌，9-牛基因组，10-羊基因组，11-绿脓杆菌，12-大肠杆菌，13-沙门氏菌，14-志贺氏菌，15-金黄色葡萄球菌，16-阴性对照。

具体实施方式

实施例1，引物的设计及筛选

羊痘病毒属病毒等温扩增引物组，其设计是根据GenBank公布的山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛疙瘩皮肤病病毒的参考序列，用Clustal W 进行多重比对，分析序列的保守区（119272bp - 120322bp，1051bp）。采用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0，设计24套LAMP引物，由宝生物（大连）有限公司合成，利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应进程中的浊度进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组LAMP引物，分别标记为SEQ ID NO1～SEQ ID NO4。其中引物组中内引物上游:SEQ ID NO1；内引物下游:SEQ ID NO2；外引物上游:SEQ ID NO3；外引物下游:SEQ ID NO4的浓度分别为60 mmol/L，60 mmol/L ，5 mmol/L，5 mmol/L；体积比为1:1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO5；PCR下游引物：SEQ ID NO6；它们的体积比为1:1。

SEQ ID NO1代表的序列为：5’—CAAAACACAATAAAGGAACCAC—3’

SEQ ID NO2代表的序列为：5’—AGAGATGGCGGTTGTGAT—3’

SEQ ID NO3代表的序列为:

5’—CCGAACTTGTTATTTCCTGTGCTTATAGTTGAAAGGATGATGAATATGGT—3’

SEQ ID NO4代表的序列为：

5’—TTCCCGTTCATTTTACAAGATGTCTTCATCATCTGAAAAGTTGTTTCG—3’。

SEQ ID NO5代表的序列为：5’—CTACCATTAACTGTATTAGAT—3’

SEQ ID NO6代表的序列为：5’—CAAATACAAGTGAGGCATCCT—3’。

实施例2，阳性对照品的制备

用试剂盒核酸提取阳性羊痘病毒细胞培养物的DNA，电泳提取的核酸，采用PCR上游引物SEQ ID NO5和PCR下游引物 SEQ ID NO6进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和pmd19载体进行连接反应，23℃连接2小时，转化JM109菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。

实施例3，阴性对照品的制备

用试剂盒核酸提取无羊痘病毒感染的牛上皮组织的DNA，电泳提取的核酸，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。

实施例4，羊痘病毒属等温扩增技术快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1μL钙黄绿素显色剂；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

实施例5，步骤与实施例4基本相同，区别在于：在上述步骤2）中将1μL钙黄绿素显色剂换为1μL灭菌去离子水，其结果判定是：通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显白色浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

参见图1和图2的结果显示：图1中A有浑浊的为阳性，用加号标记，未见浑浊的为阴性用减号标记；B是在紫外光下的观察结果，加号标记为阳性，减号标记为阴性。图2中只有1～4号为羊痘病毒属病毒所以有浑浊现象，5～8、11～15为其他不属于羊痘病毒属的病毒因而未见浑浊现象，9和10号为牛羊的基因亦不含有羊痘病毒属病毒，未见浑浊现象，16号为阴性对照。

实施例6，2×LAMP buffer 缓冲液的配制

40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl,Ph8,25℃），20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1% TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L 氯化镁和1.2mmol/L dNTP。各物质的浓度满足上述浓度要求即可构成2×LAMP buffer 缓冲液。

实施例7，试剂盒的组装

将如上所配制的阳性对照、阴性对照、灭菌去离子水各一支、扩增反应液1.5mL/管，2支，钙黄绿素显色剂60μL/管一支放置于试剂盒的支架上，盖好盖子，贴上生产日期及产品标签，低温保存及运输。

<110>  重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>  羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法

<160>  6   

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400> SEQ ID NO1

caaaacacaa taaaggaacc ac                                                22

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO2

agagatggcg gttgtgat                                                     18

<210>  3

<211>  50

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO3

ccgaacttgt tatttcctgt gcttatagtt gaaaggatga tgaatatggt                           50

<210>  4

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO4

ttcccgttca ttttacaaga tgtcttcatc atctgaaaag ttgtttcg                             48

<210>  5

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO5

tccgagctct ttcctgattt ttcttactat                                             30

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  SEQ ID NO6

tatggtacct aaattatata cgtaaataac                                           30

Claims (3)

1.一种羊痘病毒属病毒等温扩增技术快速检测用试剂盒，其特征在于：它包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管 管内由以下反应液组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的60 mmol/L的羊痘病毒内引物上游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的60 mmol/L的羊痘病毒内引物下游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的5 mmol/L的羊痘病毒外引物上游1.0 μL；

DNA序列为SEQ ID NO.4的5 mmol/L的羊痘病毒外引物下游1.0 μL；

2×LAMP缓冲液 12.5μL；

5U/μL Bst DNA 聚合酶 0.8μL；

灭菌去离子水 3.7μL；

合计21 μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20μL；

序列为SEQ ID NO.5的PCR上游引物和序列为SEQ ID NO.6的PCR下游引物，PCR模板为标准阳性羊痘病毒细胞培养物的DNA，按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pmd19载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA;

所述阴性对照管，管内为无羊痘病毒感染的健康牛上皮组织基因组DNA，体积为20μL；

所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL；

所述2×LAMP缓冲液由以下成分组成：

40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1% TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L 氯化镁和1.2mmol/L dNTP。

2.一种羊痘病毒属等温扩增技术非疾病诊断目的的快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1μL钙黄绿素显色剂；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：反应产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。

3.一种羊痘病毒属等温扩增技术非疾病诊断目的的快速检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的病毒DNA提取试剂盒，提取样品中的羊痘病毒DNA，获得待检模板DNA； 

2）扩增反应体系为：21μL扩增反应液，1 μL灭菌去离子水；3μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）羊痘病毒的等温扩增：将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管于62～64℃恒温反应60min，80℃反应10min终止反应；

4）结果判定：通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显白色浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。

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