CN111118215A - 一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明运用分子生物学、生物信息学等方法进行序列比对，筛选出引物组CaPV‑130‑F、CaPV‑130‑R和探针CaPV‑130，并优化了反应体系和反应程序，使试剂盒有良好的特异性和高灵敏度。本发明可为羊痘病毒属病毒诊断提供了一种快速检测方法，为山羊痘病毒属病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

Description

一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物、探针及试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒。
背景技术
山羊痘病毒属是痘病毒科、脊索动物痘病毒亚科的一个属，该属成员包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒，该属病毒为DNA病毒，基因组全长约150kb，编码147个开放阅读框。山羊痘可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率达100％。
山羊痘病毒通过接触痘疹破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播而感染其它山羊，同群间传播迅速。山羊痘病毒对干燥有较高的抵抗力，干燥痂皮内的病毒可以存活3～6个月，在温度达100℃时，仍可存活5min左右。此外，山羊痘病毒对常用消毒剂有较强的抵抗力，但500mL/L酒精和0.1g/L KMnO4可以在1h内将其灭活；对乙醚和氯仿敏感；反复冻融对其没有明显的灭活作用。山羊痘病毒在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，并产生痘斑和结节性病灶。绵羊痘，又名绵羊天花，是由绵羊痘病毒引起的一种接触性传染病，呈世界性流行。它的特征是在全身皮肤、或者粘膜上出现典型的痘疹，病羊发热并有较高的死亡率，大多数绵羊生产国均有流行。牛结节性皮肤病是由牛结节性皮肤病病毒引起的以患牛发热，皮肤黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病。该病又称结节性皮炎或块状皮肤病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致动物死亡。
近年来，国内羊痘病例呈现地区流行，而牛结节性皮肤病在我国尚无流行报道。但2019年8月12日，牛结节性皮肤病传入我国新疆地区，这是我国首次确诊发生该病。经当地畜牧兽医部门排查，在伊犁州察布查尔县、霍城县、伊宁市发现病牛200多头，给我国的奶牛和肉牛养殖造成了严重的经济损失。由于山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒基因组序列差异较小，存在一定的交叉保护性，有研究显示羊痘疫苗可以预防牛结节性皮肤病。
针对羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒基因组同源性高的特征，研发一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR试剂盒非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测山羊痘病毒属病毒的方法。通过分子生物学、生物信息学等方法进行序列比对、引物和探针设计及反应体系优化，组建用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR试剂盒。该试剂盒可为山羊痘病毒属病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
本发明所采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物组，该引物可以扩增一段山羊痘病毒中的保守序列，所述引物组的核苷酸序列为：
CaPV-130-F:5’-TGGAAGCAAGTGGTAACGG-3’；
CaPV-130-R:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTATTTMG-3’。
第二方面，本发明提供一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR探针，所述探针核苷酸序列为：
CaPV-130探针：5’-KTCATCAAAAGGAAACGGATCYCCRA-3’。
根据本发明的实施例，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的猝灭基团为BHQ1。
第三方面，本发明提供一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的引物组和前面所述的探针。
根据本发明的实施例，试剂盒还包括FastFire qPCR PreMix(Probe)，所述FastFire qPCR PreMix(Probe)可从任一生物公司购买。
第四方面，本发明还提供上述引物组和探针在检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR试剂盒中的应用，包括以下步骤：
(1)提取样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，用前面所述引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和前面所述探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线；
(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，确定样本中是否有山羊痘病毒。
根据本发明的实施例，所述步骤(2)中的扩增体系为：
Figure BDA0002369294040000021
Figure BDA0002369294040000031
根据本发明的实施例，所述步骤(2)的扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火延伸15s，共计40个循环。
所述步骤(3)中，结果判定的方法为：待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；Ct值>37或是无Ct值判定为山羊痘病毒属病毒核酸阴性。
本发明的有益效果是：
本发明的检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒，不仅仅用于山羊痘病毒、绵羊痘病毒的检测，还可以应用于牛结节性病病毒的检测。本发明所制备的山羊痘病毒属病毒荧光PCR检测试剂盒，具有特异性强、敏感性高、准确性高、省时省力等优点，可为山羊痘病毒属病毒的诊断提供了一种快速检测方法，为山羊痘病毒属病毒的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。
附图说明
图1是山羊痘病毒属病毒荧光PCR检测试剂盒特异性试验结果；曲线1：山羊痘病毒阳性对照；曲线2：小反刍兽疫病毒、羊口疮病毒、羊败血性链球菌、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒3型。
图2是以山羊痘病毒质粒为阳性对照，以不含羊痘病毒基因片段的质粒为阴性对照，检测从广东地区采集的52份临床样品；曲线1～3分别代表样本1、2、3。
图3是山羊痘病毒属病毒荧光PCR检测试剂盒敏感性试验结果；曲线1-9分别为阳性质粒的101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍倍比稀释结果。
具体实施方式
材料和方法：
羊口疮病毒活疫苗购自山东泰丰生物制品有限公司，山羊痘活疫苗购自重庆澳龙生物制品有限公司，山羊痘与小反刍兽疫二联苗购自国药集团扬州威克生物工程有限公司。山羊痘病毒阳性重组质粒由广东省农业科学院动物卫生研究所制备保存。此外，牛病毒性腹泻阳性毒株、边界病毒毒株、羊副流感病毒3型病毒毒株由江苏省农业科学院兽医研究所毛立博士馈赠。
主要试剂：
荧光试剂盒：包含上述的引物CaPV-130-F、引物CaPV-130-R、CaPV-130探针、FastFire qPCR PreMix(Probe)试剂和双蒸水。
2×FastFire qPCR PreMix(Probe)试剂、双蒸水等购自天根生化科技(北京)有限公司。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1荧光定量PCR引物及探针设计
根据山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒的保守基因序列的差异性，设计了一对荧光定量PCR的引物；本发明经过大量筛选，筛选出一组扩增山羊痘病毒属病毒基因序列灵敏度高和特异性强的引物对CBoV-F和CBoV-R，以及TaqMan探针，其碱基序列如下所示：
CaPV-130-F:TGGAAGCAAGTGGTAACGG(SEQ ID NO:1)；
CaPV-130-R:CTATTCTATCCCATCATTATACGTATTTMG(SEQ ID NO:2)；
CaPV-130探针：FAM-KTCATCAAAAGGAAACGGATCYCCRA-BHQ1(SEQ ID NO:3)。
实施例2
(1)标准样品的制备
为了绘制荧光定量PCR的标准曲线，我们提取了山羊痘病毒的DNA作为PCR模板，用引物将靶序列进行扩增，将扩增产物连入载体中，获得山羊痘病毒的靶序列的载体，即山羊痘病毒的阳性标准品。
(2)阳性标准样品的荧光定量PCR检测
以步骤(1)制备的阳性标准品，用实施例1所述引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和所述探针在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品进行荧光定量PCR扩增，扩增体系为：
Figure BDA0002369294040000041
扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火延伸15s，共计40个循环；
获得扩增曲线。
(3)结果判定：待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；Ct值>37或是无Ct值判定为山羊痘病毒属病毒核酸阴性。
结果分析：如图1所示，曲线1为山羊痘病毒的扩增曲线，曲线呈S型且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性。
实施例3一种检测山羊痘病毒属病毒的荧光定量PCR法
从广东地区采集临床山羊及牛口腔痂皮、口腔拭子等样本52份，检测样品中是否有羊痘病毒，步骤如下：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以实施例2中的山羊痘病毒重组质粒为阳性对照，以不含羊痘病毒基因片段的质粒为阴性对照，用前面所述引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和前面所述探针进行荧光定量PCR，扩增体系为：
Figure BDA0002369294040000051
扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火延伸15s，共计40个循环；
获得扩增曲线。
(3)结果判定：待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；Ct值>37或是无Ct值判定为山羊痘病毒属病毒核酸阴性。
结果分析：如图2所示，阳性对照以及样本1-3出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性，进一步经核酸测序，确定样本1-3为山羊痘病毒。检测结果符合预期，准确率达100％。
对上述荧光定量PCR方法进一步检测特异性和灵敏性。
特异性试验
(1)分别提取羊口疮病毒的DNA和小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒的RNA，并将小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒的RNA反转录成DNA，以实施例2中的山羊痘病毒重组质粒为阳性对照；
(2)以步骤(1)提取的DNA或者反转录的DNA作为模板，用前面所述引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和前面所述探针进行荧光定量PCR，扩增体系为：
Figure BDA0002369294040000052
Figure BDA0002369294040000061
扩增程序为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火延伸15s，共计40个循环；
获得扩增曲线。
(3)结果判定：待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；Ct值>37或是无Ct值判定为山羊痘病毒属病毒核酸阴性。
结果分析：如图1所示，曲线1为山羊痘病毒的扩增曲线，曲线呈S型且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；曲线2为羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒等，曲线2未呈现S曲线并无Ct值，表明本试剂盒具有良好的特异性。
灵敏度试验
采用本发明的引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和本发明的探针CaPV-130，以羊痘病毒阳性重组质粒为模板(浓度为100ng/μL)，进行倍比稀释(分别为101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍倍稀释)，以此测定该方法的灵敏度。
如图3所示，最右侧曲线的结果为最高的稀释倍数109，即优化后的试剂盒灵敏度为1×10-4pg/μL，换算为拷贝为32个拷贝/μL，表明本试剂盒有较高的灵敏度。
对比例
本发明在设计荧光PCR引物时，在羊痘病毒的50多个基因区域开展了引物和探针设计，发现大部分引物不特异、引物易出现二聚体等现象，最终遴选出本发明中的引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和CaPV-130探针。
综上所述，本发明的试剂盒有良好的特异性，不能检出羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、边界病毒、羊副流感病毒等；本发明的试剂盒灵敏度高，可检测浓度为1×10-4pg/μL的样品，即为32个拷贝/μL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学研究院动物卫生研究所
<120> 一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物、探针及试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggaagcaag tggtaacgg 19
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctattctatc ccatcattat acgtatttmg 30
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ktcatcaaaa ggaaacggat cyccra 26

Claims (8)

1.一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
CaPV-130-F：5’-TGGAAGCAAGTGGTAACGG-3’；
CaPV-130-R：5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTATTTMG-3’。
2.一种用于检测山羊痘病毒属病毒的荧光PCR探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：
CaPV-130探针：5’-KTCATCAAAAGGAAACGGATCYCCRA-3’。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的猝灭基团为BHQ1。
4.一种用于检测山羊痘病毒属病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的引物组和权利要求2中所述的探针。
5.一种用于检测山羊痘病毒属病毒试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1所述引物组CaPV-130-F、CaPV-130-R和权利要求2所述探针进行荧光定量PCR，获得扩增曲线；
(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，确定样本中是否有山羊痘病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光PCR的反应体系为：
Figure FDA0002369294030000011
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)荧光PCR的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火延伸15s，共计40个循环。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)结果判定方法为：待检样品出现典型的S曲线且Ct值≦37，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；Ct值>37或是无Ct值判定为山羊痘病毒属病毒核酸阴性。
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